एक नवीन नेट्रिन -1-व्युत्पन्न पेप्टाइड न्यूरोनल मृत्यु के खिलाफ सुरक्षा बढ़ाता है और चूहों में इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव को कम करता है भाग 3

सेलाइन, टीएटी, या टीई1 (सेलाइन में घुला हुआ) के उपचार समूह चूहों को आईसीएच के 2 बाद और हर दिन 5 दिनों के लिए इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा कुल मात्रा में 0.1 एमएल प्रति पशु दिया गया। पेप्टाइड्स को 12 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर अंधाधुंध तरीके से दिया गया।

फिजियोलॉजिकल सेलाइन आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला फिजियोलॉजिकल बफर है, जिसका व्यापक रूप से चिकित्सा और जैविक प्रयोगों में उपयोग किया जाता है। लेकिन क्या आप जानते हैं? फिजियोलॉजिकल सेलाइन हमारी याददाश्त में भी सुधार कर सकता है!

सबसे पहले, शारीरिक खारा कोशिकाओं के सामान्य कार्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह सामान्य कोशिका आसमाटिक दबाव बनाए रख सकता है और कोशिकाओं की सामान्य आकृति विज्ञान और कार्य को बनाए रख सकता है। मस्तिष्क में, बड़ी संख्या में तंत्रिका कोशिकाओं को मूल पदार्थ के रूप में शारीरिक खारा की आवश्यकता होती है, और शारीरिक खारा का पूरक मस्तिष्क कोशिकाओं के सामान्य संचालन को बढ़ावा दे सकता है, मस्तिष्क के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान कर सकता है और मस्तिष्क को स्वस्थ बना सकता है।

दूसरे, शारीरिक खारा मस्तिष्क न्यूरॉन्स के बीच संकेत संचरण को बढ़ावा दे सकता है और मस्तिष्क की सीखने की क्षमता को बढ़ा सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि कार्य सीखने की प्रक्रिया में, शारीरिक खारा का इंजेक्शन शिक्षार्थियों के सीखने के प्रभाव में काफी सुधार कर सकता है, और शिक्षार्थियों की भावनात्मक स्थिति में सुधार कर सकता है, सीखने की चिंता और तनाव को कम कर सकता है। साथ ही, शारीरिक खारा हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स की संख्या और न्यूरॉन्स की जटिलता को भी बढ़ा सकता है, जो स्मृति के निर्माण और रखरखाव के लिए अनुकूल है।

इसके अलावा, शारीरिक खारा मस्तिष्क के चयापचय वातावरण में सुधार कर सकता है और मस्तिष्क पर विभिन्न हानिकारक प्रभावों को कम कर सकता है, जैसे क्षति, घाव, इस्किमिया और हाइपोक्सिया। ये ऐसे कारक हैं जो मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकते हैं, और फिजियोलॉजिकल सेलाइन का इंजेक्शन मस्तिष्क की मुकाबला करने की क्षमता को बढ़ा सकता है और इसकी क्षति को कम कर सकता है, जिससे मस्तिष्क की याददाश्त और सोचने की क्षमता में सुधार होता है।

सामान्य तौर पर, याददाश्त में सुधार के लिए सलाइन एक आदर्श पदार्थ है। यह मस्तिष्क पर कई सकारात्मक प्रभाव डाल सकता है, जिसमें न्यूरॉन्स की संख्या और जटिलता को बढ़ाना, चयापचय वातावरण को बढ़ाना और न्यूरॉन्स के बीच सिग्नल ट्रांसमिशन को बढ़ावा देना शामिल है। इसलिए, जब हमें अपनी याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता होती है, तो हम अपने मस्तिष्क को बेहतर सुरक्षा और सहायता प्रदान करने के लिए सेलाइन इंजेक्शन लगाने पर भी विचार कर सकते हैं। यह देखा जा सकता है कि हमें अपनी याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच हमारी याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि यह न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना, जो स्मृति और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, सिस्टैंच रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषण और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो।

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4.13. ICH का कोलेजनेज़-प्रेरित माउस मॉडल

कोलेजनेज़ इंजेक्शन का उपयोग आमतौर पर ICH [60] को प्रेरित करने के लिए किया जाता है। नर C57BL/6 चूहों (8 से 12 सप्ताह की उम्र) को आइसोफ्लुरेन (2 से 5%) से एनेस्थेटाइज किया गया और एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखा गया।

प्रक्रिया के दौरान, प्रत्येक जानवर के शरीर का तापमान होमथर्मिक कंबल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण (रुइवोड लाइफ साइंस कंपनी, लिमिटेड, शेन्ज़ेन, चीन) और एक सिरिंज (हैमिल्टन कंपनी, रेनो, एनवी, यूएसए) का उपयोग करते हुए, 0.3 μLof कोलेजनेज़ ({{3%)। {{12 }}45 आईयू; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) को प्रवाह दर पर राइटस्ट्रिएटम (एपी: +0.2 मिमी; एमएल: −2.3 मिमी; डीवी: −3.5 मिमी) में डाला गया था। 0.1 μL/मिनट।

नियंत्रित पशुओं में कुल मिलाकर 0.3 µL खारा डाला गया। सभी सर्जिकल प्रक्रियाएं सड़न रोकने वाली परिस्थितियों में की गईं। इस अध्ययन में, 66 से अधिक नर चूहों का उपयोग किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग से पहले जानवरों को यादृच्छिक रूप से समूहों में बांटा गया था [57]।

4.14. व्यवहार विश्लेषण

मस्तिष्क हेमेटोमा गठन के बाद चूहों के न्यूरोलॉजिकल व्यवहार विश्लेषण का पता चिपकने वाली टेप हटाने वाले परीक्षण [61] और सिलेंडर परीक्षण [60] द्वारा लगाया गया था। चिपकने वाला टेप हटाने का परीक्षण चूहों के प्रत्येक अगले पंजे (दाएं और बाएं) के प्लांटर क्षेत्र पर चिपकने वाला टेप लगाकर किया गया था।

प्रत्येक चूहे को एक नये पिंजरे में रखा गया था।

टेप लगाने से लेकर माउस के सफलतापूर्वक हटाने तक का समय प्रत्येक पंजे के लिए रिकॉर्ड किया गया था। प्रत्येक पंजे के लिए अधिकतम 300 सेकंड की अनुमति थी। प्रयोगों के बीच, जानवरों को उनके घरेलू पिंजरों में रोगज़नक़-मुक्त सुविधा में रखा गया।

सिलेंडर परीक्षण एक पारदर्शी ऐक्रेलिक ग्लास सिलेंडर (व्यास: 8 सेमी; ऊंचाई: 25 सेमी) में एक माउस को 2 दर्पणों और एक कैमरे के सामने 5 मिनट के लिए रखकर किया गया था। इष्टतम वीडियो प्राप्त करने के लिए कैमरे को 2 दर्पणों और सिलेंडर के सामने केंद्रीय रूप से रखा गया था।

स्वतंत्र अग्रपाद के उपयोग के मूल्यांकन के लिए, (1) चूहों की पूर्ण पालन-पोषण के दौरान एक अग्रपाद के साथ सिलेंडर की दीवार से संपर्क करने की क्षमता और (2) पूर्ण पालन-पोषण के बाद चूहों की केवल एक अग्रपाद के साथ फर्श पर उतरने की क्षमता का मूल्यांकन किया गया। धीमी गति का उपयोग करके प्रत्येक अग्रपाद के लिए कम से कम 20 संपर्क बिंदु गिने गए।

सर्जरी से पहले बेसलाइन विश्लेषण के लिए, परीक्षण के बीच 1 घंटे के ब्रेक के साथ प्रति माउस दो बार परीक्षण किया गया था। फोरलिंब्यूज को दाएं से बाएं ओर के स्वतंत्र फोरलिंब उपयोग के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है।

4.15. हेमेटोमा वॉल्यूम विश्लेषण

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या उपचार से हेमेटोमा की मात्रा कम हो गई, ICH के 5 दिन बाद चूहों की बलि दी गई; मस्तिष्क को हटा दिया गया और OCT में फ़्लैश फ़्रीज़ कर दिया गया। कोरोनल खंडों को 30 µm की मोटाई में काटा गया और सीधे कांच की स्लाइडों पर रखा गया। हेमेटोमा की मात्रा निर्धारित करने के लिए, अनुभागों को मानकीकृत कोरोनल स्तरों पर डिजिटलीकृत किया गया था।

एक ब्लाइंडयूजर ने प्रत्येक अनुभाग में बाएं और दाएं गोलार्धों में आकृति और हेमेटोमा को मापा। हेमेटोमा की मात्रा और सूजन को ImageJ (NIH) का उपयोग करके मापा और गणना की गई।

प्रति समूह कम से कम 5 मस्तिष्कों को हेमेटोमा माप के अधीन किया गया, और पूरे मस्तिष्क में हेमेटोमावॉल्यूम को मापा गया।

4.16. फ्लोरो-जेड सी धुंधलापन

कोलेजनेज़-प्रेरित आईसीएच के बाद चूहों में न्यूरोडीजेनेरेशन का मूल्यांकन निर्माता के प्रोटोकॉल [62] के अनुसार फ्लोरो-जेड सी रेडी-टू-डाइल्यूट स्टेनिंग किट (टीआर -100- एफजेटी, बायोसेंसिस, थेबार्टन, ऑस्ट्रेलिया) के साथ धुंधला करके किया गया था।

संक्षेप में, मॉडलिंग के 5 दिन बाद नियंत्रण चूहों और आईसीएच चूहों (±आईपी पेप्टाइड) की बलि दी गई, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रयोग के लिए इस्तेमाल किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार दिमाग को संसाधित किया गया।

तैरते हुए मस्तिष्क के हिस्सों को 5 मिनट के लिए 1% सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल में डुबोया गया, 2 मिनट के लिए 7{5}}% इथेनॉल में धोया गया, और फिर आसुत जल में 2 मिनट के लिए धोया गया। इसके बाद, तैरते हुए हिस्सों को 0.06% पोटेशियम परमैंगनेट घोल (आसुत जल में KMnO4) में 10 मिनट के लिए डुबोया गया।

वर्गों को अंधेरे में हल्के झटकों के साथ 20 मिनट के लिए 0.0001% फ्लोरो-जेड स्टेनिंग घोल (आसुत जल में फ्लोरो-जेड सी) में डुबोने से पहले डीडीएच2ओ से धोया गया था।

अनुभागों को ddH2O से धोया गया, लेपित स्लाइडों पर लगाया गया, और रात भर अंधेरे में कमरे के तापमान पर सुखाया गया। पेरिहेमेटोमल क्षेत्र के भीतर फ्लोरो-जेड सी धुंधलापन की जांच ज़ीस एलएसएम 880 कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की गई थी। फ़्लोरो-जेड सीस्टेनिंग की मात्रा ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की गई थी।

4.17. ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस

ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन 30-µm-मोटी वर्गों की एक श्रृंखला का उपयोग करके किया गया था। अनुभागों को निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था: माउस एंटीन्यूएन (1:500, मिलिपोर, एमएबी377, बिलेरिका, एमए, यूएसए) या माउस एंटी-जीएफएपी (1:200, सिग्माएल्ड्रिच, जी3893, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) एंटीबॉडी 4 पर ◦सी रात भर। पीबीएस से धोने के बाद, अनुभागों को एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित गधा एंटी-माउस (1:1000; इनविट्रोजन, ए21202, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया।

4.18. ट्यूनेल परख

मस्तिष्क पेरीहेमेटोमल क्षेत्र में परमाणु डीएनए विखंडन के साथ एपोप्टोटिक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफ़ेज़-मध्यस्थता डीऑक्सीयूरिडीन ट्राइफॉस्फेट (डीयूटीपी) निक एंड-लेबलिंग (ट्यूनेल) परख का उपयोग किया गया था।

स्टेनिंग एक वाणिज्यिक वन-स्टेपट्यूनेल एपोप्टोसिस परख किट (बायोटाइम, सी1090, नानजिंग, चीन) का उपयोग करके की गई थी और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद, TUNELreaction का प्रदर्शन किया गया।

मस्तिष्क वर्गों को TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण (1 घंटे at37 ◦C) के साथ ऊष्मायन किया गया था, और फिर वर्गों को पीबीएस से धोया गया था और डीएपीआई के साथ उलट दिया गया था। NeuN-TUNEL धुंधलापन के सह-स्थानीयकरण की जांच Zeiss LSM 880 कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की गई थी।

स्ट्रिएटम के अंदर पेरिहेमेटोमल क्षेत्र में ट्यूनेल-पॉजिटिव न्यूरॉन्स (न्यूएन पॉजिटिव) को 20X उद्देश्य के तहत लिए गए प्रति माउस तीन अलग-अलग चित्रों पर ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। GFAP-TUNEL स्टेनिंग का कोलोकलाइज़ेशन NeuN-TUNEL स्टेनिंग के समान था।

4.19. विवो ब्लड-ब्रेन बैरियर पारगम्यता परख में

विवो में, रक्त-मस्तिष्क बाधा पारगम्यता परख पहले बताए अनुसार की गई थी [63-65]। संक्षेप में, नियंत्रण चूहों और आईसीएच चूहों (±आईपी पेप्टाइड) को एफआईटीसी-लेबल वाले 4 केडीए डेक्सट्रान (पीबीएस, सिग्मा एल्ड्रिच, {{7%) एमजी-एफ, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए में 2 एमएम स्टॉक के 100 μL) के साथ इंट्रापेरिटोनियली इंजेक्ट किया गया था। मॉडलिंग के 5 दिन बाद, उसके बाद 5 मिनट बाद एनेस्थीसिया दिया जाता है।

ट्रेसर के लिए 10 मिनट के संचलन समय के बाद, जानवरों को ट्रांसकार्डियल छिड़काव के लिए तैयार किया गया था, और एट्रियलपंक्चर के ठीक बाद छाती गुहा से ~ 300 μl रक्त एकत्र किया गया था, इसके बाद पीबीएस के साथ 3 मिनट के लिए छिड़काव किया गया था। हेमिब्रेन (घ्राण लोब, सेरिबैलम और हिंडब्रेन से मुक्त) और एक किडनी को एकत्र किया गया और तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमा दिया गया और -80 ◦C पर संग्रहीत किया गया।

प्रतिदीप्ति माप के लिए, नमूनों को बर्फ को पिघलाया गया, तौला गया, और पीबीएस (हेमिसेरेब्रम के लिए 400 μL और गुर्दे के लिए 600 μL) में समरूप बनाया गया, इसके बाद 4 ◦C और 15,{5}}× g पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया।

सतह पर तैरनेवाला (100 μL), साथ ही सीरम की समान मात्रा (पीबीएस में 1/5 कमजोर पड़ने) को एक 96-वेल ब्लैकप्लेट में लोड किया गया था, और प्रतिदीप्ति को संबंधित उत्तेजना (490 एनएम)/उत्सर्जन (520 एनएम) पर मापा गया था ) एक प्लेट रीडर में (टेकन, मैनडॉर्फ, स्विट्जरलैंड)। ऑटोफ्लोरेसेंस मूल्यों को घटाने के लिए नकली जानवरों (ट्रेसेरिनजेक्शन के बिना) का उपयोग किया गया था। पारगम्यता सूचकांक (एमएल/जी) की गणना ऊतक आरएफयू/जी ऊतक वजन और सीरम आरएफयू/एमएल सीरम के अनुपात के रूप में की गई थी।

4.20. फ्लोरोसेंट लेक्टिन धुंधलापन

मस्तिष्क के माइक्रोवेसल्स की कल्पना करने के लिए, हमने 1 घंटे के लिए तैरते हुए वर्गों को डुबोने के लिए फ़्लोरेसिन-संयुग्मित लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम लेक्टिन (1:200, वेक्टर लैबोरेट्रीज़, FL-1171, बर्लिंगेम, CA, यूएसए) का उपयोग किया।

अनुभागों को 20× उद्देश्य के तहत ज़ीस एलएसएम 880 कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया गया था, और छवियों को 1.3 गामा सेटिंग के साथ संसाधित किया गया था। कोरोनल ब्रेन पेरिनेमल के पेरीहेमेटोमल क्षेत्र में 3 पूर्वनिर्धारित क्षेत्रों से तीन छवियां ली गईं। एक अंधे अन्वेषक द्वारा प्रत्येक मस्तिष्क में पोत शाखा बिंदुओं की मात्रा निर्धारित की गई थी। एक शाखा बिंदु को एक एकल फ़्लोरेसिन-लेबल वाले पोत के रूप में परिभाषित किया गया था जो स्पष्ट रूप से 2 अलग और अलग पोत ट्रैकों में अलग हो गया था [66]।

4.21. सांख्यिकीय विश्लेषण

जैसा कि पहले बताया गया है, सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को बिना सोचे-समझे संचालित किया गया और 3 बार स्वतंत्र रूप से निष्पादित किया गया। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया है। ग्राफपैड प्रिज्म v7 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके, उपयुक्त के रूप में वन-वे एनोवा, टू-वे एनोवा और स्टूडेंट-टेस्ट द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। ) और एसपीएसएस सॉफ़्टवेयर संस्करण 20.0 (एसपीएसएस, इंक., शिकागो, आईएल, यूएसए)।

सांख्यिकीय पैरामीटर प्रासंगिक चित्र किंवदंतियों में पाए जा सकते हैं। सांख्यिकीय महत्व *p < {{0}} पर निर्धारित किया गया था। 05; ** पी < 0.01; *** पी <0.001; **** पी <0.0001.]

प्र. 5। निष्कर्ष

नेट्रिन का EGF3 डोमेन -1 DCC के साथ नेट्रिन -1 की सहभागिता के लिए महत्वपूर्ण है और विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय कर सकता है। नेट्रिन के कटे हुए पेप्टाइड ई1 -1 (अवशेष 407-422) न्यूरॉन्स को हेमिन-प्रेरित विषाक्तता से बचाने के लिए डीसीसी के साथ बातचीत करते हैं।

पेप्टाइड ई1 के अनुप्रयोग से आईसीएच के प्रायोगिक मॉडल में कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति में सुधार होता है। इसके अलावा, पेप्टाइड E1 ICH के बाद न्यूरॉन्स को अध: पतन और एपोप्टोसिस से बचा सकता है।

लेखक का योगदान: संकल्पना, एलएल, जेड-एक्सएच और एक्स.-जेजेड; कार्यप्रणाली, एलएल, के.-जेएल और जे.-बीसी; सत्यापन H.-LY और X.-XH; जांच, एक्स.-जेजेड; डेटा क्यूरेशन, जेवाई; संसाधन एलएल औरजेड.-एक्सएच; एलएल, जेड-एक्सएच और एक्स.-जेजेड लिखना; पर्यवेक्षण, Z.-XH, X.-JZ; फंडिंग अधिग्रहण, Z.-XHand X.-JZ सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ लिया है और उससे सहमत हैं।

वित्त पोषण: इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671065और 32071018), जिलिन प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास योजना (202520YY01017404) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

संस्थागत समीक्षा बोर्ड वक्तव्य: सभी प्रक्रियाओं को पूर्वोत्तर सामान्य विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (एनईएनयू/आईएसीयूसी, एपी2016200299) द्वारा अनुमोदित किया गया था। पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना के राष्ट्रीय मानक (जीबी/टी 35892-2018), पशु कल्याण की नैतिक समीक्षा के लिए प्रयोगशाला पशु-दिशानिर्देश, हमारे पशु देखभाल और प्रोटोकॉल के लिए मार्गदर्शन था।

सूचित सहमति वक्तव्य: लागू नहीं।

आभार: इस कार्य को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671065 और 32071018) और, जिलिन प्रांत की विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास योजना (202520YY01017404) द्वारा समर्थित किया गया था।

हितों का टकराव: लेखक हितों का कोई टकराव नहीं होने की घोषणा करते हैं। अध्ययन के डिज़ाइन में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी; डेटा के संग्रह, विश्लेषण या व्याख्या में; पांडुलिपि के लेखन में, या परिणाम प्रकाशित करने के निर्णय में।

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