4. सामग्री और विधियाँ

4.1. संयंत्र के लिए सामग्री

इस अध्ययन के लिए उपयोग किए गए अफ्रीकी एस. औरिया बीज इटली के एक विशेषज्ञ स्टोर से प्राप्त किए गए थे। पौधों की खेती कैग्लियारी विश्वविद्यालय (UNICA) की पादप जीवविज्ञान और फार्मास्युटिकल वनस्पति विज्ञान प्रयोगशाला में की गई थी। 5 सप्ताह के बाद, प्रजातियों की पर्यावरण-शारीरिक आवश्यकताओं के अनुसार, उन्हें "प्लांटा मेडिका" ग्रीनहाउस में रखा गया। पौधों को दो साल की वृद्धि के बाद उनके खिलने की अवधि में एकत्र किया गया। हवाई हिस्सों को पूरी तरह सूखने तक (जब वे एक स्थिर वजन तक पहुंच गए) तुरंत एक वायु-बलित वेंटिलेशन ओवन (एफडी 115, बाइंडर) में रखा गया था। वाउचर संख्या (6/23.8/वी1) के साथ इटली के कैग्लियारी विश्वविद्यालय के हर्बेरियम करालिटनम (सीएजी) में एक वाउचर नमूना जमा किया गया था।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ करने और मुक्त कट्टरपंथी-प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोकने की क्षमता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयन क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

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4.2. आवश्यक तेल विश्लेषण

यूरोपीय फार्माकोपिया दिशानिर्देशों [89] के अनुसार, आवश्यक तेल को क्लीवेंजर-प्रकार के उपकरण का उपयोग करके 3 घंटे के हाइड्रोडिस्टीलेशन द्वारा प्राप्त किया गया था। फ्लेम आयनाइजेशन डिटेक्शन (जीसी-एफआईडी) और गैस क्रोमैटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) के साथ गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा बाद का विश्लेषण [13] के अनुसार आयोजित किया गया था। संक्षेप में, जीसी विश्लेषण के लिए, एक एचपी 5 केशिका स्तंभ का उपयोग किया गया था, जिसमें विभिन्न तापमानों पर क्रमशः 82 मिनट की प्रायोगिक प्रक्रिया के साथ, 60 ◦C से 246 ◦C तक 3 ◦C/मिनट की दर पर रखा गया था, जिसे तब रखा गया था 20 मिनट के लिए 246 डिग्री सेल्सियस। हीलियम (शुद्धता 99.9999 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर) का उपयोग 1 एमएल/मिनट प्रवाह दर पर वाहक गैस के रूप में किया गया था। पतला नमूना का कुल 1 μL (एन-हेक्सेन में 1:1{{32%), w/w) को 1:20 विभाजन अनुपात के साथ एक ऑटोसैंपलर द्वारा इंजेक्ट किया गया था। एमएस स्थितियों के संबंध में, 240 ◦C स्थानांतरण लाइन, 200 ◦C EI आयन स्रोत, और 150 ◦C चतुर्ध्रुव तापमान का उपयोग किया गया था, जिसमें 70 eV की आयनीकरण ऊर्जा और स्कैन के m/z पर 3.2 स्कैन s-1 थे। रेंज (30 से 480 तक)। एमएसडी केमस्टेशन सॉफ्टवेयर (एगिलेंट, रेव. ई.01.00.237, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) का उपयोग क्रोमैटोग्राम और मास स्पेक्ट्रा को प्रबंधित और विस्तृत करने के लिए किया गया था। अंत में, प्राप्त यौगिकों की पहचान NIST02 और एडम्स लाइब्रेरी तुलना [37,38] द्वारा की गई। यौगिकों के प्रयोगात्मक अवधारण सूचकांक (आरआई) की अर्ध-ध्रुवीय चरणों के साथ तुलना करके परिणामों को और अधिक जांचा गया, जिसे आरआई ने साहित्य में बताया था। प्रायोगिक आरआई को रैखिक प्रक्षेप [90] के साथ संदर्भ के रूप में एन-अल्केन्स के दो मानक मिश्रण (क्रमशः सी8-सी20 और सी21-सी40) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। रिपोर्ट किए गए घटकों के प्रतिशत की गणना जीसी पीक क्षेत्रों पर बिना किसी एफआईडी प्रतिक्रिया कारक सुधार के की गई थी।

4.3. एंटिफंगल गतिविधि

एस. औरिया ईओ एंटीफंगल गतिविधि के लिए सात डर्माटोफाइट उपभेदों का परीक्षण किया गया। क्रमशः, नाखून और त्वचा के अलगाव से तीन नैदानिक ​​उपभेद प्राप्त किए गए: एपिडर्मोफाइटन फ्लोकोसम एफएफ9, ट्राइकोफाइटन मेंटाग्रोफाइट्स एफएफ7, और माइक्रोस्पोरम कैनिस एफएफ1। जबकि शेष चार डर्माटोफाइट उपभेद कोलेसिओन एस्पानोला डी कल्टिवोस टिपो (सीईसीटी) से संबंधित थे: टी. मेंटाग्रोफाइट्स संस्करण। इंटरडिजिटल सीईसीटी 2958, टी. रूब्रम सीईसीटी 2794, टी. वेरुकोसम सीईसीटी 2992, और एम. जिप्सियम सीईसीटी 2908। शुद्धता और व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक परीक्षण से पहले सभी उपभेदों को सबाउरॉड डेक्सट्रोज एगर (एसडीए) या पोटैटो डेक्सट्रोज एगर (पीडीए) में संवर्धित किया गया था।

माइक्रोडिल्यूशन के लिए सीएलएसआई प्रोटोकॉल द्वारा सुझाए गए संशोधनों के अनुसार ईओ की न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता (एमआईसी) और न्यूनतम घातक एकाग्रता (एमएलसी) का प्रदर्शन किया गया [91]। संक्षेप में, ईओ को डीएमएसओ (5–0.32 µL/mL) में पतला किया गया और फिर बाँझ परीक्षण ट्यूबों में जोड़ा गया। इनोकुलम को मैलापन को 0.5 मैकफारलैंड में समायोजित करके तैयार किया गया था और फिर ग्लूटामाइन के बिना और 3-(एन-मॉर्फोलिनो) प्रोपेन सल्फोनिक एसिड (एमओपीएस) पीएच 7 के साथ आरपीएमआई{6}} में पतला किया गया था। {10}} 1-2 × 104 सीएफयू/एमएल की सांद्रता तक, जिसे बाद में ईओ युक्त टेस्ट ट्यूब में जोड़ा गया था। फिर ट्यूबों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए ऊष्मायन किया गया। बाद में, फंगल विकास के लिए ट्यूबों का मूल्यांकन किया गया, और सबसे कम सांद्रता जहां कोई वृद्धि नहीं देखी गई, उसे न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) माना गया। सबसे कम सांद्रता जहां 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए एसडीए में नकारात्मक ट्यूबों को चढ़ाने के बाद कोई वृद्धि नहीं देखी गई, उसे न्यूनतम घातक एकाग्रता (एमएलसी) माना जाता था। परीक्षण किए गए सूक्ष्मजीवों की संवेदनशीलता को नियंत्रित करने के लिए एक संदर्भ एंटिफंगल यौगिक, फ्लुकोनाज़ोल (फाइज़र) का उपयोग किया गया था। परिणाम दो प्रतियों में किए गए तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे, और परिणाम माध्य के रूप में व्यक्त किए गए थे। नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों को भी शामिल किया गया था, जो क्रमशः गैर-इनोक्युलेटेड माध्यम और अधिकतम डीएमएसओ एकाग्रता (1 प्रतिशत) के साथ इनोक्युलेटेड माध्यम द्वारा दर्शाए गए थे।

4.4. सूजनरोधी गतिविधि

4.4.1. कोश पालन

माउस ल्यूकेमिक मैक्रोफेज RAW 264.7 सेल लाइन, जो अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC TIB-71) से संबंधित थी, को सुसंस्कृत किया गया था जैसा कि पहले हमारे समूह द्वारा रिपोर्ट किया गया था [92]।

4.4.2. नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन

ग्रीज़ अभिकर्मक [93] का उपयोग करके संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में नाइट्रेट की एकाग्रता का आकलन करके कोई उत्पादन का मूल्यांकन नहीं किया गया था। कोशिकाओं (0.6 × 1{7}}6 कोशिकाओं/वेल) को 48-वेल कल्चर प्लेटों में संवर्धित किया गया। मैक्रोफेज को रात भर स्थिर किया गया, फिर 1 घंटे के लिए EO ({{15%).08–1.25 µL/mL) के साथ DMSO में पतला करके पूर्व-उपचार किया गया और बाद में 24 घंटे के लिए 50 ng/mL LPS के साथ सक्रिय किया गया। एलपीएस-उत्तेजित मैक्रोफेज और अनुपचारित मैक्रोफेज का उपयोग क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ग्रिज़ प्रतिक्रिया हमारे समूह [92] में पहले वर्णित अनुसार की गई थी। उपयोग की गई उच्चतम सांद्रता (0.4 प्रतिशत) पर डीएमएसओ को हमारे समूह द्वारा पहले ही दिखाया गया था कि इसमें कोई सूजन-रोधी या साइटोटॉक्सिसिटी गतिविधि नहीं है (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

4.4.3. प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रोटीन, iNOS और COX की अभिव्यक्ति-2 

RAW 264.7 कोशिकाओं (1.2 × 106 कोशिकाओं/वेल) को 6-वेल प्लेटों में संवर्धित किया गया और रात भर स्थिर किया गया। फिर, इन कोशिकाओं को 1.25 µL/mL सांद्रता पर EO के साथ 1 घंटे ऊष्मायन के अधीन किया गया, इसके बाद 24 घंटे LPS सक्रियण (50 ng/mL) किया गया। अनुपचारित कोशिकाओं से एक नकारात्मक नियंत्रण का गठन किया गया था, और केवल एलपीएस-उपचारित कोशिकाओं से एक सकारात्मक नियंत्रण का गठन किया गया था। सेल लाइसेट्स की तैयारी ज़ुज़ार्टे एट अल द्वारा पहले किए गए प्रोटोकॉल का पालन करती है। [92]

इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आईएनओएस) और साइक्लोऑक्सीजिनेज़ {{{{36 }}}} (सीओएक्स -2) सामग्री का मूल्यांकन वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा किया गया था जैसा कि पहले बताया गया है [13]। प्रोटीन पृथक्करण के लिए, 130 वी पर 10 प्रतिशत (वी/वी) एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जैल के साथ 1.5 घंटे के लिए एक इलेक्ट्रोफोरेटिक रन किया गया था। परिणामस्वरूप प्रोटीन लाइनों को 3 घंटे के लिए 400 एमए पर पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली (पहले मेथनॉल के साथ सक्रिय) में ब्लॉट किया गया था। फिर झिल्लियों को टीबीएस-टी में 5 प्रतिशत (डब्ल्यू/वी) स्किम दूध के साथ गैर-विशिष्ट आईजीजी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। उन्हें विशिष्ट एंटी-आईएनओएस (1:500; आर एंड डी सिस्टम) या एंटी-सीओएक्स -2 (1:5000; एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके) एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। . अंत में, उन्हें टीबीएस-टी (10 मिनट, 3 बार) के साथ 30 मिनट तक धोया गया और द्वितीयक एंटीबॉडी (1:40, 000; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, डलास, टीएक्स, यूएसए) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। ) हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज के साथ संयुग्मित। इम्युनोकॉम्पलेक्स का पता एक केमिलुमिनसेंस स्कैनर (इमेज क्वांट एलएएस 500, जीई, बोस्टन, एमए, यूएसए) द्वारा किया गया था। ट्यूबुलिन के खिलाफ एंटीबॉडी (1:20,000; सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। इमेजलैब सॉफ्टवेयर संस्करण 6.1.0 (बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग प्रोटीन मात्रा निर्धारण के लिए किया गया था।

4.5. सेल माइग्रेशन

माउस भ्रूणीय फ़ाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) को पहले [6] में वर्णित अनुसार सुसंस्कृत किया गया था।

4.5.2. सेल माइग्रेशन परख

मार्टिनोटी एट अल के अनुसार खरोंच घाव परख का उपयोग करके सेल माइग्रेशन किया गया था। [94] मामूली संशोधनों के साथ, जैसा कि पहले बताया गया था [13]। संक्षेप में, एनआईएच 3टी3 फ़ाइब्रोब्लास्ट को 2.5 × 105 कोशिकाओं/एमएल पर रखा गया और संगम तक पहुंचने की अनुमति दी गई। बाद में, घाव को 200 μL पिपेट टिप से लगाया गया, और गैर-चिपकने वाली कोशिकाओं को पीबीएस पीएच 7.4 से धोकर हटा दिया गया। ईओ (1.25 µL/एमएल) जोड़े जाने के साथ या उसके बिना 2 प्रतिशत एफबीएस के साथ डीएमईएम। छवियों को चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्क्रैच के बाद 0, 12 और 18 घंटे में प्राप्त किया गया था, और घाव क्षेत्र को ImageJ/Fiji सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था। प्रस्तुत परिणाम निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे:

4.6. सेल व्यवहार्यता

जैसा कि पहले बताया गया था, मैक्रोफेज और फ़ाइब्रोब्लास्ट की व्यवहार्यता पर ईओ की विभिन्न सांद्रता के प्रभाव का आकलन रेज़ाज़ुरिन कमी परख का उपयोग करके किया गया था।

4.7. एटोपोसाइड-प्रेरित बुढ़ापा

जैसा कि अन्यत्र रिपोर्ट किया गया है [95], कुछ संशोधनों के साथ, वृद्धावस्था प्रेरक के रूप में एटोपोसाइड का उपयोग करके वृद्धावस्था का मूल्यांकन किया गया था। संक्षेप में, एटोपोसाइड के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को एस. औरिया ईओ की उपस्थिति या अनुपस्थिति (सीटी) में 72 घंटे के लिए और ऊष्मायन किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल (#9860, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी इंक., डेनवर, एमए, यूएसए) के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ का मूल्यांकन किया गया था। स्पष्ट नीले रंग का धुंधलापन बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ गतिविधि को इंगित करता है। रंग विकास के बाद, बाद के छवि विश्लेषण के लिए कुओं की तस्वीरें खींची गईं। इमेजजे सॉफ़्टवेयर का उपयोग वृद्ध कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करके मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया गया था।

4.8. सांख्यिकीय विश्लेषण 

प्रयोग कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए दो प्रतियों में किए गए। माध्य मान ± SEM (माध्य की मानक त्रुटि) परिणामों में प्रस्तुत किए जाते हैं। एंटी-इंफ्लेमेटरी, सेल व्यवहार्यता और बुढ़ापा परख के लिए सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन ग्राफपैड प्रिज्म संस्करण 9.3 का उपयोग करके विचरण (एनोवा) और डननेट के पोस्ट हॉक परीक्षण के एक-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किया गया था। 0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, सीए , यूएसए)। जबकि सेल माइग्रेशन परख के लिए सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद सिडैक के कई तुलनात्मक परीक्षण किए गए थे, पी मान <{6}}.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में स्वीकार किया गया था।

प्र. 5। निष्कर्ष

यह कार्य आमतौर पर साल्विया एसपीपी के लिए जिम्मेदार लाभकारी प्रभावों को पुष्ट करता है। एस. औरिया के लिए बताए गए कुछ पारंपरिक उपयोगों को मान्य करके। इसके अलावा, प्रमुख यौगिकों के रूप में 1,8 सिनेओल, -पिनीन, सीस-थुजोन, कपूर, (ई)-कैरियोफिलीन, ट्रांस-थुजोन, -पिनीन, कैम्फीन और -हुमुलीन के साथ एक विलक्षण रासायनिक संरचना का खुलासा किया गया था। हम यहां रिपोर्ट करते हैं कि ईओ एंटीफंगल, एंटी-इंफ्लेमेटरी और घाव भरने वाले प्रभाव डालता है, इस प्रकार त्वचा संक्रमण, सूजन संबंधी बीमारियों और घावों के इलाज के लिए इस प्रजाति से जुड़े पारंपरिक उपयोग को मान्य करता है।

इसके अलावा, यह अध्ययन पहली बार रिपोर्ट करता है कि यह प्रजाति एंटीसेन्सेंस प्रभाव डालने में सक्षम थी, जिससे इस प्रजाति में रुचि को और बढ़ावा मिला। इसलिए, ये परिणाम सूजन और त्वचा से जुड़े संक्रमण को कम करने में एस. औरिया की भूमिका को उजागर करते हैं, जिससे डर्मो-सौंदर्य प्रसाधनों में रुचि बढ़ती है। जबकि इस अध्ययन से पता चला है कि प्रासंगिक जैविक गतिविधियों के साथ उच्च मूल्य वाले मेटाबोलाइट्स के उत्पादन को खेती के माध्यम से बढ़ावा दिया जा सकता है, आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के परिणामस्वरूप रासायनिक प्रोफ़ाइल की अत्यधिक परिवर्तनशीलता को देखते हुए, खेती किए गए पौधे का सटीक रासायनिक विश्लेषण आवश्यक है। (तनाव, मिट्टी के गुण, फसल का मौसम)।

लेखक का योगदान:एलएस और एएम; सत्यापन, डीएम, ईसी, एमजेजी, एमटीसी, और एसपी; औपचारिक विश्लेषण, जेएमए-एस., एमजेजी, और एपी; जांच, जेएमए-एस., एएम, और एपी; संसाधन, एएम, एमटीसी, और एलएस; डेटा क्यूरेशन, एपी; लेखन-मूल मसौदा तैयार करना, ईसी, डीएम, जेएमए-एस., एपी, और एएम; लेखन- समीक्षा और संपादन, ईसी, डीएम, एमटीसी, एलएस, और एएम; विज़ुअलाइज़ेशन, जेएमए-एस.; पर्यवेक्षण, एलएस और एएम; परियोजना प्रशासन, एलएस; फंडिंग अधिग्रहण, एलएस और एमटीसी सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ लिया है और उससे सहमत हैं।

अनुदान: इस कार्य को यूआईडीबी/04539/2020, यूआईडीपी/04539/2020 और एलए/पी/0058/ परियोजनाओं के तहत प्रतिस्पर्धा 2020-प्रतिस्पर्धा और अंतर्राष्ट्रीयकरण के लिए परिचालन कार्यक्रम और एफसीटी-फंडाकाओ पैरा ए सिएनसिया ईए टेक्नोलोजिया के माध्यम से पुर्तगाली राष्ट्रीय निधि द्वारा वित्त पोषित किया गया था। 2020.

स्वीकृतियाँ: लेखक तकनीकी सहायता के लिए डेनिएला स्टैंडन, द इंटरनेशनल स्टडी एंड लैंग्वेज इंस्टीट्यूट (द यूनिवर्सिटी ऑफ रीडिंग, यूके, d.standen@reading.ac.uk) के बहुमूल्य योगदान को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।

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