फाइब्रोसिस में इंटरल्यूकिन (आईएल) के लिए एक नई भूमिका

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भाग : परमाणु IL-33 फाइब्रोब्लास्ट के एक बाह्य मैट्रिक्स-स्रावित फेनोटाइप में प्रारंभिक रूपांतरण को रोकता है

फ्रांसेस्का गट्टी, सोबुज मिया, क्लारा हैमरस्ट्रॉम और एट अल।

इंटरल्युकिन(IL)-33 एक साइटोकाइन है जो मध्यस्थता करता प्रतीत होता हैफाइब्रोसिसइसके रिसेप्टर ST2 (IL .) के माध्यम से संकेत देकर(इंटरल्युकिन)-33आर/आईएलआईआरएल1)। हालांकि, यह एक प्रोटीन भी है जिसे संश्लेषण के बाद कोशिका नाभिक में क्रमबद्ध किया जाता है, जहां यह क्रोमैटिन तह को प्रभावित करता प्रतीत होता है। यहां हम परमाणु IL . के लिए एक नई भूमिका का वर्णन करते हैं(इंटरल्युकिन)-33 murine में फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप को विनियमित करने मेंगुर्दाफाइब्रोसिसएकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट द्वारा संचालित। IL . की ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग(इंटरल्युकिन)-33-बंधाव के 24 घंटे बाद गुर्दे की कमी से फाइब्रोजेनिक जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और बाह्य मैट्रिक्स गठन और रीमॉडेलिंग में शामिल जीन सेट के संवर्धन का पता चला। ये परिवर्तन IL . के इंट्रासेल्युलर प्रभावों पर निर्भर थे(इंटरल्युकिन)-33 क्योंकि एल.33 के लिए एक न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी के साथ उपचार द्वारा उनका पुनरुत्पादन नहीं किया गया था जो आईएल को रोकता है(इंटरल्युकिन)-33R/ST2L रिसेप्टर सिग्नलिंग और न ही वे L-33R/ST2-की कमी वाले गुर्दे में देखे गए। एलएल -33 के इंट्रासेल्युलर फ़ंक्शन का और पता लगाने के लिए, हमने मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट्स के ट्रांसक्रिप्शन प्रोफाइल की स्थापना की, यह देखते हुए कि आईएल -33 के नॉकडाउन ने ट्रांसक्रिप्शन प्रोफाइल को एक मायोफिब्रोब्लास्ट फेनोटाइप की ओर एक भड़काऊ से तिरछा कर दिया, जो उच्च स्तर में परिलक्षित होता है। , COL5A1 और ट्रांसजेलिन प्रोटीन, साथ ही IL6, CXCL8, CLL7, और CCL8 के निम्न अभिव्यक्ति स्तर। निष्कर्ष में, हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि परमाणु IL(इंटरल्युकिन)-फाइब्रोब्लास्ट्स में 33 प्रारंभिक प्रोफाइब्रोटिक प्रतिक्रिया को तब तक कम कर देता है जब तक कि लगातार उत्तेजना, जैसा कि यूयूओ द्वारा लागू किया जाता है, इस सुरक्षात्मक तंत्र को ओवरराइड कर सकता है।

इंटरल्युकिन-33 (आईएल-33/आईएल(इंटरल्युकिन)1F1l) का सदस्य हैइंटरल्यूकिन-1 सुपरफ़ैमिली जिसने के एक विचारक मध्यस्थ के रूप में काफी ध्यान आकर्षित किया हैफाइब्रोसिसविकास। इस रुचि का अधिकांश भाग IL . के बार-बार इंजेक्शन को देखकर बढ़ाया गया था(इंटरल्युकिन)-33, ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर ST2 (IL .) के माध्यम से कार्य करता है(इंटरल्युकिन)33आरजे/आईएल(इंटरल्युकिन)1RL1), प्रेरित त्वचीयफाइब्रोसिस' और यह देखते हुए कि IL(इंटरल्युकिन)-33-कमी की कमी से कार्बन टेट्राक्लोराइड-प्रेरित लीवर काफी हद तक कम हो गयाफाइब्रोसिस. दरअसल, आईएल(इंटरल्युकिन)-33 प्रचार कर सकता हैफाइब्रोसिसप्रोफाइब्रोटिक आईएल . उत्पन्न करके(इंटरल्युकिन)-13 टाइप 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी 2) और टी हेल्पर 2लिम्फोसाइट्स से'।

वृक्क बीचवालाफाइब्रोसिसऔर पैरेन्काइमल ट्यूबलर सेल हानि पुरानी गुर्दे की बीमारियों के सामान्य अंतिम परिणाम हैं और रोग की प्रगति के अच्छे भविष्यवक्ता हैं। दो अलग-अलग माउस मॉडल से उत्पन्न वर्तमान डेटा इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि IL(इंटरल्युकिन)-33 गुर्दे की विकृति में भी योगदान देता हैफाइब्रोसिस: एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट (UUO) में, चेन एट अल ने दोनों IL में पैरेन्काइमल हानि और बढ़ी हुई उपकला प्रसार की सूचना दी(इंटरल्युकिन)-33- और ST2-कमी वाले चूहे', और वृक्क इस्किमिया-रीपरफ्यूज़न में, लिआंग एट अल। ने दिखाया कि IL . का निषेध(इंटरल्युकिन)-33 घुलनशील आईएल के प्रशासन द्वारा संकेत (इंटरल्युकिन)-33 रिसेप्टर (sST2) भी कम हो गयाफाइब्रोसिस.

रिपोर्टें जिन्होंने IL . के फाइब्रोजेनिक गुणों को संबोधित किया है(इंटरल्युकिन)-33 आम तौर पर एक तंत्र के मद्देनजर निष्पादित और व्याख्या की जाती है जिसके द्वारा आईएल(इंटरल्युकिन)-33, तनावग्रस्त या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से मुक्त होकर, अपने रिसेप्टर के बाह्य डोमेन से जुड़ता है। इसके विपरीत, आईएल की छँटाई।(इंटरल्युकिन)-33 संश्लेषण के बाद कोशिका नाभिक में- और रिसेप्टर-स्वतंत्र क्रोमैटिन फोल्डिंग को प्रभावित करने की इसकी क्षमता से पता चलता है कि आईएल -33 प्रतिलेखन कारक-जैसे, रिसेप्टर-स्वतंत्र कार्यों को भी लागू कर सकता है, कार्रवाई का एक तरीका जिसने बहुत कम प्रयोगात्मक ध्यान प्राप्त किया है . इस तथ्य के मद्देनजर ये विचार और भी दिलचस्प हैं कि IL . का परमाणु स्थानीयकरण(इंटरल्युकिन)-33 महत्वपूर्ण है, जैसा कि परमाणु स्थानीयकरण संकेत के बाधित होने पर एक घातक, गैर-समाधान करने वाली सूजन से पता चलता है'।

के प्रमुख सेलुलर मध्यस्थफाइब्रोसिसमायोफिब्रोब्लास्ट है, जो सक्रिय होने पर ऊतक की मरम्मत के प्राथमिक कोलेजन-उत्पादक और सिकुड़ा कोशिका के रूप में कार्य करता है। मायोफिब्रोब्लास्ट्स को ए-स्मूथ मसल एक्टिन (a-SMAACTA2) की अभिव्यक्ति की विशेषता है जो उनके सिकुड़ा कार्य को सक्षम बनाता है और के विनाशकारी प्रभाव में योगदान देता हैफाइब्रोसिसविकास, हमने पहले दिखाया है कि परमाणु I-33 प्रायोगिक घाव भरने के दौरान, गैस्ट्रिक अल्सर और अल्सरेटिव कोलाइटिस में मायोफिब्रोब्लास्ट में तेजी से और दृढ़ता से प्रेरित होता है। दरअसल, IL . की अभिव्यक्ति(इंटरल्युकिन)-33 ए-एसएमए-पॉजिटिव मायोफिब्रोब्लास्ट की एक सामान्य विशेषता प्रतीत होती है, क्योंकि यह अग्नाशय में भी पाई जाती है।फाइब्रोसिसऔर यकृत के मायोफिब्रोब्लास्ट जैसी स्टेलेट कोशिकाओं में। एक साथ लिया, इन निष्कर्षों से यह पूछना दिलचस्प हो जाता है कि क्या IL(इंटरल्युकिन)-33 मायोफिब्रोब्लास्ट फ़ंक्शन और विभेदन के नियमन में भूमिका निभा सकता है।

हम यहां मायोफिब्रोब्लास्ट फेनोटाइप को विनियमित करने में परमाणु lL-33 के लिए एक नई भूमिका का वर्णन करते हैं। आनुवंशिक विलोपन या IL . के औषधीय निषेध के माध्यम से(इंटरल्युकिन)-33 UUO मॉडल में, साथ ही IL की कमी(इंटरल्युकिन)-33 सक्रिय मानव प्राथमिक सुसंस्कृत त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट में, हम उस परमाणु IL . को प्रदर्शित करते हैं(इंटरल्युकिन)-33 एक पूर्ण विकसित मायोफिब्रोब्लास्टिक फेनोटाइप में प्रारंभिक रूपांतरण को रोकता है और एक भड़काऊ फेनोटाइप का समर्थन करता है। आईएल . का अवक्षयण(इंटरल्युकिन)-33 ने बाह्य मैट्रिक्स घटकों COL1Al, COL1A2, COL3A1, COL5A1 और ट्रांसजेलिन की अभिव्यक्ति को बढ़ाया, लेकिन प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकाइन IL की अभिव्यक्ति को बाधित किया(इंटरल्युकिन)-6 और केमोकाइन्स CXCL8 CCL7 और CCL8। इसलिए, हमारे निष्कर्ष आईएल-33 की भूमिका को समझने के लिए एक नया दृष्टिकोण पेश करते हैंफाइब्रोसिसविकास और ऊतक होमियोस्टेसिस।

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परिणाम

मायोफिब्रोब्लास्ट प्रमुख IL . हैं(इंटरल्युकिन)-33- murine UUO में कोशिकाओं को व्यक्त करना।चेन और उनके सहयोगियों के एक हालिया अध्ययन ने आईएल . की अभिव्यक्ति में वृद्धि की सूचना दी(इंटरल्युकिन)-33 और ST2 दिन 4 पर एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट के बाद। हमने C57BL/6J चूहों में UUO के बाद 1,7, और 21 दिनों में गुर्दे एकत्र करके उनके प्रयोग के लिए संपर्क किया, IL में लगातार वृद्धि देखी गई(इंटरल्युकिन)33 mRNA टेप (चित्र। 1A) और परमाणु IL . को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि(इंटरल्युकिन)-33(चित्र.1बी)। हमने टाइप I कोलेजन के ट्रांसक्रिप्शन और प्रोटीन एक्सप्रेशन को भी देखा जो के विकास को दर्शाता हैफाइब्रोसिस(अंजीर। आईसी, डी)। हमने तब IL . के फेनोटाइप का विश्लेषण किया(इंटरल्युकिन)-33-कोशिकाओं को व्यक्त करना। चेन एट अल की तरह। , हमने देखा कि IL(इंटरल्युकिन)-33-दिन 2 में देखे गए सेल सबसेट को व्यक्त करने में मुख्य रूप से ए-एसएमए-पॉजिटिव मायोफिब्रोब्लास्ट शामिल थे, हालांकि, हमें आईएल के लिए कोई संकेत नहीं मिला(इंटरल्युकिन)-33 सीडी में 31-पॉजिटिव एंडोथेलियल सेल्स और न ही सीडी में45-पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स (चित्र। IE और फिगर S1)। हमने IL . का भी अवलोकन किया(इंटरल्युकिन)-33 बिखरे हुए पेरिसाइट्स में (चित्र 1ए में लाल तीर, दिन 21 पैनल)। पीडीजीएफआरबी के लिए एक युग्मित इम्यूनोस्टेनिंग, मायोफिब्रोब्लास्ट्स और पेरिसाइट्स के लिए एक और मार्कर, ने व्यापक कोलोकलाइज़ेशन (छवि। आईई) का खुलासा किया, इसके अलावा, हमने मूल्यांकन किया कि क्या आईएल(इंटरल्युकिन)33 को फ़ाइब्रोब्लास्ट सक्रियण के ज्ञात मार्करों के साथ कोलोकलाइज़ किया गया था, जिसमें पाया गया कि S100A4 (जिसे फ़ाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट प्रोटीन, FSP -1 के रूप में भी जाना जाता है) की अभिव्यक्ति, बल्कि केशिकाओं और मध्यम आकार के जहाजों (छवि IE) की एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त की गई थी। . इसी तरह, वीआईएम/विमेंटिन भी मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं में पाया गया, विशेष रूप से ग्लोमेरुली और मध्यम आकार के जहाजों में, और आईएल में कोई स्पष्ट सह-अभिव्यक्ति नहीं थी।(इंटरल्युकिन).33-धनात्मक कोशिकाएँ (चित्र 1E)। आईएल . का आगे का विश्लेषण(इंटरल्युकिन)-33-7 वें दिन मायोफिब्रोब्लास्ट को व्यक्त करने से पता चला कि वे मुख्य रूप से प्रांतस्था और कॉर्टिकोमेडुलरी जंक्शन के लिए स्थानीयकृत थे। और मज्जा और पैपिला में कम प्रचुर मात्रा में (चित्र 1F)।

चित्रा 1. एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट IL . को प्रेरित करती है(इंटरल्युकिन)-33 माउस किडनी में अभिव्यक्ति।

(ए, सी) स्वस्थ नियंत्रण चूहों (एन =2) या नकली ऑपरेशन के अधीन चूहों (एन =1) या यूयूओ के बाद एल, 7, या 21 दिनों के बाद गुर्दे में 33 और कोलाल की सापेक्ष अभिव्यक्ति (n=3 हर समय बिंदु पर)। qRT-PCR द्वारा सामग्री और विधियों में विस्तृत रूप से प्रतिलेखन स्तर निर्धारित किया गया था। डेटा बिंदु व्यक्तिगत चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी, डीएफ) IL . के लिए दागे गए ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि फोटोमिकोग्राफ(इंटरल्युकिन)-33 [ब्राउन सिग्नल इन (बी) और (एफ), ब्राउन या टील सिग्नल इन (ई)], COL1 (पैनल डी में ब्राउन सिग्नल), अस्मा (लाल, ई, एफ), सीडी 31 (बैंगनी, ई) ), पीडीजीएफआरबी (टील, ई), विमेंटिन (चैती, ई) और एस 100 ए 4 (बैंगनी, ई) स्वस्थ नियंत्रण चूहों या चूहों से गुर्दे में यूयूओ 2 दिन (ई), 7 दिन (बी, डी, एफ) या 21 दिनों के अधीन (बी, डी) पहले। पैनल 'एफ' गुर्दे के विभिन्न क्षेत्रों को लेबल के रूप में दिखाता है। स्केल बार्स =20 सुक्ष्ममापी।

I-33 के आनुवंशिक विलोपन का UUO में तंतुमयता की प्रगति पर नगण्य प्रभाव पड़ता है, लेकिन यह कोलेजन संश्लेषण को जल्दी बढ़ावा देता है।हमने अगली बार IL . की भूमिका का आकलन किया(इंटरल्युकिन)-33 IL . में गुर्दे की रुकावट के प्रति प्रतिक्रिया की तुलना करके(इंटरल्युकिन)-33 और जंगली प्रकार के चूहे। चेन और सहकर्मियों के विपरीत, जिन्होंने कम होने की सूचना दीफाइब्रोसिसIL . में विकास(इंटरल्युकिन)-33-यूयूओ के अधीन कमी वाले चूहों, हमने आईएल . के बीच कोई अंतर नहीं देखा(इंटरल्युकिन)33--और टाइप I कोलेजन के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा UUO के बाद दिन7 या21 में फाइब्रोसिस विकास में WT'mice(Fig.2A, B)। हालाँकि, कोलेजन टेप का मूल्यांकन करके ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर फ़ाइब्रोोटिक प्रतिक्रिया को विच्छेदित करते हुए, हमने कोल ट्रांसक्रिप्शंस के दो गुना उच्च स्तर के लिए एक प्रारंभिक, महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन और IL की तुलना करते समय Col3al को बढ़ाने की प्रवृत्ति देखी।(इंटरल्युकिन)-33-दिन 1 में कमी और जंगली प्रकार के गुर्दे(चित्र 2सी, डी)। इसलिए, हमने चेन एट अल के प्रयोगात्मक डिजाइन को दोहराने का फैसला किया। 4 पोस्ट-यूयूओ में नमूनों का विश्लेषण करके और एसटी 2-कमी वाले चूहों सहित, उनकी तुलना आईएल . से करते हैं(इंटरल्युकिन)-33-कमी और WT चूहों। इन विश्लेषणों ने IL . में Colla2 की पर्याप्त वृद्धि का खुलासा किया(इंटरल्युकिन).33-दिन 4 में जंगली प्रकार के गुर्दे की तुलना में कमी वाले गुर्दे लेकिन एसटी में कोई समान वृद्धि नहीं-2-कमी वाले गुर्दे(चित्र 2ई)। 4 दिन में जीनोटाइप के बीच कॉलर और Col3al प्रतिलेख स्तरों में कोई स्पष्ट अंतर नहीं था, यह दर्शाता है कि इन जीनों पर प्रभाव कम समय तक चलने वाला है (डेटा नहीं दिखाया गया है और चित्र 2F)।

चित्रा 2. आईएल . में कोलेजन अभिव्यक्ति(इंटरल्युकिन)-33-/और यूयूओ के दौरान वाइल्डटाइप किडनी।

(ए, बी) I -33-- और WT चूहों से गुर्दे में COL1 (भूरा) के लिए दागे गए ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ यूयूओ के 7 और 21 दिन बाद। (सी, डी) समय पाठ्यक्रम में Collal और Col3al के mRNA प्रतिलेखन की तुलना इल(इंटरल्युकिन)-33--और WT चूहों, स्वस्थ नियंत्रण चूहों (n=2), शम-संचालित चूहों (n=1) और चूहों को UUO1,7, या 21 दिन पहले (n{{{{{{{}} दिखा रहे हैं 7}} प्रत्येक समय बिंदु और प्रत्येक जीनोटाइप पर। (ई, एफ) आईएल से गुर्दे में Collal और Col3al प्रतिलेखन की तुलना(इंटरल्युकिन)-33-, ST2-और WT चूहों शम-ऑपरेशन के 4 दिन बाद(n=5 प्रति जीनोटाइप)या UUO(n=10प्रति जीनोटाइप)। प्रतिलेखन स्तर mRNA के qRT-PCR द्वारा निर्धारित किया गया था। डेटा बिंदु अलग-अलग चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं, बार माध्य मान दिखाते हैं।*p<><><>

इल(इंटरल्युकिन)-33 यूयूओ के प्रारंभिक चरण में प्रोफाइब्रोटिक जीन की अभिव्यक्ति को कम करता है।आईएल में दिन 1 (छवि 1 सीडी) और कोला 2 दिन 4 (छवि 2 ई) में कॉलर और कोल 31 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति(इंटरल्युकिन).33-कमी वाले चूहों ने IL की भूमिका का संकेत दिया(इंटरल्युकिन)-33 चोट के लिए शीघ्र प्रतिक्रिया में। हमने विस्तारित प्रयोग में अधिक जानवरों को शामिल करके इस संभावना का पता लगाया, IL में Collar, Colla2 और Col3al के बढ़े हुए प्रतिलेख स्तर को देखते हुए(इंटरल्युकिन).-33-दिन 1 में कमी वाले चूहे (चित्र 3ए-सी)।

यह देखने के बाद कि आईएल(इंटरल्युकिन)-33 यूयूओ के अधीन चूहों से गुर्दे के ऊतकों में सेल नाभिक के लिए स्थानीयकृत, हमने आगे पूछा कि क्या आईएल में परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति देखी गई है(इंटरल्युकिन)-33-यूयूओ के बाद 1 दिन में कमी वाले चूहे प्रभावशाली, परमाणु आईएल के रिलीज होने के कारण थे-33 फ़ंक्शन या बाह्य कोशिकीय आईएल की अनुपस्थिति के कारण(इंटरल्युकिन)-33. हमने IL . को लक्षित करने वाले एक तटस्थ एंटीबॉडी के प्रशासन द्वारा बाद वाले विकल्प को संबोधित किया(इंटरल्युकिन)-33 UUO से पहले जंगली प्रकार के चूहों के लिए (चित्र 3D)। इस उपचार ने IL . के फाइब्रोजेनिक फेनोटाइप को पुन: पेश नहीं किया(इंटरल्युकिन)33 म्यूटेंट, इस परिकल्पना को मजबूत करते हैं कि आईएल . की अनुपस्थिति में प्रोफाइब्रोटिक जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि देखी गई है(इंटरल्युकिन)-33 बाह्य कोशिकीय IL . के बजाय परमाणु की कमी के कारण था(इंटरल्युकिन)-33.

चित्रा 3.आईएल(इंटरल्युकिन)-33 UUO के प्रारंभिक चरण में कोलेजन की अभिव्यक्ति को कम करता है।

(एसी) IL . से गुर्दे में Collal, Colla2, और Col3al का प्रतिलेखन(इंटरल्युकिन)-33-/और WT चूहों l दिन के बाद दिखावा-ऑपरेशन (n=5 प्रति जीनोटाइप) या UUO(n=10प्रति जीनोटाइप)। (डी) एंटी-आईएल . के साथ इलाज किए गए डब्ल्यूटी चूहों से गुर्दे में Col3al का प्रतिलेखन(इंटरल्युकिन)-33, यूयूओ से पहले आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी या वाहन। यूयूओ (एन =10 प्रति उपचार समूह) या शम-ऑपरेशन (एन =5) के बाद किडनी को 24 घंटे काटा गया। प्रतिलेखन स्तर qRT-PCR द्वारा निर्धारित किया गया था। डेटा बिंदु अलग-अलग चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं, बार माध्य मान दिखाते हैं।**p<><>

आईएल . का ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण(इंटरल्युकिन)-33-कमी गुर्दे बाह्य मैट्रिक्स पुनर्गठन और कोलेजन गठन की एक प्रोफ़ाइल को प्रकट करते हैं।ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग द्वारा यूयूओ की प्रारंभिक प्रतिक्रिया की अधिक विस्तार से जांच करने के लिए, आरएनए को आईएल . के गुर्दे से निकाला गया था(इंटरल्युकिन)-33-यूयूओ के 24 घंटे बाद कमी और जंगली प्रकार के चूहे। एक जोड़ी-वार फिशर के रैखिक विभेदक का उपयोग WT और IL के बीच शीर्ष 5 प्रतिशत (200 जीन) विभेदित जीन की पहचान करने के लिए किया गया था।(इंटरल्युकिन)-33-एक प्रमुख घटक विश्लेषण (चित्र 4ए) में जीनोटाइप के बीच स्पष्ट अलगाव को प्रकट करने वाली कमी वाले गुर्दे। एक गैर-कठोर दृष्टिकोण (p .)<0.05,><0.25, and="" fold="" change="">1.3) ने इसके विपरीत IL . में 134 डाउनरेगुलेटेड और 46 अपग्रेडेड प्रोब की पहचान की(इंटरल्युकिन)33-/- (n=5) बनाम WT (n=4) (सप्लीमेंट टेबल S1), विशेष रूप से Col1a1, Col1a12 और Col3a1 के साथ-साथ मायोफिब्रोब्लास्ट से जुड़े Acta2 (चित्र 4B) के बीच। . इसके अलावा, डीएवीआईडी ​​एनोटेशन क्लस्टरिंग (टेबल एस 2) का उपयोग करके विभेदित रूप से व्यक्त जीन के जीन ऑन्कोलॉजी विश्लेषण ने कोलेजन और प्रोटीज इनहिबिटर के साथ-साथ पीडीजीएफ बाइंडिंग और ईसीएम-रिसेप्टर इंटरैक्शन से जुड़े जीओ-शर्तों के लिए एक सकारात्मक संवर्धन और जीओ- के लिए नकारात्मक संवर्धन का खुलासा किया। ऑक्सीडोरक्टेस गतिविधि और सोडियम-स्वतंत्र आयनों ट्रांसपोर्टरों से जुड़े शब्द।

चित्रा 4. आईएल . के बीच ट्रांसक्रिप्शनल अंतर का सारांश(इंटरल्युकिन)-33-यूयूओ के 24 घंटे बाद कमी और जंगली प्रकार के चूहे।

(ए) 3डी स्कैटर प्लॉट 200 जीनों के प्रमुख घटक विश्लेषण के आधार पर नमूनों के वितरण को दर्शाता है। (बी) शीर्ष विभेदित जीन का हीट मैप।

फाइब्रोब्लास्ट IL.33 का अवक्षेपण बढ़े हुए बाह्य मैट्रिक्स बयान के अनुरूप एक जीन हस्ताक्षर को बढ़ावा देता है।आईएल . के कार्य का पता लगाने के लिए(इंटरल्युकिन)-33प्रमुख IL . में(इंटरल्युकिन)-33-बाधित गुर्दे की कोशिका आबादी को व्यक्त करते हुए, हमने सुसंस्कृत मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट को IFN-y और TGF- के लिए 24 घंटे के लिए I-33 के siRNA की मध्यस्थता वाली खराबी के लिए उजागर करके एक मायोफिब्रोब्लास्ट फेनोटाइप की ओर तिरछा कर दिया। कुशल नॉकडाउन को प्रोटीन और प्रतिलेख स्तर (छवि 5 ए) दोनों पर सत्यापित किया गया था और इसके साथ प्रोफाइब्रोटिक COL3A1, COL5A1 और TAGLN (छवि 5B-D) के mRNA और प्रोटीन स्तर में वृद्धि हुई थी। प्रारंभिक विश्लेषणों ने टीजीएफ- की भागीदारी का संकेत दिया और हमें ट्रांसक्रिप्शनल रूप से प्रोफाइल पूल, सुसंस्कृत मानव फाइब्रोब्लास्ट को सीआरएनए से आईएल के साथ इलाज करने के लिए प्रेरित किया(इंटरल्युकिन)-33 और IFN-y द्वारा सक्रिय (IL . को प्रेरित करने के लिए)(इंटरल्युकिन)-33 अभिव्यक्ति) या 24 घंटे के लिए आईएफएन-वाई और टीजीएफ-बी के संयोजन द्वारा इस विश्लेषण ने आईएल की कमी से जुड़े 64 विभेदित रूप से व्यक्त जीन की पहचान की(इंटरल्युकिन)-33(adj. p<0.05 and="" fold="" change="">1.5, अंजीर 5ई), जिनमें से 35 साइटोकाइन उपचार (छवि 5ई, एफ) दोनों के लिए सामान्य थे। इसके अलावा, अधिकांश जीनों ने दोनों स्थितियों में समान रुझान दिखाया, भले ही वे उनमें से केवल एक (छवि 5F) के तहत अंतर अभिव्यक्ति के लिए चुनी गई सीमा तक पहुंच गए हों, इस धारणा का समर्थन करते हुए कि आईएल को बाधित करने का प्रभाव(इंटरल्युकिन)-33 दोनों स्थितियों में समान था। जीन ऑन्कोलॉजी विश्लेषण के लिए, इसलिए, हमने उन जीनों पर विचार किया, जिन्हें IL . द्वारा आंशिक रूप से व्यक्त किया गया था(इंटरल्युकिन)-33 कम से कम एक शर्त के तहत कमी और एनोटेशन क्लस्टरिंग (तालिका S3), यूयूओ-एक्सपोज़्ड, आईएल में हमारी खोज के अनुरूप(इंटरल्युकिन)-33-गुर्दे की कमी, हमने पाया कि IL का निषेध(इंटरल्युकिन)-33 फ़ाइब्रोब्लास्ट में कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स घटकों से जुड़े GO-शब्दों के लिए समृद्ध जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। इसके अलावा, I -33 की कमी से दमित जीनों को भड़काऊ उत्तेजना की प्रतिक्रिया से जुड़े GO- शर्तों के लिए समृद्ध किया गया था। साथ में, हमारे डेटा का अर्थ है कि IL(इंटरल्युकिन)-33 फ़ाइब्रोब्लास्ट में अभिव्यक्ति बाह्य मैट्रिक्स निक्षेपण और मायोफिब्रोब्लास्ट सक्रियण से संबंधित टेपों के अपग्रेडेशन को कम करने का कार्य करती है, जबकि कुछ हद तक भड़काऊ टेप आईएल द्वारा समर्थित हैं(इंटरल्युकिन)-33.

चित्रा 5. फाइब्रोब्लास्ट आईएल . की कमी(इंटरल्युकिन)-33बढ़े हुए बाह्य मैट्रिक्स निक्षेपण के अनुरूप जीन हस्ताक्षर को लागू करता है।

आईएल . की अभिव्यक्ति(इंटरल्युकिन)33 (ए), सीओएल 5 ए 1 (बी), एफआईबीएल 5 (सी) और टीजीएलएन (डी) आईएल के साथ इलाज किए गए मानव फाइब्रोब्लास्ट में अभिव्यक्ति(इंटरल्युकिन)-33-विशिष्ट और तले हुए siRNA को gRT-PCR (शीर्ष पैनल) और पश्चिमी धब्बा (निचले पैनल) द्वारा मापा गया था। बार्स 4 स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान दिखाते हैं,*p<0.05.(e)venn diagram="" comparing="" differential="" expression="" of="" transcripts="" in="" response="" to="" the="" silencing="" of="">(इंटरल्युकिन)33 नियंत्रण और सक्रिय कोशिकाओं के बीच।

(एफ) IL . के siRNA- साइलेंसिंग के जवाब में विभेदित रूप से व्यक्त किए गए टेप दिखाने वाला हीट मैप(इंटरल्युकिन)-33 नियंत्रण और सक्रिय सेल में।

आईएल . का अवक्षयण(इंटरल्युकिन)-33 सक्रिय फ़ाइब्रोब्लास्ट में एक भड़काऊ फ़िनोटाइप पर एक मायोफिब्रोब्लास्टिक का पक्षधर है।हमारे अवलोकन के आधार पर कि I-33 का प्रभाव जारी रहता है और समय के साथ अधिक स्पष्ट हो जाता है, भले ही IL(इंटरल्युकिन)-33 अभिव्यक्ति में गिरावट (चित्र S2A, B), हमने आगे पूछा कि क्या IL . का मुख्य परमाणु कार्य है(इंटरल्युकिन)-33 प्रो-फाइब्रोटिक प्रभावकों के प्रत्यक्ष विनियमन के बजाय फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव का विनियमन हो सकता है। उत्तेजना होने पर, मौन फाइब्रोब्लास्ट और अन्य मेसेनकाइमल कोशिकाएं भड़काऊ और / या सिकुड़ा हुआ कार्य विकसित करती हैं। भड़काऊ फाइब्रोब्लास्ट और सिकुड़ा हुआ मायोफिब्रोब्लास्ट के बीच का स्पेक्ट्रम खराब परिभाषित रहता है और संभवतः दो अलग-अलग फेनोटाइप के बजाय एक स्लाइडिंग संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, ओहलुंड एट अल.23 द्वारा हाल ही में एक प्रकाशन ने कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) की तुलना अर्ध-अग्नाशयी स्टेलेट कोशिकाओं से की, एक भड़काऊ फेनोटाइप की पहचान की, जिसे आईसीएएफ कहा जाता है (साइटोकिन-स्रावित ट्यूमर ऑर्गेनोइड के साथ ट्रांसवेल्स में सह-सुसंस्कृत और उच्च और निम्न स्तर को व्यक्त करता है। इल(इंटरल्युकिन)6 और एसएमए, क्रमशः [आईएल(इंटरल्युकिन).dPa-SMAl]) और एक सिकुड़ा हुआ मायोफिब्रोब्लास्टिक फेनोटाइप, myCAFs (IL .)(इंटरल्युकिन)6 "ए-एसएमए-, घने मोनोलयर्स में सुसंस्कृत), ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग और आईसीएएफ और एमवीसीएएफ की तुलना ने विशेषता ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल की पहचान की। जबकि एक भड़काऊ फेनोटाइप (आईसीएएफ) के साथ फाइब्रोब्लास्ट ने अपनी अभिव्यक्ति को बढ़ायाइंटरल्यूकिन्सऔर केमोकाइन्स, मायोफिब्रोब्लास्टिक फेनोटाइप (myCAFs) वाले लोगों को टीजीएफ-प्रतिक्रिया जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और कोलाजेन्स सहित बाह्य मैट्रिक्स घटकों की विशेषता थी। हमने इस डेटा सेट का उपयोग जीएसईए सॉफ्टवेयर में फेनोटाइप्स और प्रदर्शन किए गए जीन सेट संवर्धन विश्लेषण के बीच शीर्ष अंतर विनियमित जीन से युक्त हस्ताक्षर सूची बनाने के लिए किया था। परिणामों ने संकेत दिया कि I-33 के निषेध ने एक सिकुड़ा हुआ मायोफिब्रोब्लास्टिक फेनोटाइप (myFBL) का समर्थन किया और मानव फाइब्रोब्लास्ट्स (चित्र। 6A, B, टेबल S4) में एक भड़काऊ फेनोटाइप (iFBL) को बाधित किया, इस प्रकार हमारे जीन ऑन्कोलॉजी विश्लेषण के परिणामों से सहमत हुए। . इस बिंदु पर, हमने अपना ध्यान IL . की ओर लगाया(इंटरल्युकिन)6 और CXCL8, साइटोकिन्स जिन्हें iCAFs के लिए मार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है, यह पाते हुए कि हालांकि ये जीन हमारे प्रतिलेखीय विश्लेषण में अंतर अभिव्यक्ति के मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं, उनके अभिव्यक्ति के स्तर में कमी का पता qRT-PCR द्वारा IL की कमी के बाद लगाया जा सकता है।(इंटरल्युकिन)-33(चित्र.6सी, डी)। हमारे प्रतिलेखीय विश्लेषण (छवि 5F) में पाए जाने वाले भड़काऊ मध्यस्थों के बीच, हमने एंटी-आईएल के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं में CCL7 और CCL8 के लिए अभिव्यक्ति में कमी की भी पुष्टि की।(इंटरल्युकिन)-33 siRNA (चित्र 6ई, एफ)।

इन टिप्पणियों ने हमें यह जांचने के लिए प्रेरित किया कि क्या हमारे निष्कर्षों का अनुवाद 1 दिन पर murine UUO मॉडल में किया जा सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण (Fg.6G) और परिमाणीकरण (चित्र। 6H) ने IL के शामिल होने का खुलासा किया।(इंटरल्युकिन)6-चेन एट अल4 द्वारा ट्रांसक्रिप्ट स्तर पर टिप्पणियों के समान, जंगली-प्रकार के गुर्दे में कोशिकाओं को व्यक्त करना। इसके विपरीत, हमने IL . की संख्या में काफी कमी देखी(इंटरल्युकिन)-6-आईएल में सकारात्मक कोशिकाएं(इंटरल्युकिन)-33- चूहों, हमारे इन विट्रो-जनरेटेड मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट डेटा के साथ अच्छे समझौते में हैं।

चित्रा 6. आईएल . की कमी(इंटरल्युकिन)-33 फाइब्रोब्लास्ट को मायोफिब्रोब्लास्टिक फेनोटाइप की ओर तिरछा करता है।

(ए, बी) जीन सेट संवर्धन विश्लेषण से पता चला है कि कोशिकाओं को आईएल . के साथ इलाज किया जाता है(इंटरल्युकिन)-33-विशिष्ट siRNA को मायोफिब्रोब्लास्ट (myFBL) बनाम इंफ्लेमेटरी फ़ाइब्रोब्लास्ट (iFBL) हस्ताक्षर के लिए सकारात्मक रूप से समृद्ध किया गया था और एक भड़काऊ बनाम अर्ध-फ़ाइब्रोब्लास्ट हस्ताक्षर के लिए नकारात्मक रूप से समृद्ध किया गया था। (CF) IL का ट्रांसक्रिप्शन(इंटरल्युकिन)6 (सी), आईएल(इंटरल्युकिन)8 (डी), सीसीएल 7 (ई) और सीसीएल 8 (एफ) मानव फाइब्रोब्लास्ट में आईएल . के साथ इलाज किया जाता है(इंटरल्युकिन)33-विशिष्ट या तले हुए siRNA को gRT-PCR द्वारा मापा गया। प्रत्येक डेटा बिंदु स्वतंत्र प्रयोगों से तकनीकी तीन प्रतियों के औसत मूल्यों को दर्शाता है। (जी) डब्ल्यूटी और आईएल से शम या यूयूओ सर्जरी के 4 दिन बाद गुर्दे के वर्गों के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ काटा गया।(इंटरल्युकिन)-33-/- चूहों और आईएल . के लिए प्रतिरक्षित(इंटरल्युकिन)-6(भूरा संकेत)। स्केल बार =100 उम। (एच) सिग्नल की अंधाधुंध मात्रा का ठहराव प्रति उच्च-शक्ति दृश्य क्षेत्र में सकारात्मक कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना करता है। व्यक्तिगत डेटा बिंदु एक माउस में सकारात्मक कोशिकाओं की औसत संख्या दिखाते हैं, उच्चतम घनत्व वाले क्षेत्रों में 3 उच्च-शक्ति क्षेत्रों की गणना करते हैं। *पी<>

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