प्राथमिक हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प के रूप में एक्टियोसाइड: एक प्रीक्लिनिकल अध्ययन

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दी मा, जुआन वांग, लू लियू, मीकी चेन और ज़ियोंग वांगो

सार

पृष्ठभूमि: हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया भर में खराब रोग का निदान, उच्च रुग्णता और मृत्यु दर की विशेषताओं के साथ एक सामान्य घातक ट्यूमर है। विशेष रूप से, उन्नत एचसीसी रोगियों के लिए केवल कुछ प्रणालीगत उपचार विकल्प उपलब्ध हैं और इसमें सॉराफेनीब और हाल ही में वर्णित एटेज़ोलिज़ुमाब प्लस बेवाकिज़ुमैब रेजिमेन को संभव प्रथम-पंक्ति उपचार के रूप में शामिल किया गया है। हम यहां उन्नत एचसीसी के खिलाफ संभावित उम्मीदवार के रूप में कई औषधीय पौधों में व्यापक रूप से वितरित एक्टोसाइड, एक फेनिलथेनोइड ग्लाइकोसाइड का प्रस्ताव करते हैं।

तरीके: सेल प्रसार, कॉलोनी गठन और प्रवासन का विश्लेषण तीन मानव एचसीसी सेल लाइनों BEL7404, HLF और JHH -7 में किया गया था। HUVES का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस परख की गई। BEL7404 या JHH -7 xenograft नग्न चूहों का मॉडल एक्टोसाइड के संभावित एंटीट्यूमर प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए स्थापित किया गया था। क्यूआरटी-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग एक्टियोसाइड के संभावित एंटीट्यूमर तंत्र को प्रकट करने के लिए किया गया था।

परिणाम:सिस्टैंच से एक्टोसाइडसभी तीन मानव एचसीसी सेल लाइनों बीईएल7404, एचएलएफ और जेएचएच में सेल प्रसार, कॉलोनी गठन और प्रवास को बाधित किया -7। एचयूवीईसी के ट्यूब निर्माण और सेल प्रवास के निषेध द्वारा एक्टोसाइड द्वारा एंजियोजेनेसिस के निषेध का पता चला था। एक्टोसाइड और सोराफेनीब के संयोजन ने सेल कॉलोनी के गठन और एचसीसी कोशिकाओं के प्रवास के साथ-साथ एचयूवीईसी के एंजियोजेनेसिस के मजबूत निषेध का उत्पादन किया। एक्टोसाइड की विवो एंटीट्यूमर प्रभावकारिता को आगे BEL7404 या JHH -7 xenograft नग्न चूहों के मॉडल में प्रदर्शित किया गया था, जब JHH -7 xenograft के विकास को रोकने में सोराफेनीब के साथ संयुक्त होने पर वृद्धि हुई थी। एक्टोसाइड के साथ जेएचएच -7 कोशिकाओं के आगे के उपचार से ट्यूमर शमन प्रोटीन p53 के स्तर में वृद्धि के साथ-साथ कैलिकेरिन-संबंधित पेप्टिडेज़ (KLK1, 2, 4, 9, और 10) जीन स्तर में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं हुई। शेष KLK1-15 जीनों में परिवर्तन।

निष्कर्ष:सिस्टैंच से एक्टोसाइडसंभावित रूप से p53 स्तरों के अप-विनियमन के साथ-साथ KLK अभिव्यक्ति और एंजियोजेनेसिस के निषेध के माध्यम से एक एंटीट्यूमर प्रभाव डालती है। क्लिनिक में उन्नत एचसीसी के उपचार में एक्टोसाइड एक सहायक के रूप में उपयोगी हो सकता है।

कीवर्ड: एक्टोसाइड, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा, सोराफेनीब, ज़ेनोग्राफ़्ट, पी 53, कल्लिकेरिन

पार्श्वभूमि

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया भर में खराब रोग का निदान और उच्च रुग्णता और मृत्यु दर की विशेषताओं के साथ एक सामान्य घातक ट्यूमर है [1, 2]। एचसीसी की घटना और प्रगति में योगदान करने के लिए विभिन्न कारकों की पहचान की गई है, जिसमें हेपेटाइटिस बी या सी वायरस द्वारा संक्रमण, ट्यूमर शमन जीन की निष्क्रियता जैसे कि पी 53, के-रस जैसे ऑन्कोजीन की असामान्य सक्रियता और कुछ सिग्नलिंग अणु शामिल हैं। जैसे कि PI3K, ERK/MAPK, और Wnt/-कैटेनिन के साथ-साथ मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की चोरी [3, 4]। एचसीसी के प्रबंधन के लिए, उच्छेदन, यकृत प्रत्यारोपण और रेडियोफ्रीक्वेंसी एब्लेशन प्रारंभिक चरण के एचसीसी रोगियों के लिए विकल्प हैं, फिर भी पुनरावृत्ति और मेटास्टेसिस की उच्च दर के साथ [3, 5, 6]। इसके अलावा, उन्नत एचसीसी रोगियों के लिए केवल कुछ प्रणालीगत उपचार विकल्प उपलब्ध हैं और इसमें सॉराफेनीब और हाल ही में वर्णित एटेज़ोलिज़ुमाब प्लस बेवाकिज़ुमैब रेजिमेन को संभव प्रथम-पंक्ति उपचार के रूप में शामिल किया गया है [7]। इस संदर्भ में, कई आणविक लक्ष्यों को लक्षित करने वाले नए एजेंटों को विकसित करना या उन्नत एचसीसी के उपचार में संयुक्त चिकित्सा के अनुप्रयोग जैसी नई रणनीति स्थापित करना महत्वपूर्ण और रुचि का है।

सिस्टैंच से एक्टोसाइडएक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड व्यापक रूप से कई औषधीय पौधों में वितरित किया जाता है, जिसमें लिगस्ट्रम पुरपुरस्केंस [8], रहमानिया ग्लूटिनोसा [9], और लिगस्ट्रम पुरपुरस्केंस [10] शामिल हैं। बढ़ते सबूतों से पता चला है कि एक्टोसाइड विभिन्न जैविक गतिविधियों को अंजाम दे सकता है, जिसमें इसकी एंटीट्यूमर गतिविधि भी शामिल है। उदाहरण के लिए, एक्टोसाइड ने प्रोस्टेटिक कैंसर कोशिकाओं [11] पर मजबूत एंटीप्रोलिफेरेटिव प्रभाव दिखाया। एक मेलेनोमा माउस मॉडल में एक्टोसाइड दमन ट्यूमर के विकास की इंट्रापेरिटोनियल डिलीवरी संभवतः प्रोटीन किनेज सी [12] को बाधित करने के माध्यम से होती है। इसके अलावा, एक्टोसाइड ने PI3K/Akt सिग्नलिंग [13] को लक्षित करके कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं के संवेदीकरण को 5- फ्लूरोरासिल में प्रबल किया। हमारे पिछले डेटा ने बी16 मेलेनोमा कोशिकाओं [14] में एक्टोसाइड द्वारा मेलेनोजेनेसिस के निषेध को भी दिखाया है। इसके बावजूद, एचसीसी के उपचार में एक्टोसाइड की संभावित प्रभावकारिता और संभावित अंतर्निहित तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी उपलब्ध है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने दिखाया है किसिस्टैंच से एक्टोसाइडसभी तीन मानव HCC सेल लाइनों BEL7404, HLF और JHH7 में सेल प्रसार, कॉलोनी गठन और प्रवास को रोकता है। एक्टोसाइड के साथ उपचार के बाद एंजियोजेनेसिस को भी रोक दिया जाता है, जैसा कि एचयूवीईसी के ट्यूब गठन और सेल प्रवास के निषेध द्वारा दिखाया गया है। एक्टोसाइड की विवो एंटीट्यूमर प्रभावकारिता को आगे BEL7404 या JHH -7 xenograft नग्न चूहों के मॉडल में प्रदर्शित किया गया है, जब JHH -7 xenograft के विकास को रोकने में सोराफेनीब के साथ संयुक्त होने पर वृद्धि हुई है। एक्टोसाइड के एंटीट्यूमर प्रभाव को इसके p53 के अप-विनियमन के साथ-साथ केएलके और एंजियोजेनेसिस के दमन के लिए निर्दिष्ट किया जा सकता है।

तरीकों

कोश पालन

मानव हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) सेल लाइन्स बीईएल7404, एचएलएफ, और जेएचएच7 को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन से प्राप्त किया गया था और 100 यूनिट/एमएल पेनिसिलिन जी और 100 यूजी/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त डीएमईएम माध्यम में नियमित रूप से सुसंस्कृत किया गया था। 5 प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में। मानव गर्भनाल एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) को मानव गर्भनाल नसों (ScienCell Research Laboratories, San Diego, USA द्वारा प्रदान की गई) से अलग किया गया था और एक एंडोथेलियल सेल माध्यम में बनाए रखा गया था जैसा कि पहले बताया गया था [15]।

अभिकर्मकोंसिस्टैंच से एक्टोसाइड (ए 0 1) जिआंगसु योंगजियान मेडिसिन टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (ताइझोउ, चीन; लॉट नंबर 100581; शुद्धता एचपीएलसी द्वारा 99 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर) से खरीदा गया था। सोराफेनीब को सेलेक केमिकल्स (ह्यूस्टन, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। हमने एक्टियोसाइड को 0.9 प्रतिशत खारा में घोल दिया। सॉराफेनीब का स्टॉक समाधान डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ; 10 मिमी) में तैयार किया गया था, जिसे अलग-अलग किया गया था, और इसे −20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था।

जानवरों

नर BALB/c (Nu/Nu) चूहों (18-20 g, प्राप्ति के समय 6-8 सप्ताह) का अध्ययन अध्ययन में किया गया (शंघाई स्लैक लेबोरेटरी एनिमल कंपनी लिमिटेड, शंघाई, चीन)। जानवरों को एक तापमान में व्यक्तिगत रूप से हवादार पॉलीसल्फोन पिंजरों में रखा गया है- और प्रकाश-नियंत्रित कमरे (12 घंटे प्रकाश - 12 घंटे अंधेरे चक्र, 7 बजे रोशनी: 00 बजे) भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ . सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग से संबंधित दर्द के अध्ययन के लिए इंटरनेशनल एसोसिएशन के दिशानिर्देशों का पालन किया गया था।

सेल प्रसार परख एमटीटी परख का उपयोग करके एंटी-प्रोलिफ़ेरेटिव गतिविधि का प्रदर्शन किया गया था। संक्षेप में, कोशिकाओं को 4-5 × 103 कोशिकाओं के घनत्व पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाया गया था। रातोंरात संलग्न होने के बाद, कोशिकाओं को एक्टोसाइड की सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ इलाज किया गया था। संकेतित समय बिंदु पर दवा उपचार के बाद, कोशिकाओं को 3-(4,5- डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) के साथ ऊष्मायन किया गया था। रोश डायग्नोस्टिक कॉर्पोरेशन, इंडियानापोलिस, आईएन, यूएसए। अंतिम एकाग्रता: 5 ug/ml) 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर। 570 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर परिमाणीकरण के लिए डीएमएसओ में फॉर्मेज़न उत्पाद को भंग कर दिया गया था।

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 कोशिकाओं को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (× 100 आवर्धन; ओलिंप, टोक्यो, जापान) के तहत गिना गया था।

घाव भरने की परख कोशिकाओं को {0}}वेल प्लेट्स (1 × 105 सेल प्रति कुएं) में रखा गया और 90 प्रतिशत संगम तक सुसंस्कृत किया गया। घाव के अंतराल का उत्पादन करने के लिए सेल परत को एक बाँझ 200 उल पिपेट टिप के साथ खरोंच किया गया था। घायल क्षेत्र में सेल प्रवास को × 100 के आवर्धन पर एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत संकेतित समय बिंदुओं (0, 10, और 24 घंटे) पर देखा गया था। प्रत्येक प्रयोग तीन प्रतियों में किया गया था।

ट्यूब गठन परख एचयूवीईसी को पहले वर्णित [15] के रूप में सुसंस्कृत किया गया था। संक्षेप में, 96-वेल प्लेट्स को निर्माता के निर्देशों के अनुसार Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) के साथ लेपित किया गया और फिर 30-40 मिनट के लिए पोलीमराइज़ करने के लिए इनक्यूबेटर में वापस आ गया। एचयूवीईसी को तब 2 × 105 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर रखा गया था और 8 घंटे के लिए विभिन्न दवाओं के साथ इलाज किया गया था। संकेतित समय बिंदुओं पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ ट्यूब गठन का फोटो खींचा गया और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया।

पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण

कुल सेल lysates रेडियोइम्यूनोप्रेजर्वेशन परख बफर (RIPA) (5 0 pH 8 पर mM Tris HCl.0, 150 mM NaCl, 1 प्रतिशत NP40, 1 प्रतिशत सोडियम डीओक्सीकोलेट, 0.1 प्रतिशत एसडीएस, 10 के साथ तैयार किए गए थे। यूजी/एमएल ल्यूपेप्टिन, 10 यूजी/एमएल एप्रोटीनिन और 2 एमएम पीएमएसएफ)। समान मात्रा (20 कुरूप / लेन) वाले प्रोटीन के नमूनों को एसडीएस-पेज जेल पर अलग किया गया और पीवीडीएफ झिल्ली (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्ली को रात भर p53 एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, बोस्टन, एमए) के साथ लगाया गया था। लोडिंग नियंत्रण के लिए, झिल्लियों को एक स्ट्रिपिंग बफर के साथ रिंस किया गया और -एक्टिन एंटीबॉडी (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए) के साथ रिप्रोड किया गया। एक ईसीएल डिटेक्शन सिस्टम (पर्किन एल्मर लाइफ साइंसेज, बोस्टन, यूएसए) का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाया गया था।

QRT- पीसीआर

ट्राईजोल अभिकर्मक (इनविट्रोजन, यूएसए) का उपयोग करके सेल लाइनों से कुल आरएनए निकाला गया था और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) से गुजरना पड़ा। 2xSYBR ग्रीन qPCR सुपरमिक्स का उपयोग करते हुए रीयल-टाइम qRT-PCR स्ट्रैटेगने Mx3000P PRC ma chine (Agilent Technologies, USA) पर आयोजित किया गया था। प्राइमरी सीक्वेंस नीचे दिखाए गए थे: सेंस 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3′ और एंटी-सेंस 5′- CAAACAAGTT GTGGGCGACCC-3′ KLK1 के लिए; सेंस 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ और एंटी-सेंस 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ KLK2 के लिए; सेंस 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ और KLK3 के लिए एंटी-सेंस 5′-CCC AGA ATCACCCCGAGCAG-3′; सेंस 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ और एंटी-सेंस 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ KLK4 के लिए; सेंस 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ और एंटी-सेंस 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ KLK5 के लिए; सेंस 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ और एंटी-सेंस 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ KLK6 के लिए; सेंस 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ और एंटी-सेंस 5′- KLK7 के लिए GTCACCATTTGCAGGCGTTTT-3′; सेंस 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ और एंटी-सेंस 5′- ACACCGCCACACAGAGTAGTTG-3′ KLK8 के लिए; सेंस 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ और एंटी-सेंस 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ KLK9 के लिए; सेंस 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ और एंटी-सेंस 5′- CTGGGGAGGAAGAGAGGATGGA-3′ KLK10 के लिए; सेंस 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ और एंटी-सेंस 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ KLK11 के लिए; सेंस 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ और KLK12 के लिए एंटी-सेंस 5′-GGATCAGTCCACATACTTGC-3′; सेंस 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ और एंटी-सेंस 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ KLK13 के लिए; सेंस 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ और एंटी-सेंस 5′-CCTGAGCAACTGCTCGTGA-3′ KLK14 के लिए; सेंस 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ और एंटी-सेंस 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ KLK15 के लिए; सेंस 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ और एंटी-सेंस 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ GAPDH के लिए। प्रत्येक केएलके जीन के चक्र दहलीज (सीटी) मूल्यों को जीएपीडीएच के लिए सामान्यीकृत किया गया और एमएक्सप्रो सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया।

अकेले ए 01 की विवो एंटीट्यूमर गतिविधि में या सोराफेनीब के साथ संयोजन में बीईएल7404 सेल निलंबन तैयार किए गए थे (3 × 106 कोशिकाएं) और सूक्ष्म रूप से दाएं फ्लैंक में इंजेक्ट किया गया था। एथलेटिक नग्न चूहों. टीकाकरण के दस दिन बाद, ट्यूमर-असर वाले चूहों (शरीर का वजन (जी): 22-26; माध्य ± SEM: 23.8 ± 0 .14) की जांच की गई और ट्यूमर की मात्रा के बाद 7 उपचार समूहों में यादृच्छिकरण के लिए चुना गया ({ {12}} मिमी3 )। मॉडल समूह (n=8) को छोड़कर विभिन्न उपचार समूहों (n=5 प्रति समूह) को कुल 38 चूहों को सौंपा गया था। जानवरों को तब मौखिक गैवेज के माध्यम से एक्टियोसाइड (ए 01; 12.5, 25 और 50 मिलीग्राम / किग्रा), अकेले सोराफेनीब (50 मिलीग्राम / किग्रा) या ए01 (50 मिलीग्राम / किग्रा) के संयोजन में 14 दिनों के लिए दैनिक रूप से इलाज किया गया था। इसके अलावा, 20 मिलीग्राम/किलोग्राम A01 की एक खुराक भी अंतःशिर्ण रूप से दी गई। पिछले अध्ययनों और हमारे प्रारंभिक डेटा [15] के आधार पर खुराक का चयन किया गया था। एक इलेक्ट्रॉनिक कैलीपर का उपयोग करके हर 3 या 4 दिनों में ट्यूमर के विकास की निगरानी की गई, जिसकी गणना 0.5xlengthxwidth (mm3) के रूप में की गई। इसके अलावा, JHH-7 टीका का उपयोग करते हुए एक समानांतर प्रयोग शामिल किया गया था। टीकाकरण के सात दिन बाद, ट्यूमर असर करने वाले चूहों (शरीर का वजन (जी): 20-26; माध्य ± एसईएम: 24.0 ± 0.20) की जांच की गई और ट्यूमर की मात्रा (80-130 मिमी 3 के अनुसार उपचार समूहों में यादृच्छिकरण के लिए चुना गया। ) मॉडल समूह (n=8) को छोड़कर कुल 23 चूहों को 4 उपचार समूहों (n=5 प्रति समूह को सौंपा गया था। जानवरों को तब A01 (20 मिलीग्राम / किग्रा, iv), अकेले सोराफेनीब (50 मिलीग्राम / किग्रा, आईजी) या A01 (20 मिलीग्राम / किग्रा, iv) के साथ लगातार 14 दिनों तक प्रतिदिन एक बार प्राप्त हुआ। सभी चूहों को क्लोरल हाइड्रेट (350 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ संवेदनाहारी किया गया और अवलोकन अवधि के अंत में गर्दन की अव्यवस्था से बलि दी गई। और ट्यूमर द्रव्यमान को हटा दिया गया और एक डिजिटल कैमरे के साथ चित्रित किया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। जब तक अन्यथा न कहा गया हो, सांख्यिकीय विश्लेषण विचरण (ANOVA) के विश्लेषण का उपयोग करके किया गया, जिसके बाद पोस्टहॉक टुके परीक्षण किया गया। ट्यूमर वॉल्यूम मान माध्य (SEM) के माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में दिखाए जाते हैं। टू-वे एनोवा के बाद तुकी परीक्षण का उपयोग ट्यूमर वॉल्यूम डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। p < 0.05="" का="" मान="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="">

परिणाम

इन विट्रो में एचसीसी के प्रसार और कॉलोनी गठन पर A01 का प्रभाव

सेल प्रसार परख के लिए तीन HCC सेल लाइनों (BEL7404, HLF, और JHH7) का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, MTT परख से पता चला कि A01 ने तीनों HCC कोशिकाओं के प्रसार को रोक दिया। आगे यह पूछने के लिए कि क्या A01 की एंटीप्रोलिफ़ेरेटिव गतिविधि सेल क्लोनोजेनेसिटी को बाधित करने की क्षमता के कारण थी, कॉलोनी गठन परख की गई थी। 100 माइक्रोन पर A01 ने BEL7404 कोशिकाओं (छवि 2 ए और बी) में कॉलोनी गठन का मजबूत निषेध दिखाया। जब सोराफेनीब (2 μM) के साथ संयुक्त किया गया, तो निषेध शक्ति अकेले A01 या सॉराफेनीब की तुलना में अधिक मजबूत थी। इसी तरह के परिणाम अन्य दो एचसीसी कोशिकाओं, एचएलएफ और जेएचएच -7 (छवि 2 सी और डी) में भी देखे गए थे।

अकेले A01 के प्रभाव या इन विट्रो में एचसीसी के सेल प्रवास पर सॉराफेनीब के साथ संयोजन में

हमने अगली बार स्क्रैच घाव परख का उपयोग करके सेल माइग्रेशन का मूल्यांकन किया। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, A01 (100 या 500 μM) और सॉराफेनीब (10 μM) के संयोजन ने नियंत्रण समूह के साथ तुलना करने पर तीनों HCC कोशिकाओं में घाव भरने को काफी हद तक रोका। BEL7404 कोशिकाओं के लिए, A01 (100 या 500 μM) और सॉराफेनीब (10 μM) दोनों ने केवल बिना किसी सांख्यिकीय महत्व के घाव भरने की रोकथाम की प्रवृत्ति उत्पन्न की (चित्र 3a और d)। HLF कोशिकाओं के लिए, A01 500 μM पर और सॉराफेनीब 10 μM पर घाव भरने को रोकता है। विशेष रूप से, A01 (500 μM) ने सोराफेनीब (10 μM) के साथ मिलकर अकेले सॉराफेनीब (छवि 3 बी और ई) की तुलना में घाव भरने का एक मजबूत निषेध उत्पन्न किया। JHH कोशिकाओं के लिए, घाव भरने को A01 (500 μM) और सॉराफेनीब (10 μM) द्वारा रोका गया था। A01 (100 μM) और सॉराफेनीब (10 μM) के संयोजन ने अकेले A01 (100 μM) या सॉराफेनीब (10 μM) की तुलना में घाव भरने का एक मजबूत निषेध उत्पन्न किया। इसके अलावा, 500 μM पर A01 सोराफेनीब (10 μM) के साथ संयुक्त रूप से A01 (500 μM) या सॉराफेनीब (10 μM) अकेले (छवि 3c और f) की तुलना में घाव भरने का एक मजबूत निषेध दिखाया।

अकेले A01 के प्रभाव या इन विट्रो में एंजियोजेनेसिस पर सॉराफेनीब के साथ संयोजन में

एंजियोजेनेसिस ट्यूमर के विकास, प्रगति और मेटास्टेसिस [16] के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है, और इस प्रकार इसे कैंसर के उपचार के लिए हस्तक्षेप करने वाले लक्ष्यों में से एक माना जाता है। हमने पहले इन विट्रो में संभावित एंजियोजेनेसिस का विश्लेषण करने के लिए एक ट्यूब गठन परख की। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, अकेले सोराफेनीब (10 माइक्रोन) या ए01 (100 और 500 माइक्रोन) और सोराफेनीब (10 माइक्रोन) के संयोजन के साथ 3 घंटे के लिए उपचार ने पोत जैसी संरचनाओं के निर्माण पर निरोधात्मक प्रभाव दिखाना शुरू कर दिया, अर्थात HUVECs का बढ़ाव और संरेखण (चित्र 4a और c)। 8 घंटे, A01 (100 और 500 μM), सॉराफेनीब (10 μM) के साथ-साथ A01 और सोराफेनीब के संयोजन के लिए उपचार के बाद, A01 और सॉराफेनीब के संयोजन द्वारा मजबूत निषेध के साथ, पोत जैसी संरचनाओं के निर्माण में काफी बाधा उत्पन्न हुई। A01 या अकेले सोराफेनीब (चित्र। 4a और c)। इसके अलावा, एचयूवीईसी का सेल माइग्रेशन एंजियोजेनेसिस के दौरान नए जहाजों के निर्माण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है और इसकी जांच की जाती है। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 4b और d, A01 (500 μM), सोराफेनीब (10 μM) के साथ-साथ A01 (100 और 500 μM) और सॉराफेनीब (10 μM) का संयोजन सभी HUVECs के महत्वपूर्ण सेल माइग्रेशन को रोकता है। A01 (500 μM) सोराफेनीब (10 μM) के साथ संयुक्त रूप से A01 (500 μM) या सॉराफेनीब (10 μM) की तुलना में अधिक मजबूत अवरोध उत्पन्न करता है।

अकेले A01 के प्रभाव या BEL7404 और JHH के विवो ट्यूमर के विकास पर सॉराफेनीब के साथ संयोजन में -7 HCC xenografts

एचसीसी के विवो ट्यूमर के विकास में अकेले ए 0 1 की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए या सॉराफेनीब के साथ संयुक्त, हमने बीईएल 74 0 4 या जेएचएच -7 का उपयोग करके एक चमड़े के नीचे के ज़ेनोग्राफ़्ट नग्न माउस मॉडल की स्थापना की। कोशिकाएं। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, ए 01 (25 और 50 मिलीग्राम/किलोग्राम के साथ ओरल गैवेज के माध्यम से उपचार के बाद ट्यूमर की मात्रा बहुत कम हो गई थी; 20 मिलीग्राम/किलोग्राम, पूंछ शिरा के माध्यम से; सभी पी <0.01 बनाम="" मॉडल="" समूह)="" या="" सॉराफेनीब="" (50="" मिलीग्राम="" किग्रा,="" मौखिक="" गावेज="" के="" माध्यम="" से;="" पी=""><0.01 बनाम="" मॉडल="" समूह)="" अकेले="" (छवि="" 5="" ए="" और="" बी)।="" a01="" (50="" mg/kg)="" और="" सोराफेनीब="" (50="" mg/kg)="" के="" संयोजन="" ने="" अकेले="" सॉराफेनीब="" (p=""><0.01) के="" साथ="" तुलना="" करने="" पर="" ट्यूमर="" के="" विकास="" का="" एक="" मजबूत="" निषेध="" दिखाया,="" लेकिन="" अकेले="" a01="" के="" समान="" प्रभाव="" उत्पन्न="" किया="" (चित्र="" 5a="" और="" c)="" )="" हमने="" अगली="" बार="" a01="" की="" संभावित="" एंटी-ट्यूमर="" प्रभावकारिता="" का="" परीक्षण="" करने="" के="" लिए="" jhh="" -7="" xenograft="" नग्न="" चूहों="" के="" मॉडल="" का="" उपयोग="" किया।="" जैसा="" कि="" चित्र="" 6="" में="" दिखाया="" गया="" है,="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" या="" सॉराफेनीब="" (50="" mg/kg,="" ig)="" के="" साथ="" उपचार="" से="" jhh="" -7="" xenograft="" (p=""><0.01 बनाम="" मॉडल="" समूह)="" के="" ट्यूमर="" के="" विकास="" में="" एक="" महत्वपूर्ण="" अवरोध="" उत्पन्न="" हुआ।="" ),="" अधिक="" निषेध="" के="" साथ,="" जब="" एक="" साथ="" संयुक्त="" (चित्र।="" 6a="" और="" b;="" p=""><0.01 बनाम="" a01="" या="" अकेले="" सॉराफेनीब="">

कल्लिकेरिन-संबंधित पेप्टिडेज़ और p53 by . का संभावित मॉडुलनसिस्टैंच से एक्टोसाइड

कैलिकेरिन-संबंधित पेप्टिडेज़ (केएलके) को विभिन्न कैंसर के निदान और निदान में एक कैंसर बायोमार्कर के रूप में सुझाया गया है, जिसमें इसकी विकृत अभिव्यक्ति के कारण हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा भी शामिल है [17-19]। इस परिदृश्य में, हमने HCC JHH -7 सेल लाइन में KLK1–15 की जीन अभिव्यक्ति का पता लगाया। जैसा कि चित्र 7 में दिखाया गया है, एक्टोसाइड के साथ उपचार ने KLK1, 2, 4, 9, और 10 mRNA स्तर (चित्र 7a-e) का एक महत्वपूर्ण अवरोध उत्पन्न किया, जिसमें KLK1-15 के बाकी हिस्सों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (डेटा नहीं दिखाया गया) ) इसके अलावा, हमने ट्यूमर शमन प्रोटीन p53 के स्तर का भी पता लगाया और एक्टोसाइड (छवि 7f) के साथ उपचार में वृद्धि का खुलासा किया।

बहस

पहले के चरणों में निदान की अक्षमता और ट्यूमर के केमोरेसिस्टेंस [5, 6] के कारण उन्नत एचसीसी का प्रबंधन लंबे समय से कठिन रहा है। सोराफेनीब, मल्टीकाइनेज इनहिबिटर ने सेल प्रसार और एंजियोजेनेसिस को बाधित करने की सूचना दी, साथ में एक और ओरल मल्टी-किनेज इनहिबिटर लेनवाटिनिब उन्नत एचसीसी [3, 5, 20, 21] का मानक उपचार बन गया है। हालांकि, नैदानिक ​​​​सेटिंग्स [3, 22] में कम प्रतिक्रिया दर और अनुपयुक्तता के प्रकाश में समग्र जीवित रहने की दर मामूली है। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि एटेज़ोलिज़ुमाब प्लस बेवाकिज़ुमैब ने अनसेक्टेबल एचसीसी वाले रोगियों में सॉराफेनीब की तुलना में बेहतर नैदानिक ​​​​परिणाम दिए, जिससे यह संयोजन उन्नत एचसीसी [7] के लिए एक संभावित नया प्रथम-पंक्ति उपचार विकल्प बन गया। इस संदर्भ में, हमने पहचाना है कि फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड,सिस्टैंच से एक्टोसाइडतीन मानव HCC सेल लाइनों BEL7404, HLF, और JHH -7 के साथ-साथ HUVECs के निषिद्ध एंजियोजेनेसिस में सेल प्रसार, कॉलोनी गठन और प्रवास को बाधित किया। एक्टोसाइड और सोराफेनीब के संयोजन ने सेल कॉलोनी के गठन और एचसीसी कोशिकाओं के प्रवास के साथ-साथ एचयूवीईसी के एंजियोजेनेसिस के मजबूत निषेध का उत्पादन किया। Acteoside ने BEL7404 या JHH -7 xenograft नग्न चूहों के मॉडल में एंटीट्यूमर प्रभावकारिता प्रस्तुत की, जब JHH -7 xenograft के विकास को रोकने में सोराफेनीब के साथ संयुक्त होने पर वृद्धि हुई। आगे के विश्लेषणों से p53 में वृद्धि के साथ-साथ कुछ KLK जीन की कमी का पता चला। तदनुसार, क्लिनिक में उन्नत एचसीसी के उपचार में सहायक के रूप में एक्टोसाइड के संभावित उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए।

बढ़ते साक्ष्य ने एंटीट्यूमर प्रभाव दिखाया हैसिस्टैंच से एक्टोसाइडविभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं में जैसे बी16 मेलेनोमा कोशिकाएं, ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाएं, कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाएं, मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाएं, प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाएं, और मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाएं [11-13, 23-25] या ट्यूमर वाले जानवरों में [12]। इसके बावजूद, कुछ अध्ययनों ने चूहों में हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस को प्रेरित करने और एक्टोसाइड [26] द्वारा कीमोप्रिवेंशन को प्रकट करने के लिए कार्सिनोजेन के रूप में डायथाइलनिट्रोसामाइन का उपयोग करने वाले एक अध्ययन को छोड़कर इन विट्रो या विवो में एचसीसी पर एक्टोसाइड के प्रभावों पर ध्यान केंद्रित किया है। वर्तमान अध्ययन में, हमने सेल प्रसार, कॉलोनी गठन, और एचसीसी सेल लाइनों में प्रवास के साथ-साथ एचसीसी सेल लाइन एक्सनोग्राफ़्ट्स को प्रभावित करने वाले चूहों में ट्यूमर के विकास के निषेध को दिखाया, जिससे सीधे एचसीसी में एक्टोसाइड के एंटीट्यूमर प्रभाव का प्रदर्शन होता है। इसके अलावा, एक्टोसाइड और सॉराफेनीब के संयोजन ने और भी मजबूत एंटीट्यूमर प्रभाव उत्पन्न किया। इस सबूत के साथ कि एक्टोसाइड जिगर की चोटों के खिलाफ सुरक्षात्मक है [27-29] जानवरों में कोई विषाक्त प्रभाव नहीं है और कोई उत्परिवर्तजन नहीं है [30], यह उन्नत रोगियों में एक्टोसाइड और सोराफेनीब के संयोजन चिकित्सा के भविष्य के आवेदन के लिए संभव लगता है। क्लिनिक में एच.सी.सी.

मानव कल्लिकेरिन परिवार में 15 समरूप, एकल-श्रृंखला, स्रावित ट्रिप्सिन- या काइमोट्रिप्सिन-जैसे सेरीन प्रोटीज़ (KLK1–15) शामिल हैं और इसे ट्यूमर के विकास, नियोप्लास्टिक प्रगति, एंजियोजेनेसिस और मेटास्टेसिस [18, 31] के नियमन में फंसाया गया है। विशेष रूप से, केएलके को विभिन्न कैंसर के निदान और निदान में एक कैंसर बायोमार्कर के रूप में सुझाया गया है, जिसमें इसकी विकृत अभिव्यक्ति के कारण हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा भी शामिल है [17-19]। उदाहरण के लिए, KLK1 को गैस्ट्रिक कैंसर के बायोमार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है क्योंकि गैस्ट्रिक नियोप्लाज्म में KLK1 का स्तर बढ़ जाता है और KLK1 गतिविधि को कैलिकेरिन-बाइंडिंग प्रोटीन (KBP) [32] के साथ रोककर गैस्ट्रिक कैंसर में ट्यूमर के विकास को रोकता है। इस परिदृश्य में, हमने एक्टोसाइड (KLK1, 2, 4, 9, और 10) द्वारा KLK mRNA स्तर का एक महत्वपूर्ण निषेध देखा। केबीपी का अनुप्रयोग, जो विशेष रूप से कल्लिकेरिन को बांधता है और कल्लिकेरिन गतिविधि को रोकता है, एचसीसी की प्रगति में केएलके की संभावित भागीदारी का सुझाव देते हुए, संभवतः इसकी एंटी-एंजियोजेनिक गतिविधि [33] के माध्यम से चूहों में एचसीसी के विकास को दबाने के लिए सूचित किया गया था। इसके अलावा, ट्यूमर शमन प्रोटीन p53 बुढ़ापा, एपोप्टोसिस के साथ-साथ कोशिका चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करने में सक्षम है। बढ़ी हुई p53 अभिव्यक्ति कैंसर कोशिकाओं [34] में बढ़ी हुई रासायनिक संवेदनशीलता प्रदान करती है। इस संबंध में, हमारे पश्चिमी परिणामों ने एक्टोसाइड के साथ उपचार के बाद p53 के स्तर में वृद्धि दिखाई। एक साथ लिया गया, यह अनुमान लगाना उचित है कि एक्टोसाइड एचसीसी पर एंटीट्यूमर प्रभाव डालता है, संभवतः इसके पी 53 के अप-विनियमन के साथ-साथ केएलके और एंजियोजेनेसिस के निषेध के माध्यम से।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्यक्ष आणविक लक्ष्य जिसके लिएसिस्टैंच से एक्टोसाइडसीधे बाँध सकता है अभी भी अस्पष्ट है। आणविक डॉकिंग का उपयोग करते हुए हमारे प्रारंभिक डेटा ने कैलिकेरिन (दिखाया नहीं गया डेटा) के साथ एक्टोसाइड के प्रत्यक्ष बंधन का खुलासा किया। इस अनुमान को स्पष्ट करने के लिए और प्रयोग आवश्यक होंगे। इसके अलावा, अध्ययन 1 0-5 0 में सेल परख के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले एक्टोसाइड की खुराक के लिए, सोराफेनीब (10 माइक्रोन) की तुलना में सबसे पहले हमने एक्टियोसाइड की उन खुराक को चुना। एमटीटी परख में खुराक-प्रतिक्रिया संबंध। दूसरा, हमारे द्वारा उपयोग की जाने वाली खुराक (100, 500 μM) पिछले अध्ययनों [35] की तुलना में थी, जिसमें एक्टोसाइड (100 μM) कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं के कोशिका प्रसार को रोकता था। अंत में, सेल परख में उच्च खुराक के बावजूद, एक्टोसाइड ने हमारे अध्ययन (25 और 50 मिलीग्राम / किग्रा) में एचसीसी ज़ेनोग्राफ़्ट नग्न चूहों के मॉडल में ट्यूमर के विकास का एक स्पष्ट निषेध उत्पन्न किया, सोराफेनीब (50 मिलीग्राम / किग्रा) के समान प्रभाव। सॉराफेनीब के लिए, इसका उपयोग हमारे अध्ययन में सेलुलर स्तर पर 10 माइक्रोन की खुराक पर किया गया था। यह खुराक पिछले अध्ययनों की तुलना में है जिसमें सोराफेनीब को पीएलसी/पीआरएफ/5 और हेपजी2 कोशिकाओं की एचसीसी सेल लाइनों में 4.0-6.5 माइक्रोन के आईसी 50 के साथ सेल व्यवहार्यता को बाधित करने के लिए पाया गया था। इसके विपरीत, SCID मादा चूहों में HCC xenograft के विकास को दबाने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सॉराफेनीब की खुराक 30 mg/kg (po by gavage) [36] थी। क्लिनिक में, रोगी के लिए सोराफेनीब की अनुशंसित खुराक 400 मिलीग्राम प्रति समय (2*0.2 ग्राम), दिन में दो बार (कुल 800 मिलीग्राम प्रति दिन) है। क्लिनिक में उपयोग किए जाने वाले सॉराफेनीब के लिए यह खुराक सेल परख (माइक्रोन स्तर में IC50 मान) के विपरीत है, संभवतः विवो परिस्थितियों में इसकी खराब अवशोषण क्षमता के कारण। एक्टियोसाइड के लिए, चूहों (50 मिलीग्राम / किग्रा, आईजी) में इसकी खुराक के आधार पर, मनुष्यों के लिए इसकी समकक्ष खुराक (60 किग्रा बीडब्ल्यू) लगभग 250 मिलीग्राम है। यह खुराक क्लिनिक में इस्तेमाल होने वाले सॉराफेनीब के बराबर है और रोगियों के लिए स्वीकार्य होना चाहिए।

निष्कर्ष निष्कर्ष में,सिस्टैंच से एक्टोसाइडHCC सेल लाइनों में और HCC सेल लाइन xenograft को प्रभावित करने वाले नग्न चूहों में एक एंटीट्यूमर प्रभाव डालने में सक्षम है, संभवतः p53 के स्तर को बढ़ाने के साथ-साथ KLK और एंजियोजेनेसिस को प्रतिबंधित करने के माध्यम से प्रभाव। क्लिनिक में उन्नत एचसीसी के उपचार में एक्टोसाइड एक सहायक के रूप में उपयोगी हो सकता है।

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