एक नवीन नेट्रिन -1-व्युत्पन्न पेप्टाइड न्यूरोनल मृत्यु के खिलाफ सुरक्षा बढ़ाता है और चूहों में इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव को कम करता है भाग 2

इसके अलावा, हमने पाया कि पेप्टाइड E1 ने विशेष रूप से FAK और SFK सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय किया है। इसलिए, पेप्टाइड E1 के अत्यधिक विशिष्ट प्रभाव हो सकते हैं और ICH के बाद पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया में प्रभावी हो सकते हैं।

उच्च विशिष्टता और स्मृति के बीच एक संबंध है। उच्च विशिष्टता मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में मजबूत गतिविधि को संदर्भित करती है जब लोग कोई कार्य कर रहे होते हैं। मेमोरी का तात्पर्य लोगों की जानकारी सीखने और याद रखने की क्षमता से है। जब हम किसी कार्य को करने के लिए उच्च विशिष्टता का उपयोग करना सीख जाते हैं, तो हमारी याददाश्त भी बढ़ जाएगी।

शोध से पता चलता है कि जब हमारे पास किसी कार्य में विशेष कौशल और अनुभव होता है, तो मस्तिष्क धीरे-धीरे विशेष तंत्रिका सर्किट और मेमोरी पैटर्न का निर्माण करेगा। इन सर्किटों और पैटर्नों का कार्य की प्रतिक्रिया पर विशिष्ट प्रभाव पड़ेगा, जिससे कार्य की दक्षता में सुधार होगा। साथ ही, भविष्य में इसी तरह के कार्य करते समय, कार्य को बेहतर ढंग से याद रखने और निष्पादित करने में हमारी सहायता के लिए ये सर्किट और पैटर्न भी सक्रिय हो जाएंगे।

उच्च विशिष्टता वाले कार्यों में संगीत, भाषा, खेल आदि शामिल हैं, और इन कौशलों को सीखने से हमारी याददाश्त बढ़ सकती है। उदाहरण के लिए, जब एक पियानोवादक वादन का अभ्यास करता है, तो मस्तिष्क पियानो के विशिष्ट कौशल सीखेगा और अभ्यास प्रक्रिया के दौरान इन सर्किटों को मजबूत करना जारी रखेगा। इन सर्किटों की स्थापना और सुदृढ़ीकरण से पियानोवादक की संगीत की समझ और याददाश्त में भी सुधार होगा।

इसलिए, उच्च विशिष्टता और स्मृति के बीच एक सकारात्मक संबंध है। विशिष्ट कौशल और अनुभव सीखने से न केवल हमारी निष्पादन दक्षता में सुधार हो सकता है, बल्कि हमारी याददाश्त भी मजबूत हो सकती है, जिससे हमें विभिन्न सूचनाओं को बेहतर ढंग से सीखने और याद रखने में मदद मिलेगी। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि इसमें एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटी-एजिंग प्रभाव होते हैं, जो मस्तिष्क में ऑक्सीकरण और सूजन प्रतिक्रियाओं को कम करने में मदद कर सकते हैं, जिससे स्वास्थ्य की रक्षा हो सकती है। तंत्रिका तंत्र। इसके अलावा, सिस्टैंच तंत्रिका कोशिकाओं की वृद्धि और मरम्मत को भी बढ़ावा दे सकता है, जिससे तंत्रिका नेटवर्क की कनेक्टिविटी और कार्य में वृद्धि होती है। ये प्रभाव स्मृति, सीखने की क्षमता और सोचने की गति को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं, और संज्ञानात्मक शिथिलता और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की घटना को भी रोक सकते हैं।

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पेप्टाइड ई1 के विपरीत, पेप्टाइड ई2 ईआरके सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकता है, जो न्यूरोनल मृत्यु को बढ़ावा देता है। यह Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 -1)G मोटिफ़िन E2 के कारण हो सकता है जो ERK सिग्नलिंग पाथवे को सक्रिय कर सकता है [28]।

यह इंगित करता है कि अलग-अलग नेट्रिन {{0} व्युत्पन्न पेप्टाइड्स अलग-अलग कार्य करते हैं। नेट्रिन -1 के मुख्य रिसेप्टर्स डीसीसी और यूएनसी 5 परिवार [50] के सदस्य हैं। ICH में DCC और UNC5H2 की भूमिका विवादास्पद बनी हुई है [51,52]।

नेट्रिन का अनुक्रम -1 जिसे हमने पहचाना है वह डीसीसी [19] के साथ नेट्रिन -1 की परस्पर क्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। इन परिणामों से पता चलता है कि डीसीसी आईसीएच के बाद नेट्रिन प्रेरित कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति में भाग ले सकता है।

इन प्रक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्र और संबंधित सिग्नलिंग मार्गों की जांच के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। भविष्य के प्रयोगों में, हम नैदानिक ​​अनुप्रयोग के लिए इसकी विषाक्तता और आधे जीवन का पता लगाने के लिए पेप्टाइड ई1 के जैविक गुणों का आकलन करेंगे।

4. सामग्री और विधियाँ

4.1. पशु

प्रयोगशाला एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ़) प्रयोगशाला थी। सभी चूहों को सुबह 6 बजे से शाम 6 बजे तक रोशनी के साथ एक घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र में रखा गया और भोजन तक पहुंच प्रदान की गई। DCC+/− चूहों को पहले बताए अनुसार उत्पन्न किया गया था [53]।

कॉर्टिकल न्यूरोनल कल्चर के लिए भ्रूण डीसीसी+/− चूहों का उपयोग किया गया। जैसा कि पहले बताया गया है, जीनोटाइपिंग पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा की गई थी [53]। C57BL/6J चूहों को बीजिंग हुआफुकांग बायोसाइंस कंपनी लिमिटेड (बीजिंग, चीन) से खरीदा गया था।

4.2. निर्माणों

हमारी प्रयोगशाला में मानव डीसीसी (एचजीएनसी: 2701), मानव नेट्रिन (एचजीएनसी:8029), और मानव यूएनसी5ए (एचजीएनसी:12567) एन्कोडिंग अभिव्यक्ति निर्माण तैयार किए गए थे [14,32,45]।

PCDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His एक सीमलेस असेंबली क्लोनिंग किट (क्लोन स्मार्टर, C5891, यूएसए) के साथ तैयार किया गया था। पूरक तालिका S2 में hNetrin-1 (∆407–443) का सीडीएनए अनुक्रम देखा गया।

जीएसटी संलयन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए डीसीसी के एफएन5 डोमेन और नेट्रिन के अमीनो एसिड 407-443 के अनुरूप सीडीएनए अनुक्रम पीजीईएक्स {{4} x -1 वेक्टर में बंधाव द्वारा निर्मित किए गए थे।

4.3. नेट्रिन का संग्रह -1 वातानुकूलित माध्यम

हमारी पिछली रिपोर्ट [13,14] में बताए अनुसार नेट्रिन -1- वातानुकूलित माध्यम को एकत्र और मान्य किया गया था। संक्षेप में, Myc-His-टैग किए गए मानव नेट्रिन -1 को HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था।

24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को ऑप्टि-एमईएम (इन्विट्रोजन, 31985070, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से 3 बार धोया गया और फिर सीरम-मुक्त ऑप्टि-एमईएम में तीन दिनों के लिए रखा गया।

मीडिया को केन्द्रापसारक निस्पंदन (मिलिपोर, यूएफसी903096, बिलेरिका, एमए, यूएसए) द्वारा समृद्ध किया गया और -80 ◦C पर संग्रहीत किया गया। समृद्ध नेट्रिन -1 को एंटी-हिज़ के साथ प्रतिरक्षित किया गया और लोडिंग नियंत्रण के रूप में बीएसए के साथ तुलना करके मात्रा निर्धारित की गई।

फिर नेट्रिन के प्रभाव का मूल्यांकन FAK के फॉस्फोराइलेशन द्वारा किया गया। आम तौर पर, नेट्रिन के 0.1 मिलीग्राम/एमएल -1 ने प्रभावी ढंग से एफएके फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित किया, और इस एकाग्रता का उपयोग हमारे अध्ययन में किया गया था। जब तक अन्यथा संकेत न दिया गया हो, सभी प्रयोगों में नेट्रिन-1उत्तेजना की अवधि 20 मिनट थी।

4.4. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

वेस्टर्न ब्लॉटिंग का प्रदर्शन पहले बताए अनुसार किया गया था [54]। नमूनों को लाइसिस बफर (1% नॉनिडेट पी -40, 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम ईजीटीए, 150 एमएम NaCl, में मिलाया गया। 10% ग्लिसरॉल, 1% ट्राइटन

उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी थे: माउस एंटी-डीसीसी (1:500, #554223, बीडी, सैन जोस, सीए, यूएसए), माउस एंटी-हिज़ (1:1000, टीए{{7%), जेडएसजीबी-बीआईओ, बीजिंग, चीन ), माउस एंटी-माइसी (1:1000, 22ई8, सनजीन बायोटेक, तियानजिन, चीन), माउस एंटी-नेट्रिन -1 (1:1000, एएलएक्स804838, एंज़ो लाइफ साइंसेज, फार्मिंगडेल, न्यूयॉर्क, यूएसए), माउस एंटी-फ्लैग (1:1000, एफ3165, सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), खरगोश एंटी-फॉस्फो-एफएके (पीटीईआर861) (1:1000, एफ9176, सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए),खरगोश विरोधी एफएके (1:200, एससी{{32%), सांता क्रूज़, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए), खरगोश विरोधी फॉस्फोएसआरसी (टीवाईआर418)(1:1000, इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) , खरगोश विरोधी एसआरसी परिवार (1:1000,#2123, सीएसटी, डेनवर, एमए, यूएसए), माउस एंटी-जीएपीडीएच (1:5000, ट्रांसजीन बायोटेक, बीजिंग, चीन), माउस एंटी-बीटा एक्टिन (1:3000, ए5441, सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), रैबिट एंटी-फॉस्फो-ईआरके (थ्र202/टायर204) (1:1000, #9101, सीएसटी, डेनवर, एमए, यूएसए), रैबिटएंटी-ईआरके (1:1000, # 4695, सीएसटी, डेनवर, एमए, यूएसए), माउस, बकरी या खरगोश के खिलाफ एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जैक्सन इम्यूनोरिसर्च (वेस्ट ग्रोव, पीए, यूएसए) से खरीदे गए थे।

4.5. सेल सरफेस बाइंडिंग

जैसा कि पहले वर्णित है [55] कवरस्लिप्स पर चढ़ाए गए HEK293 कोशिकाओं को कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग करके फ्लैग-डीसीसी प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। अभिकर्मक के बाद लगभग 4{15}} घंटे बाद, कोशिकाओं को 30 के लिए 1{16}}0 µg/mL माइसी-नेट्रिन-1 या माइसी-नेट्रिन{8}} (∆407-443) से इनक्यूबेट किया गया। एचबीएचए (20 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.0, और एचबीएसएस में 0.5 मिलीग्राम/एमएलबीएसए) के साथ 5 मिनट तक धोने से पहले, 1 × पीबीएस के साथ धोया जाता है, और 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ क्रमिक रूप से तय किया जाता है। जिन प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था वे खरगोश विरोधी माइक (1:200, एबकैम, एबी9106, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) और माउस एंटी-फ्लैग (1:100, सिग्मा एल्ड्रिच, एफ3165) एंटीबॉडी थे।

जिन द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था वे एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित गधाविरोधी-खरगोश (1:1000; इनविट्रोजन, ए21206) और एलेक्सा फ्लोरर 546-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस(1:1000; इनविट्रोजन, ए10036) एंटीबॉडी थे . नाभिकों को 40,6-डायमिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) (थर्मो फिशर, वाल्थम, एमए, यूएसए) से रंगा गया था। सभी छवियाँ Zeiss LSM 880 कन्फोकल माइक्रोस्कोप से प्राप्त की गईं।

4.6. जीएसटी पुल-डाउन

जीएसटी-डीसीसी संलयन प्रोटीन को निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा ग्लूटाथियोन-सेफ़रोज़ टीएम 4बी बीड्स (जीई हेल्थकेयर, लिटिल शैल्फोंट, बकिंघमशायर, यूके) से शुद्ध किया गया था।

संकेतित प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए HEK293T कोशिकाओं से लगभग 500 माइक्रोग्राम सेल लाइसेट को रात भर में 4 ◦C पर RIPA बफर में 2-5 माइक्रोग्राम जीएसटी-डीसीसी-एफएन5 फ्यूजन प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया गया था। ग्लूटाथी-वन-सेफ़रोज़TM 4B मोतियों का उपयोग जीएसटी-डीसीसी-एफएन5 फ़्यूज़न प्रोटीन और इसके इंटरैक्टिंग प्रोटीन को पकड़ने के लिए किया गया था। बाध्य प्रोटीनों को ताप विकृतीकरण द्वारा प्रोटीन लोडिंग बफर में छोड़ा गया।

4.7. प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन संस्कृति

प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को पहले बताए अनुसार सुसंस्कृत किया गया था [56]। संक्षेप में, भ्रूण (E17) को संवेदनाहारी गर्भवती चूहों से हटा दिया गया। सेरेब्रल कॉर्टिस को अलग कर छोटे-छोटे टुकड़ों में काट दिया गया।

20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस में 0.05% डीएनएस के साथ 125% ट्रिप्सिन प्लस के ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को आग-पॉलिश ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ पीसा गया और 40 µm फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया।

पृथक कोशिकाओं को 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम में निलंबित कर दिया गया और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर पॉली-डी-लाइसिन-लेपित व्यंजन या ग्लास कवरस्लिप पर चढ़ाया गया। 4 घंटे के बाद, माध्यम को बी27 और ग्लूटामैक्स के साथ पूरक न्यूरोबैसल माध्यम से बदल दिया गया।

4.8. एनएलटी सेल संस्कृति और उपचार प्रोटोकॉल

माउस जीएनआरएच-व्यक्त करने वाली न्यूरोनल कोशिकाएं (एनएलटी) हमारी प्रयोगशाला द्वारा बनाए रखी गईं। एनएलटीकोशिकाओं को डीएमईएम (सिग्मा एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में 10% एफबीएस (बायोलॉजिकलइंडस्ट्रीज, किबुत्ज़ बीट हेमेक, इज़राइल) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था। 95% हवा और 5% CO2 का आर्द्र वातावरण।

हेमिन की न्यूरोटॉक्सिसिटी निर्धारित करने के लिए, हेमिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) की विभिन्न सांद्रता (0, 10, 30, 60, 90, और 120 µM) को एनएलटी कोशिकाओं में जोड़ा गया और 6 घंटे तक इलाज किया गया। इन सांद्रताओं में से, 60 µM (LD50) का चयन किया गया और बाद के प्रयोगों में उपयोग किया गया।

नियंत्रण समूहों का उपचार केवल वाहन (डीएमएसओ) से किया गया। उपचार के 6 घंटे बाद सेल व्यवहार्यता और लाइव/डेडस्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया। प्रत्येक समूह के लिए तीन कुओं का उपयोग किया गया। प्रयोगों को कम से कम 3 बार दोहराया गया।

4.9. हेमिन-प्रेरित कोशिका मृत्यु का इन विट्रो मॉडल

जैसा कि पहले बताया गया है, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स और एनएलटी कोशिकाओं में क्रमशः 5{4}}µM और 60 µM हेमिन के साथ उपचार द्वारा कोशिका मृत्यु को प्रेरित किया गया था [57,58]। स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए हेमिन को 0.1 M NaOH में घोला गया। न्यूरोप्रोटेक्शन अध्ययनों के लिए, कोशिकाओं को नामित एजेंटों या सोडियम सेलेनाइट घुलित डबल आसुत जल की उपस्थिति में हेमिन 6h के साथ इलाज किया गया था।

4.10. सीसीके-8 परख

जैसा कि पहले बताया गया है, सेल व्यवहार्यता को CCK -8 परख (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japan) द्वारा मापा गया था [59]। संक्षेप में, न्यूरोनल को 100 µL कल्चर माध्यम में 6000 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर 96- वेल प्लेटों में डाला गया और रात भर इनक्यूबेटर में डाला गया।

कोशिकाओं का 6 घंटे तक हेमिन से उपचार किया गया। न्यूरोनल कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं में पहले से गर्म किए गए पीबीएस (37 ◦C) और CCK -8 अभिकर्मक (10 µL प्रति 100 µL माध्यम) में धोया गया था।

उसके बाद, हमने 5% CO2 वातावरण में 2 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट किया, और 450 एनएम पर अवशोषण को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण (अनुपचारित कोशिकाओं) के प्रतिशत के रूप में दर्शाया गया था।

4.11. जीवित/मृत धुंधलापन

व्यवहार्यता को मापने के लिए सीसीके -8 परख की क्षमता को निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीबीएस (लाइव/डेड परख, कीजेन बायोटेक, नानजिंग, चीन) में कैल्सिनएएम/पीआई के साथ धुंधला करके सत्यापित किया गया था।

धुंधला घोल में पीबीएस में मिश्रित 2 µM कैल्सीन AM अभिकर्मक और 8 µM PI अभिकर्मक शामिल थे। नमूनों को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (ओलंपस FSX100, टोक्यो, जापान) के 20xobjective लेंस का उपयोग करके चित्रित किया गया। हेमिन-प्रेरित कोशिका मृत्यु के इन विट्रो मॉडल के लिए कम से कम 3 स्वतंत्र कोशिका संस्कृतियों का उपयोग किया गया था।

4.12. पेप्टाइड संश्लेषण और प्रशासन

पेप Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), पेप E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), पेप E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), टैट (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC लेबल TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC लेबल Pep EGF3 (NH{{ 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2, ध्वज लेबल Pep Ctrl(NH{30%)DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TCRCGKTYDVGI-CONH2, ध्वज लेबल Pep E1 (NH{{36%) DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-HPVGAAGK TCNQTTGQ-CONH2) और ध्वज लेबल किया गया 99% शुद्धता वाले पेप E2 (NH{{42%) DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) पेप्टाइड्स शंघाई GL बायोकेम (शंघाई, चीन) कंपनी और वुहान बायोइयरजीन बायोसाइंसेज (वुहान, चीन) कंपनी द्वारा खरीदे गए थे।

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