एक उपन्यास, गतिभंग माउस मॉडल गतिभंग Telangiectasia के कारण एक नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक बकवास उत्परिवर्तन (भाग 2)

अधिक जानकारी के लिए कृपया संपर्क करेंdavid.wan@wecistanche.com

3.0 चर्चा

डीडीआर मार्ग में एक माध्यमिक हिट के अलावा जीनोटॉक्सिक तनाव को बढ़ाकर, हमने एक उपन्यास माउस मॉडल तैयार किया जो किसी भी मॉडल के एटी लक्षणों का सबसे व्यापक सेट प्रदर्शित करता है। इसमें अनुमस्तिष्क शोष से जुड़े गंभीर और प्रगतिशील गतिभंग और पीएन गुणों के गड़बड़ी के साथ-साथ कैंसर की एक उच्च घटना और प्रतिरक्षा कोशिका विकास में दोष शामिल हैं। साथ में, इन सहरुग्णताओं में अकाल मृत्यु के तीन प्रमुख कारण शामिल हैं:एटी—प्रत्येक योगदानलगभग एक तिहाई मौतों के लिए। इनमें से, गतिभंग का अक्षम प्रभाव सबसे अधिक पैठ है और रोगियों और देखभाल करने वालों द्वारा उनके जीवन की गुणवत्ता पर सबसे बड़ा प्रभाव होने की सूचना दी जाती है। इस कारण से, इस नए माउस मॉडल में गतिभंग और अनुमस्तिष्क शोष की उपस्थिति का बहुत महत्व है, क्योंकि यह पहली बार न केवल तंत्रिका संबंधी शिथिलता के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक संसाधन प्रदान करता है, बल्कि विवो मॉडल में एक गंभीर रूप से आवश्यक भी है। परीक्षण गंभीर रूप से आवश्यक एटी चिकित्सीय, जैसे कि रीड-थ्रू यौगिकों का हम यहां वर्णन करते हैं। हमने Atm3535 में गतिभंग की समग्र प्रगति के बीच कई समानताएं पाईं; Aptx चूहों औररोगियों में. क्लिनिकल एटी में, मोटर की कमी लगभग 2 साल की उम्र तक देखी जा सकती है, जब माता-पिता और डॉक्टर बच्चे से एक चिकनी, रिफ्लेक्सिवली कोऑर्डिनेटेड गेट में संक्रमण की कम क्षमता का पता लगाते हैं-दुर्भाग्य से, बीमारियों के कारण पहले के चरणों में मोटर दोषों के बारे में बहुत कम जानकारी है। कम प्रसार और प्रारंभिक नैदानिक ​​परीक्षण की वर्तमान कमी (रोथब्लम-ओवियाट एट अल। 2016)। रोगी आमतौर पर बिना सहायता के चलना सीखते हैं और जीवन के पहले 4 से 5 वर्षों के दौरान न्यूरोलॉजिकल लक्षण स्थिर बने रहते हैं (रोथब्लम-ओवियट एट अल। 2016)। हमें Atm735×R3x में मोटर की कमी की एक समान प्रारंभिक प्रगति मिली; Aptx ^ 'चूहों, P8 (राइटिंग रिफ्लेक्स डेफिसिट) पर शुरुआती हल्के मोटर घाटे का पता लगाने के बाद, सापेक्ष स्थिरता की अवधि के बाद, P210 के बाद प्रगतिशील और गंभीर गतिभंग की शुरुआत से पहले, जिसमें चाल, स्टार्टल रिफ्लेक्स, कंपकंपी और लोकोमोटर में परिवर्तन शामिल थे। गतिविधि। इन निष्कर्षों से कई महत्वपूर्ण प्रश्न उठते हैं, जिनमें एटीएम और/या एपीटीएक्स की न्यूरोडेवलपमेंटल भूमिका है या नहीं

अनुमस्तिष्क विकार के प्रारंभिक चरण पर केंद्रित भविष्य के अध्ययन यह समझने में महत्वपूर्ण होंगे कि क्या सेरिबैलम सामान्य रूप से शिथिलता से पहले विकसित होता है या क्या विकास संबंधी दोष एक प्रारंभिक कारण हैं। हमने यह भी पाया, एटी रोगियों के समान, कि देर से विकसित होने वाले गतिभंग की गंभीरता परिवर्तनशील थी, कुछ चूहों के साथ एक अनाड़ी, उच्च-कदम वाले रियर गेट (वीडियो 3) और अन्य लगभग पूरी तरह से पीछे के ट्रंक के विरूपण के माध्यम से चलते थे। Fig.1E और वीडियो 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958)। कुल मिलाकर, हमने पाया कि एटीएम?35×xR35×; Aptx के चूहों ने एटी रोगियों में देखे गए मोटर समन्वय के समान एक नेत्रहीन गहरा और औसत दर्जे का प्रगतिशील नुकसान विकसित किया, जिसे Atm या Aptx की कम से कम एक प्रति की अभिव्यक्ति द्वारा बचाया गया था। एटी में मोटर समन्वय के नुकसान को मस्तिष्क में इसके अपेक्षाकृत चयनात्मक न्यूरोपैथोलॉजी और गतिभंग के कई अलग-अलग रूपों में इसकी कारण भूमिका के कारण अनुमस्तिष्क अध: पतन के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है (होचे एट अल। 2012)। के साथ संगतएटी रोगीन्यूरोइमेजिंग स्टडीज (वालिस एट अल। 2007; सहमा एट अल। 2015; सहमा एट अल। 2014; दिनीन एट अल। 2020; तवानी एट अल। 2003; क्वारेंटेली एट अल। 2013), हम उस अनुमस्तिष्क आकार को एटीएम 735 × आर 3 × में पाते हैं। ; Aptx के चूहे शुरू में सामान्य होते हैं, लेकिन न्यूरोलॉजिकल फ़ंक्शन में परिवर्तन के साथ-साथ उत्तरोत्तर शोष होते हैं। जबकि अनुमस्तिष्क ऊतक के नुकसान को मनुष्यों में गतिभंग का एक मुख्य कारण माना गया है, यह नैदानिक ​​​​डेटा से स्पष्ट नहीं है कि गतिभंग की गंभीरता अनुमस्तिष्क अध: पतन की सीमा का एक अच्छा भविष्यवक्ता है जो पोस्टमॉर्टम (एगुइलर एट अल। 1968 बी: क्रॉफर्ड एट अल, 2006) पाया गया। : दिनीन एट अल.2020)। एटीएम में?35×R35×; Aptx ^ चूहों, हम पर्किनजे न्यूरॉन डेंड्राइट परत के पतले होने से जुड़े स्पष्ट शोष पाते हैं जो देर से, गंभीर व्यवहार घाटे से पहले होता है। एटीएम में हमारे हिस्टोलॉजिकल अवलोकन?35xR35×; Aptx'mice का सुझाव है कि अनुमस्तिष्क कोशिकाओं के गहन नुकसान के बजाय अनुमस्तिष्क समारोह में परिवर्तन, कई एससीए (शक्कोट्टई एट अल। 2011) में महत्वपूर्ण पीएन हानि से पहले व्यवहार संबंधी दोषों के अवलोकन के अनुरूप, एटैक्सिक फेनोटाइप का कारण बनने के लिए पर्याप्त हैं। लोरेंजेटी एट अल। 2000; क्लार्क एट अल। 1997; जयबल एट अल।2016)। चूहों में गतिभंग उत्पन्न करने के लिए एटीएम और एपीटीएक्स की कमी का कारण जब मनुष्यों में गतिभंग पैदा करने के लिए पर्याप्त है, तो इसका कारण स्पष्ट नहीं है। एक संभावना यह है कि कृंतक मस्तिष्क प्रत्येक दिन कोशिकाओं को प्रभावित करने वाले 10-20 k डीएनए घावों (लिंडाहल और बार्न्स 2000) का जवाब देते हुए प्रतिपूरक पथ या निरर्थक प्रोटीन का अधिक लचीले ढंग से उपयोग कर सकता है। इस चुनौती को संभावित रूप से पूरा करने के लिए डीएनए मरम्मत के कई रूप मौजूद हैं, जिनमें बेस एक्सिशन रिपेयर (बीईआर), न्यूक्लियोटाइड एक्सिशन रिपेयर (एनईआर) शामिल हैं।

सिस्टैंच के बारे में अधिक जानने के लिए यहां क्लिक करें

साथ ही समजातीय और गैर-समरूप अंत में शामिल होना (HEJ और NHEJ, क्रमशः), जिनमें से सभी एटीएम और एपीटीएक्स को शामिल किया गया है (चाउ एट अल। 2015; कैग्लायन एट अल। 2017; वाकासुगी एट अल। 2014; टुम्बले एट अल। 2018; चटर्जी और वॉकर 2017) वैकल्पिक रूप से, यह हो सकता है मामला है कि अकेले एटीएम या एपीटीएक्स में कमी माउस के तुलनात्मक रूप से कम जीवनकाल के दौरान सेल स्वास्थ्य को पर्याप्त रूप से प्रभावित नहीं करती है, और इस प्रकार इस समय अवधि में प्रकट होने के लिए डीएनए क्षति के पर्याप्त संचय को प्राप्त करने के लिए दोनों प्रोटीनों को समाप्त करना आवश्यक है। इस संभावना को इस तथ्य से बल मिलता है कि एटीएम और एपीटीएक्स में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में अलग-अलग जैव रासायनिक गुण और कार्यात्मक भूमिकाएं हैं, और इसलिए दोनों में कमी की भविष्यवाणी जीनोम स्थिरता (यानी, जीनोटॉक्सिक तनाव में वृद्धि) के लिए एक व्यापक हिट का कारण होगी। हमारी खोज से पता चलता है कि चूहों में न्यूरोलॉजिकल दोषों को प्रेरित करने के लिए दो जीनोम स्टेबिलिटी पाथवे प्रोटीन की आवश्यकता होती है, यह दृढ़ता से बताता है कि यह डीएनए की मरम्मत में एटीएम के ओरिओल का नुकसान है, बजाय ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस सिग्नलिंग, माइटोफैगी, या माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में संभावित कार्यों के कारण जो अनुमस्तिष्क दोष का कारण बनता है ( शीलो 2020)। विकल्प, हालांकि, पूरी तरह से खारिज नहीं किया जा सकता है, क्योंकि एपीटीएक्स, एटीएम की तरह, मस्तिष्क कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर देखा गया है, जहां इसे माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (मेघेर और लाइटोवलर्स 2014; साइकोरा एट अल। 2011) के प्रसंस्करण का समर्थन करने के लिए माना जाता है। यह नया माउस मॉडल इन संभावनाओं का पता लगाने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है और यंत्रवत् रूप से परिभाषित करता है कि कैसे एटीएम और एपीटीएक्स की हानि अंततः अनुमस्तिष्क शिथिलता का कारण बनती है। AtmR35XR35X से रिकॉर्ड किए गए PNs में देखे गए बायोफिजिकल गड़बड़ी; Aptx चूहे इसी तरह गतिभंग के कई अन्य माउस मॉडल में पाए जाते हैं। इसमें पीएन इनपुट रेजिस्टेंस, मेम्ब्रेन कैपेसिटेंस और एपी थ्रेशोल्ड और चौड़ाई में देखे गए बदलाव शामिल हैं, जिनका वर्णन एससीए के माउस मॉडल जैसे 1, 3, और 7 में भी किया गया है। 'ऑर्को एट अल.2015)। इसके अलावा, पीएन एक्शन पोटेंशिअल फायरिंग फ़्रीक्वेंसी में प्रगतिशील कमी हम सकारात्मक रूप से AtrnR35XR35X में गतिभंग के विकास से संबंधित हैं; Aptx'mice को SCA 1, 2, 3,5, 6, और 13 के साथ-साथ कुछ एपिसोडिक रूपों (समीक्षा देखें (कुक, फील्ड्स, और वाट 2021)) सहित बड़ी संख्या में गतिभंग माउस मॉडल में रिपोर्ट किया गया है। अलग-अलग सेलुलर दोषों के कारण कई अलग-अलग गतिभंगों में देखे गए पीएन गड़बड़ी में महत्वपूर्ण ओवरलैप को देखते हुए, पीएन एपी फायरिंग आवृत्तियों को बहाल करना एक व्यापक-आधारित चिकित्सीय दृष्टिकोण माना गया है। हालाँकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या पीएन फायरिंग कम होना गतिभंग का एक कारण कारक है। इसके अलावा, प्रायोगिक साक्ष्य से पता चलता है कि पीएन गतिविधि में परिवर्तन वास्तव में पीएन फिजियोलॉजी (डेल'ऑर्को एट अल। 2015) की चल रही बीमारी से संबंधित हानि के दौरान होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए एक सामान्यीकृत प्रतिक्रिया हो सकती है। इस प्रकार, सभी अनुमस्तिष्क गतिभंगों में निरंतर प्रयासों की आवश्यकता होती है ताकि अनुमस्तिष्क तंत्रिका संकेतन में विशिष्ट परिवर्तनों के लिए रोग के कारण आनुवंशिक, आणविक और सेलुलर व्यवधानों को जोड़ा जा सके जो अंततः गतिभंग उत्पन्न करते हैं। इस प्रयास में महत्वपूर्ण महत्व यह निर्धारित करना होगा कि क्या रोग पैदा करने वाले अनुमस्तिष्क दोष आमतौर पर अनुमस्तिष्क समारोह के नुकसान के माध्यम से गतिभंग का कारण बनते हैं (जैसे, आंदोलन के दौरान समन्वय संकेतों का नुकसान), या एक प्रमुख-नकारात्मक प्रभाव से (जैसे, डाउनस्ट्रीम तंत्रिका को बाधित करना) असामान्य तंत्रिका आउटपुट पैटर्न वाले सर्किट)। अंततः, जबकि अनुमस्तिष्क गतिभंग को संबोधित करने के लिए एक सामान्य चिकित्सीय रणनीति का सबसे बड़ा प्रभाव होगा, एक निर्देशित दृष्टिकोण जो सेलुलर शिथिलता के विशिष्ट आनुवंशिक और आणविक कारणों को संबोधित करता है, अंततः एक प्रभावशाली चिकित्सीय को सफलतापूर्वक विकसित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। डीएनए में कमी के बीच यंत्रवत लिंक एटीएम और एपीटीएक्स और पीएन डिसफंक्शन जैसे स्थिरता प्रोटीन स्पष्ट नहीं हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि पीएन पर एटीएम और एपीटीएक्स नुकसान का प्रभाव आंतरिक है, क्योंकि हम ग्रेन्युल कोशिकाओं के प्रीसानेप्टिक गुणों में परिवर्तन या उनके सेलुलर नुकसान (जीसीएल मोटाई में कोई बदलाव नहीं) के सबूत नहीं पाते हैं। इसके अलावा, जब हमने एटीएम- और एपीटीएक्स-कमी वाले पीएन और वाइल्डटाइप में अवर ओलिवरी इनपुट की अल्पकालिक प्लास्टिसिटी में अंतर देखा, तो ये परिणाम संभावित रूप से सीए 2 * होमियोस्टेसिस में एक व्यवधान की ओर इशारा करते हैं जो संभावित रूप से इनोसिटोल 1,4, 5- में कमी के माध्यम से होता है। ट्राइफॉस्फेट रिसेप्टर 1 (ltpr1) अभिव्यक्ति, एससीए 1,2, और 3 माउस मॉडल के साथ-साथ एटीएम की कमी वाले चूहों (किम एट अल। 2020; चेन एट अल। 2008; डेमिरसी एट अल। 2009; शक्कोट्टई एट) में देखे गए समान अल.2011)। हालांकि यह भविष्य की परीक्षा और तुलना के लिए एक आशाजनक अवसर प्रदान करता है, यह अभी तक स्पष्ट नहीं है, यहां तक ​​​​कि एससीए के लिए भी, क्या सीए * होमियोस्टेसिस में परिवर्तन, कारण कारक है या सिर्फ एक अन्य लक्षण या यहां तक ​​​​कि रोगग्रस्त या परेशान पीएन (डेल) की प्रतिपूरक प्रतिक्रिया है। 'ऑर्को एट अल.2015)। प्रतिरक्षा प्रणाली में, एटीएम को डीएनए ब्रेक की मरम्मत में शामिल किया जाता है जो स्वाभाविक रूप से बी-और टी-सेल अग्रदूतों में एंटीजन रिसेप्टर जीन के जीन पुनर्व्यवस्था के दौरान होता है, इन कोशिकाओं के एंटीजन रिसेप्टर (एलजी और टीसीआर) विविधता के लिए महत्वपूर्ण घटना। हमारी ढूँढना किटी सेलमनुष्यों और एटी नॉकआउट चूहों (शूबर्ट, रीचेनबैक, और ज़िलेन 2002; हैथकॉक एट अल। 2013; चाओ, यांग, और जू 2000; बार्लो एट अल। 1996) में पूर्व अध्ययनों के अनुरूप रक्त में अनुपात काफी कम हो गया है। परिधि में टी-कोशिकाओं की यह कमी सेलुलर और विनोदी प्रतिरक्षा दोनों में एक दोष के साथ संबंध रखती है। महत्वपूर्ण रूप से, हमने पाया कि एटीएम जीन की एक प्रति की अभिव्यक्ति रक्त में सीडी 4 प्लस की कमी को बहाल करने के लिए पर्याप्त है, यह दर्शाता है कि आंशिक एटीएम अभिव्यक्ति को बहाल करने में सक्षम उपचारों में चिकित्सीय प्रभावकारिता होगी। यद्यपि हमने इस पेपर में बी-सेल विकास का आकलन नहीं किया है, यह संभावना है कि इसी तरह के निष्कर्ष उस प्रक्रिया पर लागू होंगे जो उनकी यांत्रिक समानता (मार्शल एट अल। 2018) को देखते हुए लागू होंगे। जैसा कि अपेक्षित था, परिधीय रक्त में टी-कोशिकाओं की कमी दोषपूर्ण थाइमोसाइट विकास से संबंधित है। थाइमस में, हमें दो मुख्य दोष मिले। एक, मुख्य रूप से APTX की कमी से प्रेरित, DN3 से DN4 संक्रमण में एक दोष के रूप में प्रकट होता है जो TCR ठिकाने के प्रारंभिक पुनर्व्यवस्था के साथ मेल खाता है। अन्य दोष, जो मुख्य रूप से एटीएम की कमी के कारण होता है, डबल-पॉजिटिव सीडी4*सीडी8 की एकल-पॉजिटिव कोशिकाओं, मुख्य रूप से सीडी4' थायमोसाइट्स की घटती प्रगति के साथ संबंध रखता है। जबकि APTX की खोज आश्चर्यजनक थी, क्योंकि इसकी कमी (AOA 1) प्रतिरक्षा घाटे से जुड़ी नहीं है, APTX को XRCC4 (क्लेमेंट्स एट अल। 2004) सहित TCR जीन पुनर्व्यवस्था प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है। TCR जीन पुनर्व्यवस्था के दौरान एंड-जॉइनिंग मैकेनिज्म में APTX की भूमिका को परिभाषित करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययन होंगे

महत्वपूर्ण है, और संभावना है कि माइक्रोहोमोलॉजी के उपयोग जैसे वैकल्पिक अंत-जुड़ने तंत्र, इसकी अनुपस्थिति में प्रतिरक्षा घाटे की कमी के लिए जिम्मेदार हैं, इसके लिए और जांच की आवश्यकता है (बोग एट अल। 1997)। एटीएम की उत्तरजीविता?35×/R35×; Aptx'mice पिछले AT माउस मॉडल की तुलना में काफी लंबा है। इसकी तुलना में, पहलाएटी KOबार्लो एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया माउस मॉडल। जन्म के बाद आमतौर पर 2-4 महीनों के भीतर थाइमोमा से मृत्यु हो गई (बार्लो एट अल। 1996)। इसमें और कई अन्य नॉकआउट एटी माउस मॉडल में कैंसर से बचे रहने की संभावना आनुवंशिक है, क्योंकि उत्परिवर्तन को परेशान करने वाली पृष्ठभूमि के तनाव को ए / जे और सी 57 बीएल / 6 के साथ कैंसर के प्रसार और उत्तरजीविता पर महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया गया है।

BALBC और 129S स्ट्रेन (Genik et al. 2014) पर उत्तरजीविता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। तथ्य यह है कि हमारे एटीएम की कमी वाले चूहों को C57BL/6 पृष्ठभूमि पर बनाए जाने की संभावना है; कि Aptx*t चूहों में गतिभंग नहीं होता है, यह उनकी तुलनात्मक रूप से लंबी उम्र है। यह देखते हुए कि Atm35xR35×; संभावना नहीं है कि एटी केओ चूहों में शुरुआती मौत एक एटैक्सिक फेनोटाइप के अवलोकन को रोकती है जो अन्यथा इन चूहों में विकसित होगी। हालाँकि, यह अज्ञात है कि क्या C57BL/6 पृष्ठभूमि गतिभंग के विकास के लिए लचीलापन प्रदान करती है, जैसा कि यह कैंसर के लिए करता है। रोग की गंभीरता को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक या संभवतः एपिजेनेटिक कारकों को परिभाषित करना भविष्य के चिकित्सीय विकास के लिए मार्ग प्रदान कर सकता है। हमारे माउस मॉडल में एटीएम और APTX अशक्त उत्परिवर्तन की वैश्विक प्रकृति को देखते हुए, हम पूरी तरह से इस बात से इंकार नहीं कर सकते हैं कि अतिरिक्त-अनुमस्तिष्क दोष भी गंभीर गतिभंग फेनोटाइप में योगदान कर सकते हैं, और इस प्रकार अग्रमस्तिष्क, ब्रेनस्टेम, रीढ़ की हड्डी में सेरिबैलम के बाहर भविष्य की परीक्षा , और यहां तक ​​कि मांसपेशियों को भी संचालित करने की आवश्यकता होगी। सेरिबैलम के भीतर, जबकि हमने सेरिबैलम के विभिन्न क्षेत्रों के भीतर पीएन फायरिंग गुणों में कुछ शारीरिक अंतर पाया, हमने एमएल चौड़ाई या पीएन घनत्व में क्षेत्रीय अंतर का पता नहीं लगाया। हालांकि, सेरिबैलम में एक समूहीकरण कारक के रूप में क्षेत्रीय शरीर रचना का उपयोग करने में चुनौतियां हैं, क्योंकि ऊतक के भौतिक सिलवटों का वर्णन कार्यात्मक, आणविक अभिव्यक्ति, या शारीरिक संपत्ति डोमेन की सीमाओं के साथ जरूरी नहीं है (ऐप्स और हॉक्स 2009) ; त्सुत्सुमी एट अल। 2015; गाओ, वैन बेउगेन, और डी ज़ीउव 2012; झोउ एट अल। 2014)। इन डोमेन के भीतर अनुमस्तिष्क दोषों की सीमा की जांच करने पर केंद्रित प्रयोग भविष्य के अध्ययनों में महत्वपूर्ण होंगे और एटी रोगियों में शारीरिक अंतर की वास्तविक रिपोर्टों की तुलना में (वेरहेगन एट अल। 2012; डी लियोन, ग्रोवर, और हफ 1976; अमरोमिन, बोडर, और टेप्लिट्ज 1979; मोनाको एट अल। 1988; टेरप्लान और क्रॉस 1969; स्ट्रिच 1966; सॉलिटेयर 1968; सॉलिटेयर और लोपेज़ 1967; एगुइलर एट अल। 1968a; पाउला-बारबोसा एट अल। 1983)। जबकि हम Atm735wR35x में गतिभंग की प्रगति में दो संभावित चरणों का पता लगाते हैं; Aptx चूहों, गंभीर गतिभंग का बाद का चरण चूहों में वयस्कता में विकसित होता है, मनुष्यों में बचपन-शुरुआत की तुलना में। यह कुछ न्यूरोडेवलपमेंटल अध्ययनों में इसके उपयोग को सीमित कर सकता है। साथ ही, भविष्य के प्रयोगों की व्याख्या को इस तथ्य पर ध्यान से ध्यान देना चाहिए कि यह नया मॉडल एक ही समय में दो जीनोम स्थिरता जीनों में शून्य उत्परिवर्तन व्यक्त करता है, ऐसी स्थिति जो मानव रोगियों में एटी या एओए 1 के साथ नहीं पाई गई है। अंत में, एटीएम की कमी से अनुमस्तिष्क विकृति और गतिभंग का कारण कहां, कब और कैसे होता है, यह एक चुनौती रही है, क्योंकि पूर्व एटीएम की कमी वाले चूहों में आमतौर पर सेलुलर और आणविक घाटे को एटैक्सिक फेनोटाइप से जोड़ने के लिए आवश्यक विशिष्ट विशेषताओं का अभाव होता है। जांच के कई आशाजनक रास्ते परिभाषित किए गए हैं, जिनमें न्यूरोनल स्तर पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जहां एटीएम को ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस सिग्नलिंग (चेन एट अल। 2003) और सिनैप्टिक फ़ंक्शन (ली एट अल। 2009; वेल एट अल। 2016) में फंसाया गया है। साथ ही ग्लियल फंक्शन, जहां हाल के साक्ष्य से पता चलता है कि ग्लिअल पैथोलॉजी अनुमस्तिष्क विकृति में एक प्रमुख कारक हो सकता है (कमिंस्की एट अल। 2016; कैंपबेल एट अल। 2016; पीटरसन, रिमकस, और वासरमैन 2012; वेयेमी एट अल। 2015)। यह उपन्यास पशु मॉडल मशीनी परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है कि कैसे एटीएम की कमी अनुमस्तिष्क विकृति और गतिभंग का कारण बनती है। इसके अतिरिक्त, यह मॉडल पहले से प्रस्तावित चिकित्सीय उम्मीदवारों (ब्राउन एट अल। 2004; चेन एट अल। 2003) और हमारे अपने एसएमआरटी यौगिकों (डु एट अल। 2013) के परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण प्रीक्लिनिकल टूल के रूप में सबसे महत्वपूर्ण रूप से काम कर सकता है। चिकित्सीय परीक्षण के लिए उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडल नहीं होने की गंभीर सीमाएं, विशेष रूप से एटी और एओए1 जैसे दुर्लभ विकारों के लिए, अतिरंजित नहीं किया जा सकता है।

4.0 सामग्री और तरीके

4.1 नैतिकता वक्तव्य

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार सख्ती से किया गया था। लुंडक्विस्ट इंस्टीट्यूट (31374-03, 31773-02) और यूसीएलए (एआरसी -2007-082, एआरसी {{3} में अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) प्रोटोकॉल के अनुसार सभी जानवरों को संभाला गया था। }). लुंडक्विस्ट संस्थान के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति (आश्वासन संख्या: डी 16-00213) द्वारा प्रोटोकॉल को मंजूरी दी गई थी। आवश्यक होने पर सहायता प्रदान करके और नैतिक समापन बिंदु चुनकर दर्द और पीड़ा को कम करने के लिए हर संभव प्रयास किया गया था।

4.2 चूहे

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>उत्तरी अफ्रीका की एक बड़ी आबादी में टी उत्परिवर्तन पाया गयापरमरीजों using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>टीजीए), मानव एटी पीटीसी की प्रतिकृति)। इसके बाद जीनोमिक एलील्स को 3-वे गेटवे रिएक्शन (ब्रैडली एट अल। 2012) का उपयोग करके नॉरकॉम स्तनधारी लक्ष्य वेक्टर के एक संशोधित संस्करण में क्लोन किया गया था। परिणामी लक्ष्य सदिशों को C2 ES कोशिकाओं (C57BI/6N, A. Nagy लैब, टोरंटो, कनाडा में व्युत्पन्न) में इलेक्ट्रोपोरेट किया गया और G418 (Gertsenstein et al.2010) के साथ चयन द्वारा सफलतापूर्वक लक्षित क्लोनों की पहचान की गई। एटीएम जीन लोकस में उत्परिवर्तित लक्ष्यीकरण कैसेट के एकीकरण की पुष्टि दक्षिणी धब्बा द्वारा की गई थी, और एटीएम पीटीसी उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पीसीआर उत्पादों की अनुक्रमण द्वारा, एटीएम स्थान में त्रुटि मुक्त लक्ष्यीकरण, और त्रुटि मुक्त कार्यात्मक घटकों की पुष्टि की गई थी।

वेक्टर (डेटा नहीं दिखाया गया)। ट्रांसजेनिक लाइनों को प्राप्त करने के लिए ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन के लिए सकारात्मक ES क्लोन का उपयोग किया गया था। ट्रांसजेनिक एलील में एक फ्लक्स्ड मानव बीटा-एक्टिन प्रमोटर-डेल्टा होता हैटीके1-नियो cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>टीजीए)एमएफजीसीसी;(अंजीर।1ए)। टीएम 62 डिग्री डिग्री पर निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करके दो एटीएम लाइनों का जीनोटाइपिंग किया गया था: एटीएम जीन फॉरवर्ड (एफ) प्राइमर: 5'-सीसीटीटीजीजीजीसीएटीएजीटीटीजीसीएएसीटीजी -3'; और एटीएम जीन रिवर्स (आर) प्राइमर: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', 151bp का वाइल्ड-टाइप एलील उत्पाद या 241bp का लक्षित एलील उत्पाद (अंजीर। 1A, 1B)। Atmn35 ~ और Atm035×v थे क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और बाद में C57BI/6J सरोगेट मदर्स का उपयोग करके 9 पीढ़ियों (99.2 प्रतिशत आइसोजेनिक) के लिए C57Bl/6J चूहों के साथ बैक-क्रॉस किया गया। Atm735× और Atm?35xऔर Atm 35×/Q35× F1 सिबलिंग Atm35 और Atm835X प्लस चूहों से प्राप्त प्रजनक थे। AtmR35×k35×: दोनों उपजाऊ पाए गए। Aptx नॉकआउट (Aptx) चूहे बनाए गए और डॉ। मैथ्यूज को डॉ। मैककिनोन (एहेल एट अल। 2006) से भ्रूण के रूप में प्रदान किए गए, और बाद में C57Bl/6J सरोगेट माताओं के माध्यम से पुनः प्राप्त किए गए। Aptx के चूहे C57Bl/6 और 129 मिश्रित पृष्ठभूमि पर हैं। एटीएम35k35; Atm35X से विभिन्न वाइल्डटाइप, विषमयुग्मजी और समयुग्मजी संयोजनों के Aptx चूहों का निर्माण किया गया; Aptxt प्रजनकों को Atm?35×R35 और Aptx^ चूहों को पार करके उत्पन्न किया गया था। गैट विश्लेषण और शेरपा परीक्षण (अंजीर। 2, 3) के लिए अनुदैर्ध्य व्यवहार अध्ययन में डबल उत्परिवर्ती और संबंधित नियंत्रण चूहों के एक समूह का उपयोग किया गया था। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल और वर्टिकल पोल टेस्ट प्रयोगों (अंजीर। 4, 7) के लिए आयु-मिलान वाले दोहरे उत्परिवर्ती और नियंत्रण चूहों के कई अतिरिक्त समूहों का उपयोग किया गया था। मूल AtmR35 × और Atm35 × पुनर्व्यवस्थित चूहों (Figs.5, 6, और 8) से पैदा हुए चूहों का उपयोग करके प्रतिरक्षाविज्ञानी और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोग किए गए थे। P 8-11 चूहों के कान के ऊतकों के नमूनों से जीनोटाइपिंग की गई। Transnetyx Inc. द्वारा संचालित रीयल-टाइम PCR विधियों का उपयोग प्रत्येक जानवर के जीनोटाइप को निर्धारित करने के लिए किया गया था। कान की बायोप्सी के साथ ही दिए गए पैर के अंगूठे के टैटू के जरिए जानवरों की पहचान की गई। Atm35 × और Atm35 × के लिए अद्वितीय प्राइमरों की मात्रा निर्धारित की गई और उनका उपयोग जंगली-प्रकार, विषमयुग्मजी और समरूप चूहों (ऊपर सूचीबद्ध) की पहचान करने के लिए किया गया। Aptx'and Aptx*" प्राइमरों का उपयोग उनके जीनोटाइप का आकलन करने के लिए किया गया था।

4.3 पशु स्वास्थ्य

जानवरों को P8, 45, 120,210,400 पर एक डिजिटल पैमाने के माध्यम से तौला गया। पशु मृत्यु को मृत पाए जाने के दिन के रूप में दर्ज किया गया था, या इच्छामृत्यु के दिन जब जानवर एक मानवीय समापन बिंदु पर पहुंच गए थे (पशु 60 के दशक के भीतर खुद को सही करने में असमर्थ था, महत्वपूर्ण बाल मैटिंग आत्म-संवारने की कमी या अत्यधिक संकट का संकेत था जैसा कि पशु चिकित्सा द्वारा नोट किया गया था। कर्मचारी)। मौत पर जानवरों के शवों को तुरंत फ्रीज कर दिया गया, और पोस्टमॉर्टम शवों को बैचों में ले जाया गया। मौत का संभावित कारण आंतरिक अंगों के दृश्य निरीक्षण द्वारा स्टाफ पशु चिकित्सक (डॉ कैटालिना गुएरा) के सहयोग से हमारी सर्वोत्तम क्षमता के लिए निर्धारित किया गया था। कुछ चूहों को मछली पालने का मैदान के कर्मचारियों द्वारा नरभक्षी या गलती से नष्ट कर दिया गया था और उन्हें

इसलिए "लापता" के रूप में लेबल किया गया। मृत्यु के बिना किसी स्पष्ट दृश्य कारण वाले चूहों को "अनिश्चित" लेबल किया गया था। चूहे जो थोरैसिक द्रव्यमान के साथ पाए गए थे जहां सामान्य रूप से युवा चूहों में थाइमस होगा उन्हें "थाइमिक कैंसर" के रूप में सूचीबद्ध किया गया था। अन्य सभी की पहचान की गई मृत्यु के संभावित कारणों (उदाहरण के लिए, बढ़े हुए यकृत, मूत्र अवरोध) को "अन्य" लेबल किया गया था।

4.4 व्यवहार

किसी भी व्यवहार परीक्षण को करने से पहले, चूहों को ~ 20 मिनट के लिए व्यवहार सूट के लिए तैयार किया गया था। दिन के अलग-अलग समय पर चूहों का परीक्षण किया गया, उनके दैनिक चक्र के अनुरूप। व्यवहार के आधार पर विभिन्न समय बिंदुओं पर संकेतित जीनोटाइप के भोले दोहरे उत्परिवर्ती चूहों पर व्यवहार परीक्षणों की एक बैटरी का प्रदर्शन किया गया था, लेकिन चूहों के एक ही समूह में। परीक्षणों की बैटरी में कैटवॉक गेट असेसमेंट (P45, 120,210, 400) और स्मिथक्लाइन-बीचम हारवेल इम्पीरियल-कॉलेज और रॉयल-लंदन-हॉस्पिटल फेनोटाइप असेसमेंट (SHERPA) टेस्ट (P30 और 400) का एक सबसेट शामिल था। ये परीक्षण यूसीएलए बिहेवियरल कोर द्वारा आयोजित किए गए थे। वर्टिकल पोल टेस्ट पर डबल म्यूटेंट और कंट्रोल चूहों की अतिरिक्त जांच की गई। प्रत्येक परीक्षण विषय के बीच सभी व्यवहार संबंधी उपकरणों को इथेनॉल (70 प्रतिशत) से मिटा दिया गया।

चाल विश्लेषण

हमने एक नोल्डस कैटवॉक गैट विश्लेषण प्रणाली का उपयोग किया, जिसे सामान्य महत्वाकांक्षा के दौरान चूहों की चाल को अर्ध-स्वचालित रूप से मापने और विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। संक्षेप में, कांच के नीचे के गलियारे में चूहों की आवाजाही एक केंद्रीय स्थिति से रिकॉर्ड की गई वीडियो है। ग्लास वॉकिंग प्लेटफॉर्म पर हल्की रोशनी के कारण वीडियो में पंजा प्रिंट हाइलाइट किए गए हैं। वीडियो के भीतर प्रत्येक माउस स्टेप को बाद में सेमी-ऑटोमेटेड तरीके से कैटवॉक एक्सटी (नोल्डस) का उपयोग करके पता लगाया जाता है। प्रत्येक माउस के लिए एक रन में मॉनिटर किए गए प्लेटफॉर्म पर लगातार महत्वाकांक्षा के 3 परीक्षण होते हैं। केवल सुसंगत परीक्षण स्वीकार किए जाते हैं, और चूहों को गलियारे में किसी भी दिशा में 3 अनुरूप परीक्षणों को पूरा करने के लिए 10 प्रयास तक लग सकते हैं। अनुपालन परीक्षणों को उन लोगों के रूप में परिभाषित किया गया था जो पूरे प्लेटफॉर्म पर 5 एस-लंबे के तहत आंदोलन के साथ और 60 प्रतिशत से अधिक गति भिन्नता के साथ नहीं थे। एक बार मंच पर रखे जाने के बाद, चूहे आम तौर पर प्रयोगकर्ता को प्रेरित करने की आवश्यकता के बिना आगे-पीछे भागते थे।

लंबवत ध्रुव

चूहों को एक 80 सेमी लंबे बोल्ट के शीर्ष पर रखा जाता है, उनकी नाक नीचे की ओर होती है और पंजे जितना संभव हो उतना ऊपर के करीब होते हैं। चूहों को तुरंत छोड़ दिया जाता है, और प्लेसमेंट के तुरंत बाद समय शुरू हो जाता है।

जब पहला अग्र पंजा ध्रुव के नीचे की सतह को छूता है तो समय रुक जाता है। एक चूहे की प्राकृतिक प्रवृत्ति तुरंत ध्रुव पर चढ़ना है, और उन्हें ध्रुव को पार करने के लिए 60 के दशक तक का समय दिया जाता है, अन्यथा, उन्हें ध्रुव से बाहर निकलने में मदद मिलती है। एक गैर-पूर्ण परीक्षण को स्वचालित रूप से 30s का समय दिया जाता है, क्योंकि 95 प्रतिशत चूहे जो 30 सेकंड के भीतर नहीं उतरे, 60 के निशान पर अभी भी पोल पर थे। SHIRPA व्यवहार परीक्षण कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स व्यवहारिक कोर द्वारा P30 . पर आयोजित किए गए थे

और P400। मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करने के लिए सभी मापदंडों को स्कोर किया जाता है। जो समय के साथ और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करने में सक्षम बनाता है। प्रत्येक माउस को अगले माउस पर जाने से पहले ~20-मिनट समयावधि के भीतर सभी व्यवहारों में क्रमिक रूप से परीक्षण किया गया था। प्रयोगकर्ता को पशु जीनोटाइप के लिए अंधा कर दिया गया था। स्क्रीन को पहले वर्णित के रूप में प्रदर्शित किया गया था (रोजर्स एट अल। 1997)।

व्यवहार अवलोकन

प्राथमिक स्क्रीन एक व्यवहार अवलोकन प्रोफ़ाइल प्रदान करती है और प्रत्येक जानवर का मूल्यांकन 5 मिनट के लिए एक देखने वाले जार (10 सेमी व्यास) में अबाधित व्यवहार को देखकर शुरू होता है। शरीर की स्थिति, सहज गतिविधि, श्वसन दर और कंपकंपी के स्कोर किए गए व्यवहारों के अलावा, पर्यवेक्षक विचित्र या रूढ़िवादी व्यवहार और आक्षेप, बाध्यकारी चाट, आत्म-विनाशकारी काटने, और प्रतिकर्षण (पीछे की ओर चलना) और स्थानिक संकेतों के किसी भी उदाहरण को लॉग करता है। भटकाव

अखाड़ा व्यवहार

इसके बाद, स्थानांतरण उत्तेजना और सामान्य व्यवहार के अवलोकन के परीक्षण के लिए माउस को अखाड़े (30 सेमी x 50 सेमी) में स्थानांतरित कर दिया जाता है। 30 एस-अवधि के भीतर लोकोमोटर गतिविधि को मापने के लिए क्षेत्र को 10 x 10 सेमी² वर्ग के ग्रिड में चिह्नित किया गया है। जबकि माउस क्षेत्र में सक्रिय है, चौंकाने वाली प्रतिक्रिया, चाल, श्रोणि ऊंचाई, और पूंछ ऊंचाई के उपाय दर्ज किए जाते हैं।

लापरवाह संयम

स्वायत्त व्यवहार को रिकॉर्ड करने के लिए जानवर को एक लापरवाह स्थिति में रखा जाता है। इस आकलन के दौरान ग्रिप स्ट्रेंथ, बॉडी टोन, पिना रिफ्लेक्स, कॉर्नियल रिफ्लेक्स, टो पिंच, वायर पैंतरेबाज़ी और हार्ट रेट का मूल्यांकन किया गया।

संतुलन और अभिविन्यास

अंत में, वेस्टिबुलर सिस्टम फ़ंक्शन के कई उपाय किए गए। राइटिंग रिफ्लेक्स, कॉन्टैक्ट राइटिंग रिफ्लेक्स और नेगेटिव जियोटैक्सिस टेस्ट किए गए। इस प्रक्रिया के दौरान मुखरता, पेशाब और सामान्य भय, चिड़चिड़ापन या आक्रामकता दर्ज की गई।

इस्तेमाल हुए उपकरण

1. स्पष्ट प्लेक्सीग्लस क्षेत्र (अनुमानित आंतरिक आयाम 55x33 x18 सेमी)। अखाड़े के फर्श पर 15 वर्ग (11 सेमी) के साथ चिह्नित एक प्लेक्सीग्लस शीट है। एक कठोर क्षैतिज तार (3 मिमी व्यास) को पीछे के दाएं कोने में इस तरह सुरक्षित किया जाता है कि जानवर तार पैंतरेबाज़ी के दौरान पक्षों को छू नहीं सकते। टेल सस्पेंशन और ग्रिप स्ट्रेंथ व्यवहार को मापने के लिए बॉक्स की चौड़ाई में 12 मिमी जाल (अनुमानित) के साथ एक ग्रिड (40x 20 सेमी) सुरक्षित किया गया है। 2. एक स्पष्ट प्लेक्सीग्लस सिलेंडर (15 x ll सेमी) को देखने वाले जार के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 3. एक ग्रिड फ्लोर(40x 20 cm) 12mm मेश के साथ जिस पर व्यूइंग जार खड़े होते हैं।4. चार बेलनाकार स्टेनलेस-स्टील समर्थन (3 सेमी लंबाई x 2.5 सेमी व्यास) बेंच से ग्रिड को ऊपर उठाने के लिए। 5. जानवरों के अखाड़े में स्थानांतरण के लिए एक वर्ग (13 सेमी) स्टेनलेस स्टील प्लेट। 6. कॉर्नियल और पिना रिफ्लेक्स परीक्षणों के लिए संदंश में रखे गए 3/0 मेर्सिलक की लंबाई को काटें 7. लार और काटने का परीक्षण करने के लिए एक प्लास्टिक डॉवेल रॉड को पेंसिल बिंदु तक तेज किया गया था।8। पैर की अंगुली चुटकी के लिए विदारक उपकरण संदंश की एक जोड़ी, बारीक बिंदुओं (125 मिमी संदंश, फिलिप हैरिस साइंटिफिक, कैट। नंबर डी 46-174) के साथ घुमावदार। 9.एक स्टॉपवॉच.10. चौंकाने वाली प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए एक आईएचआर क्लिक बॉक्स का उपयोग किया जाता है। माउस से 30 सेमी ऊपर रखने पर क्लिक बॉक्स 90dB SPL पर एक संक्षिप्त 20 kHz टोन उत्पन्न करता है। संपर्क प्रो. केपी स्टील, एमआरसी इंस्टीट्यूट ऑफ हियरिंग रिसर्च, यूनिवर्सिटी पार्क, नॉटिंघम एनजी7 2आरडी। 11.ए रूलर.12. कॉन्टैक्ट राइटिंग रिफ्लेक्स के लिए 2.5 सेमी के आंतरिक व्यास के साथ 30 सेमी स्पष्ट प्लेक्सीग्लस ट्यूब। 4.5 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक्यूट सेरिबेलर स्लाइस की तैयारी 300 माइक्रोन मोटाई के प्यारे पैरासैगिटल स्लाइस प्रायोगिक और नियंत्रण लिटमेट चूहों के सेरिबैलम से तैयार किए गए थे। प्रकाशित विधियों का पालन करके (हैनसेन एट अल।, 2013)। संक्षेप में, सेरिबैला को जल्दी से हटा दिया गया और (एमएम) की संरचना के साथ एक बर्फ-ठंडे बाह्य समाधान में डुबोया गया: 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 ग्लूकोज, 2.5 KCl, 2.5 CaCla, 1.3 MgCla, और 1 NaHzPOa, pH7.4 जब 5 प्रतिशत CO-/95 प्रतिशत O2 के साथ गैसीकृत। सेरेबेला को एक वाइब्रेटोम (लीका वीटी -100, लीका बायोसिस्टम्स, नुस्लोच, जर्मनी) का उपयोग करके परजीवी रूप से विभाजित किया गया था और शुरू में -30 मिनट के लिए 35 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था, और फिर उपयोग करने तक कमरे के तापमान पर संतुलित और संग्रहीत किया गया था। एक्स्ट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक्स्ट्रासेल्युलर और इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग को पर्किनजे न्यूरॉन्स (पीएन) से स्लाइस में लगातार कार्बोजन-बुलबुले बाह्य समाधान के साथ सुगंधित किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस (बाह्यकोशिकीय) या 32 डिग्री (इंट्रासेल्युलर) ± 1 डिग्री (ऊपर देखें) पर बनाए रखा गया था। कोशिकाओं को डीआईसी ऑप्टिक्स और एक जल-विसर्जन 40 × उद्देश्य (एनए 0.75) के साथ एक ज़ीस एक्जामिनर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया था। ~3 एमक्यू प्रतिरोध (मॉडल पी -1000, सटर इंस्ट्रूमेंट्स, नोवाटो, सीए) के ग्लास पिपेट को बाह्य समाधान से भर दिया गया था और वोल्टेज-क्लैंप मोड में एक्शन पोटेंशिअल से जुड़े कैपेसिटिव करंट ट्रांसिएंट्स को मापने के लिए पीएन एक्सॉन हिलॉक्स के पास तैनात किया गया था। विंदुक क्षमता के साथ 0 एमवी पर आयोजित। पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए, पिपेट एक इंट्रासेल्युलर समाधान (mM) से भरे हुए थे: 140 महीने (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2,0.2 CaClz, 10 HEPES, 14 Phosphocreatine tris Salt）, 1 EGTA,4 Mg -एटीपी, 0.4 Na-GTP.100 μM पिक्रोटॉक्सिन (सिग्मा) को निरोधात्मक GABAegeric synaptic आदानों को अवरुद्ध करने के लिए जोड़ा गया था। डेटा का उपयोग करके हासिल किया गया था

वोल्टेज या करंट-क्लैंप मोड में 20 या 100 kHz पर एक मल्टीक्लैम्प 700B एम्पलीफायर, pClamp10 (आणविक उपकरण, सनीवेल, CA) के साथ डिजीडेटा 1440 और 2 से 4 kHz पर फ़िल्टर किया गया। श्रृंखला प्रतिरोध आमतौर पर 10 और 15 एमक्यू के बीच था। श्रृंखला प्रतिरोध को केवल अल्पकालिक प्लास्टिसिटी प्रयोगों के लिए 80 प्रतिशत पर मुआवजा दिया गया था। बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए, सभी जीनोटाइप, लिंग और आयु समूहों में प्रत्येक जानवर के लिए कुल 20 से 45 पीएन दर्ज किए गए थे। रिकॉर्डिंग को सेरिबैलम के मध्य-पार्श्व और रोस्ट्रोकॉडल अक्ष दोनों में वितरित किया गया था। केवल "स्वस्थ" रूप (सेलुलर सीमाओं के कम विपरीत) और नियमित, निर्बाध फायरिंग दर वाली कोशिकाओं की जांच की गई। विश्लेषण के दौरान, कुछ कोशिकाओं में 2 सेकंड से अधिक की फायरिंग में अंतराल पाया गया, और इन कोशिकाओं को विश्लेषण से समाप्त कर दिया गया, क्योंकि इस प्रकार की फायरिंग "अस्वास्थ्यकर" होने के साथ जुड़ी हुई है। रिकॉर्डिंग से पहले डीआईसी माइक्रोस्कोपी के तहत उपस्थिति, न ही "अस्वास्थ्यकर" कोशिकाओं की संख्या अन्य जीनोटाइप (पी 400 पर नियंत्रण जीनोटाइप में सभी कोशिकाओं के 7 प्रतिशत बनाम 4 से 11 प्रतिशत) की तुलना में अधिक थी। फ्लोकुलस, लेटरल (2"डी या 3'), इंटरमीडिएट (6" या 7वें), और मेडियल (11" या 12t) स्लाइस में सीरियल सेक्शन से रिकॉर्डिंग करके तंत्रिका गतिविधि की स्थानिक तुलना प्राप्त की गई थी। कम संख्या स्लाइस का उपयोग किया गया था छोटे आयु समूहों (P45 और 110) को आयु समूहों में रिकॉर्डिंग की सापेक्ष स्थिति से मोटे तौर पर मेल खाने के लिए। 0-3 ऊतक गुणवत्ता और स्वास्थ्य पर निर्भर प्रत्येक स्लाइस के भीतर प्रत्येक लोब्यूल से रिकॉर्डिंग की गई थी। प्रत्येक रिकॉर्डिंग {{29} तक चली }मिनट. प्रत्येक आयु वर्ग के लिए 3 से 5 चूहों का उपयोग किया गया था, और प्रयोगकर्ता को जीनोटाइप, आयु और लिंग के लिए अंधा कर दिया गया था।

इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग पीएन से या तो लोब्यूल IIl या VIl औसत दर्जे का सेरिबैलम (यानी, वर्मिस) में प्राप्त की गई थी; लोब्यूल्स के बीच गुणों में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं देखा गया।

विश्लेषण

क्लैम्पफिट (आणविक उपकरण), गोप्रो (वेवमेट्रिक्स), और एक्सेल (माइक्रोसॉफ्ट) में मानक और कस्टम रूटीन का उपयोग करके सहज क्रिया संभावित इंटरस्टिमुलस अंतराल का पता लगाया गया और उनका विश्लेषण किया गया। विशेष रूप से, एक्शन पोटेंशिअल का पता लगाया गया था, और स्पाइकिंग आँकड़े (यानी, आवृत्ति और अंतराल की लंबाई) को अनुकूलितlgorProroutines(TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। माध्य इंटर-स्पाइक अंतराल (सीवी) और माध्य इंटर-स्पाइक अंतराल (सीवी2=2 आईएसआईएन प्लस 1-आईएसआईएनएल/(आईएसआईएन प्लस 1 प्लस आईएसआईएन)) की भिन्नता के गुणांक की गणना एक्सेल में की गई थी कस्टम मैक्रोज़। lgorPro का उपयोग करके मानक झिल्ली गुणों का विश्लेषण किया गया। आरएम को एक -80 एमवी होल्डिंग क्षमता से एक -5 एमवी स्टेप पल्स के लिए औसतन 3 वोल्टेज ट्रेस प्रतिक्रियाओं द्वारा निर्धारित किया गया था और शुरुआत के बाद 900 और 1000 एमएस के बीच परिणामी वर्तमान विक्षेपण को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था। झिल्ली समय स्थिरांक को एक घातांक को प्रारंभिक क्षय चरण में 90 प्रतिशत से 10 प्रतिशत शिखर तक फिट करके मापा गया था। सीएम की गणना आरएम द्वारा झिल्ली समय को विभाजित करके की गई थी। एसईपीएससी घटनाओं को एक 1- मिनट के युग में दर्ज किया गया था और न्यूरोएक्सप्रेस (v21.1.13) का उपयोग करके पता लगाया और मापा गया था। समानांतर और चढ़ाई वाले फाइबर अक्षतंतु को थीटा-ग्लास इलेक्ट्रोड (WPI) और एक TTL- नियंत्रित प्रोत्साहन आइसोलेटर (ISO-Flex, AMPI) का उपयोग करके उत्तेजित किया गया था। विकसित ईपीएससी एम्पलीट्यूड और क्षय समय स्थिरांक (समानांतर के लिए 1 क्स्प और क्लाइंबिंग फाइबर के लिए 2 क्स्प) का विश्लेषण lgorPro में कस्टम रूटीन का उपयोग करके किया गया था। एक्शन पोटेंशिअल की जांच -500 और 2250 पीए (250 पीए स्टेप्स) के बीच 1 एस वर्तमान इंजेक्शन के एक सेट के हिस्से के रूप में की गई थी, जिसमें 70 एमवी क्षमता बनाए रखने के लिए समायोजित होल्डिंग करंट था। कस्टम . का उपयोग करके एक्शन पोटेंशिअल वेवफ़ॉर्म को मापा गया

lgorPro में दिनचर्या। एक्शन पोटेंशिअल थ्रेशोल्ड को पहले झिल्ली वोल्टेज के रूप में परिभाषित किया गया था जिसमें पहला व्युत्पन्न 30 mV/ms (झू एट अल। 2006) से अधिक था।

4.6 अनुमस्तिष्क शोष की परीक्षा

अनुमस्तिष्क आकार खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के तुरंत बाद, एक पृष्ठीय, संपूर्ण-माउंट छवि प्राप्त की गई थी। छवियों को तब फिजी (NIH) का उपयोग करके संसाधित किया गया था। अग्रमस्तिष्क और अनुमस्तिष्क आकार का आकलन उनके 2-आयामी स्थान को रेखांकित करके और फिर क्षेत्र की गणना करके किया गया था। हमने सेरिबैलम के परिणामों को अग्रमस्तिष्क के आकार से विभाजित करके एक सापेक्ष सेरिबैलम-टू-फोरब्रेन अनुपात का उत्पादन करने के लिए समग्र मस्तिष्क के आकार में संभावित अंतर के लिए सामान्यीकृत किया। प्रयोगकर्ता जानवर के जीनोटाइप के लिए अंधे थे। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री संबंधित अध्ययन के अंतिम बिंदुओं पर (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), सभी जीनोटाइप के नर और मादा चूहे इस अध्ययन में प्रतिनिधित्व किया गया आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था और फॉस्फेट-बफर खारा के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव किया गया था, इसके बाद 4 प्रतिशत (डब्ल्यू / वी) बफर्ड पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) और फिर मस्तिष्क को निकालने के लिए विच्छेदित किया गया था। खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के तुरंत बाद पूरे मस्तिष्क की छवियां ली गईं और मस्तिष्क को 24 घंटे के लिए 4 प्रतिशत पीएफए ​​​​में डूबा दिया गया, और फिर ट्रिस-बफर सलाइन (टीबीएस) में 0.05 प्रतिशत एज़ाइड और 30 प्रतिशत सुक्रोज के साथ 72 घंटे के लिए क्रायोप्रोटेक्टेड किया गया। घंटे और अगले उपयोग तक 4 डिग्री पर संग्रहीत। सेरिबैलम को अग्रमस्तिष्क से अलग किया गया था और एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम माइक्रोम एचएम 430, थर्मो साइंटिफिक） का उपयोग करके 40 माइक्रोन मोटाई पर सेक्शन में विभाजित किया गया था। सेरिबैलम वर्गों को छह की एक श्रृंखला में एकत्र किया गया था और आगे के उपयोग तक 4 डिग्री या -20 डिग्री पर टीबीएस-एएफ (30 प्रतिशत सुक्रोज के साथ टीबीएस, 0.05 प्रतिशत सोडियम एज़ाइड, और 30 प्रतिशत एथिलीन ग्लाइकॉल) में संग्रहीत किया गया था। Purkinje न्यूरॉन्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, दोनों Atm* के सेरिबैलम सेक्शन; एपीटीएक्स*टी और एटीएम?35×R35×; Aptx^(n=5 प्रति जीनोटाइप) को 5 मिनट के लिए टीबीएस में तीन बार धोया गया और फिर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 15 प्रतिशत सामान्य बकरी सीरम में अवरुद्ध कर दिया गया, इसके बाद खरगोश या माउस एंटी-कैल्बिंडिन डी में फ्री-फ्लोटिंग ऊष्मायन किया गया। -28k (1:1000) कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेकर पर 1 घंटे के लिए। तब टीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए वर्गों को तीन बार धोया गया था, इसके बाद बकरी विरोधी खरगोश या माउस एलेक्सा फ्लोर 488 (1: 1000) में फ्री-फ्लोटिंग ऊष्मायन 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेकर पर अंधेरे में किया गया था। माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, वर्गों को टीबीएस में 5 मिनट के लिए तीन बार धोया गया, फिर घुड़सवार और डीएपीआई के साथ फ्लोरोमाउंट-जी के साथ कवर किया गया। कुछ वर्गों के लिए, एंटी-क्लीवेड कैस्पेज़ -3 (1:200) और एंटी-सीडी68 (1:400) एंटीबॉडी को अतिरिक्त रूप से एलेक्सा फ्लोर 647 (1:500) सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग करके कैलबिंडिन के समानांतर जांचा गया। स्लाइड्स को स्टीरियो इन्वेस्टिगेटर (एमबीएफ बायोसाइंस, वर्.2020) का उपयोग करके एपोटोम 2 (कार्ल ज़ीस माइक्रोस्कोपी, एक्सियो इमेजर.एम2) से लैस एक ज़ीस माइक्रोस्कोप पर 2.5, 10,20,40, या 63x उद्देश्य, और छवियों का उपयोग करके स्कैन किया गया था। हमामात्सू सीएमओएस कैमरा (हमामत्सु फोटोनिक्स, ओआरसीए फ्लैश 4.0 एलटी प्लस) के साथ कैप्चर किया गया। परिणामी छवियों में प्रत्येक लोब्यूल में कैलबिंडिन-प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं की संख्या को मापने के लिए, हमने स्टीरियो इन्वेस्टिगेटर का उपयोग यादृच्छिक रूप से 300 से 500 माइक्रोन के बीच 2 लाइनों को यादृच्छिक रूप से खींचने के लिए किया। प्रत्येक लोब्यूल और मैन्युअल रूप से 40x बढ़ाई के तहत ऊतक स्लाइस की 40 उम मोटाई के भीतर लंबाई के साथ पीएन की कुल संख्या की गणना की। प्रति लोब्यूल के दो नमूनों के 2 डी घनत्व (# पीएन / (रैखिक लंबाई * 40 उम मोटाई)) तब थे लोब्यूल और जानवरों के बीच आगे की तुलना के लिए औसत। कैलबिंडिन पॉजिटिव पीएन डेन्ड्राइट चौड़ाई को 20x आवर्धन के तहत 25 या 40 उम मोटी ऊतक वर्गों में प्रत्येक जानवर से लोब्यूल VI में एक पूर्वनिर्धारित स्थान पर मापा गया था। प्राथमिक और द्वितीयक शाखाओं की वृक्ष के समान चौड़ाई को पीएन सेल निकायों और आणविक परत के किनारे के बीच की मध्य रेखा पर मापा गया था। 7 से 13 डेंड्राइट्स के बीच प्रति सेक्शन, एक सेक्शन प्रति जानवर मापा गया। पीएन दैहिक माप के लिए, स्टीरियो इन्वेस्टिगेटर का उपयोग बेतरतीब ढंग से 20x आवर्धन के तहत पूरे औसत दर्जे के खंड में वितरित पीएन का चयन करने के लिए किया गया था। प्रति जानवर औसत PN चौड़ाई 3 धारावाहिक वर्गों (16 से 37 PNs प्रति अनुभाग) में औसत परिणामों द्वारा निर्धारित की गई थी। PN चौड़ाई को PN परत के लिए लंबवत मापा गया था या अगर कुछ डिग्री से अधिक से पूछा जाता है तो बाहर निकलने वाले डेंड्राइट के लिए। आणविक परत और ग्रेन्युल सेल परत (क्रमशः कैलबिंडिन और डीएपीआई दागों के साथ कल्पना की गई) चौड़ाई का मूल्यांकन स्टीरियो अन्वेषक में किया गया था, प्रत्येक लोब्यूल के लिए पूर्वनिर्धारित स्थानों पर दो चौड़ाई मापों का औसत, 2.5x आवर्धन के तहत प्रत्येक लोब्यूल की लंबी सीमा के साथ-साथ लगभग आधा। अनुमस्तिष्क वर्गों में सकारात्मकता CD68 के कुल प्रतिशत क्षेत्र और पूरे औसत दर्जे का अनुमस्तिष्क खंड में सकारात्मक धुंधलापन को मापकर निर्धारित की गई थी। 10x सिले छवियों को नकारात्मक नियंत्रण के लिए थ्रेसहोल्ड किया गया था और प्रति पशु एक खंड ImageJ का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी। कैलबिंडिन-पॉजिटिव पीएन के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए जो क्लीवेड कैस्पेज़ के लिए सकारात्मक थे-3 हमने स्टीरियो इन्वेस्टिगेटर का उपयोग करके पूरे सेरिबैलम में पीएन की गणना की। प्रति जानवर तीन, 20x बढ़ाई सिले छवियों की जांच की गई और परिणाम औसत थे। Caspase -3 सकारात्मकता के लिए दहलीज केवल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दागे गए नियंत्रण वर्गों से स्थापित की गई थी। गैर-फ्लोरोसेंट हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, 25- उम-मोटी, मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों को सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड्स पर और रात भर हवा में सुखाया जाता है। ऊतक को 5 मिनट के लिए दो बार फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में धोया गया था, फिर ~ 25 के लिए 95 प्रतिशत इथेनॉल में 0.1 प्रतिशत हेमटॉक्सिलिन और ~ 3 के लिए 95 प्रतिशत इथेनॉल में 0.5 प्रतिशत ईओसिन के साथ क्रमिक रूप से दाग दिया गया था और बाद में डबल-डिस्टिल्ड पानी में धोया गया था। प्रत्येक दाग। ऊतक को बाद में 95 प्रतिशत इथेनॉल, 100 प्रतिशत इथेनॉल, और 100 प्रतिशत जाइलीन वॉश में 1 मिनट के लिए निर्जलित किया गया, फिर परमाउंट के साथ कवर किया गया। एक ही Zeiss माइक्रोस्कोप और MBF अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर एक रंगीन कैमरा (Q इमेजिंग, MBF बायोसाइंसेज) का उपयोग करके स्लाइड्स की नकल की गई। प्रयोगकर्ताओं को माउस जीनोटाइप के लिए अंधा कर दिया गया था जिसमें वर्गों की जांच की गई थी, और सभी हिस्टोलॉजिकल मापों के लिए परीक्षा के क्रम को इंटरलीव किया गया था।

4.7 फ्लो साइटोमेट्री मापन

रक्त और थाइमस कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण को विशिष्ट एंटी-माउस एंटीबॉडी-सीडी 4, सीडी 8, सीडी 3, सीडी 44 और सीडी 25 के साथ धुंधला करके किया गया था। संक्षेप में, पूरे रक्त के नमूने（50 μ） को फ्लोरोसेंट-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया गया था, फिर लाल रक्त कोशिकाओं को बीडी लाइसिंग समाधान का उपयोग करके lysed किया गया था, जबकि जीवित सफेद रक्त कोशिकाओं को एक व्यवहार्यता दाग का उपयोग करके दाग दिया गया था। थाइमी यंत्रवत् रूप से अलग हो गए थे। सीडी 4, सीडी 8, सीडी 44 और सीडी 25 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके 1 से 2 मिलियन थाइमस कोशिकाओं को समान रूप से दाग दिया गया था। इम्युनो-दाग सफेद रक्त कोशिकाओं या थाइमस नमूनों का विश्लेषण FACS ARIA l का उपयोग करके किया गया था और डेटा का विश्लेषण FlowJo सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया था जैसा कि पहले बताया गया था (संघेज़ एट अल। 2017)।

4.8 पश्चिमी बायोट्स

प्रोटीन के अर्क (कोशिकाओं/ऊतकों) को रेडियोइम्युनोप्रेरीगेशन परख (RIPA) लसीका बफर (150 mM NaCl, 1 प्रतिशत Nonidet P-40 [NP-40],0 में समरूप बनाया गया था। .5 प्रतिशत डीऑक्सीकोलेट, 0 .1 प्रतिशत एसडीएस, 50 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0) प्रोटीज इनहिबिटर के साथ (10 यूजी / एमएल एईबीएसएफ, 10 यूजी / एमएल ल्यूपेप्टिन, 5 यूजी / एमएल पेप्सटिन, 5 यूजी / एमएल काइमोट्रिप्सिन, 10ug/ml एप्रोटीनिन)। प्रोटीन के अर्क को सोनिकेट किया गया और फिर 13, 000 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए 4 सी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पिलाया गया। बीसीए प्रोटीन परख का उपयोग प्रोटीन सांद्रता को निर्धारित करने के लिए किया गया था। 50 से 100 कुरूप प्रोटीन की समान मात्रा वाले नमूनों को 4 से 12 प्रतिशत ग्रेडिएंट टीजीएक्स प्रीकास्ट जैल बायोरेड का उपयोग करके अलग किया गया और फिर नाइट्रोसेल्यूलोज ट्रांसफर पैक का उपयोग करके ट्रांसब्लॉट सेमी-ड्राई बायोरेड सिस्टम द्वारा स्थानांतरित किया गया। समान प्रोटीन लोडिंग के लिए पोंको एस दाग द्वारा स्थानांतरित धब्बों को दाग दिया गया और फिर कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए टीबीएसटी में 5 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध से धोया और अवरुद्ध किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी रातोंरात 4 डिग्री पर झटकों के साथ लगाए गए थे। निम्नलिखित एंटीबॉडी के लिए धमाकों की जांच की गई: एटीएम (D2E2) खरगोश mAb सेल सिग्नलिंग, 1: 1000 कमजोर पड़ने पर, -एक्टिन (D6A8) खरगोश mAb सेल सिग्नलिंग, GAPDH (D16H11) खरगोश mAb सेल सिग्नलिंग के बाद उपयुक्त हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित ( एचआरपी) माध्यमिक विरोधी खरगोश, कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए विरोधी माउस। टीबीएसटी के साथ कई बार धोने के बाद, रेडियंस प्लस केमिलुमिनेसेंस सब्सट्रेट द्वारा एज़्योर c400 और बायोरेड केमीडॉक इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था। ImageJ का उपयोग करके एटीएम का डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया। संकेत के अनुसार 2 तकनीकी और 2-3 जैविक प्रतिकृति के साथ प्रयोग किए गए।

4.9 सांख्यिकीय मूल्यांकन

प्रत्येक समूह के लिए चुने गए जानवरों की संख्या 0.5 के आकार, 0.8 की शक्ति, और प्रारंभिक डेटा से अनुमानित प्रभाव आकार के आधार पर GPower v3.1 का उपयोग करते हुए एक प्राथमिक शक्ति विश्लेषण पर आधारित थी। या पूर्व अध्ययन। हमने सामान्य रूप से वितरित और गैर-पैरामीट्रिक (क्रुस्कल वालेस) सांख्यिकीय विधियों के लिए दोनों पैरामीट्रिक (1- और 2-वे एनोवा) का उपयोग किया, जो अंतराल डेटा के लिए समूहों के बीच अंतर के परीक्षण के लिए जोड़े गए कई तुलना परीक्षणों द्वारा पीछा किया गया था। टेक्स्ट। अंजीर में प्रतिरक्षा डेटा के लिए आउटलेयर। 6 और 7 को ROUT विधि (Q=2 प्रतिशत ) के माध्यम से बाहर रखा गया था। प्रत्येक डेटा सेट के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट विश्लेषण प्रत्येक आंकड़ा किंवदंती में नोट किए जाते हैं। सभी आंकड़ों के लिए: एनएस महत्वपूर्ण नहीं, * पी 0 से कम या बराबर। 05, ** पी<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">