एक द्विसंयोजक जीवित क्षीण इन्फ्लूएंजा वायरस टीका सूअरों में भटके हुए H1N2 और H3N2 क्लिनिकल आइसोलेट्स से बचाता है भाग 1

अमूर्त:

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) कई स्तनधारी प्रजातियों के लिए अत्यधिक संक्रामक श्वसन रोग का कारण बन सकता है। सूअरों में, IAV अतिसंवेदनशील आबादी में उच्च रुग्णता और कम मृत्यु दर वाली बीमारी का कारण बनता है जिसका महत्वपूर्ण वित्तीय और उत्पादन प्रभाव हो सकता है। वे उत्परिवर्तन और जीन पुनर्मूल्यांकन के अवसर भी प्रस्तुत कर सकते हैं, जिससे महामारी की संभावना वाले इन्फ्लूएंजा उपभेद उत्पन्न हो सकते हैं।

इन्फ्लुएंजा ए एक अत्यधिक संक्रामक श्वसन रोग है जो वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा है। प्रतिरक्षा से संबंधित अध्ययनों से पता चला है कि एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रणाली लोगों को फ्लू वायरस से संक्रमित होने पर वायरस से लड़ने में बेहतर बनाती है, जिससे बीमारी की घटना और गंभीरता कम हो जाती है।

रोग प्रतिरोधक क्षमता रोग से लड़ने की हमारी प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता है। मानव प्रतिरक्षा प्रणाली में दो भाग होते हैं: जन्मजात प्रतिरक्षा और अर्जित प्रतिरक्षा। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली वह है जिसके साथ हम पैदा होते हैं और इसमें बीमारी से बचाव के लिए पूरे शरीर की क्षमता होती है। अर्जित प्रतिरक्षा प्रणाली वह प्रतिरक्षा है जो हम धीरे-धीरे अपने जीवन में प्राप्त करते हैं, जिसमें मुख्य रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एंटीबॉडी से बनी ह्यूमरल प्रतिरक्षा और टी कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बनी सेलुलर प्रतिरक्षा शामिल है।

अध्ययनों से पता चला है कि स्वस्थ जीवनशैली और आहार, व्यायाम और पर्याप्त विटामिन और अन्य पोषक तत्व प्राप्त करके, आप अपनी प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार कर सकते हैं। इसके अलावा, टीका इन्फ्लूएंजा वायरस के प्रति शरीर की प्रतिरोधक क्षमता को भी बढ़ा सकता है और बीमारी की घटनाओं को कम कर सकता है।

इन्फ्लुएंजा ए वायरस मनुष्यों और जानवरों द्वारा साझा किया जाता है, इसलिए वे अक्सर उत्परिवर्तित होते हैं। खासकर शरद ऋतु और सर्दियों में लोगों की रोग प्रतिरोधक क्षमता कम होती है और इन्फ्लूएंजा ए वायरस इस मौके का फायदा उठाकर आसानी से हमला कर सकता है। लेकिन अगर हम एक स्वस्थ जीवनशैली विकसित करने, व्यायाम को मजबूत करने और सक्रिय रूप से टीकाकरण करने पर जोर देते हैं, तो हम अपनी प्रतिरक्षा में सुधार कर सकते हैं और इन्फ्लूएंजा ए वायरस के आक्रमण से बेहतर ढंग से निपट सकते हैं। इसके अलावा, यदि आप पाते हैं कि आपमें फ्लू जैसे लक्षण हैं, तो आपको चिकित्सा उपचार लेना चाहिए और समय पर उपचार प्राप्त करना चाहिए, ताकि आपका शरीर जल्दी ठीक हो सके।

संक्षेप में, इन्फ्लूएंजा ए वायरस और प्रतिरक्षा के बीच पारस्परिक प्रभाव होता है। किसी की प्रतिरक्षा को मजबूत करना, स्वस्थ जीवनशैली और आहार बनाए रखना और विशेष रूप से टीकाकरण स्वीकार करना इन्फ्लूएंजा ए वायरस को रोकने और उससे लड़ने के लिए सभी प्रभावी उपाय हैं। आइए सकारात्मक रहें और इन्फ्लूएंजा ए वायरस की रोकथाम के संदर्भ में एक स्वस्थ जीवन शैली की ओर बढ़ें! यह देखा जा सकता है कि हमें रोग प्रतिरोधक क्षमता में सुधार करने की जरूरत है। सिस्टैंच प्रतिरक्षा में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि मांस की राख में विभिन्न प्रकार के जैविक रूप से सक्रिय तत्व होते हैं, जैसे पॉलीसेकेराइड, दो मशरूम, हुआंग ली, आदि। ये तत्व विभिन्न प्रतिरक्षा प्रणालियों को उत्तेजित कर सकते हैं। कोशिका जैसी कोशिकाएं, उनकी प्रतिरक्षा गतिविधि को बढ़ाती हैं।

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इसलिए, सूअरों में इन्फ्लूएंजा संक्रमण को रोकना और नियंत्रित करना बहुत महत्वपूर्ण है, और ऐसा करने का मुख्य तरीका टीकाकरण है। दुनिया भर में सूअरों में सबसे अधिक प्रचलित IAV के उपप्रकार H1N1, H1N2, और H3N2 हैं; हालाँकि, इन वायरस की आनुवंशिक विविधता क्षेत्र के अनुसार काफी भिन्न हो सकती है। हमने पहले दो कैनेडियन स्वाइन इन्फ्लूएंजा ए वायरस (एसडब्ल्यूआईएवी) आइसोलेट्स, ए/स्वाइन/अल्बर्टा/एसडी0191/2016 (एच1एन2) [एसडी191] और ए/स्वाइन/सस्केचेवान/एसडी0069/2015 (एच3एन2) का उपयोग करके एक इलास्टेज-निर्भर द्विसंयोजक जीवित क्षीणित टीका विकसित किया था। ) [एसडी69], जो समजातीय उपभेदों से रक्षा करता है।

इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि यह टीका सूअरों में अधिक वर्तमान, प्रवाहित गैर-समरूप H1N2 और H3N2 उपभेदों, A/स्वाइन/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] और A/स्वाइन/AB/SD0435/ से सुरक्षा प्रदान करता है। 2019 (H3N2) [SD435]।

टीके ने सीरम और फेफड़ों में एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त की और वायरल प्रतिकृति के साथ-साथ इन उपभेदों से जुड़े फेफड़ों की विकृति को कम किया। इसलिए, यह द्विसंयोजक टीका एक मजबूत उम्मीदवार बना हुआ है जो उत्तरी अमेरिका में स्वाइन इन्फ्लूएंजा वैक्सीन बाजार के लिए फायदेमंद होगा।

कीवर्ड:

इन्फ्लुएंजा; टीका; सूअर.

1 परिचय

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) सूअर सहित कई प्रजातियों के लिए एक महत्वपूर्ण रोगज़नक़ है। संक्रमण से सूअरों में अत्यधिक संक्रामक श्वसन रोग हो सकता है [1]। सूअरों में इन्फ्लूएंजा संक्रमण से हल्की बीमारी होती है और मृत्यु दर बहुत कम होती है, लेकिन झुंड में रुग्णता दर 100 प्रतिशत तक पहुंच सकती है [2]। इसके परिणामस्वरूप किसानों को आर्थिक नुकसान होता है क्योंकि संक्रमित सूअरों का वजन कम हो जाता है, उत्पादन क्षमता कम हो जाती है, और सूअरों में प्रजनन विफलता हो जाती है [3,4]।

अन्य स्वाइन श्वसन रोगज़नक़ों के साथ इन्फ्लूएंजा के सह-संक्रमण से पोर्सिन श्वसन रोग कॉम्प्लेक्स का विकास हो सकता है, और परिणामस्वरूप, मृत्यु दर और आर्थिक नुकसान में वृद्धि हो सकती है [5]।
इसके अतिरिक्त, सूअरों के श्वसन पथ में पक्षी और स्तनधारी सियालिक एसिड गैलेक्टोज लिंकेज की उपस्थिति के कारण पक्षी और मानव IAV के साथ-साथ सूअर IAV (swIAV) से संक्रमण होने की आशंका होती है [6]। इससे कई उपभेदों के साथ सह-संक्रमित होने पर पुन: वर्गीकरण संभव हो जाता है, जिससे महामारी की संभावना वाले नए उपभेदों का उत्पादन हो सकता है [4,7]।

चूंकि मनुष्यों में श्वसन पथ में सियालिक एसिड गैलेक्टोज लिंकेज वितरण समान होता है, इसलिए मनुष्यों और सूअरों के बीच द्वि-दिशात्मक स्पिलओवर घटनाएं संभव होती हैं। इसकी पहली ज्ञात घटना 1918 इन्फ्लूएंजा महामारी के दौरान हुई थी जब आईएवी को मनुष्यों से सूअर में पेश किया गया था [8]। यह वंश 1990 के दशक तक सुअर आबादी में स्थिर रहा, जब मानव और एवियन H3N2 उपभेदों ने परिसंचारी H1N1 वंश के साथ पुन: मिश्रित होकर H1N1, H1N2 और H3N2 उपप्रकारों के दोहरे और तिगुने पुनर्मूल्यांकन उपभेदों का उत्पादन किया [8,9]।

नव विकसित ट्रिपल रीअसॉर्टेंट जीन (टीआरआईजी) कैसेट ने उत्तरी अमेरिकी सूअरों में तेजी से आईएवी विविधीकरण की अवधि को जन्म दिया [10]। यह TRIG कैसेट बहुत स्थिर है और विभिन्न HA और NA संयोजनों के प्रतिस्थापन की सुविधा प्रदान करता है [5]। 2005 के बाद से, इस आंतरिक TRIG कैसेट के साथ मानव HA और NA जीन के साथ जुड़े कई उपभेद संयुक्त राज्य अमेरिका में सूअर के झुंडों में फैल गए हैं [9]।

अगली उल्लेखनीय स्पिलओवर घटना 2009 में हुई, जब सूअर मूल का H1N1 स्ट्रेन (H1N1pdm2009) मनुष्यों में फैल गया, जिससे 2009 इन्फ्लूएंजा महामारी हुई [11]। उत्तरी अमेरिकी सूअरों में मानव महामारी H1N1 IAV (H1pdm) का मानव-से-सूअर संचरण (रिवर्स ज़ूनोसिस) कई बार दर्ज किया गया, जिसके कारण एक नई वंशावली और नए पुन: असॉर्टेंट swIAVs की स्थापना हुई [8,10,12]।

कुल मिलाकर, उत्तरी अमेरिकी सूअर में सात एंटीजेनिक रूप से अलग एच1 क्लेड और एच3 वायरस के चार अलग-अलग क्लेड दर्ज किए गए हैं [5]। हाल ही में, एशिया में एक swIAV निगरानी कार्यक्रम ने H1pdm और ट्रिपल रीअसॉर्टेंट आंतरिक जीन के साथ एक प्रमुख यूरेशियन एवियन-लाइक (EA) रीअसॉर्टेंट जीनोटाइप 4 (G4) वायरस की पहचान की।

इस जी4 वायरस को परीक्षण किए गए 10.4 प्रतिशत सूअर श्रमिकों में मापा गया था, और यह मनुष्यों में संचारित करने की क्षमता और वर्तमान में प्रसारित मानव वायरस से भिन्न एंटीजेनेसिटी के साथ महामारी क्षमता के मार्कर प्रस्तुत करता है [7]। इसलिए सूअर उद्योग और सार्वजनिक स्वास्थ्य दोनों दृष्टिकोण से सूअरों में इन्फ्लूएंजा संक्रमण को रोकना और नियंत्रित करना बहुत महत्वपूर्ण है, और ऐसा करने का मुख्य तरीका टीकाकरण है [4]।

संयुक्त राज्य अमेरिका में, सबसे आम प्रकार का टीका संपूर्ण निष्क्रिय वायरस (डब्ल्यूआईवी) है, लेकिन एचए और एनएस को व्यक्त करने वाले एक आरएनए वेक्टर वैक्सीन को भी मंजूरी दे दी गई है। [4] . उत्तरी अमेरिका सहित दुनिया भर में सूअरों में सबसे अधिक प्रचलित IAV के उपप्रकार H1N1, H1N2 और H3N2 हैं [13]।

हालाँकि, इन विषाणुओं की आनुवंशिक विविधता क्षेत्र के अनुसार बहुत भिन्न हो सकती है, और कनाडा और संयुक्त राज्य अमेरिका में swIAV के आनुवंशिक विकास में अंतर हैं, विशेष रूप से H1 उपप्रकार के विषाणुओं में [12]। 2009 और 2016 के बीच कनाडा में निगरानी से पता चला कि H1 के आनुवंशिक समूह जो संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रमुख थे, H1g (1A.3.3.3) और H1d-1 (1B.2.2), कनाडा में नहीं पाए गए, और कनाडा में एच1 वायरस संयुक्त राज्य अमेरिका के एच1 वायरस से अत्यधिक भिन्न थे [12]।

कनाडा में एक नए H1 क्लैड (H1a-3) की पहचान की गई, जो मैनिटोबा में शुरू हुआ और पूरे देश और संयुक्त राज्य अमेरिका में फैलने से पहले तेजी से विकसित हुआ। H3 वायरस के संबंध में, अमेरिकी सूअर (IV-A से IV-F) में छह H3 वंशावली का दस्तावेजीकरण किया गया था, और उनमें से तीन कनाडाई सूअर (IV-B, IV-C, और IV-E) में पाए गए थे [12 ].

यह प्रभावी टीका कार्यक्रमों को सूचित करने के लिए क्षेत्रीय निगरानी और परिसंचारी उपभेदों के बारे में जागरूकता के महत्व पर प्रकाश डालता है और इंगित करता है कि अमेरिकी सूअर में प्रसारित आईएवी के आधार पर डिज़ाइन किए गए टीके कनाडाई सूअर की रक्षा नहीं कर सकते हैं [12]।

इससे पहले, दो कनाडाई swIAV आइसोलेट्स, A/ स्वाइन/अल्बर्टा/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] और A/स्वाइन/सस्केचेवान/SD0069/2015 (H3N2) का उपयोग करके एक द्विसंयोजक टीका बनाया गया था, जो H के प्रतिनिधि हैं। 9}} एंटीजेनिक समूह और पश्चिमी कनाडा से एक नया एच3 एंटीजेनिक समूह (स्वाइन क्लस्टर IV-E), क्रमशः [14]। यह नया टीका एक जीवित क्षीणित वायरस टीका है जो SD191 और SD69, SD191−R342V, और SD69-K345V के इलास्टेज-निर्भर रूपों का उपयोग करके बनाया गया है। अध्ययनों से पता चला है कि यह SD191 और SD69 दोनों के खिलाफ सुरक्षात्मक था, साथ ही एक विषम H1N2 स्ट्रेन A/स्वाइन/सस्केचेवान/SD0142/2015 (H1N2) के खिलाफ भी था जो पश्चिमी कनाडा से भी अलग किया गया था [14]।

तब से, परिसंचारी swIAV उपभेदों का बहाव जारी है। पश्चिमी कनाडा में सूअरों से हाल ही में क्लिनिकल आइसोलेट्स को वेस्टर्न कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन, सास्काचेवान विश्वविद्यालय, सास्काटून, एसके, कनाडा में फील्ड नमूनों से एकत्र और अलग किया गया था। ए/स्वाइन/एमबी/एसडी0467/2019 (एच1एन2) [एसडी467] एच -3 एंटीजेनिक समूह का सदस्य है, लेकिन एसडी191 की तुलना में 54 प्रमुख एच1 एंटीजेनिक साइटों में से पांच अमीनो एसिड प्रतिस्थापन हैं [10,15, 16].

ए/स्वाइन/एबी/ एसडी0435/2019 (एच3एन2) [एसडी435] आईवी-ई क्लस्टर का सदस्य है, लेकिन छह प्रमुख एच3 एंटीजेनिक साइटों में से दो अमीनो एसिड प्रतिस्थापनों को शामिल करने के लिए आगे बढ़ा है [17]।

इस अध्ययन में, हमने मूल्यांकन किया कि क्या द्विसंयोजक इलास्टेज-आश्रित LAIV नए नैदानिक ​​​​आइसोलेट्स के खिलाफ टिकेगा, और यह रिपोर्ट कर सकता है कि वर्तमान में प्रसारित swIAV उपभेदों SD467 (H1N2) और SD435 (H3N2) के साथ चुनौती मिलने पर इसने सूअरों की रक्षा की।

2। सामग्री और विधि

2.1. कोशिकाएँ और वायरस

मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी (एमडीसीके) (एटीसीसी, #सीआरएल-2936) कोशिकाओं को न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) (सिग्मा-एल्ड्रिच, एम4655, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में बनाए रखा गया था जिसमें 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम था। (एफबीएस) (थर्मो फिशर साइंटिफिक, ओटावा, ओएन, कनाडा 16000-044), और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 प्रतिशत आर्द्र सीओ2 इनक्यूबेटर में रखा गया था। ए/स्वाइन/अलबर्टा/एसडी0435/2019 (एच3एन2) [एसडी435] और ए/स्वाइन/मैनिटोबा/एसडी0467/2019 (एच1एन2) [एसडी467] swIAV को वेस्टर्न कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन, सास्काचेवान विश्वविद्यालय, सास्काटून में फील्ड नमूनों से अलग किया गया था। , एसके, कनाडा।

वैक्सीन वायरस SD191−R342V और SD69- K345V को पहले बताए अनुसार बचाया गया था [14]। सभी वायरस एमडीसीके कोशिकाओं में 0.2 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) (सिग्मा-एल्ड्रिच, ए7030) की उपस्थिति में 1 माइक्रोग्राम/एमएल एल-[(टोल्यूनि{) के साथ विकसित किए गए थे। {11}}सल्फोनामाइड)-2-फिनाइल] एथिल क्लोरोमिथाइल कीटोन (टीपीसीके)- ट्रिप्सिन (डब्ल्यूटी वायरस) या 0.5 माइक्रोग्राम/एमएल मानव न्यूट्रोफिल इलास्टेज (इलास्टेज-निर्भर वायरस) (सिग्मा-एल्ड्रिच, ई8140)।
2.2. पशु परीक्षण डिजाइन

प्रेयरी स्वाइन सेंटर इंक. (सास्काटून, एसके, कनाडा) से चौबीस चार सप्ताह पुराने स्वआईएवी-नकारात्मक सूअर प्राप्त किए गए थे। इन सूअरों को बेतरतीब ढंग से चुना गया और चार समूहों में विभाजित किया गया, जिसमें प्रति टीका लगाए गए समूह में सात सूअर और प्रति नकली टीका लगाए गए समूह में पांच सूअर थे।

समूह असाइनमेंट का वर्णन चित्र 1ए में किया गया है। इन समूहों को टीकाकरण समूहों (समूह ए प्लस बी और सी प्लस डी एक साथ रखे गए) के आधार पर अलग-अलग कमरों में रखा गया था और संक्रमण से पहले सात दिनों तक अनुकूलन करने की अनुमति दी गई थी।

पाँच सप्ताह की आयु (दिन 0) के साथ-साथ आठ सप्ताह की आयु (दिन 21) पर, समूह ए और बी के सूअरों को एमईएम के 4 एमएल के साथ इंट्राट्रैचियल मॉक टीका लगाया गया, जबकि समूह सी और डी को टीका लगाया गया। एक द्विसंयोजक वैक्सीन के साथ जिसमें प्रत्येक SD191−R342V का 1 × 106 PFU और 4 mL MEM में SD{7}}K345V होता है। दस दिन बाद (दिन 31), सूअरों को या तो एमईएम (मॉक) या 1 × 106 पीएफयू या तो एसडी{13}}डब्ल्यूटी (एच3एन2) या एसडी467-डब्ल्यूटी (एच1एन2) के साथ चुनौती दी गई।

चुनौती के बाद पांच दिनों तक सूअरों की निगरानी की गई, जिसमें प्रतिदिन मलाशय का तापमान लिया गया और 1, 3 और 5 दिनों में दोनों नासिका छिद्रों से नाक के स्वाब लिए गए। पहले (20वें दिन) और दूसरे (30वें दिन) टीकाकरण के बाद सीरम एकत्र किया गया था। सीरम वायरस न्यूट्रलाइजेशन (एसवीएन) परख और एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा)।

चुनौती के बाद पांचवें दिन, सभी सूअरों को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई, और फेफड़ों को निकाला गया और swIAV-विशेषता वाले सकल घावों की उपस्थिति का मूल्यांकन किया गया। वायरस अलगाव के लिए फेफड़े के ऊतकों के नमूने भी एकत्र किए गए (चित्र 1बी)।

2.3. नैतिक वक्तव्य

सभी पशु प्रक्रियाओं को यूनिवर्सिटी ऑफ़ सस्केचेवान की यूनिवर्सिटी एनिमल केयर कमेटी (UACC) और एनिमल रिसर्च एथिक्स बोर्ड (AREB) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को 12 नवंबर 2021 (पशु उपयोग प्रोटोकॉल #20190064) को मंजूरी दी गई थी। सभी प्रक्रियाएं वैक्सीन और संक्रामक रोग संगठन (वीआईडीओ), सास्काचेवान विश्वविद्यालय, सास्काटून, एसके, कनाडा में कैनेडियन काउंसिल ऑफ एनिमल केयर (सीसीएसी) द्वारा आवश्यक मानकों के अनुसार निष्पादित की गईं।

2.4. सैम्पलिंग

प्रत्येक नथुने से नाक के स्वाब को 1 × एंटीबायोटिक एंटीमायोटिक (थर्मो फिशर साइंटिफिक, ओटावा, ओएन, कनाडा, 15240-062) युक्त एमईएम के 1 एमएल में रखा गया और क्यूआरटी-पीसीआर किए जाने तक -80 ◦C पर जमाया गया। सभी सूअरों को इथेनॉल (240 मिलीग्राम/एमएल सोडियम पेंटोबार्बिटल; 2 एमएल प्रति 4.5 किग्रा) के अंतःशिरा प्रशासन द्वारा मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई। इच्छामृत्यु के बाद, बैंगनी-लाल, ठोस घावों के साथ-साथ निमोनिया का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए फेफड़ों को पूरी तरह से हटा दिया गया था।

प्रतिशत का निर्धारण फेफड़े के लोब के वजन के साथ-साथ पूरे फेफड़े की मात्रा के आधार पर किया गया था [18]। वायरल अनुमापन के लिए दाएं एपिकल, कार्डियक और डायाफ्रामिक लोब से फेफड़े के नमूने भी लिए गए। इन फेफड़ों के नमूनों को अनुमापन के लिए 1× एंटीबायोटिक-एंटीमायोटिक युक्त 10 प्रतिशत w/v एमईएम की समान मात्रा में मिलाया गया था।

चित्र 1. नए क्लिनिकल आइसोलेट्स के खिलाफ द्विसंयोजक LAIV की सुरक्षात्मक प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए सूअरों का समूहन और परीक्षण डिजाइन। सूअरों (एमईएम/एमईएम समूहों के लिए एन {{1%) और द्विसंयोजक/द्विसंयोजक समूहों के लिए एन=7) को एमईएम के 4 एमएल या 1 × 1{10}}6 पीएफयू से बने द्विसंयोजक टीके के साथ अंतःश्वासनलीय टीका लगाया गया था। 0 और 21 दिन पर प्रत्येक SD191−R342V और SD{8}}K345V का। 31वें दिन, सूअरों को SD435 (H3N2) या SD467 (H1N2) के MEM या 1 × 106 PFU के साथ अंतःश्वासनलीय रूप से चुनौती दी गई। (ए)

इस पशु परीक्षण के लिए टीकाकरण, चुनौती और नमूना लेने का कार्यक्रम। चौबीस चार सप्ताह के स्वआईएवी-नकारात्मक सूअरों को संक्रमण से पहले सात दिनों के लिए अनुकूलन की अनुमति दी गई थी। पांच सप्ताह की आयु (दिन 0) के साथ-साथ आठ सप्ताह (दिन 21) की आयु में, समूह ए और बी के सूअरों को 4 एमएल एमईएम के साथ अंतःश्वासनलीय रूप से नकली टीका लगाया गया, जबकि समूह सी और डी को टीका लगाया गया। एक द्विसंयोजक वैक्सीन के साथ जिसमें प्रत्येक SD191−R342V का 1 × 106 PFU और 4 mL MEM में SD69-K345V होता है।

दस दिन बाद (दिन 31), सूअरों को या तो एमईएम (नकली) या 1 × 106 पीएफयू या तो एसडी{3}}डब्ल्यूटी (एच3एन2) या एसडी{6}}डब्ल्यूटी (एच1एन2) के साथ चुनौती दी गई। चुनौती के बाद पांच दिनों तक सूअरों की निगरानी की गई, जिसमें प्रतिदिन मलाशय का तापमान लिया गया और 1, 3 और 5 दिनों में दोनों नासिका छिद्रों से नाक के स्वाब लिए गए। पहले (20वें दिन) और दूसरे (30वें दिन) टीकाकरण के बाद सीरम एकत्र किया गया था। चुनौती के बाद 5वें दिन (36वां दिन) सभी सूअरों को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दे दी गई, और मूल्यांकन के लिए उनके फेफड़े निकाल लिए गए। (बी) BioRender.com के साथ बनाया गया।

2.5. एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)

कोटिंग एंटीजन बनाने के लिए, एसडी435 और एसडी467 को एमडीसीके कोशिकाओं में प्रचारित किया गया और सुक्रोज ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके शुद्ध किया गया। 1:1000 (v/v) (थर्मो फिशर साइंटिफिक, AAB2319703) की सांद्रता पर वायरस में 97 प्रतिशत -प्रोपियोलैक्टोन जोड़ने से वायरस निष्क्रिय हो गया। इस मिश्रण को रात भर 4 ◦C पर हिलाया गया, -प्रोपियोलैक्टोन के हाइड्रोलिसिस की सुविधा के लिए दो घंटे के लिए 37 ◦C पर ऊष्मायन किया गया, फिर उपयोग होने तक −80 ◦C पर संग्रहीत किया गया।

टीकाकरण और चुनौती से प्रेरित swIAV-विशिष्ट IgG स्तरों को मापने के लिए, सुअर सीरम को पहले (दिन 20) और दूसरे (दिन 30) टीकाकरण के बाद, और नेक्रोपसी (दिन 36) से पहले लिया गया था।

शुद्ध -प्रोपियोलैक्टोन-निष्क्रिय वायरस SD435 (1 μg/mL), और SD467 (2 μg/mL), कार्बोनेट/बाइकार्बोनेट कोटिंग बफर में पतला, (पीएच 9.6) को इम्मुलोन {{8}वेल प्लेटों पर 1 {{ पर लागू किया गया था। 12} 0 µL/वेल (थर्मो लैबसिस्टम्स, ओटावा, ओएन, कनाडा, 3655) और 4 ◦C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। रात भर ऊष्मायन के बाद, लेपित प्लेटों को टीबीएसटी ({{16%).1 एम ट्रिस, 0.17 एम NaCl, और 0.05 प्रतिशत ट्वेन 20) से चार बार धोया गया, जिसमें सीरम या BALF के चार गुना क्रमिक तनुकरण मिलाए गए। प्लेट को दो प्रतियों में, उसके बाद कमरे के तापमान पर दो घंटे तक ऊष्मायन किया जाता है। सीरम को 1:10 के आरंभिक तनुकरण पर मिलाया गया था, और BALF को बिना पतला किये मिलाया गया था।

पिछले अध्ययन में बिना टीकाकरण वाले सूअरों से पहले से परिभाषित सकारात्मक नियंत्रण सीरा और उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण, सीरम और BALF के नमूने प्रत्येक प्लेट पर चलाए गए थे [14]। प्लेटों को टीबीएसटी से चार बार धोया गया, जिसके बाद बकरी विरोधी स्वाइन आईजीजी (एच प्लस एल) फॉस्फेट-लेबल एफिनिटी शुद्ध एंटीबॉडी (1: 5000) (सिग्मा एल्ड्रिच, एसएबी 3700435) या माउस एंटी-पिग आईजीए (सेरोटेक, एमसीए 658) ( 1:300) को टीबीएसटी में घोलकर एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पकने के लिए छोड़ दिया गया।

आईजीए एलिसा को बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एच प्लस एल) एंटीबॉडी (सीएएलटीएजी, बर्लिंगम, सीए, यूएसए, एम 3 0 015) और स्ट्रेप्टाविडिन क्षारीय फॉस्फेट समाधान (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च, वेस्ट ग्रोव,) के अतिरिक्त द्वारा विकसित किया गया था। पीए) दोनों को कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए। ऊष्मायन के बाद, आईजीजी और आईजीए दोनों प्लेटों को टीबीएसटी से चार बार धोया गया, जिसमें पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट सब्सट्रेट (पीएनपीपी) [10 मिलीग्राम/एमएल पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट डी (ट्रिस) नमक क्रिस्टलीय (सिग्मा-एल्ड्रिच), 1 प्रतिशत डायथेनॉलमाइन ( सिग्मा-एल्ड्रिच), 0.5 मिलीग्राम/एमएल एमजीसीएल2, और पीएच 9.8] (1 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ा गया और दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया।

प्रतिक्रिया को 0.3 एम एथिलीनडायमिनेटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) जोड़ने के माध्यम से रोक दिया गया था, और प्लेटें 490 एनएम के संदर्भ के साथ 405 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में पढ़ी गईं। नमूने के अनुमापांक को उच्चतम तनुकरण के रूप में परिभाषित किया गया था, जिस पर उस नमूने का OD परिभाषित कटऑफ (ज्ञात नकारात्मक नमूने का औसत OD और मानक विचलन का दो गुना) से अधिक था।

2.6. वायरस न्यूट्रलाइज़ेशन (वीएन) परख

एमडीसीके कोशिकाओं (3.5 × 104) को अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाया गया। सीरम और BALF को 30 मिनट के लिए 56 ◦C पर गर्म करके निष्क्रिय किया गया। सीरम और BALF के दो गुना तनुकरण को चार प्रतियों में प्लेट में जोड़ा गया था, और 60 μL पतला सीरम या BALF को SD435 या SD456 की समान मात्रा के साथ 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर 100 TCID50 युक्त ऊष्मायन किया गया था।

फिर मिश्रण का 100 μL एमडीसीके कोशिकाओं में जोड़ा गया, और साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीई) को संक्रमण के 48 घंटे और 72 घंटे बाद (पीआई) दर्ज किया गया। न्यूट्रलाइज़ेशन एंटीबॉडी टिटर प्रत्येक सीरम नमूने का उच्चतम पतलापन था जिसने 4 में से कम से कम 2 कुओं में सीपीई से कोशिकाओं को पूरी तरह से सुरक्षित रखा।

2.7. वायरल निर्धारण

एकत्र करने पर, फेफड़ों के नमूनों को तुरंत बर्फ पर रखा गया और प्रसंस्करण तक -80 ◦C पर जमा दिया गया। प्रसंस्करण के लिए, प्रत्येक फेफड़े के ऊतक का वजन किया गया और एमईएम की 10 प्रतिशत (w/v) सांद्रता को 1× एंटीबायोटिक-एंटीमायोटिक (थर्मो फिशर साइंटिफिक, 15240-062) के साथ पूरक किया गया। फेफड़े के ऊतकों को टिश्यू लाइज़र II (क्यूजेन, हिल्डेन, जर्मनी) में 5 मिनट के लिए 30 हर्ट्ज पर समरूप बनाया गया, इसके बाद 4 ◦C पर 10 मिनट के लिए 5000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया। समरूप सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और अगले विश्लेषण तक -80 ◦C पर संग्रहीत किया गया था।

नाक के स्वाब को 15 सेकंड के लिए घुमाया गया और 4 ◦C पर 25 मिनट के लिए 1600× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और अगले विश्लेषण तक -80 ◦C पर संग्रहीत किया गया। वायरल टाइटर्स का निर्धारण फेफड़ों के लिए TCID50 परख और नाक के स्वैब के लिए मात्रात्मक RT-पीसीआर द्वारा किया गया था।

2.8. आरएनए निष्कर्षण और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर)
चुनौती के बाद नाक के स्वाब में एसडी467 और एसडी435 के वायरल आरएनए स्तर को निर्धारित करने के लिए, क्यूआरटी-पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। ज्ञात अनुमापांक के SD435 और SD467 से निकाले गए RNA का उपयोग करके एक मानक वक्र बनाया गया था। संक्षेप में, आरएनईज़ी प्लस मिनी किट (क्यूजेन, टोरंटो, ओएन, कनाडा, 74136) का उपयोग 200 μL नेज़ल वॉश से वीआरएनए निकालने के लिए किया गया था।

यूनिवर्सल इन्फ्लूएंजा प्राइमर Uni12 और सुपरस्क्रिप्ट III ट्रांसक्रिपटेस (इनविट्रोजन, बर्लिंगटन, ओएन, कनाडा) [19] का उपयोग करके आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था। क्यूपीसीआर को पावर एसवाईबीआर ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स), 5 μL सीडीएनए और 10μM फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के 1 μL के साथ स्टेपवनप्लसTM रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, सीए, यूएसए) पर तीन प्रतियों में प्रदर्शित किया गया था। पीसीआर प्रतिक्रियाएं 40 चक्रों के लिए 58 डिग्री सेल्सियस के एनीलिंग तापमान पर चलाई गईं। क्यूपीसीआर प्राइमरों के सभी क्रम अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

2.9. सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म 8 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। मैन-व्हिटनी और क्रुस्कल-वालिस गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग किया गया था। महत्वपूर्ण अंतरों को * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0.001) द्वारा दर्शाया जाता है। , या **** (पी <0.0001)। एनएस=महत्वपूर्ण नहीं है।

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