रुटिन युक्त आहार अल्जाइमर रोग के एक माउस मॉडल में मस्तिष्क इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स होमोस्टैसिस में सुधार करता है भाग 3
Jun 14, 2023
4.6. थियोबार्बिट्यूरिक एसिड-रिएक्टिव पदार्थ (टीबीएआर)
टीबीएआर की सामग्री का उपयोग लिपोपरोक्सीडेशन के सूचकांक के रूप में किया गया था। मस्तिष्क के ऊतकों में, 25 मिलीग्राम/एमएल (डब्ल्यू/वी) की सांद्रता में 5 0 एमएम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) जोड़ा गया था, और निलंबन को 10 एस के लिए सोनिकेशन द्वारा समरूप बनाया गया था। होमोजेनेट के 30 μL में, 250 μL 1 प्रतिशत फॉस्फोरिक एसिड और 75 μL 0.6 प्रतिशत थायोबार्बिट्यूरिक एसिड (TBA) मिलाया गया। अभिकर्मक मिश्रण को 45 मिनट के लिए पानी के स्नान में 100 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था, जिसके बाद इसे बर्फ के स्नान में ठंडा किया गया था और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। प्रत्येक नमूने से 150 µL सतह पर तैरनेवाला की मात्रा ली गई। प्रतिदीप्ति को FLUOSTAR माइक्रोप्लेट रीडर (BMG LABTECH, ऑर्टेनबर्ग, बाडेन-वुर्टेमबर्ग, जर्मनी) का उपयोग करके 485 एनएम (बैंडविड्थ 5 एनएम) पर उत्तेजना फिल्टर सेट और 530 एनएम (बैंडविड्थ 5 एनएम) पर उत्सर्जन फिल्टर सेट के साथ मापा गया था। एक मानक के रूप में मैलोनडायल्डिहाइड (एमडीए) का उपयोग करके एक अंशांकन वक्र तैयार किया गया था। परिणाम pmol MDA/mg प्रोटीन में व्यक्त किए गए।
सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ करने और मुक्त कट्टरपंथी-प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोकने की क्षमता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयन क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

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4.7. मुख्य एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की एंजाइमेटिक गतिविधि
मस्तिष्क के ऊतकों में एंजाइम गतिविधि के निर्धारण के लिए, 50 एमएम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) और एंटीप्रोटीज़ (1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम पीएमएसएफ, 1 ग्राम/एमएल पेप्स्टैटिन, और 1 ग्राम/एमएल ल्यूपेप्टिन) युक्त एक लाइसिस बफर को एक में जोड़ा गया था। 50 mg/mL (w/v) की सांद्रता। फिर, निलंबन को बर्फ के स्नान में 30 सेकंड के लिए सोनिकेट किया गया, और होमोजेनेट को 4 ◦C पर 15 मिनट के लिए 10, 10 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की एंजाइमिक गतिविधि के निर्धारण के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था।
सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ (एसओडी) गतिविधि को 420 एनएम [69] पर पायरोगैलोल ऑटोऑक्सीडेशन के निषेध के बाद मापा गया था। एंजाइम की एक इकाई को पाइरोगैलोल ऑटोऑक्सीडेशन की दर को 50 प्रतिशत तक रोकने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया था। एसओडी एंजाइमेटिक गतिविधि को अंतर्राष्ट्रीय इकाइयों (आईयू)/मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया था। 240 एनएम [70] पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के गायब होने के बाद कैटालेज (सीएटी) गतिविधि को ट्राइटन-एक्स -100 (1 प्रतिशत, वी/वी)-उपचारित सतह पर तैरनेवाला में मापा गया था, और एंजाइम गतिविधि को सब्सट्रेट के रूप में रिपोर्ट किया गया था ( µmol H2O2) परिवर्तित/मिनट · मिलीग्राम प्रोटीन। कुल ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीपीएक्स) अतिरिक्त जीआर, जीएसएच और क्यूमीन हाइड्रोपरॉक्साइड [71] की उपस्थिति में 340 एनएम पर एनएडीपीएच ऑक्सीकरण के बाद निर्धारित किया गया था। जीपीएक्स गतिविधि को सब्सट्रेट (एनएमओएल एनएडीपीएच) रूपांतरित/न्यूनतम मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया था। जीएसएसजी [72] की उपस्थिति में 340 एनएम पर एनएडीपीएच ऑक्सीकरण के बाद ग्लूटाथियोन रिडक्टेस (जीआर) गतिविधि का विश्लेषण किया गया और सब्सट्रेट (एनएमओएल एनएडीपीएच) रूपांतरित/मिनट · मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया। जैविक नमूनों की अनुपस्थिति (एंजाइम की अनुपस्थिति में) में सहज प्रतिक्रिया के लिए जीआर और दोनों जीपीएक्स गतिविधियों को ठीक किया गया था।
4.8. BACE1 गतिविधि परीक्षण
BACE1 परीक्षण प्रोटोकॉल में एक सेक्रेटेज़-विशिष्ट सब्सट्रेट (पेप्टाइड) का उपयोग शामिल होता है जो दो रिपोर्टर अणुओं, अर्थात् EDANS और DABCYL से संयुग्मित होता है, जिसके परिणामस्वरूप एक फ्लोरोसेंट सिग्नल निकलता है [73,74]। BACE1 गतिविधि को कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस लाइसेट्स दोनों में मापा गया था। प्रतिक्रिया 50 एमएम सोडियम एसीटेट बफर (पीएच 4.5) में 10 µM सब्सट्रेट का उपयोग करके 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर की गई थी। प्रतिदीप्ति तीव्रता माप 360 एनएम (बैंडविड्थ 5 एनएम) पर उत्तेजना फिल्टर सेट और 530 एनएम (बैंडविड्थ 5 एनएम) पर उत्सर्जन फिल्टर सेट के साथ एक फ्लुस्टार माइक्रोप्लेट रीडर (बीएमजी लैबटेक, ऑर्टेनबर्ग, बाडेनवुर्टेमबर्ग, जर्मनी) का उपयोग करके किया गया था। सेक्रेटेज एंजाइमेटिक गतिविधि का स्तर फ्लोरोमेट्रिक प्रतिक्रिया के समानुपाती होता है, और डेटा को पृष्ठभूमि नियंत्रण (सब्सट्रेट या ऊतक की अनुपस्थिति में प्रतिक्रियाएं) की तुलना में प्रतिदीप्ति में एक्स-गुना वृद्धि के रूप में व्यक्त किया जाता है। प्रोटीन सांद्रता के साथ BACE1 गतिविधि को सामान्य किया गया। चूहों की BACE1 गतिविधि, क्वेरसेटिन या रुटिन-उपचारित, TgAPP नियंत्रण चूहों की गतिविधि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी।
4.9. मुख्य एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की आरटी-पीसीआर जीन अभिव्यक्ति, एपीपी, बीएसीई1, एडीएएम10, कैस्पेज़-3 और कैस्पेज़-6 और सूजन संबंधी साइटोकिन्स
4.9.1. कुल आरएनए निष्कर्षण और शुद्धिकरण
हमने मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों, अर्थात् कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस का विश्लेषण किया, जो −80 ◦C पर संग्रहीत हैं। मस्तिष्क ऊतक की ज्ञात मात्रा में, ट्रायोमोल® लाइसिस बफर को 1:10 (w/v) के अनुपात में जोड़ा गया था। नमूनों को एक ताररहित मोटर (पेलेट मूसल, सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग करके 30 सेकंड के लिए समरूप बनाया गया था, और न्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों के पूर्ण पृथक्करण की अनुमति देने के लिए 25 ◦C पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। फिर, उपयोग किए गए ट्रायोमोल® लाइसिस बफर के प्रत्येक एमएल के लिए 0.2 एमएल क्लोरोफॉर्म जोड़ा गया था। ट्यूबों को 15 सेकेंड तक जोर-जोर से हिलाया गया और 3 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। फिर, उन्हें 4 ◦C पर 15 मिनट के लिए 11,{13}}× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, तीन चरण प्राप्त हुए, ऊपरी चरण में आरएनए था।
आरएनए को अलग करने के लिए, ऊपरी चरण को दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित किया गया और 0.5 एमएल आइसोप्रोपेनॉल जोड़कर अवक्षेपित किया गया। व्युत्क्रमण द्वारा आइसोप्रोपेनॉल और जलीय घोल को पूरी तरह से मिलाने के बाद, मिश्रण को वर्षा को बढ़ावा देने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था, और 4 ◦C पर 10 मिनट के लिए 12, {4}}× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया, और छर्रों को 75 प्रतिशत इथेनॉल से धोया गया और 4 ◦C पर 5 मिनट के लिए 7500× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। छर्रों को कमरे के तापमान पर सुखाया गया और 50 μL DEPC-उपचारित पानी में घोल दिया गया। डीएनए के निशान हटाने के लिए, 2.5 μL DNase (RNase-मुक्त) जोड़ा गया और 30 मिनट के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। अंत में, DNase को निष्क्रिय करने के लिए नमूनों को 5 मिनट के लिए 64 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया।
इसके बाद, आरएनए की सांद्रता को यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (बीएमजी लैबटेक, ऑर्टनबर्ग, बाडेन-वुर्टेमबर्ग, जर्मनी) में 260 एनएम पर मापा गया और 260 और 280 एनएम (ए260/ए280) पर अवशोषण अनुपात पर विचार करते हुए शुद्धता का आकलन किया गया।
आरएनए की अखंडता और शुद्धता का निर्धारण जेलरेड से सना हुआ 1 प्रतिशत एगरोज़ जेल में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया गया था और यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की गई थी, जहां, यदि आरएनए बरकरार था, तो राइबोसोमल आरएनए (28 एस और 18 एस) के अनुरूप दो ऊपरी बैंड और दो निचले बैंड थे। स्थानांतरण आरएनए (टीआरएनए) और 5एस राइबोसोमल आरएनए के अनुरूप अवलोकन किया जाना था।
4.9.2. पूरक डीएनए (सीडीएनए) संश्लेषण
सीडीएनए आरएनए की तुलना में बहुत अधिक स्थिर है और इसलिए अधिक सुविधाजनक और सुरक्षित नमूना प्रबंधन की अनुमति देता है। आरटी-क्यूपीसीआर (फेरमेंटस लाइफ साइंसेज) के लिए फर्स्ट स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट का उपयोग करके रेट्रोट्रांसक्रिप्शन द्वारा सीडीएनए को एमआरएनए से संश्लेषित किया गया था।
आरएनए के 2 माइक्रोग्राम में सीडीएनए संश्लेषण के लिए रेट्रोट्रांसक्रिप्शन करने के लिए, 11 μL डीईपीसी-उपचारित पानी और 1 μL 10X रैंडम प्राइमर जोड़े गए थे। फिर, आरएनए को विकृत करने के लिए मिश्रण को 10 मिनट के लिए 65 ◦C पर ऊष्मायन किया गया था। इस समय के बाद, आरएनए के पुनर्जीवन से बचने के लिए ट्यूबों को तुरंत 5 मिनट के लिए 4 ◦C पर लाया गया। सीडीएनए संश्लेषण के लिए अभिकर्मक मिश्रण तालिका एस1 (पूरक डेटा) में दिखाया गया है।
प्रत्येक नमूने में प्रतिक्रिया मिश्रण का आठ μL जोड़ा गया। पूरी मात्रा को ट्यूबों के नीचे लाया गया और 60 मिनट के लिए 42 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। अंत में, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को 10 मिनट के लिए 70 ◦C पर गर्म करके निष्क्रिय करके प्रतिक्रिया को रोक दिया गया।
4.9.3. वास्तविक समय पीसीआर
वास्तविक समय पीसीआर की मुख्य विशेषता यह है कि उत्पादों का विश्लेषण प्रतिदीप्ति का निर्धारण करके प्रवर्धन प्रक्रिया के दौरान होता है। इस तरह, प्रवर्धन और पता लगाने की प्रक्रिया किसी भी आगे की कार्रवाई की आवश्यकता के बिना एक ही ट्यूब या शीशी में एक साथ होती है। वास्तविक समय पीसीआर के लिए, थर्मल साइक्लर्स का उपयोग किया जाता है, जो एक साथ प्रतिदीप्ति को बढ़ा और पता लगा सकता है। हमने लाइटसाइक्लर रीयल-टाइम थर्मल साइक्लर (रोश डायग्नोस्टिक्स, मैनहेम, जर्मनी) का उपयोग किया।

तालिका S2 (अनुपूरक डेटा) एक पहचान प्रणाली के रूप में अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमरों और डीएनए-बाइंडिंग डाई (SYBR ग्रीन I, रोश मॉलिक्यूलर सिस्टम्स, इंक., रोटक्रेज़, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को सूचीबद्ध करता है।
विभिन्न परिमाणित मार्करों के लिए प्राइमरों के डिजाइन के लिए, प्राइमर3प्लस जैव सूचना विज्ञान कार्यक्रम का उपयोग किया गया था, जिसके लिए हमने मेडलाइन ओपन-एक्सेस डेटाबेस से रुचि के जीन के सीडीएनए अनुक्रम लिए। प्राइमरों की आपूर्ति मर्क (सिग्मा-एल्ड्रिच) द्वारा की गई थी। संकरण तापमान और उपयोग किए गए विभिन्न प्राइमरों का क्रम तालिका S3 (पूरक डेटा) में दिखाया गया है।
रुचि के जीन के प्रवर्धन के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति तालिका S4 (पूरक डेटा) में दिखाई गई है।
अंत में, नमूनों को पिघलने के कार्यक्रम के अधीन किया गया: 15 एस के लिए 95 ◦C, 3 0 s के लिए 65 ◦C, और निरंतर प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग के साथ 0.1 ◦C/s की दर पर 98 ◦C तक।
सीडीएनए स्तरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, जीएडीपीएच को हाउसकीपर के रूप में उपयोग करते हुए, चक्र सीमा (सीटी) तुलना विधि [75] का उपयोग किया गया था। हाउसकीपर का प्रवर्धन विश्लेषण किए गए जीन के समानांतर किया गया था। सीटी मानों की गणना लाइटसाइक्लर (रोश डायग्नोस्टिक्स, मैनहेम, जर्मनी) द्वारा प्रदान किए गए 4.{2}} सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की गई थी। सॉफ्टवेयर नमूना प्रवर्धन और पृष्ठभूमि के कारण प्रतिदीप्ति के बीच अंतर करने की अनुमति देता है। पिघलने की अवस्था भी दर्ज की गई। प्रवर्धित टुकड़े के पिघलने के तापमान का निर्धारण प्रवर्धित उत्पाद के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। बैंड का आकार 1.5 प्रतिशत एगरोज़ जेल पर जांचा गया।
क्वेरसेटिन या रुटिन उपचार के साथ अध्ययन के तहत जीन की अभिव्यक्ति की भिन्नता को नियंत्रण टीजीएपीपी (उपचार के बिना चूहों) और जीएडीपीएच के स्तर के साथ इस अभिव्यक्ति को सामान्य करने के एक कार्य के रूप में व्यक्त किया गया था। चेंज फोल्ड (2−∆∆Ct) नियंत्रण चूहों से संबंधित विशेष उपचार के तहत रुचि के जीन को संशोधित करने की संख्या को दर्शाता है।
4.10. सांख्यिकीय आंकड़े
सभी परीक्षण कम से कम दो प्रतियों में और तीन अलग-अलग प्रयोगों में किए गए। प्राप्त परिणाम माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। डेटा का परीक्षण करने और यह प्रदर्शित करने के बाद कि यह सामान्य वितरण में फिट बैठता है, विचरण (एनोवा) का एक-तरफ़ा विश्लेषण किया गया था। समूहों के बीच औसत अंतर की जांच करते हुए, न्यूमैन-केल्स मल्टीपल तुलना पोस्ट-हॉक परीक्षण चलाए गए। p < 0.05 का मान महत्वपूर्ण माना गया। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सिग्माप्लॉट 11.0 सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था।
प्र. 5। निष्कर्ष
आहार संबंधी आदतें और अनुपूरक सेलुलर रेडॉक्स स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं। इस आधार पर, हमने एसिम्प्टोमैटिक एडी में सेलुलर रेडॉक्स स्थिति और प्रोटीसोम-निर्भर अमाइलॉइड विशेषताओं के बीच परस्पर क्रिया पर विचार करते हुए, अमाइलॉइड पैथोलॉजी को कम करने के लिए क्वेरसेटिन या रुटिन युक्त फ्लेवोनोइड आहार के साथ एडी माउस मॉडल में सेलुलर रेडॉक्स होमोस्टैसिस को सुधारने का लक्ष्य रखा। हमारे डेटासेट प्रासंगिक हैं क्योंकि टीजीएपीपी माउस मॉडल में प्रदर्शित फ्लेवोनोइड प्रभाव हमारे इन विट्रो और पूर्व विवो मॉडल में पहले बताए गए प्रभावों के अनुरूप हैं।

निष्कर्ष में, हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि स्पर्शोन्मुख चरण में या एडी-जैसे लक्षणों की शुरुआत में आहार उपचार शुरू करने से एपीपी अभिव्यक्ति और बीएसीई1 गतिविधि के समवर्ती नियमितीकरण के माध्यम से सेलुलर रेडॉक्स स्थिति और एपीपी शारीरिक प्रसंस्करण बहाल हो सकता है।
यद्यपि हमारे निष्कर्षों को मानवीय स्थिति पर लागू करना मुश्किल है, लेकिन भविष्य के उपचारों के प्रति मानवीय प्रतिक्रिया पर उनका व्यापक प्रभाव हो सकता है। दो फ्लेवोनोइड्स में से, रुटिन, विवो प्रभावों में समग्र रूप से अधिक प्रमुख होने के साथ, मस्तिष्क के इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स होमोस्टैसिस की वृद्धि के आधार पर, एडी में सहायक चिकित्सा के रूप में दिन-प्रतिदिन के आहार में शामिल करने के लिए सबसे उपयुक्त लगता है।
पूरक सामग्री:निम्नलिखित सहायक जानकारी वेबसाइट पर डाउनलोड की जा सकती है। संदर्भ [76] पूरक सामग्री में उद्धृत किया गया है।
लेखक का योगदान:पीबी-बी. और एसएम-ए. विचार और प्रायोगिक डिज़ाइन की कल्पना की, प्रयोगों में मदद की, प्राप्त परिणामों की व्याख्या की और पांडुलिपि लिखी। केएलजे-ए. प्रयोग किए, डेटा विश्लेषण किया और प्राप्त परिणामों की व्याख्या की। जेबी ने डेटा विश्लेषण और पांडुलिपि के संशोधन में मदद की। सभी डेटा घर में तैयार किए गए थे, और किसी पेपर मिल का उपयोग नहीं किया गया था। सभी लेखक सत्यनिष्ठा और सटीकता सुनिश्चित करते हुए कार्य के सभी पहलुओं के लिए जवाबदेह होने के लिए सहमत हैं। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ लिया है और उससे सहमत हैं।
फंडिंग:इस शोध को मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन «मटुआ मैड्रिलेना» (मेडिकल रिसर्च प्रोजेक्ट्स के लिए अनुदान का चौथा संस्करण), स्पेनिश शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय (संदर्भ एजीएल {{0} सी 03-02), और द्वारा वित्त पोषित किया गया था। स्पैनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय (संदर्भ CTQ2010-16170)।
संस्थागत समीक्षा बोर्ड वक्तव्य:पशु प्रोटोकॉल मैड्रिड के कॉम्प्लूटेंस विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किए गए थे और वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय निर्देश 2010/63/और पशु कल्याण पर स्पेनिश कानून के पूर्ण अनुपालन में थे ( रॉयल डिक्री 53/2013, 1 फरवरी 2013)।
सूचित सहमति वक्तव्य:लागू नहीं।
डेटा उपलब्धता विवरण:इस अध्ययन के निष्कर्षों का समर्थन करने वाला डेटा उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक से उपलब्ध है।
आभार:हम केएलजेए को प्री-डॉक्टोरल अनुदान के लिए फाउंडेशन फोल्च को धन्यवाद देते हैं।
हितों का टकराव:लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।
लघुरूप
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