कवरस्लिप प्लेसमेंट द्वारा सिम्युलेटेड हाइपोपरफ्यूज़न के साथ संवर्धित रेनल ट्यूबलर कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल फैक्टर का एक विशिष्ट वितरण-1

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

टोमोको होंडा¹| योसुके हिराकावा¹ | किइची मिज़ुकामी²| तोशितादा योशिहारा²| तेत्सुहिरो तनाका¹| सेजी टोबिटा²| मासाओमी नांगाकु

सार

वृक्क ट्यूबलोइंटरस्टिटियम में क्रोनिक हाइपोक्सिया क्रोनिक की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैगुर्दाबीमारी(सीकेडी)। इसलिए हाइपोक्सिया के जवाब में ट्यूबलर हाइपोक्सिया और हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल फैक्टर (एचआईएफ) -1 की गतिविधि की जांच करना महत्वपूर्ण है। पेरिटुबुलर केशिका की दुर्लभता सीकेडी में हाइपोपरफ्यूज़न का कारण बनती है; हालांकि, HIF पर हाइपोपरफ्यूज़न के प्रभाव की शायद ही कभी जांच की गई हो। हमने मानव में कवरस्लिप प्लेसमेंट के कारण हाइपोपरफ्यूजन को प्रेरित कियागुर्दा-2 कोशिकाओं और कवरस्लिप के नीचे एक ऑक्सीजन प्रवणता का अवलोकन किया। एचआईएफ की इम्यूनोसाइटोकेमेस्ट्री -1 ने एक पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र के किनारे पर एक डोनट के आकार का गठन दिखाया, जिसे हमने "एचआईएफ-रिंग" नाम दिया। HIF- रिंग का ऑक्सीजन तनाव लगभग 4 mmHg और 20 mmHg के बीच होने का अनुमान लगाया गया था। यह परिणाम सजातीय ऑक्सीजन तनाव के साथ एनोक्सिक रेंज में एचआईएफ -1 संचय दिखाने वाले पिछले शोधों के अनुकूल नहीं था। हमने आगे एक कवरस्लिप के तहत एक पीएच ग्रेडिएंट की उपस्थिति के साथ-साथ संस्कृति माध्यम के पीएच में परिवर्तन के कारण एचआईएफ रिंग की एक पारी को देखा, यह सुझाव देते हुए कि एचआईएफ रिंग का गठन एचआईएफ -1 के दमन द्वारा किया गया था। कम पीएच के लिए। इस शोध ने प्रदर्शित किया कि HIF -1 सक्रियण हाइपोपरफ्यूज़न के साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं में शारीरिक स्थिति की नकल करता है।

कीवर्डहाइपोपरफ्यूजन, हाइपोक्सिया, हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर, ऑक्सीजन ग्रेडिएंट, पीएच

सिस्टांचे हर्बागुर्दे की बीमारी से बचाता है, नमूना लेने के लिए यहां क्लिक करें

1|परिचय

जीर्ण की घटनागुर्दाबीमारी(सीकेडी) दुनिया भर में समाज की उम्र के रूप में बढ़ रहा है (टोनेली और रिएला, 2014)। एक बार गुर्दे की क्षति एक निश्चित डिग्री तक पहुंच जाती है और अंत में अंत-चरण गुर्दे की बीमारी (ईएसआरडी) में अंतर्निहित बीमारी की परवाह किए बिना सीकेडी की प्रगति अपरिवर्तनीय है। यह परिणाम "अंतिम सामान्य मार्ग" के अस्तित्व को इंगित करता है। पिछले पैथोलॉजिकल विश्लेषणों के अनुसार, गुर्दे के कार्य में गिरावट ग्लोमेरुलर क्षति की तुलना में ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल क्षति के साथ अधिक मजबूती से संबंधित है। यह प्रदर्शित करने वाली कई रिपोर्टें आई हैं कि रीनल फाइब्रोसिस ट्यूबलोइंटरस्टिटियम में क्रोनिक हाइपोक्सिया को प्रेरित करता है, और यह ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल हाइपोक्सिया सीकेडी को बढ़ाता है और ईएसआरडी की ओर जाता है। यह साक्ष्य इंगित करता है कि ट्यूबलोइंटरस्टीशियल हाइपोक्सिया सीकेडी के अंतिम सामान्य मार्ग में एक भूमिका निभाता है (मिमुरा और नांगाकू, 2010; नांगाकू, 2006)।गुर्दाऑक्सीजन की उच्च मांग के कारण हाइपोक्सिया के लिए अतिसंवेदनशील है, और अंतःस्रावी धमनियों और नसों के बीच ऑक्सीजन शंट का अस्तित्व (नांगाकू, 2006; वेल्च एट अल।, 2001; झांग एट अल।, 2014)। इसलिए, हम मानते हैं कि वृक्क ट्यूबलोइंटरस्टिटियम में हाइपोक्सिया और हाइपोक्सिया की प्रतिक्रिया की जांच करना आवश्यक है।

जीवित जीवों में हाइपोक्सिया के लिए प्राथमिक जैविक प्रतिक्रिया हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल फैक्टर (एचआईएफ) मार्ग (हाइपोक्सिया, 2011; सेमेन्ज़ा एंड वांग, 1992; झोउ एट अल।, 2003) के माध्यम से होती है। HIF में - और -सबयूनिट होते हैं। यद्यपि -सबयूनिट संवैधानिक रूप से सक्रिय है, -सबयूनिट ऑक्सीजन की उपस्थिति में अवक्रमित हो जाता है। नॉर्मोक्सिक स्थितियों के तहत, HIF- को प्रोलिल हाइड्रॉक्सिलेज़ डोमेन (Ph.D.) द्वारा हाइड्रॉक्सिलेटेड किया जाता है, जिससे इसे वॉन हिप्पेल-लिंडौ ट्यूमर सप्रेसर (VHL) द्वारा पहचाना जा सकता है। इस मान्यता के परिणामस्वरूप प्रोटीसम में हाइड्रॉक्सिलेटेड HIF- का सर्वव्यापकता और क्षरण होता है। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, HIF- साइटोसोल में जमा हो जाता है, क्योंकि गैर-हाइड्रॉक्सिलेटेड HIF- गिरावट से बच जाता है। संचित HIF- को साइटोसोल से नाभिक में स्थानांतरित किया जाता है, जहां यह HIF- के साथ मंद हो जाता है, और एक ट्रांसक्रिप्शनल कारक के रूप में कार्य करता है, जो डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है। HIF- सबयूनिट्स- HIF-1, HIF-2, और HIF-3-रीनल ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं के तीन पहचाने गए समस्थानिकों में से HIF-1 (तनाका एट अल) को व्यक्त करने के लिए जाना जाता है। ।, 2016)। पिछले अध्ययनों ने एचआईएफ के क्षणिक या क्षेत्रीय संचय को दिखाया हैगुर्दासीकेडी (गोल्डफार्ब एट अल।, 2006; यू एट अल।, 2012) के साथ, और यह एचआईएफ सीकेडी परिवेश में कम ऑक्सीजन तनाव में सक्रिय है। सीकेडी में हाइपोक्सिया के लिए कुरूपता उन कारकों की उपस्थिति के कारण हो सकती है जो एचआईएफ मार्गों को दबाते हैं (असई एट अल।, 2016; तनाका एट अल।, 2013; थंगराजा एट अल।, 2009)। एचआईएफ सक्रियण के सुरक्षात्मक प्रभावों को कई पशु मॉडल में सूचित किया गया है, जिसमें स्ट्रेप्टोजोटोकिन-प्रेरित मधुमेह चूहों और 5/6 वें नेफरेक्टोमी चूहों (डेंग एट अल।, 2010; नॉर्डक्विस्ट एट अल।, 2015) शामिल हैं। पीएच.डी. अवरोधकों ने हाल ही में सीकेडी (अकिजावा एट अल।, 2019; चेन एट अल।, 2017, 2019; कोयने एट अल।, 2017; मियाता एट अल।, 2011; पेर्गोला एट अल) के रोगियों में गुर्दे की एनीमिया के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। ।, 2016; प्रोवेनज़ानो एट अल।, 2016)। हालांकि, गुर्दे के हाइपोक्सिया की प्रगति का विवरण, और जिस तरह से एचआईएफ संचय होता हैगुर्दासीकेडी के साथ, अस्पष्ट रहें। HIF- का ऑक्सीजन-निर्भर हाइड्रॉक्सिलेशन साइटोसोल में होता है, और इसलिए इंट्रासेल्युलर और बाह्य ऑक्सीजन तनाव को मापना महत्वपूर्ण है। माइक्रोइलेक्ट्रोड या रक्त ऑक्सीजन स्तर पर निर्भर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (बोल्ड-एमआरआई) के उपयोग सहित ऑक्सीजन तनाव को मापने के लिए कई विधियों का उपयोग किया जाता है। हमने इंट्रासेल्युलर ऑक्सीजन स्थिति (हीराकावा एट अल।, 2017; योशिहारा एट अल।, 2015) के मात्रात्मक माप के लिए फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (पीएलआईएम) का उपयोग किया। BTPDM1 एक फॉस्फोरसेंट डाई है जो इरिडियम (III) कॉम्प्लेक्स BTP, (bp)2Ir (acc) (bp=बेंजोएट-पाइरिडीन, aac=एसिटाइलसीटोन) पर आधारित है, जिसमें एक cationic dimethylamino समूह है, जो निष्क्रिय रूप से है इंट्रासेल्युलर लाइसोसोम में वितरित। इंट्रासेल्युलर ऑक्सीजन दबाव (योशिहारा एट अल।, 2015) को मापने के लिए इसे फॉस्फो-हाल की जांच के रूप में संश्लेषित किया गया था। BTPDM1 के साथ PLIM ने सामान्य चूहों के गुर्दे की सतह पर वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में ऑक्सीजन के आंशिक दबाव की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों के अधिग्रहण को सक्षम किया, जो सामान्य किडनी में भी ऑक्सीजन ढाल की उपस्थिति का संकेत देने वाला डेटा प्रदान करता है (हिराकावा एट अल।, 2018) )

जीवित अंगों में ऑक्सीजन प्रवणताएं होती हैं, जिनमें शामिल हैंगुर्दे, सामान्य परिस्थितियों में भी (हिराकावा एट अल।, 2018; कीट्ज़मैन, 2017; ज़डानोव एट अल।, 2015), और इसलिए सीकेडी में इस तरह के ग्रेडिएंट की भी उम्मीद की जा सकती है। हाइपोपरफ्यूज़न सीकेडी में माइक्रोवैस्कुलचर के दुर्लभ होने के कारण होता है, जिसमें प्रगतिशील ग्लोमेरुलर चोट के परिणामस्वरूप पेरिटुबुलर केशिका रक्त प्रवाह में कमी आती है, जिससे अंतरालीय फाइब्रोसिस बढ़ जाता है। इंटरस्टीशियल फाइब्रोसिस ट्यूबलर कोशिकाओं को ऑक्सीजन के प्रसार और आपूर्ति को बाधित करता है, और माइक्रोवैस्कुलचर के दुर्लभकरण की ओर जाता है, जो आगे चलकर ट्यूबलोइंटरस्टीशियल हाइपोक्सिया (मिमुरा और नांगाकू, 2010; नांगाकू, 2006) को बढ़ाता है। हालाँकि, हाइपोपरफ्यूजन के जैविक प्रभाव अस्पष्ट रहते हैं, क्योंकि अधिकांश अध्ययनों ने समरूप छिड़काव और ऑक्सीजन तनाव (रेक्सियस-हॉल एट अल।, 2017) की स्थितियों के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं पर हाइपोक्सिया और एचआईएफ -1 के प्रभावों की जांच की है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एक कवरस्लिप के साथ कवर किए गए मोनोलेयर्ड सुसंस्कृत कोशिकाएं संस्कृति माध्यम में प्रसार के लिए एक बाधा से प्रेरित हाइपोपरफ्यूजन का एक अच्छा मॉडल प्रदान करती हैं। प्रतिरूपित हाइपोपरफ्यूजन एक ऑक्सीजन प्रवणता के साथ जुड़ा हुआ है क्योंकि एक कवरस्लिप माध्यम के ऊपर से कोशिकाओं तक ऑक्सीजन के प्रसार को रोकता है (पिट्स एंड टॉम्ब्स, 2004; ताकाहाशी और सातो, 2010; योशिहारा एट अल।, 2015)। एक कवरस्लिप के साथ कवर किए गए सुसंस्कृत कोशिकाओं के एक मोनोलेयर में, संवर्धित कोशिकाओं में सीमित ऑक्सीजन प्रसार के कारण कवरस्लिप के किनारे से दूरी के साथ इंट्रासेल्युलर ऑक्सीजन तनाव गिरता है। नतीजतन, एक ऑक्सीजन ढाल किनारे से कवरस्लिप के केंद्र तक बनता है, और इंट्रासेल्युलर ऑक्सीजन तनाव कवरस्लिप के केंद्र में एक एनोक्सिक रेंज तक गिर सकता है (ताकाहाशी और सातो, 2010; योशिहारा एट अल।, 2015) . वर्तमान अध्ययन में, हमने एचआईएफ सक्रियण पर ध्यान केंद्रित किया और जांच की कि क्या ऑक्सीजन ढाल के साथ हाइपोपरफ्यूजन की उपस्थिति में एचआईएफ-अभिव्यक्ति में ऑक्सीजन-स्वतंत्र परिवर्तन है। चूंकि विवो में वृक्क नलिकाओं में ऑक्सीजन प्रवणता के साथ हाइपोपरफ्यूज़न मौजूद है, इसलिए कवरस्लिप मॉडल में HIF- अभिव्यक्ति पर ऑक्सीजन-स्वतंत्र प्रभावों का अवलोकन CKD में HIF- संचय की अंतर्निहित अपर्याप्तता के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

सिस्टैंच का सत्तगुर्दे के लिए

2|सामग्री और तरीके

2.1|कोश पालन

संवर्धित कोशिकाओं को 5 प्रतिशत CO2 के साथ आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया गया था। हाइपोक्सिक ऊष्मायन एक व्यक्तिगत CO2/मल्टी-गैस इनक्यूबेटर APM-30D (Astec) में किया गया था। एनोक्सिया को एनोक्सिया बैग, एनारोपैक, और एनारोबिक खेती सेट # ए -13 (मित्सुबिशी गैस केमिकल) से प्रेरित किया गया था।

एचके-2 कोशिकाएं (होमो सेपियन्स, मानवगुर्दा, पुरुष, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), सामान्य वयस्क मानव गुर्दे से एक अमर समीपस्थ नलिका उपकला कोशिका रेखा, Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम/पोषक तत्व मिश्रण F{{2} में सुसंस्कृत थे। } हैम (DMEM/F12) (D8062, सिग्मा एल्ड्रिच) जिसमें 10 सेमी कल्चर डिश में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (F7524, सिग्मा एल्ड्रिच), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (15070063, थर्मो फिशर साइंटिफिक) होता है। पारित होने के लिए, एचके -2 कोशिकाओं को ट्रिप्सिन (204-16935, वाको प्योर केमिकल इंडस्ट्रीज, लिमिटेड) से अलग कर दिया गया और 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।

हेला सर्वाइकल कैंसर कोशिकाएं और मानव भ्रूणगुर्दाकोशिकाओं 293 (HEK293) को डीएमईएम में कम (1000 मिलीग्राम / एल) ग्लूकोज (डी 6046, सिग्मा एल्ड्रिच) के साथ संवर्धित किया गया था जिसमें 10 सेमी संस्कृति डिश में 5 प्रतिशत एफबीएस था। इन कोशिकाओं को एचके -2 कोशिकाओं के रूप में पारित किया गया था।

RenaLifeTM Comp किट (LRC-LL0025, Lonza Ltd.) का उपयोग करके वृक्क समीपस्थ नलिका उपकला कोशिकाओं (RPTECs) (CC - 2553, Cambrex) को बनाए रखा गया था। पारित होने के लिए, RPTECs को ट्रिप्सिन का उपयोग करके अलग कर दिया गया, ट्रिप्सिन न्यूट्रलाइज़िंग सॉल्यूशन (CC -5002, लोन्ज़ा लिमिटेड) के साथ बेअसर कर दिया गया, और 5 मिनट के लिए 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।

2.2|एक कवरस्लिप प्लेसमेंट द्वारा हाइपोपरफ्यूजन मॉडल की स्थापना

15 मिमी व्यास (C015001, मत्सुनामी) के गोल आकार के कवरलिप्स को अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके साफ किया गया और उपयोग करने से पहले 99.5 प्रतिशत इथेनॉल में संग्रहीत किया गया। कवरस्लिप के बाहर कोशिकाओं के अवलोकन के आधार पर दो विधियों को नियोजित किया गया था।

मोनोलेयर्ड सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक कवरस्लिप और एक डिश के नीचे (चित्र S1a,b), या एक वैकल्पिक विधि (चित्र S1c) के बीच सैंडविच किया गया था, जैसा कि नीचे वर्णित है। या तो पारंपरिक या वैकल्पिक विधि को लाइव इमेजिंग के लिए हमारे कवरस्लिप मॉडल को स्थापित करने के लिए चुना गया था, चाहे ऑक्सीजन इमेजिंग हो या पीएच इमेजिंग। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) के लिए, वैकल्पिक विधि को चुना गया था, क्योंकि पारंपरिक पद्धति का उपयोग करते समय, सेल निर्धारण (चित्रा S2a) के लिए कवरस्लिप हटाने के दौरान अधिकांश कोशिकाओं को अक्सर डिश के नीचे से अलग कर दिया जाता है।

2.2.1|पारंपरिक तरीका

1 दिन पर, कोशिकाओं को 1 0 0 प्रतिशत * (लगभग 5.0 × 105/डिश) के संगम पर 27 मिमी ग्लास-आधारित डिश (3910-035, इवाकी) के तल पर रखा गया था। उन्हें डीएमईएम/एफ12 में रात भर बिना एंटीबायोटिक घोल के 10 प्रतिशत एफबीएस युक्त सुसंस्कृत किया गया। 2 दिन पर, संकेतित अवधि के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं के ऊपर एक कवरस्लिप रखा गया था (चित्र S1b)।

2.2.2|वैकल्पिक तरीका

कोशिकाओं को एक 35 मिमी-संस्कृति डिश में 1 0 0 प्रतिशत संगम (लगभग 5.0 × 105/डिश) पर दिन में एक कवरस्लिप पर रखा गया था।

1. वे DMEM/F12 में रात भर एंटीबायोटिक समाधान के बिना 10 प्रतिशत FBS युक्त सुसंस्कृत थे। 2 दिन पर, एक निर्दिष्ट अवधि (चित्रा S1c) के लिए अपनी कोशिकाओं की सतह को एक नए 27 मिमी ग्लास-आधारित डिश के नीचे से जोड़ने के लिए, कवर-स्लिप को उल्टा कर दिया गया था।

हमने 10 मिमी (CS01005, मत्सुनामी) (चित्र S2b) के व्यास के साथ गोल आकार के कवरस्लिप का उपयोग करके एक कवरस्लिप मॉडल भी बनाया।

2.3|BTPDM1 के साथ लाइव ऑक्सीजन इमेजिंग

सुसंस्कृत कोशिकाओं को 1 दिन पर तैयार किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है। 2 दिन पर, कोशिकाओं को हैंक्स बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (HBSS) (H8264, सिग्मा एल्ड्रिच) से दो बार रिंस किया गया और 500 nM BTPDM1 के साथ इनक्यूबेट किया गया, एक इरिडियम-आधारित cationic लिपोफिलिक डाई का उपयोग इंट्रासेल्युलर फॉस्फोरसेंट जांच (योशिहारा एट अल) के रूप में किया जाता है। 2015), डीएमईएम/एफ12 में फिनोल रेड (21041-025, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के बिना 30 मिनट के लिए। कोशिकाओं को एचबीएसएस से दो बार धोए जाने के बाद, उन्हें एक कवरस्लिप और एक डिश के नीचे के बीच सैंडविच किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है। एक कवरस्लिप के साथ कवर की गई संवर्धित कोशिकाओं में BTPDM1 से फॉस्फोरेसेंस की तीव्रता को एक उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके देखा गया था, और BTPDM1 फॉस्फोरेसेंस (हीराकावा एट अल।, 2015) को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, BZ-X710 (कीनेस कॉर्पोरेशन) का उपयोग करके पता लगाया गया था। उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से प्राप्त छवियों को BZ-X विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चमक और कंट्रास्ट के लिए समायोजित किया गया था।

2.4|immunocytochemistry

एक कवरस्लिप पर कोशिकाओं को 200 माइक्रोन पिमोनिडाज़ोल एचसीएल (एचपी 3-100, हाइपोक्सीप्रोब, इंक।) के साथ डीएमईएम / एफ 12 में 1 घंटे के लिए फिनोल लाल के बिना सुसंस्कृत किया गया था, जिसके बाद कवरस्लिप को बदल दिया गया था और एक कवर ग्लास डिश से जोड़ा गया था, जैसा कि पहले वर्णित। कोशिकाओं को तब एक निर्दिष्ट अवधि के लिए फिनोल रेड के बिना DMEM/F12 में सुसंस्कृत किया गया था। जब पिमोनिडाज़ोल काउंटरस्टेनिंग का उपयोग नहीं किया गया था, तो पिमोनिडाज़ोल के साथ प्रीट्रीटमेंट को छोड़ दिया गया था।

संस्कृति की अवधि पूरी होने के बाद, प्रत्येक कवरस्लिप को एकत्र किया गया था, और कोशिकाओं को तुरंत बर्फ पर मेथनॉल / एसीटोन (1: 1) के साथ तय किया गया था, जहां वे 30 मिनट तक रहे। Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (PBS) (D5652, सिग्मा एल्ड्रिच) के साथ दो बार धोने के बाद, कोशिका झिल्ली को 30 मिनट के लिए पारगम्य किया गया, 30 मिनट के लिए 5 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) (A3059, सिग्मा एल्ड्रिच) के साथ ऊष्मायन किया गया, और बाद में 10 मिनट के लिए सीरम मुक्त प्रोटीन ब्लॉक (X0909, DAKO) के साथ। कोशिकाओं को पहले एंटीबॉडी के साथ और बाद में एक दूसरे, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। पहले एंटीबॉडी की सूची तालिका S1 में दी गई है। FITC-स्वाइन पॉलीक्लोनल एंटी-खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन (F0205, 1:20 कमजोर पड़ने, DAKO) को पहले एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था यदि मेजबान एक खरगोश था। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 594 स्ट्रेप्टाविडिन (S11227, 1:500 कमजोर पड़ने, थर्मो फिशर साइंटिफिक) को पहले एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था यदि मेजबान एक माउस था, उसके बाद बायोटिनाइलेटेड एंटी-माउस आईजीजी (एच प्लस एल) (बीए {{23}) }, 1:1000 कमजोर पड़ने, वेक्टर प्रयोगशालाओं), दूसरे एंटीबॉडी के रूप में। प्रत्येक नमूने के लिए बिस्बेंजिमाइड एच 33342 ट्राइहाइड्रोक्लोराइड (बी 2261, सिग्मा एल्ड्रिच) का उपयोग करके परमाणु धुंधलापन किया गया था।

निम्नलिखित फिल्टर के साथ एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, BZ-X710 (कीनेस कॉर्पोरेशन) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट संकेतों को देखा गया: टेक्सास रेड 560/40 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (पूर्व), 630/75 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (ईएम), जीएफपी ( उदा: 470/40 एनएम, ईएम: 525/50 एनएम), और डीएपीआई (पूर्व: 360/40 एनएम, ईएम: 460/50 एनएम)। छवियों को BZ-X विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके चमक और कंट्रास्ट के लिए समायोजित किया गया था।

2.5|कोबाल्ट क्लोराइड से उपचारित HK-2 कोशिकाओं के HIF का ICC

वैकल्पिक विधि को कोबाल्ट क्लोराइड से उपचारित एचके-2 कोशिकाओं के एक कवरस्लिप मॉडल का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया गया था। एचके -2 कोशिकाओं को 1 दिन के कवरस्लिप पर अर्ध-संगम घनत्व (2.5 × 105 / डिश) पर रखा गया था और 16 घंटे के लिए 300 माइक्रोन कोबाल्ट क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (सी 8661, सिग्मा एल्ड्रिच) के साथ इलाज किया गया था। दिन 2। दिन 3 पर, कवरस्लिप को 3 घंटे के लिए एक नए 27 मिमी ग्लास-आधारित डिश के नीचे सेल सतहों को संलग्न करने के लिए उलटा किया गया था, और एचआईएफ के आईसीसी का प्रदर्शन किया गया था।

2.6|पश्चिमी सोख्ता

विभिन्न ऑक्सीजन तनावों के तहत और विभिन्न पीएच स्तरों पर एचआईएफ {{0}} संचय की जांच करने के लिए, 1.0 × 106 एचके-2 कोशिकाओं प्रति 10 सेमी संस्कृति डिश या तो नॉर्मोक्सिया, 2 प्रतिशत ऑक्सीजन, 1 प्रतिशत ऑक्सीजन, या एनोक्सिया, 5 घंटे के लिए, या DMEM/F12 में pH 7.4, pH 6.0, या pH 5.0 पर 5 h के लिए इनक्यूबेट किया गया था।

इन कोशिकाओं को RIPA बफर में 5 0 mM Tris-buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 w/v प्रतिशत सोडियम से युक्त किया गया था। डीऑक्सी-कोलेट, 0.1 w/v प्रतिशत SDS, और 1.0 w/v प्रतिशत NP40।

पश्चिमी सोख्ता के लिए, एसडीएस नमूना बफर जिसमें {0}}.35 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8), 10 प्रतिशत एसडीएस, 36 प्रतिशत ग्लिसरॉल, 0.012 प्रतिशत ब्रोमोफेनॉल नीला, और 0.1 एम डाइथियोथेरिटोल शामिल हैं। (डीटीटी) प्रोटीन में जोड़ा गया था। एसडीएस नमूना बफर वाले प्रोटीन को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री पर उबालकर सुखाया गया।

वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन को 1 0 प्रतिशत एसडीएस पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर अलग किया गया था। प्रोटीन को तब ट्रांस-ब्लॉट® का उपयोग करके ट्रांसफर बफर (48 मिमी ट्रिस-बेस बफर, 39 मिमी ग्लाइसिन, 0.04 प्रतिशत एसडीएस, और 20 वी / वी प्रतिशत मेथनॉल) में एक एमर्सहम टीएम हाइबॉन्ड टीएम पीवीडीएफ झिल्ली (10600023, जीई हेल्थकेयर) पर स्थानांतरित किया गया था। TurboTM ट्रांसफर सिस्टम (बायो-रेड)। झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी, एंटी-एचआईएफ 1 एंटी-बॉडी (एनबी 100-134, 1: 500 कमजोर पड़ने, नोवस बायोलॉजिकल, आरआरआईडी: एबी _350071), और एंटी-एक्टिन एंटीबॉडी (ए 2066) के साथ कमरे के तापमान पर लगाया गया था। , 1:2000 कमजोर पड़ने, सिग्मा एल्ड्रिच, आरआरआईडी: एबी _476693), और बाद में माध्यमिक एंटीबॉडी में, पॉलीक्लोनल बकरी एंटी-खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन / एचआरपी (पी0448, 1:10000 कमजोर पड़ने, डको, आरआरआईडी: एबी {{26 }}). पियर्स टीएम ईसीएल प्लस वेस्टर्न ब्लॉटिंग सबस्ट्रेट (32132, थर्मोफिशर साइंटिफिक) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक Luminoimage विश्लेषक ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare) का उपयोग करके केमिलुमिनेसेंस देखा गया। कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग करके पुनरुत्पादकता की पुष्टि की गई। नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ इमेजजे सॉफ्टवेयर (श्नाइडर एट अल।, 2012) का उपयोग करके बैंड की तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी।

2.7|लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख

समरूप हाइपोक्सिक संस्कृति ऊष्मायन में HIF1 संचय को मापने के लिए एक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख की गई थी। हमने पहले एक हाइपोक्सिया-उत्तरदायी तत्व (एचआरई) द्वारा संचालित एक टैग ल्यूसिफरेज जीन का निर्माण किया और हाइपोक्सिया-रिस्पॉन्सिव रिपोर्टर वेक्टर (ट्रांसजीन कंस्ट्रक्शन) विकसित किया। इसका निर्माण चूहे के संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर जीन उप-क्लोन से एचआरई की अग्रानुक्रम प्रतियों से एएम सीएमवी-प्रमोटर-ल्यूसिफरेज ट्रांसक्रिप्शन यूनिट (प्री-ल्यूक) (चियांग एट अल।, 2011; तनाका एट) के 5' क्षेत्र में किया गया था। अल।, 2004)।

एचके {{0}} 1.0 × 105 प्रति कुएं की सांद्रता पर कोशिकाओं को 12-वेल कल्चर प्लेट्स (150628, थर्मो फिशर साइंटिफिक) में तैयार किया गया था। कोशिकाओं को 500 एनजी पीजीएल 3- बेसिक एचआरई-ल्यूसिफरेज वैक्टर और 30 एनजी पीआरएल-एसवी 40 रेनिला ल्यूसिफरेज कंट्रोल वैक्टर (पेमरेगा) के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, जिसमें 2 μl फ़्यूजेन® एचडी ट्रांसफ़ेक्शन रिएजेंट (ई2311, क्रोमेगा) का उपयोग किया गया था। कुंआ। एचके -2 कोशिकाओं को 500 एनजी ऑफपीजीएल 3- के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था 3- बेसिक जुगनू ल्यूसिफरेज वैक्टर और 30 एनजी ऑफ पीआरएल-एसवी 40 रेनिला ल्यूसिफरेज कंट्रोल वैक्टर (पेमरेगा) को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 5 घंटे के लिए नॉर्मोक्सिया, 2 प्रतिशत हाइपोक्सिया, 1 प्रतिशत हाइपोक्सिया या एनोक्सिया बैग के तहत ऊष्मायन किया गया था। दोहरी ल्यूसिफरेज परख के लिए कोशिकाओं को निष्क्रिय प्रोटीन लसीका बफर के 100 μl का उपयोग करके काटा गया था। माप के लिए एक LB9507 ल्यूमिनोमीटर (ईजी और बर्थोल्ड) का उपयोग किया गया था। अभिकर्मक दक्षता के लिए सही करने के लिए, जुगनू ल्यूसिफरेज प्रकाश इकाई के सापेक्ष मूल्य को रेनिला ल्यूसिफरेज से विभाजित किया गया था।

ed . के लिए सिस्टैंच

2.8|एपोप्टोसिस का विश्लेषण

सुसंस्कृत कोशिकाओं को 0 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट, 1 घंटे, 3 घंटे, 6 घंटे और 24 घंटे के लिए कवरस्लिप के साथ कवर किया गया था, और फिर ट्रिप्सिन का उपयोग करके एकत्र किया गया था। 30 मिनट के लिए 3 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्साइड (081- 04215, वाको प्योर केमिकल इंडस्ट्रीज, लिमिटेड) से उपचारित कोशिकाओं को एपोप्टोटिक नियंत्रण के रूप में तैयार किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, म्यूज़न ™ सेल एनालाइज़र (मिलिपोर) में म्यूज़न एनेक्सिन वी और डेड सेल किट (एमसीएच 100105, मिलिपोर) का उपयोग करके एपोप्टोसिस का मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था।

2.9|मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर)

कुल आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण क्रमशः RNAiso Plus (9109, Takara) और PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया। सीएफ़एक्स कनेक्ट रियल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड) में थंडरबर्ड SYBR qPCR मिक्स (QPS - 201, Toyobo) का उपयोग करके रीयल-टाइम PCR का प्रदर्शन किया गया। प्रतिलेख स्तर -actin mRNA अभिव्यक्ति के स्तर के लिए सामान्यीकृत किए गए थे। जीन-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके तीन प्रतियों में qRT-PCR का प्रदर्शन किया गया। HIF-1 को आगे, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ और रिवर्स, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था। -एक्टिन को आगे, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′, और रिवर्स 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था।

2.10|SiRNA के साथ अभिकर्मक

आरएनएआई-प्रेरित एचआईएफ -1 एचके -2 कोशिकाओं में नॉकडाउन की जांच करने के लिए, 5.0 × 104 एचके-2 प्रति कुएं कोशिकाओं को छह-अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार किया गया था। दो प्रकार के RNAi-HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, थर्मो फिशर साइंटिफिक] और siHIF-1 #2 [HSS104775, थर्मोफिशर साइंटिफिक])- का प्रयोग Lipofectamine RNAiMAX के साथ किया जाता है। अभिकर्मक अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक)। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, Stealth RNAi™ siRNA नेगेटिव कंट्रोल मेड GC डुप्लेक्स #3 (12935-113) का उपयोग किया गया; प्रत्येक siRNA के 1.5 μl और 5 μl RNAiMAX मिश्रित किए गए थे। siRNA- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक (1 प्रतिशत O2) स्थितियों के तहत ऊष्मायन किया गया था और RNA निकाला गया था। क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके एचआईएफ -1 नॉकडाउन की दक्षता की जांच की गई।

2.11|PH ग्रेडिएंट के प्रभावों की लाइव इमेजिंग

हमने एक कवरस्लिप के तहत जीवित कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर पीएच ग्रेडिएंट की कल्पना की। कवरस्लिप मॉडल को लागू करने से पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को pHrodo Green AM इंट्रासेल्युलर pH इंडिकेटर (p35373, ThermoFisher वैज्ञानिक) के साथ इलाज किया गया था। एक GFP फिल्टर के साथ एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, BZ-X710 (कीनेस कॉर्पोरेशन) का उपयोग एक कवरस्लिप के तहत प्रतिदीप्ति तीव्रता ढाल के समय संक्रमण का निरीक्षण करने के लिए किया गया था।

2.12|HIF रिंग का मात्रात्मक विश्लेषण

2.12.1|HIF रिंग की साइट

हमने इमेजजे का उपयोग करते हुए कवरस्लिप किनारों से एचआईएफ के छल्ले और पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्रों की दूरी को निम्नानुसार मापा। HIF रिंग और पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव सर्कल के बाहरी और आंतरिक सर्कल के क्षेत्रों को निर्धारित किया गया था, और प्रत्येक सर्कल की त्रिज्या की गणना की गई थी। कवरस्लिप किनारे से इसकी दूरी की गणना करने के लिए प्रत्येक मान को 7.5 मिमी से घटाया गया था, जो कि 15 मिमी कवरस्लिप का त्रिज्या है। प्रत्येक स्थिति में HIF के ICC के तीन स्वतंत्र प्रयोग किए गए।

2.12.2|एचआईएफ रिंग की परिभाषा

हमने नॉर्मोक्सिया और न्यूट्रल पीएच के तहत इनक्यूबेट किए गए कवरस्लिप मॉडल से प्राप्त फ्लोरोसेंट छवियों का इस्तेमाल किया। हमने एचआईएफ रिंग की साइट और उसके बाहर और अंदर को 2.5-3 के रूप में परिभाषित किया। -1.0 स्केल (1.12– 1.35 मिमी), और 5.0-5.5 स्केल (2.24–2.47 मिमी), क्रमशः, इमेजजे का उपयोग करके कवरस्लिप किनारे से। हमने प्रति नमूना HIF-1 संकेतों की पांच साइटों को मापा और औसत की गणना की। HIF के ICC के तीन स्वतंत्र प्रयोग किए गए।

सिस्टैंच एक्सट्रेक्ट पाउडर

2.13|PLIM छवि द्वारा ऑक्सीजन के दबाव का मापन

2.13.1|ऑक्सीजन के दबाव को मापने के लिए कैलिब्रेशन लाइन का निर्माण

हमारी पिछली रिपोर्ट (योशिहारा एट अल।, 2015) में वर्णित विधि के आधार पर एचके -2 कोशिकाओं का अंशांकन वक्र बनाया गया था। एचके -2 30 मिनट के लिए 500 एनएम बीटीपीडीएम 1 से भरी हुई कोशिकाओं को एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से लैस ऑक्सीजन-एकाग्रता-परिवर्तनीय मल्टी-गैस इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया गया था जो आजीवन माप प्रणाली से जुड़ा था। स्टर्न-वोल्मर विश्लेषण पर आधारित एक कैलिब्रेशन लाइन का निर्माण कई अलग-अलग ऑक्सीजन तनावों के तहत एचके -2 कोशिकाओं के फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम (पीएल) का उपयोग करके किया गया था।

समीकरण (1)

जहां p, pO2 में PL का प्रतिनिधित्व करता है, 0 deoxygenation में PL का प्रतिनिधित्व करता है, kq शमन दर स्थिरांक का प्रतिनिधित्व करता है, और pO2 ऑक्सीजन के आंशिक दबाव का प्रतिनिधित्व करता है। इस अंशांकन लाइन का उपयोग करके, पीएल से ऑक्सीजन दबाव की गणना की जा सकती है।

2.13.2|कवरस्लिप मॉडल की PLIM छवि

एचके -2 30 मिनट के लिए 500 एनएम बीटीपीडीएम 1 से भरी हुई कोशिकाओं को तैयार किया गया था। एक कवरस्लिप मॉडल का निर्माण और संवर्धन एक O2 एकाग्रता-परिवर्तनीय मल्टी-गैस इनक्यूबेटर में किया गया था जो एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से लैस है, जो आजीवन माप प्रणाली से जुड़ा है।

फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (पीएलआईएम) छवियों को एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक कन्फोकल स्कैनिंग सिस्टम (हीराकावा एट अल।, 2018) से लैस किया गया था। 21 प्रतिशत O2 या 4 प्रतिशत O2 में 30 मिनट ऊष्मायन के बाद PLIM छवियां प्राप्त की गईं। कवरस्लिप में पीएल में भिन्नता को ध्यान में रखते हुए, औसत पीएल निर्धारित करने के लिए, कवरस्लिप किनारे के पास ऊपरी, नीचे, बाएं और दाएं क्षेत्रों से प्रति नमूना चार पीएलआईएम छवियां ली गईं।

2.13.3|PLIM छवि में HIF रिंग की पहचान

पिमोनिडाजोल 10 एमएमएचजी ऑक्सीजन दबाव से नीचे सकारात्मक था। कैलिब्रेशन लाइन के अनुसार 10 एमएमएचजी ऑक्सीजन दबाव के पीएल के बराबर 4034.6 एनएस था, इसलिए पीएलआईएम छवि में पिमोनिडाज़ोल सर्कल की बाहरी रेखा की पहचान की जा सकती है। इसके बाद, पीएलआईएम छवि में बाहरी और आंतरिक एचआईएफ रिंगों की साइटों को दूरी मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग करके पाया जा सकता है। हमने एचआईएफ रिंग के बराबर औसत पीएल की सीमा को 21 प्रतिशत ओ2 और 4 प्रतिशत ओ2 में मापा।

2.13.4|HIF रिंग के ऑक्सीजन दबाव का मापन

हमने अंशांकन रेखा का उपयोग करते हुए, PLs से HIF रिंग के ऑक्सीजन दबाव की सीमा की गणना की। SPCImage 5.0 (बेकर और हिकल GmbH) का उपयोग करके PLIM छवियों का विश्लेषण किया गया।

2.14|सांख्यिकीय विश्लेषण

डननेट के परीक्षण का उपयोग प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों की तुलना करने के लिए किया गया था, और मूल्यों <.05 को="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" अंतरों="" को="" इंगित="" करने="" के="" लिए="" माना="" जाता="" था।="" छात्र="" के="" t="" -ests="" का="" उपयोग="" तीन="" या="" अधिक="" समूहों="" की="" तुलना="" करने="" के="" लिए="" किया="" गया="" था,="" और="" bonferroni="" समायोजित="" p="" -value="" लागू="" किया="" गया="" था।="" सभी="" सांख्यिकीय="" विश्लेषण="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas)="" का="" उपयोग="" करके="" किए="" गए="" थे।="" मानों="" को="" सामान्य="" रूप="" से="" वितरित="" जनसंख्या="" से="" व्युत्पन्न="" माना="" जाता="" था,="" और="" उन्हें="" माध्य="" ±="" मानक="" विचलन="" (sd)="" के="" रूप="" में="" दिखाया="" जाता="">

एक सिस्टैंच क्या है?

3|परिणाम

3.1|हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में ऑक्सीजन ग्रेडिएंट फॉर्मेशन

हमने फॉस्फोरेसेंस का उपयोग करके सीधे ऑक्सीजन तनाव का आकलन करके कवरस्लिप प्लेसमेंट से प्रेरित हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में ऑक्सीजन ढाल के अस्तित्व की पुष्टि की। फॉस्फोरेसेंस तीव्रता माप ऑक्सीजन दबाव में अनुमानित प्रवृत्ति की भविष्यवाणी कर सकता है (हीराकावा एट अल।, 2015; योशिहारा एट अल।, 2015)। हमने BTPDM1 के साथ इलाज किए गए HK -2 कोशिकाओं के एक कवरस्लिप मॉडल की फॉस्फोरेसेंस तीव्रता का अवलोकन किया। फॉस्फोरेसेंस तीव्रता की छवियों ने कवरस्लिप के अंदर अधिकांश क्षेत्र में हाइपोक्सिया दिखाया, लेकिन किनारे के पास कोई हाइपोक्सिया नहीं, एक अवलोकन जो एचके -2 कोशिकाओं में कवरस्लिप के किनारे के आसपास ऑक्सीजन ढाल के अस्तित्व का सुझाव देता है। कवरस्लिप (चित्र 1क)। चूंकि फॉस्फोरेसेंस की तीव्रता जांच की एकाग्रता पर निर्भर करती है, और उत्तेजना समय पर, फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम (पीएल) माप ऑक्सीजन दबाव (योशिहारा एट अल।, 2015) के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी होता है। इस प्रकार, एक coverslip के किनारे के आसपास सुसंस्कृत कोशिकाओं के ऑक्सीजन तनाव की मात्रात्मक माप के लिए, हमने 30 मिनट (चित्रा 1बी) के लिए एक coverslip के साथ कवर एचके -2 कोशिकाओं की पीएलआईएम छवियां प्राप्त कीं। कवरस्लिप किनारे से दूरी बढ़ने पर PL बढ़ा दिया गया। हमने पुष्टि की कि कैलिब्रेशन लाइन (चित्रा S3) का उपयोग करके गणना की गई ऑक्सीजन तनाव, कम हो गई क्योंकि कवरस्लिप किनारे से दूरी बढ़ गई, जो कवरस्लिप (चित्रा 1 सी) के किनारे के आसपास ऑक्सीजन ढाल के अस्तित्व के लिए सबूत प्रदान करती है। फॉस्फोरेसेंस तीव्रता के अस्थायी प्रोफाइल की जांच से संकेत मिलता है कि कवरस्लिप प्लेसमेंट के 10 मिनट बाद ऑक्सीजन ढाल बनना शुरू हो गया

(चित्र 1d)।

3.2|हाइपोपरफ्यूज़न मॉडल में अद्वितीय HIF-1 वितरण,"HIF रिंग"

हमने ऑक्सीजन ग्रेडिएंट के साथ हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में HIF-1 वितरण की जांच की। HK-2 कोशिकाओं में HIF-1 के ICC ने पिमोनिडाज़ोल-पॉज़िटिव क्षेत्र के किनारे पर एक डोनट के आकार की वृद्धि दिखाई, जिसे हम "HIF रिंग" (चित्र 2a) कहते हैं। HIF -1 सिग्नल की तीव्रता HIF रिंग पर इसके आंतरिक या बाहरी क्षेत्रों (चित्र 2b) की तुलना में काफी अधिक थी। एक अन्य HIF -1 एंटीबॉडी (चित्र S4a) या अन्य ट्यूबलर सेल लाइनों (चित्र S4b, c) के साथ ICC का उपयोग करके इस घटना की पुष्टि की गई थी। हमने अन्य प्रकार की सुसंस्कृत कोशिकाओं, जैसे हेला सर्वाइकल कैंसर कोशिकाओं में एचआईएफ -1 का आईसीसी विश्लेषण भी किया। हालाँकि, इन कोशिकाओं के एक आवरण के कमजोर आसंजन ने HIF -1 वितरण का विस्तृत मूल्यांकन कठिन बना दिया, हमने हेला कोशिकाओं (चित्रा S4d) में HIF -1 के डोनट के आकार की वृद्धि देखी।

HIF रिंग और पिमोनिडाज़ोल-पॉज़िटिव क्षेत्र ने कवरस्लिप प्लेसमेंट के कई घंटे बाद बनना शुरू किया, और HIF रिंग 3 h (चित्र 2c) द्वारा स्थिर दिखाई दी। HIF -1 नॉकडाउन के परिणामस्वरूप HIF रिंग (चित्र 2d, चित्र S4e) सहित HIF -1 संकेत गायब हो गया, यह दर्शाता है कि HIF रिंग HIF -1 पर निर्भर थी।

इस संभावना की जांच करने के लिए कि HIF रिंग का निर्माण ऑक्सीजन पर निर्भर है, हमने विभिन्न ऑक्सीजन तनावों के साथ ऊष्मायन के तहत कवरस्लिप मॉडल में HIF-1 के वितरण की जांच की। हमने कवरस्लिप मॉडल बनाने के तुरंत बाद एक डिश को विभिन्न ऑक्सीजन तनावों के साथ हाइपोक्सिक कक्षों में रखा। हाइपोक्सिक ऊष्मायन के दौरान, हमने देखा कि एचआईएफ रिंग और पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र दोनों बाहर की ओर विस्तारित होते दिखाई दिए (चित्र 3ए)। हमने नॉर्मोक्सिया, 4 प्रतिशत O2 और 1 प्रतिशत O2 ऊष्मायन के तहत एक कवरस्लिप किनारे से प्रत्येक HIF रिंग और पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र की दूरी को मापा। आसपास के ऑक्सीजन तनाव में कमी (चित्रा 3 बी) के रूप में एचआईएफ रिंग और पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र दोनों का विस्तार बाहर की ओर हुआ। इन परिणामों ने संकेत दिया कि HIF वलय HIF-1 और ऑक्सीजन तनाव पर निर्भर था।

यह पुष्टि करने के लिए कि डोनट के आकार का संचय HIF की एक विशिष्ट घटना है, हमने कवरस्लिप मॉडल में हाउसकीपिंग जीन के साथ ICC का प्रदर्शन किया। GAPDH और एक्टिन संकेतों को एक कवरस्लिप के पूरे क्षेत्र में बनाए रखा गया था और HIF रिंग के क्षेत्र और अन्य क्षेत्रों (चित्र S5a, b) के बीच तुलनीय थे।

3.3|HIF रिंग के ऑक्सीजन दबाव की सीमा का मापन

हमने एचआईएफ के वलय के आकार की वृद्धि की पुष्टि की -1 एक आवरण के साथ कवर की गई सुसंस्कृत कोशिकाओं में संचय, ऑक्सीजन तनाव पर निर्भर एक घटना। शामिल ऑक्सीजन तनाव की सीमा निर्धारित करने के लिए, हमने फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम तकनीक का उपयोग करके HIF रिंग के ऑक्सीजन दबाव का विश्लेषण किया। हमने 21 प्रतिशत ओ2 या 4 प्रतिशत ओ2 (चित्रा 4ए) में 3 0 मिनट ऊष्मायन के बाद कवरस्लिप मॉडल की पीएलआईएम छवियां प्राप्त कीं। एचआईएफ (चित्रा 3 बी) के आईसीसी में पिमोनिडाज़ोल सर्कल के किनारे पर गठित एचआईएफ रिंग। हमने पीएलआईएम छवि में उस साइट की पहचान की जो एचआईएफ के आईसीसी में पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र के बराबर थी और बाद में एचआईएफ रिंग से दूरी डेटा के मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग करते हुए एचआईएफ रिंग (चित्रा 4 बी) के अनुरूप साइट की पहचान की। पिमोनिडाजोल-पॉजिटिव एरिया (चित्र 3बी)। हमने HIF रिंग के PLs की रेंज भी मापी और फिर 21 प्रतिशत O2 (4.20 [3.46–4.97] ~ 35.9 [28.5–44.9] mmHg) में HIF रिंग के ऑक्सीजन दबाव की गणना करने के लिए एक कैलिब्रेशन लाइन (चित्र S3) का उपयोग किया। , और 4 प्रतिशत O2 (2.19 [0.21–4.32] ~ 20.4 [17.1–24.1] mmHg) (चित्र 4c)।

3.4|HIF-1 सजातीय ऑक्सीजन तनाव के तहत संचय

जबकि एक कवरस्लिप मॉडल में HIF रिंग के बाहर HIF-1 के कमजोर संकेतों को अपर्याप्त हाइपोक्सिया के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, रिंग के अंदर, जहां HIF-1 को कम ऑक्सीजन तनाव द्वारा अधिक दृढ़ता से सक्रिय किया जाना चाहिए था, होना चाहिए एक ऑक्सीजन-स्वतंत्र घटना द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। केवल हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में होने वाले एनोक्सिक क्षेत्र में एचआईएफ -1 के अधिकतम संचय की कमी का कारण बनने वाली घटनाओं की जांच करने के लिए, हमने जांच की कि क्या ऊष्मायन के तहत ऑक्सीजन तनाव और एचआईएफ -1 संचय के बीच एक विपरीत संबंध था। सजातीय ऑक्सीजन तनाव के साथ। विभिन्न सजातीय ऑक्सीजन तनावों के तहत सेल lysates के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने एनोक्सिक ऊष्मायन (चित्रा 5 ए) के दौरान एचआईएफ -1 संचय में वृद्धि दिखाई। एचआरई-लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख ने यह भी संकेत दिया कि सजातीय ऑक्सीजन तनाव (चित्रा 5 बी) की स्थितियों के तहत एचआईएफ -1 संचय को कम ऑक्सीजन तनाव के साथ बढ़ाया गया था। इन परिणामों ने संकेत दिया कि एचआईएफ -1 का संचय ऑक्सीजन तनाव-निर्भर था, जिसमें अधिकतम संचय एनोक्सिक रेंज में देखा गया था। HIF-1 की विशेषताएं हाइपोपरफ्यूज़न मॉडल और समरूप ऑक्सीजन तनाव वाले मॉडल के बीच भिन्न होनी चाहिए। हमने अनुमान लगाया कि इस हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में एचआईएफ -1 संचय की अनूठी घटना ऑक्सीजन तनाव के अलावा किसी अन्य कारक द्वारा निर्धारित की जा सकती है।

3.5|एचआईएफ रिंग गठन पीएचडी से स्वतंत्र था

हमने जांच की कि क्या HIF-1 गिरावट, HIF-रिंग निर्माण का एक संभावित तंत्र, HIF रिंग के अंदर अपग्रेड किया गया था। यह विचार अमान्य लग रहा था, क्योंकि पीएच.डी. द्वारा हाइड्रॉक्सिलेशन, एचआईएफ गिरावट की दर-सीमित प्रक्रिया, को सब्सट्रेट के रूप में ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। कोबाल्ट क्लोराइड व्यापक रूप से एक रासायनिक HIF स्टेबलाइजर के रूप में उपयोग किया जाता है। हमने कोबाल्ट क्लोराइड से उपचारित एचके -2 कोशिकाओं के एक कवरस्लिप मॉडल का निर्माण किया और एचआईएफ का आईसीसी विश्लेषण किया। HIF -1 संकेत HIF रिंग के अंदर नहीं बढ़ा, जो रिंग के बाहर HIF -1 के बढ़े हुए सिग्नल (चित्र 6c) के कारण अस्पष्ट हो गया। PHD2 के नॉकडाउन के साथ HK -2 कोशिकाओं का ICC, जिसे सेल कल्चर प्रयोगों में प्राथमिक HIF प्रोलिल हाइड्रॉक्सिलेज़ माना जाता है (स्ट्रोविट्ज़की एट अल।, 2019), इसी तरह के परिणाम (चित्रा S6) का उत्पादन किया। इन परिणामों ने संकेत दिया कि HIF गिरावट का PHD-VHL अक्ष HIF रिंग गठन से असंबंधित था।

3.6|एचआईएफ पर पीएच का प्रभाव-1 संचय

पिछली रिपोर्ट में कार्डिएक मायोसाइट्स के एक कवरस्लिप मॉडल के उपयोग का वर्णन किया गया था, जिसमें कवरस्लिप (पिट्स एंड टॉम्ब्स, 2004) के अंदर पीएच में गिरावट थी। हमने एक कवरस्लिप के तहत पीएच की जांच की और एचआईएफ रिंग गठन पर इसके प्रभाव की जांच की। हमने एक इंट्रासेल्युलर पीएच संकेतक के साथ एचके -2 कोशिकाओं का इलाज किया, जिसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं में पीएच के मूल्यांकन की अनुमति देती है। लाइव इमेजिंग से पता चला है कि अधिकांश आंतरिक क्षेत्र में पीएच कम हो गया है, लेकिन कवरस्लिप के किनारे के पास नहीं, कवरस्लिप मॉडल (चित्रा 6ए) में किनारे के आसपास पीएच ढाल के अस्तित्व का सुझाव देता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता और एक कवरस्लिप किनारे से दूरी के बीच सहसंबंध के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला है कि दूरी बढ़ने के साथ पूर्व को ऊंचा किया गया था, एक अवलोकन जो कवरस्लिप किनारे (चित्रा 6 बी) के आसपास पीएच और ऑक्सीजन ग्रेडिएंट के अस्तित्व का समर्थन करता था। सजातीय ऑक्सीजन सांद्रता के तहत सेल lysates के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में पाया गया कि पीएच 5.0 माध्यम के साथ ऊष्मायन हाइपोक्सिक स्थितियों (चित्रा S7a-d) के तहत HIF -1 संचय को दबा देता है। हमने यह भी पुष्टि की कि विभिन्न पीएच स्थितियों के तहत हाइपोक्सिया के तहत एचआईएफ -1 संचय पीएच 6.0 (चित्रा S8a-c) से कम हो गया।

एक रिपोर्ट ने लगभग 6.0 के पीएच पर, हल्के अम्लीय स्थितियों के महत्व पर बल दिया। इस अध्ययन के अनुसार, हाइपोक्सिया के बाद पुन: ऑक्सीकरण ने मीडिया को अम्लीकृत कर दिया, जिससे वीएचएल के न्यूक्लियर सीक्वेस्ट्रेशन का कारण बना। बदले में, C2C12 मायोट्यूब, PC12 न्यूरॉन्स, और 786-0 वृक्क कैंसर कोशिकाओं (मेखाइल एट अल।, 2004) में HIF गिरावट को रोका गया। हमारे अध्ययन में, एचआईएफ -1 संचय वाले क्षेत्रों और जिसमें इसे दबा दिया गया था, के बीच ट्यूबलर कोशिकाओं में वीएचएल वितरण में कोई बदलाव नहीं हुआ था, एक कवरस्लिप मॉडल में पीएच मान के साथ 5.0 से 7.4 (चित्र S9a-c)। ट्यूबलर कोशिकाओं को पीएच स्थितियों (बर्क एट अल।, 1999; पावुलुरी एट अल।, 2019; रघुनंद एट अल।, 2003) की एक विस्तृत श्रृंखला के संपर्क में लाया जाता है, इसलिए हमने विभिन्न पीएच के मीडिया में एचआईएफ रिंग की भिन्नता की जांच की। 5.0 और 8.5 के बीच मान। एचआईएफ रिंग मीडिया में पीएच 8.5 और 7.4 (चित्रा 6सी) के साथ स्पष्ट रूप से देखी गई थी। HIF वलय भी pH 6.5 पर मौजूद था लेकिन अस्पष्ट था (चित्र 6c)। HIF -1 सिग्नल को एक कवरस्लिप के पूरे क्षेत्र में pH 5.0 पर देखा गया था। (चित्र 6c)। हमने एचआईएफ रिंग और पिमोनिडाजोल-पॉजिटिव एरिया (चित्रा 7 ए) के किनारे के बीच स्थितीय संबंध का और अधिक मात्रात्मक विश्लेषण किया और पाया कि पीएच के आधार पर रिंग की स्थिति भिन्न होती है। पीएच 7.4 की तुलना में आंतरिक-वृत्त का पीएच 6.5 पर विस्तार करने की प्रवृत्ति थी, जबकि बाहरी सर्कल पीमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र (चित्रा 7बी, सी) के किनारे के आधार पर पीएच 8.5 पर काफी सिकुड़ गया था। हमने यह भी पुष्टि की कि हाउसकीपिंग जीन की गतिविधियों को अम्लीय ऊष्मायन (चित्रा S10) के तहत एक कवरस्लिप मॉडल में बनाए रखा गया था। इसलिए, एचआईएफ रिंग गठन के अंतर्निहित तंत्र में पीएच एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता प्रतीत होता है।

4|बहस

इस अध्ययन में, हमने कवरस्लिप प्लेसमेंट से प्रेरित हाइपोपरफ्यूज़न के एक मॉडल का उपयोग करते हुए, गुर्दे की ट्यूबलर कोशिकाओं में HIF-1 के एक अद्वितीय वितरण की पहचान की। हमने पाया कि एचआईएफ रिंग का निर्माण और रखरखाव ऑक्सीजन के दबाव और पीएच द्वारा नियंत्रित किया गया था, जो दोनों एक कवरस्लिप मॉडल के कवरस्लिप किनारे में एक ढाल में मौजूद थे। इन परिणामों के आधार पर, हम एचआईएफ रिंग गठन के लिए एक संभावित तंत्र का प्रस्ताव करते हैं, जिसमें एचआईएफ -1 शामिल है जो ऑक्सीजन के तनाव को कम करता है, और एक कवरस्लिप किनारे से एक निश्चित दूरी के भीतर कम पीएच के कारण संचय को दबा दिया जाता है (चित्र 8) )

हाइपोपरफ्यूज़न सीकेडी (मिमुरा और नांगाकू, 2{{20}}10; नांगाकू, 2006) में माइक्रोवैस्कुलचर के रेयरफैक्शन से प्रेरित है। अपने पिछले काम में, हमने सामान्य माउस किडनी (हीराकावा एट अल।, 2018) के वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में ऑक्सीजन ढाल की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए विवो इमेजिंग में उपयोग किया था। सीकेडी में ट्यूबलर कोशिकाओं में ऑक्सीजन तनाव भी विषम होने की उम्मीद है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ऑक्सीजन प्रवणता के साथ हाइपोपरफ्यूजन का अस्तित्व हाइपोक्सिया, एचआईएफ के खिलाफ रक्षा प्रणाली को प्रभावित करता है या नहीं। इस अध्ययन में, हमने एक हाइपोपरफ्यूजन मॉडल के तहत सुसंस्कृत समीपस्थ नलिका कोशिकाओं में एचआईएफ वितरण की जांच की और पाया कि सुसंस्कृत गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं में ऑक्सीजन ढाल को एक गोल कांच के आवरण का उपयोग करके सफलतापूर्वक तैयार किया गया था। सजातीय ऑक्सीजन तनाव का उपयोग करने वाले प्रयोगों के साक्ष्य ने संकेत दिया कि HIF -1, जिसका हाइड्रॉक्सिलेशन और बाद में गिरावट मुख्य रूप से ऑक्सीजन पर निर्भर है, संचित है। यानी ऑक्सीजन का तनाव कम होने पर HIF-1 की मात्रा बढ़ जाती है। हमारे कवरस्लिप मॉडल में, हालांकि, एचआईएफ -1 को एनोक्सिक क्षेत्र में दबा दिया गया था और एक कवरस्लिप किनारे से एक निश्चित दूरी पर उच्चतम संचय था। यह डोनट के आकार का HIF संचय पहले कभी नहीं दिखाया गया है। हमने दिखाया कि ऊष्मायन वातावरण के ऑक्सीजन तनाव की परवाह किए बिना HIF रिंग की गति देखी जा सकती है, लेकिन इसका स्थान ऑक्सीजन तनाव पर निर्भर था। HIF रिंग पर ऑक्सीजन तनाव की सीमा को BTPDM1 के साथ PLIM का उपयोग करके लगभग 4–20 mmHg मापा गया। अधिकांश पिछले अध्ययन, जो एक समरूप ऑक्सीजन तनाव वाले वातावरण में सुसंस्कृत कोशिकाओं पर केंद्रित थे, ने पाया कि हाइपोक्सिक या एनोक्सिक श्रेणियों (अमेरी एट अल।, 2002; कैरेरा एट अल) में एचआईएफ -1 प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि हुई है। , 2014)। इस प्रकार, हमारे मॉडल में, HIF रिंग का निर्माण ऑक्सीजन तनाव के अलावा किसी अन्य कारक से प्रभावित हुआ होगा; यह एचआईएफ गिरावट की दर-सीमित प्रक्रिया, पीएचडी से स्वतंत्र था। एचआईएफ रिंग निर्माण के तंत्र की व्याख्या में एक सफलता पीएच ग्रेडिएंट की भूमिका की खोज थी, साथ ही साथ कवर-लिप मॉडल में ऑक्सीजन ग्रेडिएंट, जिसने विवो हाइपोपरफ्यूज़न के समान मीडिया के प्रवाह को सीमित कर दिया था। नमूना। इस हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में, कवर-स्लिप एज से दूरी बढ़ने के साथ ही इंट्रासेल्युलर पीएच कम हो गया, और कवरस्लिप किनारे के आसपास एक पीएच ग्रेडिएंट देखा गया। हमने दिखाया कि सजातीय ऑक्सीजन तनाव के तहत तटस्थ पीएच पर ऊष्मायन की तुलना में एचआईएफ -1 संचय पीएच 5.0 के आसपास कम पीएच पर दबा हुआ था। एचआईएफ रिंग का बाहरी किनारा पीएच 6.5 पर बाहर की ओर फैलता है, और एचआईएफ रिंग का भीतरी किनारा पीमोनिडाजोल-पॉजिटिव क्षेत्र के किनारे के आधार पर पीएच 8.5 पर अंदर की ओर सिकुड़ता है। HIF वलय अम्लीय परिस्थितियों में अस्पष्ट था, और HIF -1 संकेत pH 5.0 पर गायब हो गया। इस प्रकार, हमने एक coverslip मॉडल में HIF रिंग निर्माण के लिए pH के महत्व को स्पष्ट किया। हमने इस संभावना का प्रदर्शन किया कि HIF रिंग का निर्माण रिंग के अंदर कम pH द्वारा HIF -1 संचय के दमन द्वारा किया गया था।

कवरस्लिप विधि का उपयोग करने वाले पिछले कई अध्ययनों में कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया गया है। ह्यूमन हेपेटोमा सेल लाइन Hep3B का उपयोग करने वाली एक रिपोर्ट के अनुसार, जो हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (AcGFP1) के ऑक्सीजन-निर्भर रेडशिफ्ट को व्यक्त करती है, एक आयताकार कवरस्लिप के साथ कवर की गई कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग ने एक रेडशिफ्ट दिखाया क्योंकि एक कवरस्लिप किनारे से दूरी बढ़ गई (ताकाहाशी और सातो, 2010)। ऑक्सीजन तनाव कम होने के कारण हेपेटोमा कोशिकाओं का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य से लाल रंग में स्थानांतरित हो गया। एक अन्य अध्ययन में, एक गोल 15- मिमी कवरस्लिप के साथ SCC -7 कोशिकाओं के ऑक्सीजन तनाव को फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम तकनीक का उपयोग करके मापा गया था। ऑक्सीजन तनाव 6.9 mmHg और 166 mmHg था, जिसकी गणना PL से की गई थी, जो क्रमशः 3.89 µs और 893 µs, 0-2 मिमी अंदर, और कवरस्लिप किनारे के बाहर 0-1 मिमी था, (योशिहारा एट अल।, 2015)। कवरस्लिप विधि का उपयोग कार्डियक मायोसाइट्स के साथ भी किया गया है, एक ऐसी प्रणाली जिसने विवो इस्किमिया-रीपरफ्यूजन मॉडल में एक आशाजनक के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। केली एट अल ने दिखाया कि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और प्लाज्मा झिल्ली गतिकी में परिवर्तन के साथ, समय के साथ एक कवरलिप के साथ कवर किए गए मायोसाइट्स चिह्नित रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंततः मायोसाइट मृत्यु हो जाती है। उन्होंने यह भी प्रदर्शित किया कि एक कवरस्लिप के साथ कवर किए गए मायोसाइट्स का इंट्रासेल्युलर पीएच एक कवरस्लिप (पिट्स एंड टॉम्ब्स, 2004) के केंद्र में लगभग पीएच 4 तक तेजी से गिरता है। एक कवर-स्लिप मॉडल, एक कवरस्लिप के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए ऑक्सीजन या पोषण प्रसार को रोकना, केंद्र में, बाहर, और एक कवरस्लिप के किनारे क्रमशः इस्केमिक, सामान्य और सीमांत क्षेत्रों के विवो मॉडल की नकल कर सकता है। कई अध्ययनों ने इस मॉडल का उपयोग इन विट्रो में मायोसाइट्स के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन मॉडल के रूप में किया है (चुन एट अल।, 2015; पिट्स एट अल।, 2008; सोल्हजू और ओ'रूर्के, 2015; वांग एट अल।, 2012)। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हमारा अध्ययन ट्यूबलर कोशिकाओं के लिए एक कवरस्लिप विधि को लागू करने वाला पहला है। हमारे सिस्टम में, एक कवरस्लिप किनारे से ऑक्सीजन तनाव के 10 मिमीएचजी के बराबर क्षेत्र की दूरी, जहां पिमोनिडाज़ोल सकारात्मक होना चाहिए, 1.22 मिमी था, और कवरस्लिप किनारे से 2 मिमी की दूरी के भीतर ऑक्सीजन तनाव शून्य से कम हो गया था। . यह परिणाम लगभग 15 मिमी कवरस्लिप का उपयोग करते हुए पिछली रिपोर्टों के साथ संगत हो सकता है, जो किनारे से कम से कम 2 मिमी के भीतर ऑक्सीजन ढाल के अस्तित्व को प्रदर्शित करता है (अकियामा एट अल।, 2018; योशिहारा एट अल।, 2015)। हमने कवरस्लिप्स (चित्र S11) के तहत कोशिकाओं के एपोप्टोसिस की दर की जांच की और पाया कि GAPDH और एक्टिन को HIF रिंग के अंदर भी बनाए रखा गया था, यह दर्शाता है कि HIF रिंग केवल सेल एपोप्टोसिस या HIF रिंग के अंदर मृत्यु के कारण नहीं थी।

कई अध्ययनों ने विभिन्न तरीकों का उपयोग करके गुर्दे में ऑक्सीजन के तनाव को मापा है। सामान्य किडनी के ऑक्सीजन तनाव माप के कुछ उदाहरण इस प्रकार थे: कॉर्टेक्स और मेडुला में माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करते हुए 50 एमएमएचजी और 30 एमएमएचजी; और PLIM (हिराकावा एट अल।, 2017, 2018; झांग एट अल।, 2014) का उपयोग करके प्रांतस्था के ट्यूबलर कोशिकाओं के S1 और S2 खंडों में 49 mmHg और 41 mmHg। बीमार गुर्दे का ऑक्सीजन तनाव कम होगा। ऑक्सीजन माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करने वाली एक पिछली रिपोर्ट के अनुसार, डायबिटिक चूहों में वृक्क पैरेन्काइमल ऑक्सीजन तनाव कम था: कॉर्टेक्स और मज्जा में क्रमशः 36 मिमीएचजी और 11 मिमीएचजी (हेमैन एट अल।, 2013; पाम एट अल।, 2003)। चूंकि ऑक्सीजन माइक्रोइलेक्ट्रोड औसत पैरेन्काइमल ऑक्सीजन तनाव को मापते हैं, इसलिए बीमार गुर्दे में एक व्यापक श्रेणी की उम्मीद है। इस्केमिक किडनी के एक मॉडल में इंट्रासेल्युलर ऑक्सीजन तनाव घटकर शून्य mmHg हो गया, जिसकी पार्श्व गुर्दे की धमनी और शिरा को जकड़ा गया था (हिराकावा एट अल।, 2015)। इन निष्कर्षों को ध्यान में रखते हुए, HIF रिंग पर ऑक्सीजन तनाव की सीमा, लगभग 4-20 mmHg, विवो में प्रशंसनीय लग रही थी।

हमने आगे पाया कि पीएच ने एचआईएफ रिंग गठन के साथ-साथ ऑक्सीजन तनाव को भी प्रभावित किया। चूंकि गुर्दे में ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं लगातार मूत्र द्रव के संपर्क में रहती हैं, इसलिए ट्यूबलर कोशिकाओं का पीएच मूत्र से प्रभावित होना चाहिए। मूत्र में पीएच की विस्तृत श्रृंखला को ध्यान में रखते हुए, हमने 5.0-8.5 की पीएच श्रेणी में इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं का अध्ययन करने का निर्णय लिया। सामान्य गुर्दे में पीएच की सीमा में अध्ययन किया गया है। एक अध्ययन में पाया गया कि प्रांतस्था का पीएच 7.39 ± 0.{{10}}8 था, और मज्जा का 7.20 ± {{2{{39} }}}.09, जैसा कि माइक्रोइलेक्ट्रोड (बर्क एट अल।, 1999) का उपयोग करके मापा जाता है। एमआरआई-आधारित पीएच इमेजिंग का उपयोग करते हुए एक अन्य अध्ययन में क्रमशः 7.3 ± 0.13 और 7.0 ± 0.29 के पीएच मान दिखाए गए (रघुनंद एट अल।, 2003)। यह बताया गया कि एसिडोसिस (पावुलुरी एट अल।, 2019) के साथ सीकेडी के एक माउस मॉडल में गुर्दे का पीएच 6.5 से घटकर 6.32 हो गया, और एक गंभीर मामले में 5.83 तक कम हो गया। इन अवलोकनों ने सीकेडी में पीएच ड्रॉप और भिन्नता के प्रमाण प्रदान किए हैं। हालांकि, सीकेडी में क्रोनिक हाइपोक्सिया से प्रेरित एचआईएफ -1 पर पीएच के प्रभाव की पर्याप्त जांच नहीं की गई है। वर्तमान अध्ययन में, पीएच 6.5 और पीएच 7.4 के बीच एचआईएफ रिंग की एक शिफ्ट देखी गई, एक पीएच रेंज जो सीकेडी में प्रशंसनीय है। इस परिणाम ने इस परिकल्पना का समर्थन किया कि पीएच में मामूली कमी सीकेडी में एचआईएफ -1 संचय को प्रभावित करती है। सीकेडी के गंभीर मामलों में पीएच 6.0 से नीचे गिरने के साक्ष्य के आधार पर, कम पीएच पर एचआईएफ -1 शारीरिक स्थिति का आकलन करना भी आवश्यक है। हालांकि ऐसी रिपोर्टें आई हैं कि एक अम्लीय वातावरण, नॉर्मोक्सिया में भी, एचआईएफ को स्थिर करता है -1, इनमें से अधिकांश रिपोर्टों में पीएच 6.0 (फिलाटोवा एट अल।, 2016; मेखाइल एट अल।, 2004) से अधिक हल्की अम्लता की स्थिति की जांच की गई है। . इस काम में, हमने पीएच 5.0 पर ट्यूबलर कोशिकाओं में एचआईएफ -1 संचय का दमन दिखाया, और पीएच 5.0 पर ऊष्मायन किए गए एक कवरलिप मॉडल में एचआईएफ -1 संकेतों का क्षीणन दिखाया। इसलिए, विवो में सीकेडी में वृक्क पीएच की कमी को अपर्याप्त एचआईएफ सक्रियण के साथ-साथ हाइपोक्सिक किडनी में यूरेमिक विषाक्त पदार्थों के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है, जिससे सीकेडी प्रगति (तनाका एट अल।, 2013) बढ़ जाती है।

हमारे अध्ययन की अनेकों सीमाएं हैं। सबसे पहले, हाइपोपरफ्यूजन के क्षेत्र में, ऑक्सीजन की कमी और पीएच में कमी के अलावा, पोषक तत्वों में संस्कृति मीडिया की कमी होनी चाहिए। हालांकि, पीएच, ऑक्सीजन तनाव, और हाइपोपरफ्यूज़न से प्रेरित अन्य कारकों के प्रभावों को चित्रित करना मुश्किल है। शरीर में, इस्किमिया, कम ऑक्सीजन और कम पोषक तत्वों के संयोजन के कारण रक्त का पैथोलॉजिकल हाइपोपरफ्यूज़न, अंगों और कोशिकाओं में होता है। हाइपोक्सिया सेंसिंग और इस्किमिया सेंसिंग के बीच अंतर को समझना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक कारक के जैविक प्रभाव को स्पष्ट करने में कठिनाई के बावजूद, हमारा हाइपोपरफ्यूजन मॉडल शारीरिक रूप से प्रशंसनीय है, विवो में रोग संबंधी स्थिति की नकल करता है। दूसरा, एक कवरस्लिप मॉडल बनाने के लिए कौशल और अभ्यास की आवश्यकता होती है, क्योंकि अधिकांश कोशिकाएं कभी-कभी एक कवरस्लिप को हटाने के दौरान अलग हो जाती हैं, खासकर पारंपरिक पद्धति (चित्रा S2a) का उपयोग करते समय। यह समस्या प्रयुक्त सेल लाइन पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, हमारे लिए HEK 293 कोशिकाओं के लिए एक कवरस्लिप मॉडल लागू करना मुश्किल था क्योंकि एक कवरस्लिप के लिए उनका आसंजन अपेक्षाकृत कमजोर था। तीसरा, एक coverslip के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए वांछनीय था । जिस अवधि के दौरान उन्हें कवर किया गया था, क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई, जैसा कि एपोप्टोसिस के विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है। हमने निर्धारित किया कि 3 एच एचआईएफ रिंग के आकलन के लिए उपयुक्त था जब यह स्थिर लग रहा था, और लगभग 10 प्रतिशत कोशिकाएं एपोप्टोटिक (चित्रा एस 11) बन गईं। चौथी सीमा प्रत्येक नमूने (चित्रा S2b, c) में एक समान तरीके से सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक कवरस्लिप में संलग्न करने की कठिनाई थी। कवर-लिप मॉडल बनाने के पारंपरिक और वैकल्पिक तरीके के बीच लगाव में अंतर भी अध्ययन को प्रभावित कर सकता था। हमने फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम तकनीक द्वारा HIF रिंग के बराबर ऑक्सीजन टेंशन की सीमा को मापा, जिसमें हमने एक पारंपरिक पद्धति का उपयोग करके एक कवरस्लिप मॉडल बनाया। चूंकि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के दौरान एचआईएफ रिंग को एक वैकल्पिक विधि का उपयोग करके देखा गया था, इसलिए वास्तविक ऑक्सीजन तनाव भिन्न हो सकता है। हमने सबूतों का उपयोग करके इन त्रुटियों को कम किया कि पिमोनिडाज़ोल 10 एमएमएचजी या ऑक्सीजन तनाव से कम पर सकारात्मक था। पांचवीं सीमा यह है कि इंट्रासेल्युलर पीएच जरूरी नहीं कि संस्कृति माध्यम के पीएच के समान हो। पिछली कई रिपोर्टों से पता चला है कि इंट्रासेल्युलर पीएच कुछ हद तक सुसंस्कृत कोशिकाओं में मध्यम पीएच के अनुरूप है (मिक्ल एट अल।, 2019), हम मध्यम पीएच को बदलकर केवल इंट्रासेल्युलर पीएच में प्रवृत्ति का आकलन कर सकते हैं। विवो में, इंट्रासेल्युलर और बाह्य क्षेत्रों के पीएच के बीच संबंध, जैसे कि मूत्र या शरीर के तरल पदार्थ, सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में अधिक जटिल होते हैं। इस प्रकार, जिस तरह से पीएच शिफ्ट विवो में एचआईएफ -1 प्रोटीन के संचय को नियंत्रित करता है, उसके बारे में आगे के अध्ययन भविष्य के लिए आवश्यक होंगे।

Cistanche लाभ: सुधार गुर्दासमारोह

एक और सीमा यह है कि पीएच का हाइपोक्सिया मार्कर, पिमोनिडाज़ोल पर प्रभाव होना चाहिए। हमने अपने कवरस्लिप मॉडल में विभिन्न पीएच स्थितियों के तहत एक कवरस्लिप के केंद्र से पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र के किनारे की दूरी की तुलना की। पिमोनिडाज़ोल-पॉजिटिव क्षेत्र का किनारा पीएच 6.5, 7.4, और 8.5 (चित्रा S12a, b) के बीच तुलनीय था। एक पिछले अध्ययन ने विभिन्न पीएच मानों (क्लेटर एट अल।, 2 0 06) पर पिमोनिडाज़ोल बंधन के रखरखाव का भी प्रदर्शन किया। इस सबूत के आधार पर, हमने निष्कर्ष निकाला कि पिमोनिडाज़ोल हमारे कवरस्लिप प्रयोगों के लिए एक उपयुक्त हाइपोक्सिया मार्कर है। अंतिम सीमा यह है कि HIF रिंग, Pt(II)- और Pd(II)-porphyrins के लगभग 4 mmHg और 20 mmHg (0.52 प्रतिशत O2 से 2.6 प्रतिशत O2) के बीच ऑक्सीजन तनाव की एक सीमा को देखते हुए, जो व्यापक रूप से जैविक के रूप में उपयोग किया जाता है ऑक्सीजन जांच, बहुत कम ऑक्सीजन सांद्रता को मापने के लिए फायदे हैं क्योंकि इर (III) परिसरों (योशिहारा एट अल।, 2017) का उपयोग करने वालों की तुलना में उनके लंबे समय तक फॉस्फोरेसेंस जीवनकाल के कारण। हालांकि, सामान्य तौर पर, स्टर्न-वोल्मर समीकरण का उपयोग करके गणना की गई फॉस्फोरेसेंस पर आधारित एक मात्रात्मक ऑक्सीजन माप, कम O2 श्रेणियों (पापकोवस्की और ज़डानोव, 2016) पर बेहतर प्रदर्शन करता है। पिछले कई अध्ययनों ने ऑक्सीजन तनाव के इर (III) जटिल-आधारित माप को लगभग 10 मिमीएचजी (अकियामा एट अल।, 2018; योशिहारा एट अल।, 2015) के रूप में प्रदर्शित किया है। इसलिए, हम मानते हैं कि HIF रिंग के ऑक्सीजन तनाव की सीमा का सटीक परिणाम होना चाहिए।

5|निष्कर्ष

सारांश में, हमने पाया कि सीकेडी में एचआईएफ -1 शारीरिक स्थिति को समझने के लिए ऑक्सीजन और पीएच दोनों की भूमिकाओं को समझना आवश्यक है, और हाइपोपरफ्यूजन के साथ ट्यूबलर कोशिकाओं की जांच करके प्राप्त किया जा सकता है। कवरस्लिप मॉडल, मीडिया के प्रवाह की अपनी सीमाओं के साथ, विवो में हाइपोपरफ्यूज़न का एक अच्छा मॉडल था, विशेष रूप से सीकेडी में नलिकाओं में, क्योंकि पेरिटुबुलर केशिकाओं का रेयरफैक्शन सीकेडी (मिमुरा और नांगकू, 2010; नांगकू,) की एक प्रमुख पहचान है। 2006)। यह हाइपोपरफ्यूजन मॉडल विवो में ऑक्सीजन और पीएच ग्रेडिएंट्स की नकल भी कर सकता है, जैसे कि ट्यूमर और इस्केमिक घाव। मॉडल इन जैविक तंत्रों की व्याख्या के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

एक ऐसी स्थिति जिसमें सरकारी अधिकारी का निर्णय उसकी व्यक्तिगत रूचि से प्रभावित हो

घोषित करने के लिए सभी लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

लेखकों का योगदान

सभी लेखकों ने समग्र अवधारणा के निर्माण में योगदान दिया। TH ने समग्र प्रयोग किए। TH और YH ने परिणामों का विश्लेषण किया और आंकड़े बनाए। TH ने मूल पांडुलिपि लिखी। KM, TY, और ST ने फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम तकनीक का उपयोग करके प्रयोग किया और पांडुलिपि के हिस्से को संपादित किया। YH, TT, और MN ने समग्र पांडुलिपि संपादित की। सभी लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि को पढ़ और अनुमोदित कर दिया है।

संदर्भ

अकियामा, एच।, ताकाहाशी, आई।, शिमोडा, वाई।, मुकाई, आर।, योशिहारा, टी।, और टोबिता, एस। (2018)। Ir(iii) गेटेड ICCD कैमरे के साथ जीवित कोशिकाओं और ऑक्यूलर फंडस की जटिल-आधारित ऑक्सीजन इमेजिंग। फोटोकैमिकल और फोटोबायोलॉजिकल साइंसेज, 17(6), 846-853।

अकीज़ावा, टी., नंगकु, एम., यामागुची, टी., अराई, एम., कोरेटोमो, आर., माएदा, के., मियाज़ावा, वाई., और हीराकाटा, एच. (2019)। हेमोडायलिसिस रोगियों में एनीमिया के लिए एनारोडस्टैट, रूपांतरण और रखरखाव चिकित्सा: एक यादृच्छिक, प्लेसबो-नियंत्रित चरण 2 बी परीक्षण जिसके बाद दीर्घकालिक परीक्षण किया जाता है। नेफ्रॉन, 143(2), 77-85.

अमेरी, के।, बर्क, बी।, लुईस, सीई, और हैरिस, एएल (2002)। हाइपोक्सिया और एनोक्सिया में मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं में एक चूहे वीएल 30 तत्व का विनियमन: एचआईएफ की भूमिका -1। ब्रिटिश जर्नल ऑफ कैंसर, 87(10), 1173-1181।

असाई, एच।, हिरता, जे।, हिरानो, ए।, हिराई, के।, सेकी, एस।, और वतनबे- अकनुमा, एम। (2016)। एरिल हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर का सक्रियण इंडोक्सिल सल्फेट द्वारा हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर-डिपेंडेंट एरिथ्रोपोइटिन एक्सप्रेशन के दमन की मध्यस्थता करता है। अमेरिकन जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी। सेल फिजियोलॉजी, 310(2), C142-C150।

बर्क, टीजे, मल्होत्रा, डी., और शापिरो, जेआई (1999)। गुर्दे के भीतर पीएच ढाल बनाए रखने वाले कारक: वास्कुलचर आर्किटेक्चर की भूमिका। किडनी इंटरनेशनल, 56(5), 1826-1837।

कैरेरा, एस।, सेनरा, जे।, एकोस्टा, एमआई, अल्थुबिटी, एम।, हैमंड, ईएम, डी वर्डियर, पीजे, और मैकिप, एस। (2014)। शारीरिक ऑक्सीजन तनाव में वृद्धि हुई कोशिका विभाजन में HIF-1अल्फा प्रतिलेखन कारक की भूमिका। प्लस वन, 9(5), ई97938।

चेन, एन।, हाओ, सी।, पेंग, एक्स।, लिन, एच।, यिन, ए।, हाओ, एल।, ताओ, वाई।, लियांग, एक्स।, लियू, जेड।, जिंग, सी।, चेन, जे., लुओ, एल., ज़ूओ, एल., लियाओ, वाई., लियू, बीसी, लिओंग, आर., वांग, सी., लियू, सी., नेफ़, टी., … यू, केएचपी (2019) )

गुर्दे की बीमारी के रोगियों में रक्ताल्पता के लिए रॉक्सडस्टेट जो डायलिसिस प्राप्त नहीं कर रहा है। न्यू इंग्लैंड जर्नल ऑफ मेडिसिन, 381(11), 1001-1010।

चेन, एन।, कियान, जे।, चेन, जे।, यू, एक्स।, मेई, सी।, हाओ, सी।, जियांग, जी।, लिन, एच।, झांग, एक्स।, ज़ूओ, एल।, He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

एच. (2017)। चीन में एनीमिया के इलाज के लिए ओरल हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर प्रोलिल हाइड्रॉक्सिलेज़ इनहिबिटर FG-4592 का चरण 2 अध्ययन। नेफ्रोलॉजी, डायलिसिस, प्रत्यारोपण, 32(8), 1373-1386।

चियांग, सीके, तनाका, टी।, इनगी, आर।, फुजिता, टी।, और नांगकू, एम। (2011)। इंडोक्सिल सल्फेट, एक प्रतिनिधि यूरेमिक टॉक्सिन, एचआईएफ-निर्भर तरीके से एरिथ्रोपोइटिन उत्पादन को दबा देता है। प्रयोगशाला जांच, 91(11), 1564-1571।

चुन, डब्ल्यूजे, नाह, डीवाई, बीएई, जेएच, चुंग, जेडब्ल्यू, ली, एच।, और मून, आईएस (2015)। ग्लूकोज-इंसुलिन-पोटेशियम समाधान इन विट्रो कवरस्लिप इस्किमिया/रीपरफ्यूजन मॉडल में नवजात चूहों के वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की रक्षा करता है। कोरियन सर्कुलेशन जर्नल, 45(3), 234-241।

कॉइन, डीडब्ल्यू, गोल्डस्मिथ, डी।, और मैकडॉगल, आईसी (2017)। क्रोनिक किडनी रोग के एनीमिया के लिए नए विकल्प। किडनी इंटरनेशनल सप्लीमेंट, 7(3), 157-163। चुंबन.2017.09.002

देंग, ए., अरंड्ट, एमए, सैट्रिआनो, जे., सिंह, पी., रीग, टी., थॉमसन, एस. एट अल (2010)। क्रोनिक किडनी रोग में गुर्दे की सुरक्षा: हाइपोक्सिया-प्रेरक कारक सक्रियण बनाम एंजियोटेंसिन II नाकाबंदी। अमेरिकन जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी। रेनल फिजियोलॉजी, 299(6), F1365-F1373।

फिलाटोवा, ए।, सेडेल, एस।, बोगुरकु, एन।, ग्राफ, एस।, गारवालोव, बीके, और एकर, टी। (2016)। एसिडोसिस एचएसपी 90 के माध्यम से पीएच.डी./वीएचएल-स्वतंत्र तरीके से कार्य करता है ताकि ग्लियोमा में एचआईएफ फ़ंक्शन और स्टेम सेल रखरखाव को बढ़ावा दिया जा सके। कैंसर अनुसंधान, 76(19), 5845-5856। कर सकते हैं-15-2630

गोल्डफार्ब, एम।, रोसेनबर्गर, सी।, अबासी, जेड।, शिना, ए।, ज़िल्बरसैट, एफ।, एकार्ड, केयू, रोसेन, एस।, और हेमैन, एसएन (2006)। चूहे में तीव्र-पुरानी गुर्दे की विफलता: कार्यात्मक मुआवजा और हाइपोक्सिया सहिष्णुता। अमेरिकन जर्नल ऑफ नेफ्रोलॉजी, 26(1), 22-33.

हेमैन, एसएन, रोसेनबर्गर, सी।, रोसेन, एस।, और खमैसी, एम। (2013)। मधुमेह मेलिटस कंट्रास्ट-प्रेरित नेफ्रोपैथी के लिए एक जोखिम कारक क्यों है? बायोमेड रिसर्च इंटरनेशनल, 2013, 123589।

हीराकावा, वाई., मिज़ुकामी, के., योशिहारा, टी., ताकाहाशी, आई. खुलन, पी., होंडा, टी., मिमुरा, आई., तनाका, टी., टोबिता, एस., और नंगकु, एम. (2018)। रीनल कॉर्टेक्स की इंट्राविटल फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग रीनल हाइपोक्सिया को सटीक रूप से मापती है। किडनी इंटरनेशनल, 93(6), 1483-1489।

हीराकावा, वाई।, तनाका, टी।, और नांगकू, एम। (2017)। सीकेडी में रेनल हाइपोक्सिया ; पैथोफिजियोलॉजी और पता लगाने के तरीके। फिजियोलॉजी में फ्रंटियर्स, 8, 99।