एक ट्रांसजेनिक मॉडल अग्नाशयी कैंसर के विकास में क्लोथो की भूमिका को प्रकट करता है और नए क्लॉथो-आधारित चिकित्सा के लिए मार्ग प्रशस्त करता है

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सरल सारांश:हमने अग्नाशय के कैंसर में बुढ़ापा रोधी प्रोटीन क्लोथो और इसके स्रावित आइसोफॉर्म, यूके की भूमिका का अध्ययन करने का लक्ष्य रखा है। एक उपन्यास आनुवंशिक माउस मॉडल और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण सहित विवो मॉडल में तीन ने क्लोथो को अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा में एक ट्यूमर शमनकर्ता के रूप में इंगित किया और अग्नाशय के ट्यूमर में एक अद्वितीय क्लोथो डीएनए हाइपरमेथिलेशन पैटर्न का अनावरण किया। इन परिणामों में महत्वपूर्ण रोगनिरोधी मूल्य होते हैं, और आगे सुझाव देते हैं कि वह अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के लिए एक चिकित्सीय एजेंट के रूप में काम कर सकती है।

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सार: क्लोथो एक एंटी-एजिंग ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है, जिसे बहाया जा सकता है और एक हार्मोन के रूप में कार्य कर सकता है। संचित डेटा से संकेत मिलता है कि क्लोथो विकृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक ट्यूमर दबानेवाला यंत्र है, और इस गतिविधि के लिए उपडोमेन KL1 को प्रोटीन के सक्रिय क्षेत्र के रूप में नामित करता है। हमने अग्नाशय नलिका संबंधी एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) में ट्यूमर शमनकर्ता के रूप में क्लोथो की भूमिका का अध्ययन करने का लक्ष्य रखा है। कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) डेटासेट के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण ने पीडीएसी रोगियों के अस्तित्व, क्लोथो अभिव्यक्ति के स्तर और डीएनए मिथाइलेशन के बीच एक संबंध का खुलासा किया, और अग्नाशय के ट्यूमर में क्लोथो के एक अद्वितीय हाइपरमेथिलेशन पैटर्न का प्रदर्शन किया। क्लोथो और KL1 के विवो प्रभावों की तीन माउस मॉडल का उपयोग करके जांच की गई। एक उपन्यास आनुवंशिक मॉडल को नियोजित करना, अग्नाशय क्लोथो नॉकडाउन को दशमलव में उत्परिवर्तन के साथ जोड़ना, क्लोथो की कमी ने पीडीएसी पीढ़ी में योगदान दिया और माउस अस्तित्व में कमी आई। एक ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल में, आकाश को ले जाने वाले वायरल कणों का प्रशासन, एक स्प्लिस्ड क्लोथो आइसोफॉर्म जिसमें KL1 डोमेन होता है, अग्नाशय के ट्यूमर को रोकता है।सिस्टैंच खरीदेंअंत में, घुलनशील आकाश के साथ उपचार पीडीएक्स के लंबे समय तक जीवित रहने के लिए1-Cre; KrasG12D/ प्लस; Trp53R172H/ plus (KPC) चूहों, एक मॉडल को मानव PDAC का पुनर्पूंजीकरण करने के लिए जाना जाता है।बायोफ्लेवोनोइड्स,अंत में, यह अध्ययन इस बात का प्रमाण देता है कि पीडीएसी में क्लोथो एक ट्यूमर शमनकर्ता है। इसके अलावा, इन आंकड़ों से पता चलता है कि क्लोथो अभिव्यक्ति और डीएनए मेथिलिकरण के स्तर का पीडीएसी रोगियों में रोग-संबंधी मूल्य हो सकता है, और बहिर्जात एसकेएल का प्रशासन पीडीएसी के इलाज के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय रणनीति के रूप में काम कर सकता है।

कीवर्ड:क्लोथो; केएल1; एसकेएल; ट्यूमर दबाने वाला; अग्नाशय का कैंसर; पीडीएसी

1 परिचय

अग्नाशयी कैंसर सबसे आक्रामक कैंसर में से एक है, जिसकी 5-वर्ष की जीवित रहने की दर 9 प्रतिशत है। अकेले अमेरिका में 60,430 नए मामलों और 48,220 मौतों के साथ, घटनाएं और मृत्यु दर बढ़ रही है [1]। अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सभी घातक अग्नाशयी नियोप्लाज्म के 85-90 प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। वर्तमान मॉडल आनुवंशिक उत्परिवर्तन के अधिग्रहण के साथ-साथ सौम्य अग्नाशय इंट्रापीथेलियल नियोप्लासिया (पैनएलएन) 1-3 से आक्रामक कार्सिनोमा तक इसके विकास का संकेत देते हैं। दशमलव के सक्रियण को कुरूपता [2] की ओर पहला कदम माना जाता है, और माउस मॉडल में, 9 महीने [3] तक पैनिन का विकास होता है। हालांकि इन चूहों में ओवरट पीडीएसी दुर्लभ है, केपीसी मॉडल में, ट्यूमर सप्रेसर p53 [4] के नुकसान के साथ दशमलव उत्परिवर्तन का संयोजन, पीडीएसी आमतौर पर 3-6 महीने की उम्र [5] तक विकसित होता है।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

क्लोथो (यहाँ क्लोथो के रूप में प्रयोग किया जाता है) एक प्रकार है जो मैं उम्र बढ़ने के नियमन में शामिल प्रोटीन को प्रसारित करता हूं [6]। चूहों में, क्लोथो की कमी से त्वरित उम्र बढ़ने जैसा सिंड्रोम होता है, जबकि क्लोथो ओवरएक्प्रेशन जीवन काल [7,8] का विस्तार करता है। क्लोथो बाह्य क्षेत्र दो समजातीय डोमेन, KL1 और KL2 से बना है, जो झिल्ली से अलग हो सकते हैं और परिसंचारी हार्मोन के रूप में कार्य कर सकते हैं [9-11]। एक दूसरा, विभेदित रूप से फैला हुआ क्लोथो आइसोफॉर्म स्रावित होता है (यूके)। आकाश KL1 के समान है, साथ ही C-टर्मिनस पर 15 अतिरिक्त अमीनो एसिड हैं। क्लोथो की विभिन्न गतिविधियों का वर्णन किया गया है, जिसमें फ़ाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (FGF) 23 सिग्नलिंग [12,13] की सक्रियता, क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल सबफ़ैमिली वी सदस्य (TRPV) 5 कैल्शियम चैनल [14,15] का विनियमन और निषेध शामिल है। इंसुलिन और इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक (IGF) -1 रास्ते [8,16,17]।

क्लोथो मुख्य रूप से गुर्दे और मस्तिष्क में, लेकिन एक्सोक्राइन और अंतःस्रावी अग्न्याशय [7,17-20] सहित विभिन्न ऊतकों में भी व्यक्त किया जाता है। अग्न्याशय में इसकी शारीरिक गतिविधियों को अभी तक निर्धारित नहीं किया गया है; हालांकि, ग्लूकोज होमियोस्टेसिस के नियमन में इसके शामिल होने के प्रमाण हैं। क्लोथो इन विट्रो और विवो में इंसुलिन उत्पादन और स्राव को प्रेरित करता है, चूहों में इंसुलिन संवेदनशीलता को कम करता है, और टाइप 2 मधुमेह मेलेटस (T2DM) रोगियों [8, 19-22] के अग्नाशयी आइलेट्स में समाप्त हो जाता है। क्लोथो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर [16,17, 23-30] सहित कई विकृतियों में एक शक्तिशाली ट्यूमर शमन है। यह कैंसर में एपिजेनेटिक रूप से खामोश है, और क्लोथो और कार्ल दोनों इन विट्रो और विवो में कैंसर कोशिकाओं के विकास को कम करते हैं [16,17,23,25,26,28,31-33]। अग्नाशय के कैंसर में, क्लोथो का डाउनरेगुलेशन रोगी के जीवित रहने के साथ सहसंबद्ध है। इन विट्रो में, क्लोथो अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं के विकास को कम करता है और आईजीएफ-आई और बीएफजीएफ मार्गों को रोकता है [17,34]।

इस अध्ययन में, हमने विवो मॉडल में तीन का उपयोग करके पीडीएसी में ट्यूमर शमनकर्ता के रूप में क्लोथो की भूमिका को समझने का लक्ष्य रखा है। एक उपन्यास आनुवंशिक मॉडल को नियोजित करते हुए, हमने दिखाया कि अग्नाशयी क्लोथो नॉकडाउन ने पीडीएसी विकास में योगदान दिया और दशमलव उत्परिवर्ती चूहों के अस्तित्व को कम कर दिया। एक दूसरे मॉडल में, हमने दिखाया कि एसकेएल ले जाने वाले वायरल कणों का प्रशासन एक ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल में अग्नाशय के ट्यूमर को रोकता है। अंत में, घुलनशील पुनः संयोजक आकाश के साथ उपचार KPC चूहों के लंबे समय तक जीवित रहने के लिए। ये परिणाम पीडीएसी विकास में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी के रूप में कोटो की भूमिका को प्रकट करते हैं और पीडीएसी रोगियों के इलाज के लिए क्लोथो को एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में सुझाते हैं।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. UCSC Xena ब्राउज़र का उपयोग करके TCGA विश्लेषण

कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) अग्नाशयी कैंसर (पीएएडी) कोहोर्ट के लिए जीन अभिव्यक्ति RNAseg (IlluminaHiSeq) और डीएनए मिथाइलेशन (मिथाइलेशन 450k) डेटासेट का कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सांता क्रूज़ (UCSC) ज़ेना ब्राउज़र (यूसीएससी) का उपयोग करके अध्ययन किया गया था।http://xena.ucscedu/, 19 जुलाई 2020 को एक्सेस किया गया)[35]।सिस्टैंचज़ेना ब्राउज़र का उपयोग करते हुए, समग्र अस्तित्व और अग्नाशय के कैंसर के रोगियों के प्रगति-मुक्त अंतराल का विश्लेषण या तो क्लोथो अभिव्यक्तियों या KLOTHO डीएनए मिथाइलेशन के अनुसार किया गया था, और कपलान-मीयर प्लॉट बनाए गए थे। केवल प्राथमिक ट्यूमर के लिए फ़िल्टर करके डुप्लिकेट किए गए व्यक्तिगत डेटा को हटा दिया गया था। लॉग 2 (x प्लस 1) इकाइयों में दिए गए जीन अभिव्यक्ति डेटा को माध्यिका के अनुसार दो समूहों में विभाजित किया गया था; डीएनए मिथाइलेशन डेटा को निम्न और ऊपरी चतुर्थक के अनुसार दो समूहों में विभाजित किया गया था।

साइट-विशिष्ट KLOTHO डीएनए मेथिलिकरण के लिए, निम्न या उच्च स्तर के क्लोथो अभिव्यक्ति वाले नमूनों, जैसा कि क्रमशः निचले या ऊपरी चतुर्थक द्वारा परिभाषित किया गया था, का और विश्लेषण किया गया। प्रत्येक मिथाइलेशन साइट के लिए मान 36] की गणना की गई थी, और संबंधित नमूने में क्लोथो अभिव्यक्ति के साथ सहसंबंध की जांच पियर्सन के सहसंबंध गुणांक (आर) के माध्यम से की गई थी।

2.2. रसायन, एंटीबॉडी, और निर्माण

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए रसायनों में घुलनशील मानव स्प्लिस वैरिएंट क्लोथो शामिल है, जिसमें अमीनो एसिड शामिल हैं34-549(स्की डोमेन; परिग्रहण संख्या BAA24941.1), सी-टर्मिनस पर एक 15-अमीनो-एसिड अद्वितीय अनुक्रम के साथ({ {6}}; पेप्रोटेक इंक, रॉकी हिल, एनजे, यूएसए); ग्लूकोज फ्लोरिस, मिसगाव, इज़राइल）, मानव इंसुलिन एक्ट्रैपिड; नोवो नॉर्डिस्क ए / एस, बैग्सवार्ड, डेन-मार्क), और ल्यूसिफरिन (122799; पर्किनएल्मर, वॉलथम, एमए, यूएसए)।

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी में चूहे IgG2a आइसोटाइप कंट्रोल (02-9688; थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, MA, यूएसए) और एंटी - - एक्टिन (A5441; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, यूएसए) शामिल थे। . KL1 डोमेन (KM2076) के खिलाफ निर्देशित एंटी-क्लोथो एंटीबॉडी, क्योवा हाको कोग्यो कं, लिमिटेड, टोक्यो, जापान की ओर से एक तरह का उपहार था।

2.3.AAV वेक्टर उत्पादन और शुद्धिकरण

AAV9 वैक्टर, नल खाली वेक्टर, और आकाश (गुप्त क्लोथो स्प्लिस वैरिएंट आइसोफॉर्म, परिग्रहण संख्या BAA24941.1 युक्त) का उत्पादन और शुद्धिकरण यूनाइटेड मिक्स्टा UAB-VHIR और वेक्टर प्रोडक्शन यूनिट (VPU) की जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधाओं में किया गया था। , HEK293 कोशिकाओं में ट्रिपल ट्रांसफ़ेक्शन सिस्टम का उपयोग करके वैक्टर उत्पन्न किए गए थे। 48 घंटे के बाद, एएवी वैक्टर को काटा गया, बेंज़ोनेज के साथ इलाज किया गया, एक आयोडिक्सानॉल ग्रेडिएंट में शुद्ध किया गया, और पिकोग्रीन [37] का उपयोग करके शीर्षक दिया गया। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति एक सीएमवी प्रमोटर द्वारा संचालित थी, जैसा कि पहले बताया गया था [37]।

2.4. पशु रखरखाव

सोरास्की मेडिकल सेंटर (तेल अवीव, इज़राइल) में माउस रखरखाव और प्रयोग किए गए, और सोरास्की मेडिकल सेंटर एनिमल केयर एंड यूज़ कमेटी के नियमों और मानकों के अनुसार।

ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए उपयोग किए जाने वाले माउस स्ट्रेन सभी मिश्रित C57BL/6 और JVB/NJ पृष्ठभूमि पर थे। Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus , और LSL-Trp53R172H/ plus t चूहे डॉ. ज़िव गिल (रैंबम, हाइफ़ा, इज़राइल में तकनीक-इज़राइल प्रौद्योगिकी संस्थान) से दयालु उपहार थे।

2.5. अग्न्याशय-विशिष्ट KLOTHO नॉकडॉम माउस मॉडल

माउस अग्नाशय को KLOTHO के नॉकडाउन को लक्षित करने के लिए, फ्लक्स्ड KLOTHO एलील्स (KLlox) ले जाने वाले चूहों को उत्पन्न किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित [38] था।ऑस्ट्रेलियाKeflex/flox चूहों को Pdx1-Cre चूहों के साथ क्रॉसब्रेड किया गया था, जो Pdxl के प्रमोटर द्वारा नियंत्रित Cre recombinase को व्यक्त करते हैं, इस प्रकार Pdx प्राप्त करते हैं1-Cre; केएल-/- चूहों। अग्नाशय KLOTHO नॉकडाउन की पुष्टि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और mRNA स्तर के साथ की गई थी, जैसा कि इसके बाद वर्णित है।

Pdxl प्रमोटर-नियंत्रित KLOTHO नॉकडाउन और उत्परिवर्ती दशमलव अभिव्यक्ति, LSL-KrasG12D / प्लस चूहों [3] को परेशान करने वाले चूहों को उत्पन्न करने के लिए, एक उत्परिवर्ती दशमलव एलील के बाद एक Lox-Stop-Lox अनुक्रम को ले जाने के लिए, KLflox/flox चूहों के साथ क्रॉसब्रेड किया गया। इन चूहों को आगे Pdx1-Cre चूहों के साथ क्रॉस-ब्रेड किया गया, जो Pdx1-Cre की उपज देते हैं; केएल-/-; KrasG12D / प्लस चूहे। LSL-KrasG12D/ plus को भी Pdx1-Cre चूहों के साथ अलग से क्रॉसब्रेड किया गया था, और यह Pdx1-Cre; नियंत्रण के रूप में KrasG12D / plus चूहों का उपयोग किया गया था। कष्ट के लक्षणों के लिए चूहे की प्रतिदिन जांच की गई, जिसमें कठिन श्वास, बड़े वजन में परिवर्तन और बड़े ट्यूमर (1 सेमी से अधिक) शामिल हैं, और जो नैतिक समिति द्वारा निर्धारित मानदंडों को पूरा करते थे, उनकी बलि दी गई। जीवित रहने के लिए चूहे की निगरानी की गई, मृत्यु को या तो अनायास या बलिदान की आवश्यकता वाले संकेतों द्वारा परिभाषित किया गया। अग्नाशय के तरल पदार्थ द्वारा अग्नाशय के ऊतकों के तेजी से पाचन के कारण, हम केवल उन चूहों के अग्नाशय की जांच कर सकते हैं जिनकी बलि दी गई थी। ऊतकों को काटा गया और 24 घंटे के लिए फॉर्मलाडेहाइड में रखा गया, जिसे बाद में 70 प्रतिशत इथेनॉल से बदल दिया गया।

2.6. चूहे का ट्यूमर ज़ेनोग्राफ़्ट अध्ययन

महिला एथलेटिक नग्न चूहों (BALB / c पृष्ठभूमि), {0}} सप्ताह की आयु, Envigo RMS (यरूशलेम, इज़राइल) से खरीदी गई थी। विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में चूहों को लामिना के प्रवाह अलमारियाँ में रखा और बनाए रखा गया था। प्रयोग के पहले दिन, MIA PaCa -2 कोशिकाओं को स्थिर रूप से m-चेरी/लूसिफ़ेरेज़ को व्यक्त करते हुए सूक्ष्म रूप से (sc) उनके फ़्लैक्स n =21, 100 μL में 1 × 10 डिग्री कोशिकाओं में टीका लगाया गया। प्रतिशत एफसीएस डीएमईएम माध्यम）। ट्यूमर टीकाकरण के दस दिन बाद, मानव एएवी की एक उच्च खुराक (5 × 1011 जीसी / एमएल, एन =7) या कम खुराक (5 × 1010 जीसी / एमएल, एन =6) को इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट किया गया था। (im).AAV-null ने नियंत्रण (5×1010 GC/mL, n=8) के रूप में कार्य किया। ट्यूमर को सप्ताह में तीन बार एक डिजिटल कैलीपर से मापा जाता था, और वॉल्यूम की गणना दीर्घवृत्तीय मात्रा गणना सूत्र (0.5 × लंबाई × चौड़ाई 2) द्वारा की जाती थी। प्रयोग के 20 दिन, विवो में ट्यूमर का मूल्यांकन एमआईए पाका -2 सेल की ल्यूसिफरेज गतिविधि की निगरानी के लिए 150 कुग / एमएल ल्यूसिफरिन इंट्रा-पेरिटोनियल के इंजेक्शन द्वारा किया गया था, और ल्यूसिफरेज की तीव्रता को बायोस्पेज़ द्वारा मापा गया था।

उसी दिन, प्रयोग समाप्त हो गया और चूहों को इच्छामृत्यु दी गई। ट्यूमर को हटा दिया गया, तौला गया और एक डिजिटल कैलीपर के साथ मापा गया। इच्छामृत्यु से पहले रक्त एकत्र किया गया था, और मानव क्लोथो के स्तर को एलिसा (आईबीएल, मिनियापोलिस, एमएन, यूएसए) का उपयोग करके सीरम में मापा गया था। एलिसा के लिए प्रति नमूना सीरम के पचास माइक्रोलीटर (डुप्लिकेट में) का उपयोग किया गया था, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख की गई थी। पियर्सन के सहसंबंध गुणांक के माध्यम से ट्यूमर के वजन और मानव क्लोथो रक्त स्तर के बीच संबंध की जांच की गई।

2.7. केपीसी माउस मॉडल

KPC चूहों का निर्माण LSL-Trp53R172H / प्लस चूहों [5] को एक Lox-Stop-Lox अनुक्रम लेकर क्रॉसब्रीडिंग द्वारा किया गया था, इसके बाद एक बिंदु-उत्परिवर्ती p53 एलील जो एक अशक्त उत्परिवर्तन के रूप में कार्य करता है, LSL-KrasG12D / plus t चूहों के साथ। इन्हें आगे Pdx1-Cre चूहों के साथ क्रॉसब्रेड किया गया, जिसके परिणामस्वरूप Pdx1-Cre; KrasG12D/ प्लस; Trp53R172H / प्लस चूहों। चूहे का लिंग, उम्र और वजन के अनुसार मिलान किया गया और उन्हें घुलनशील मानव त्वचा के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन (15 मिलीग्राम/किलोग्राम, दो बार साप्ताहिक) या वाहन नियंत्रण (एन =6 के लिए उपचार प्राप्त करने के लिए बेतरतीब ढंग से सौंपा गया था। आकाश-उपचार समूह; n =7 नियंत्रण समूह के लिए)। उपचार 30 सप्ताह तक जारी रहा। कष्ट के लक्षणों के लिए चूहे की प्रतिदिन जांच की गई, जिसमें कठिन श्वास, बड़े वजन में परिवर्तन और बड़े ट्यूमर (1 सेमी से अधिक) शामिल हैं, और जो नैतिक समिति द्वारा निर्धारित मानदंडों को पूरा करते थे, उनकी बलि दी गई। जीवित रहने के लिए चूहे की निगरानी की गई, मृत्यु को या तो अनायास या बलिदान की आवश्यकता वाले संकेतों द्वारा परिभाषित किया गया।

2.8. जीनोटाइपिंग

जीनोटाइपिंग के लिए माउस टेल को 3 सप्ताह की उम्र में लिया गया था। डीएनए को एक क्षारीय लसीका समाधान में पूंछ के ऊष्मायन द्वारा निकाला गया था, जिसमें 25 0 μM NaOH और 2 μM डिसोडियम EDTA (पीएच 12. 0) शामिल थे, 30-60 मिनट के लिए 95 डिग्री पर , इसके बाद 0 .4 मिमी ट्रिस एचसीएल (पीएच 5.0) के साथ निष्प्रभावीकरण। आरईडीटीक रेडीमिक्स पीसीआर रिएक्शन मिक्स (सिग्मा-एल्ड्रिच, रेहोवोट, इज़राइल) का उपयोग करके डीएनए ने बाद में विभिन्न जीनोटाइप के लिए पीसीआर प्रवर्धन किया। प्राइमर 1000 एनएम अंतिम सांद्रता पर थे। पीसीआर चक्र और प्राइमर तालिका S1 में विस्तृत हैं। उत्पादों को 1.5 प्रतिशत agarose जैल पर इलेक्ट्रोफोर किया गया और एथिडियम ब्रोमाइड से दाग दिया गया।

2.9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) विश्लेषण

ऊतकों को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था, और एम्बेडेड ऊतकों को क्रमिक रूप से विभाजित किया गया था। वर्गों को या तो हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिया गया था और एक अनुभवी रोगविज्ञानी द्वारा सूक्ष्म रूप से जांच की गई थी, या आईएचसी द्वारा दाग दिया गया था, जैसा कि वर्णित है। क्लोथो IHC के लिए, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड सेक्शन, 4 um मोटी, ज़ाइलिन में डीवैक्स किए गए और पुनर्जलीकरण किए गए। साइट्रेट बफर pH6.0 में 2 0 मिनट के लिए एक गर्म स्नान (95 डिग्री) का उपयोग करके एंटीजन पुनर्प्राप्ति का प्रदर्शन किया गया था। 30 मिनट के लिए ठंडा करने के बाद, स्लाइड्स को टीबीएस-ट्राइटन (टीबीएस-टी) बफर में रिंस किया गया था।सिस्टैंच लाभइसके बाद, और अंतर्जात पेरोक्साइड ब्लॉक 10 मिनट के लिए 3 प्रतिशत एच, ओ / मेथनॉल में किया गया था। टीबीएस-टी में धोने के बाद, टीबीएस-टी में 5 प्रतिशत बीएसए का उपयोग करके 30 मिनट के लिए वर्गों को अवरुद्ध कर दिया गया और बाद में 4 डिग्री पर क्लोथो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया। ZytoChem Plus (HRP) वन-स्टेप पॉलिमर एंटी-माउस / रैबिट / रैट (ZUC053; Zytomed Systems, बर्लिन, जर्मनी) के साथ डिटेक्शन किया गया। चूहा IgG2a ने आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में कार्य किया।

2.10. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)

यज्ञोपवीत Pdxl-Cre से अग्न्याशय; KL-/- और KLflox/flox नियंत्रण चूहों को एक्साइज़ किया गया, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, और -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। अग्नाशय के समरूपीकरण के बाद, आरएनए आइसोलेशन किट (सिग्मा) का उपयोग करके कुल आरएनए तैयार किया गया था, और जेस्क्रिप्ट सीडीएनए सुपरमिक्स (क्वांटा बायोसाइंसेज, गेथर्सबर्ग, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसकोड किया गया था। सीडीएनए को रेडटैक रेडीमिक्स पीसीआर रिएक्शन मिक्स (सिग्मा) का उपयोग करके क्लोथो और -एक्टिन (लोडिंग कंट्रोल के रूप में) के लिए प्रवर्धित किया गया था। पीसीआर को 5 मिनट के लिए 94 डिग्री पर अनुकूलित किया गया था, इसके बाद 30 एस के चक्र 94 डिग्री पर, 90 के 52.5 डिग्री पर, और 20 एस को 72 डिग्री (क्लोथो के लिए 45 चक्र, -एक्टिन के लिए 25 चक्र), और 10 मिनट पर अनुकूलित किया गया था। विस्तार के लिए 72 डिग्री, 12.5 pmol क्लोथो प्राइमर (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACT-3'और R,5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC-3') और 5 pmol -actin प्राइमरों (F,5') का उपयोग करते हुए -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'और R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3)। उत्पादों को एथिडियम ब्रोमाइड से सना हुआ 1.5 प्रतिशत agarose जैल पर वैद्युतकणसंचलन किया गया था। ImageJ सॉफ्टवेयर, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए का उपयोग करके परिमाणीकरण किया गया था।

2.11.सांख्यिकीय विश्लेषण

जैसा कि उल्लेख किया गया है, परिणाम माध्य ± एसडी या एसईएम के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। जब तक अन्यथा उल्लेख नहीं किया गया, तब तक टी-टेस्ट का उपयोग करके निरंतर चर की तुलना की गई। सभी महत्व परीक्षण दो-पूंछ वाले थे, और 0.05 से कम या उसके बराबर के पी-मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पियर्सन के सहसंबंध गुणांक (आर) का उपयोग करके सहसंबंध का मूल्यांकन किया गया था। लॉग-रैंक टेस्ट का उपयोग करके उत्तरजीविता विश्लेषण किया गया था।

3। परिणाम

3.1. अग्नाशय के ट्यूमर में क्लोथो एक्सप्रेशन और डीएनए मिथाइलेशन के स्तर कैंसर रोगियों के जीवित रहने से संबंधित हैं

कैंसर जीनोम ब्राउज़र (टीसीजीए) अग्नाशयी कैंसर (पीएएडी) समूह की जांच कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सांताक्रूज (यूसीएससी) ज़ेना ब्राउज़र [35] का उपयोग करके की गई थी। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणों से पता चला है कि प्रत्येक समूह के लिए उच्च (एन =89; चित्रा 1 ए, बी) की तुलना में कम क्लोथो व्यक्त ट्यूमर वाले अग्नाशय के कैंसर के रोगियों के लिए समग्र अस्तित्व (ओएस) और प्रगति-मुक्त अंतराल (पीएफआई) में कमी आई है। मिथाइलेशन डेटा की जांच ने उन रोगियों में बाधित ओएस और पीएफआई की एक संगत प्रवृत्ति दिखाई, जिनके पास निम्न (एन=45 और एन =46 की तुलना में क्रमशः उच्च केएलओथो डीएनए मेथिलिकरण स्तर वाले ट्यूमर थे; चित्रा 2 ए, बी) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) मानव अग्नाशय के कैंसर में (चित्र 2सी-ई)।

3.2. अग्नाशय KLOTHO पछाड़ना चूहों की पीढ़ी

गैर-सशर्त KLOTHO नॉकआउट चूहे लगभग 8-9 सप्ताह की आयु [7] में मर जाते हैं, इसलिए, वे कैंसर के विकास के लिए मॉडल के रूप में काम नहीं कर सकते हैं। इसलिए, हमने चूहों के अग्नाशय को KLOTHO नॉकडाउन को लक्षित करने का लक्ष्य रखा है। इस उद्देश्य के लिए, Pdx1-Cre चूहों को फ्लक्स्ड KLOTHO एलील्स, KLox/lox [38] ले जाने वाले चूहों के साथ क्रॉसब्रेड किया गया, इस प्रकार Pdx 1- Cre; केएल-/- चूहों (चित्रा 3ए, बी)।आरएनए और प्रोटीन के स्तर ने अग्नाशयी क्लोथो नॉक-डाउन (चित्रा 3सी-ई) को मान्य किया। पीडीएक्स1-क्रे; केएल -77 चूहों ने नियंत्रण (चित्रा 3एफ) की तुलना में समय के साथ वजन में थोड़ी वृद्धि दिखाई, लेकिन सीरम ग्लूकोज या इंसुलिन और ग्लूकोज सहिष्णुता (चित्रा एस 1) में कोई अंतर नहीं है।

चित्रा 3. अग्नाशय KLOTHO पछाड़ना चूहों की पीढ़ी। (ए) KLflox एलील का योजनाबद्ध आरेख: LoxP साइटें KLOTHO के एक्सॉन 2 को फ्लैंक करती हैं, जिससे Pdx के पैनक्रिटा में लक्षित नॉकडाउन होता है1-Cre; केएल-/- चूहों। शीर्ष पैनल फ्लक्स्ड एलील दिखाता है, निचला पैनल Cre पुनर्संयोजन के अपेक्षित परिणाम दिखाता है। (बी) माउस क्लोथो जीनोटाइपिंग के पीसीआर उत्पादों को दिखाने वाला प्रतिनिधि जेल: केएल प्लस / प्लस (डब्ल्यूटी; 370 बीपी), केएल/प्लस (470 और 370 बीपी), और केएलफ्लॉक्स/फ्लोक्स (470 बीपी)। (सी, डी) अग्नाशय आरएनए को पीडीएक्स 1- Cre से निकाला गया था; KL-/-(n=7) और नियंत्रण चूहों(n=4)। क्लोथो एमआरएनए का स्तर अर्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था और इसकी मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रतिनिधि जेल दिखाया गया है (मूल अनक्रॉप्ड ब्लॉट्स चित्र S2में उपलब्ध हैं)। (ई) Pdx1-Cre से उत्पादित अग्नाशय के प्रतिनिधि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल क्लोथो धुंधला हो जाना; KL-/- और चूहों को नियंत्रित करें। बढ़ाई: X20. डब्ल्यू / ओ, बिना। (च) दोनों समूहों में चूहों का वजन (n=5प्रति समूह)। दोहराए गए उपायों ANOVA.p=0.01 का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। नियंत्रण, KLflox/flox चूहों। अग्नाशयी KLOTHO नॉकडाउन और उत्परिवर्ती दशमलव अभिव्यक्ति को परेशान करने वाले चूहे LSL-KrasG12D / प्लस [3] चूहों (Pdx 1- Cre; KrasG12D / प्लस चूहों) के साथ क्रॉसब्रीडिंग Pdx 1- Cre द्वारा उत्पन्न किए गए थे, और आगे उन्हें क्रॉसब्रीडिंग के साथ उत्पन्न किया गया था। KLflox/lox चूहों (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ प्लस चूहों)। नर चूहों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। Pdx1-Cre दोनों में गुदा घावों की उच्च दर के कारण महिला चूहों को बाहर रखा गया था; KrasG12D/ plus और Pdx1-Cre; केएल-/-; KrasG12D / प्लस चूहों, जो ऐसे चूहों [3] में म्यूकोक्यूटेनियस पेपिलोमा की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है।

3.3.अग्नाशयी क्लॉथो का नुकसान चूहों में कम अस्तित्व में योगदान देता है

Pdx के अस्तित्व में कोई अंतर नहीं था1-Cre; KL-/- चूहों, नियंत्रण की तुलना में)। हम 65 सप्ताह के लिए चूहों की निगरानी करके जीवित रहने पर संयुक्त अग्नाशय KLOTHO नॉकडाउन और दशमलव उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आगे बढ़े। मृत्यु या तो अनायास या इच्छामृत्यु से हुई जब गंभीर पीड़ा के लक्षण, या ट्यूमर के बोझ के कारण बलिदान की आवश्यकता हुई, शुरू हुआ। पीडीएक्स की उत्तरजीविता1-करे; KL-/-; KrasG12D/ प्लस चूहों (n =21) ​​को नियंत्रण Pdx1-Cre की तुलना में कम किया गया था; KrasG12D/ प्लस चूहों (n=18;p= 0.02; चित्र 4क)। इस प्रकार, 22 सप्ताह की आयु तक, Pdx का 100 प्रतिशत (18/18)1-Cre; Pdx1-Cre के 71 प्रतिशत (15/21) की तुलना में KrasGi2D/ प्लस चूहे जीवित थे; केएल-/-; KrasG12D/ प्लस चूहों। समूहों (चित्रा 4 बी) के बीच वजन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया।

चित्रा 4. अग्नाशय KLOTHO पछाड़ना कम अस्तित्व में योगदान देता है और विवो में PDAC को प्रेरित करता है। (ए) पीडीएक्स के कपलान-मीयर वक्र1-Cre; KL-/-; KrasGi2D/ plus (n=21) Pdx को नियंत्रित करने की तुलना में1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)mice.p=0.02.( बी) दोनों समूहों में चूहों का वजन (एन =19 प्रति समूह)। (सीई) पैनक्रिएटा को पीडीएक्स1-क्रे से एक्साइज किया गया था; केएल-/-; KrasG12D/ plus (n=7, औसत आयु 36 सप्ताह) और नियंत्रण Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n=8, औसत आयु 49 सप्ताह)बलिदान पर चूहे। (सी) दोनों समूहों के एच एंड ई दाग वाले अग्न्याशय के रोग संबंधी मूल्यांकन के बीच तुलना। (डी) 24-सप्ताह पुराने चूहों से काटे गए अग्नाशय के प्रतिनिधि एच एंड ई धुंधला। पीडीएक्स 1- Cre; केएल-/-; KrasG12D/ प्लस (दाएं): कोशिकीय ध्रुवता का पूर्ण नुकसान, महत्वपूर्ण परमाणु गतिभंग, और डक्टल लुमेन में सेल समूहों का नवोदित, विपुल फाइब्रोसिस और केराटिन के साथ। पीडीएक्स को नियंत्रित करें1-क्रे; KrasG12D / प्लस (बाएं): कोई घाव नहीं। आवर्धन: × 10। (ई) दोनों समूहों के प्रतिनिधि पैनिन घाव। आवर्धन: × 10।

3.4. Klotho Vioo . में PDAC के विकास में सहयोग करता है

पिछले अध्ययनों के आधार पर चूहों में पीडीएसी विकास दिखा रहा है जो दशमलव उत्परिवर्तन और ट्यूमर शमन गतिविधि के नुकसान दोनों को नुकसान पहुंचा रहा है [4], हमने पीडीएक्स की जांच की 1- Cre; केएल-/-; घावों के लिए KrasG12D/ प्लस माउस अग्नाशय। अग्नाशय के तरल पदार्थ द्वारा अग्नाशयी ऊतक के तेजी से पाचन के कारण, हम केवल उन चूहों के अग्नाशय का उपयोग कर सकते हैं जिनकी बलि दी गई थी। पीडीएक्स के नमूने1-क्रे; केएल-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​और नियंत्रण Pdx1-Cre; KrasGi2D / plus (n =8) चूहों का पैथोलॉजिकल मूल्यांकन (मृत्यु की औसत आयु: 36 और 49 सप्ताह, क्रमशः) हुआ। PDAC की पहचान दो Pdx1-Cre; केएल-/-; KrasG12D/ प्लस चूहों, लेकिन किसी भी Pdx1-Cre में नहीं; KrasG12D/ प्लस चूहों, जबकि PanN2 को दो Pdx1-Cre में नोट किया गया था; केएल-/-; KrasG12D/ प्लस चूहों और चार Pdx1-Cre में; KrasG12D/ प्लस चूहों (चित्र 4c)। प्रतिनिधि चित्र दिखाए गए हैं (चित्र 4डी-ई)।

3.5. एसकेएल के साथ उपचार अग्नाशय के ट्यूमर को रोकता है और विवो में लंबे समय तक जीवित रहता है

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; चित्रा 5एफ-जी)।

इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाने वाला दूसरा मॉडल केपीसी मॉडल था। चूहे का लिंग, उम्र और वजन के अनुसार मिलान किया गया और 30 सप्ताह तक घुलनशील मानव एसकेएल या वाहन नियंत्रण के इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया। मृत्यु या तो अनायास या इच्छामृत्यु से हुई जब गंभीर पीड़ा के लक्षण, या ट्यूमर के बोझ के कारण बलिदान की आवश्यकता हुई, शुरू हुआ। नियंत्रण (p=0.005; चित्र 5H) की तुलना में sKL से उपचारित चूहों की उत्तरजीविता बढ़ा दी गई थी।

चित्रा 5. एसकेएल उपचार स्थानीय ट्यूमर के विकास को कम करता है और विवो में अस्तित्व को बढ़ाता है। (एजी) एथिमिक नग्न बीएएलबी / सी चूहों को एमआईए पाका के साथ टीका लगाया गया था -2 कोशिकाएं जो एम-चेरी / ल्यूसिफरेज (1 × 10 डिग्री कोशिकाओं प्रति माउस)। दस दिनों के बाद, चूहों को उच्च खुराक एएवी-एसकेएल (5 × 1011 जीसी / एमएल, एन =7), कम खुराक एएवी-एसकेएल (5 × 1010 जीसी / एमएल, एन {{13}) के साथ इंजेक्शन लगाया गया। }), या AAV-null(5×1010 GC/mL,n= 8) को नियंत्रित करें। (A) विवो में एक डिजिटल कैलीपर के साथ ट्यूमर की मात्रा को मापा गया था। (बी) स्थानीय ट्यूमर के ल्यूसिफरेज गतिविधि बायोइमेजिंग के प्रतिनिधि चित्र। (सी) ट्यूमर लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि को प्रति मिनट गिनती द्वारा मापा गया था। (डी) बलिदान के दिन काटे गए ट्यूमर के प्रतिनिधि चित्र। (ई) काटा ट्यूमर का वजन। (एफ) मानव क्लोथो रक्त स्तर। *पी<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4। चर्चा

वर्तमान अध्ययन पीडीएसी में ट्यूमर शमनकर्ता के रूप में क्लोथो की भूमिका स्थापित करता है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण ने पीडीएसी रोगियों के अस्तित्व और क्लोथो अभिव्यक्ति के स्तर और डीएनए मिथाइलेशन के बीच एक संबंध का खुलासा किया, और अग्नाशय के ट्यूमर में केएलओटीएचओ के एक अद्वितीय हाइपरमेथिलेशन पैटर्न का प्रदर्शन किया। एक उपन्यास माउस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि अग्नाशय क्लोथो नॉकडाउन जीवित रहने को कम करने और PDACin विवो उत्पन्न करने के लिए दशमलव उत्परिवर्तन के साथ सहयोग करता है। इसके अलावा, एल ने एक एक्सनोग्राफ़्ट मॉडल में अग्नाशयी कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले ट्यूमर के विकास को रोक दिया और केपीसी चूहों के अस्तित्व को लंबे समय तक बढ़ाया।

क्लोथो को व्यापक रूप से विकृतियों [16,23,25,26,28-31,33,39,40] में प्रमोटर हाइपरमेथिलेशन के माध्यम से एपिजेनेटिक रूप से खामोश किया जाता है। यह पीडीएसी में छोटे समूहों में भी सूचित किया गया है, साथ ही पीडीएसी रोगियों के अस्तित्व और क्लोथो अभिव्यक्ति के स्तर और डीएनए मेथिलिकरण [17,34] के बीच एक संबंध में भी बताया गया है। तदनुसार, ओएस के हमारे मूल्यांकन के साथ-साथ पीएफआई ने 178 पीडीएसी नमूनों वाले डेटा का उपयोग करते हुए, क्लोथो अभिव्यक्ति के साथ एक सकारात्मक जुड़ाव और क्लोथो डीएनए मिथाइलेशन के साथ एक समान नकारात्मक जुड़ाव दिखाया। ये आंकड़े आगे संकेत देते हैं कि क्लोथो अभिव्यक्ति को डीएनए मेथिलिकरण द्वारा विनियमित किया जा सकता है और इस धारणा को सुदृढ़ करता है कि ये पैरामीटर पीडीएसी रोगियों के पूर्वानुमान का आकलन करने के लिए काम कर सकते हैं।

PDAC [17,34] में KLOTHO डीएनए मेथिलिकरण के पिछले अध्ययन रोगियों के सीमित उपसमुच्चय और इन विट्रो प्रयोगों पर आधारित थे और संपूर्ण KLOTHO जीन के भीतर विशिष्ट साइटों के मिथाइलेशन पैटर्न का विश्लेषण नहीं करते थे। उपरोक्त व्यापक डेटासेट के आधार पर वर्तमान विश्लेषण से पता चला है कि तीन विशिष्ट साइटें, जिनमें से दो KLOTHO के अंतिम एक्सॉन में एक CpGisland के भीतर स्थित हैं, हाइपरमेथिलेशन द्वारा klotho अभिव्यक्ति के नकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य करती हैं। हमने पहले पाया था कि इनमें से एक साइट, cg23282559, कोलोरेक्टल कैंसर [25] में भी हाइपरमेथिलेटेड है। यह अभी तक निर्धारित नहीं किया गया है कि क्या ये साइटें अन्य विकृतियों में भी क्लोथो विनियमन में भूमिका निभाती हैं।

क्लोथो को अग्न्याशय में व्यक्त करने के लिए जाना जाता है; हालांकि, सामान्य अग्नाशय के विकास और कार्य में इसकी भूमिका अभी भी अज्ञात है। जबकि क्लोथो की कमी वाले चूहों में इंसुलिन संवेदनशीलता में नाटकीय वृद्धि के साथ-साथ इंसुलिन उत्पादन में कमी आई है [22], चूहों में क्लोथो की अधिकता के परिणामस्वरूप इंसुलिन प्रतिरोध [8] के साथ तेजी से रक्त इंसुलिन में वृद्धि होती है। हैरानी की बात है कि इस अध्ययन में प्रस्तुत माउस मॉडल, अग्नाशयी क्लोथो नॉकडाउन को परेशान करते हुए, मधुमेह का एक स्पष्ट फेनोटाइप या इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता में बदलाव नहीं दिखा। इसके अलावा, अग्नाशयी आकृति विज्ञान, ट्यूमर के गठन या अस्तित्व पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। इन परिणामों से पता चलता है कि अग्नाशयी क्लोथो के नुकसान की भरपाई प्रणालीगत क्लोथो के परिधीय प्रभावों या अन्य तंत्रों द्वारा की जा सकती है। इसके अलावा, मधुमेह का विकास एक जटिल प्रक्रिया है, जो न केवल अग्न्याशय पर, बल्कि यकृत, मांसपेशियों और वसा ऊतकों पर भी निर्भर करती है। जैसा कि हमारे मॉडल में, क्लोथो मुख्य रूप से अग्न्याशय में खटखटाया गया था, यह इस माउस मॉडल में मधुमेह की कमी की व्याख्या कर सकता है।

प्रस्तुत नैदानिक ​​परिणामों के अनुरूप, Pdx1-Cre; केएल-/-; KrasG12D/ प्लस चूहों ने नियंत्रण Pdx1-Cre की तुलना में जीवन काल को छोटा कर दिया था; KrasGi2D/ प्लस चूहों (क्रमशः 48 बनाम 60 सप्ताह)। यद्यपि हम सभी माउस पैनक्रिएटा की पैथोलॉजिकल रूप से जांच करने में असमर्थ थे, पीडीएक्स 1- Cre में स्पष्ट PDAC की उच्च दर देखी गई; केएल-7-; नियंत्रण Pdx1-Cre की तुलना में KrasG12D/ प्लस चूहों; KrasG2D / प्लस चूहे। ये परिणाम विवो में अग्नाशय की विकृतियों और अस्तित्व के विकास में क्लोथो के महत्व को प्रदर्शित करते हैं। पीडीएक्स का फेनोटाइप1-Cre; KL-/-: KrasGl2D/ प्लस चूहों का उच्चारण कम होता है, दशमलव उत्परिवर्तन के साथ अन्य ट्यूमर सप्रेसर्स के नुकसान के संयोजन वाले मॉडल की तुलना में। एक उदाहरण के रूप में, केपीसी चूहों की औसत उत्तरजीविता केवल 5 महीने है [5]। यह संभव है कि यह क्लोथो के परिसंचारी द्वारा स्थानीय क्लोथो के नुकसान की आंशिक क्षतिपूर्ति के कारण हो। वैकल्पिक रूप से, अग्न्याशय में क्लोथो की अवशिष्ट अभिव्यक्ति ने फेनोटाइप को प्रभावित किया हो सकता है। भविष्य के अध्ययनों में क्लोथो के पूर्ण लक्षित साइलेंसिंग को प्राप्त करने से विभिन्न ऊतकों में इसकी भूमिका को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी, साथ ही क्लोथो के स्थानीय और प्रणालीगत प्रभावों के बीच असंतुलन भी होगा।

हमने क्लोथो की चिकित्सीय क्षमता को प्रदर्शित करने वाले दो मॉडल प्रस्तुत किए। एक xenograft माउस मॉडल में, एक वायरल त्वचा वेक्टर के अग्नाशयी कैंसर इंजेक्शन अत्यधिक प्रभावी थे, न केवल ट्यूमर के विकास को रोकने में बल्कि ट्यूमर के आकार को कम करने में भी। उपचार तब शुरू हुआ जब ट्यूमर पहले से ही दिखाई दे रहे थे और स्थापित हो गए थे, अधिकांश रोगियों में उपचार की शुरुआत के समय के समान। परिणाम बताते हैं कि उसका उपयोग जीन थेरेपी के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार प्रोटीन और पेप्टाइड-आधारित दवाओं की स्थिरता और प्रभावोत्पादक वितरण के लिए प्रमुख बाधाओं को दरकिनार किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर के वजन और मानव क्लोथो रक्त स्तर के बीच एक नकारात्मक सहसंबंध नोट किया गया था। इसके प्रभाव के संबंध में क्लोथो रक्त स्तरों के आगे के शोध से यह अनुमान लगाने में सहायता मिल सकती है कि क्लोथो या एसक्यूएल के साथ उपचार से किसे लाभ होगा, साथ ही साथ चिकित्सीय खिड़की के भीतर स्तर बनाए रखने में भी मदद मिल सकती है।

क्लोथो-आधारित उपचारों का विकास कई शोध समूहों के साथ-साथ दवा कंपनियों द्वारा मांगा गया लक्ष्य है। कैंसर के इलाज के संबंध में, कई रास्ते तलाशे जा रहे हैं। क्लोथो अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए दिखाए गए एपिजेनेटिक तंत्र का लाभ उठाकर कोई भी क्लोथो के अंतर्जात स्तर को बढ़ा सकता है। यह बताया गया है कि क्लोथो प्रमोटर कई कैंसर में भारी रूप से मिथाइलेटेड होता है, और यह उम्र का एक कार्य भी है। इस प्रकार, यौगिक जो डीएनए मिथाइल ट्रांसफरेज़ को रोकते हैं, क्लोथो अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य बन सकते हैं। दूसरी ओर, कोई व्यक्ति क्लोथो को बहिर्जात रूप से जोड़कर स्तरों को बढ़ा सकता है, उदाहरण के लिए, जीन थेरेपी को नियोजित करके या एक पुनः संयोजक क्लोथो प्रोटीन की डिलीवरी द्वारा। यहां, हमने एएवीएक्सप्रेशन सिस्टम का उपयोग करते हुए क्लोथो (एल) के सक्रिय क्षेत्र की शुरूआत की सूचना दी, जिसके परिणामस्वरूप अग्नाशय के कैंसर के एक मॉडल में चिकित्सीय प्रभाव पड़ा।

इसके बाद, हमने दिखाया कि घुलनशील आकाश के साथ उपचार केपीसी चूहों के अस्तित्व को लंबे समय तक जीवित रखता है, एक मॉडल जिसे मानव पीडीएसी को पुनर्पूंजीकृत करने के लिए जाना जाता है। इसने एक प्रतिरक्षा-सक्षम मेजबान और देशी ट्यूमर वातावरण में आकाश के प्रभाव का प्रदर्शन किया, आगे नैदानिक ​​​​सेटिंग्स में एसएसएल के संभावित उपयोग का समर्थन किया।

5। निष्कर्ष

अंत में, इस अध्ययन ने पीडीएसी में क्लोथो को एक शक्तिशाली ट्यूमर शमनकर्ता के रूप में पहचाना। PDAC के लिए वर्तमान उपचार के नियम पर्याप्त नहीं हैं, और बहिर्जात sKL का प्रशासन PDAC के उपचार के लिए एक नई रणनीति के रूप में काम कर सकता है।

यह लेख कैंसर 2021, 13, 6297 से निकाला गया है। https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers