त्वचा विरोधी उम्र बढ़ने की गतिविधि के साथ संपन्न एक ओएनोथेरा बिएनिस सेल संस्कृतियां सेल यांत्रिक गुणों में सुधार करती हैं

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सार:त्वचा की उम्र बढ़ना एक बहुत ही प्रसिद्ध प्रक्रिया है जो अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स मशीनरी के उत्पादन में गिरावट और संकुचन प्रक्रिया में समवर्ती परिवर्तन के कारण त्वचा की यांत्रिक विशेषताओं के क्रमिक बिगड़ने को निर्धारित करती है। इस प्रगति को धीमा करने के लिए, लोचदार फाइबर गठन और ऊतक मरम्मत को बढ़ावा देने में सक्षम कई प्रोटीनों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करना महत्वपूर्ण है। यहां, ओएनोथेरा द्वि-एननिस सेल कल्चर जलीय अर्क की रासायनिक दृष्टिकोण से जांच की गई है, और फिर इसे सेल में इन विट्रो में परीक्षण किया गया था, और पूर्व विवो प्रयोगों में त्वचा की उम्र बढ़ने का मुकाबला करने में एक सहायक के रूप में तदनुसार, यह किया गया है दिखाया गया है कि मैट्रिक्स कोलेजन संकुचन, एक्टिन पोलीमराइज़ेशन और आवश्यक ईसीएम प्रोटीन के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए, MYLK जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाकर, ओएनोथेरा बिएनिस अर्क सक्षम था।

कीवर्ड:चयापचय; आणविक नेटवर्क; ओएनोथेरा बिएनिस सेल संस्कृतियों का हाइड्रोफिलिक अर्क; मैट्रिक्स कोलेजन संकुचन; त्वचा की उम्र बढ़ना

1 परिचय

त्वचा की उम्र बढ़ना अंतर्जात और बहिर्जात कारकों से प्रेरित एक बहुत ही प्रसिद्ध प्रक्रिया है। बुढ़ापा के दौरान, सभी त्वचीय शारीरिक कार्य अक्षम्य रूप से पतित हो जाते हैं, और यह प्रगतिशील गिरावट त्वचा को नुकसान पहुंचाती है [1]। वास्तव में, त्वचा धीरे-धीरे अपनी यांत्रिक विशेषताओं को गिरा देती है, जो अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के उत्पादन में गिरावट और संकुचन प्रक्रिया में समवर्ती परिवर्तन दोनों के कारण होती है। सबसे महत्वपूर्ण डर्मिस एक्स्ट्रा-सेलुलर मैट्रिक्स घटक कोलेजन I और IIl, लेमिनिन, पेरीओस्टिन, टेनस्किन, इलास्टिन, फ़ाइब्रोनेक्टिन और प्रोटीग्लिकैन जैसे प्रोटीन हैं, क्योंकि उनकी सापेक्ष मात्रा और तह अवस्था कोशिकाओं और के बीच बातचीत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मैट्रिक्स, डर्मिस की उचित बनावट की गारंटी [3]। उदाहरण के लिए, बाह्य अंतरिक्ष में, फ़ाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स असेंबली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि यह सेल सतह रिसेप्टर्स (जैसे, इंटीग्रिन) और कोलेजन, प्रोटीयोग्लीकैन और अन्य फोकल आसंजन अणुओं के बीच एक सेतु बनाता है। लैमिनिन बाह्य मैट्रिक्स की संरचना में योगदान करते हैं और आसंजन, भेदभाव, प्रवासन, फेनोटाइप की स्थिरता और एपोप्टोसिस के प्रति प्रतिरोध को नियंत्रित करते हैं। इलास्टिन सेल आसंजन और सेल माइग्रेशन के लिए भी महत्वपूर्ण है, और इसमें सेल सिग्नलिंग में भाग लेने की क्षमता है। फाइब्रिलिन इसी तरह ट्रोपोएलेस्टिन और इंटीग्रिन के साथ निकटता से बातचीत करते हैं, और वे इलास्टिन के लोचदार फाइबर में संयोजन के लिए महत्वपूर्ण हैं। फैबुलस बेसमेंट झिल्ली, लोचदार फाइबर, और बाह्य मैट्रिक्स के अन्य घटकों के साथ कसकर जुड़ा हुआ है, और लोचदार फाइबर गठन में भाग लेता है। Tenascins बाह्य मैट्रिक्स (ECM) पॉलीमॉर्फिक ग्लाइकोप्रोटीन हैं जो प्रभावी ऊतक मरम्मत को सक्षम करने के लिए फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं में मध्यस्थता करते हैं [4] इसके अतिरिक्त, त्वचा सिकुड़ने की प्रक्रिया भी फ़ाइब्रोब्लास्ट की कार्रवाई पर आधारित होती है, जो त्वचीय मैट्रिक्स में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाएं होती हैं; वे मैट्रिक्स घटकों के बीच संपर्कों को बढ़ावा देने, त्वचा के उचित तनाव को स्थापित करते हैं, जो बदले में त्वचा की कॉम्पैक्टनेस, घनत्व और प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार होते हैं। उनके सेलुलर साइटोस्केलेटन संगठन के आधार पर, एक्टिन-मायोसिन मशीनरी होती है, जो उनके आकार और उनकी संरचना में संभावित परिवर्तनों को निर्धारित करती है। दरअसल, एक्टिन और मायोसिन का बंधन एक अधिक कॉम्पैक्ट सेलुलर संरचना को प्रेरित करता है, फाइबर को एक साथ लाता है, स्वस्थ और कॉम्पैक्ट ऊतक के विकास की गारंटी देता है, और फाइबर के विघटन को रोकता है जिसके परिणामस्वरूप झुर्रियां होती हैं। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट अनुबंध और खिंचाव की क्षमता वर्षों से आंशिक रूप से खो जाती है क्योंकि वृद्ध कोशिकाएं अब सही और पूरी तरह से कार्य करने में सक्षम नहीं हैं। कम यांत्रिक बल के कारण, फ़ाइब्रोब्लास्ट लम्बी आकृति की तुलना में अधिक गोल और विकृत आकारिकी में जाते हैं [5]। कुछ सबूतों ने संकेत दिया है कि उम्र बढ़ने के दौरान, MYLK (मायोसिन लाइट चेन किनेज) नामक प्रोटीन के संश्लेषण में काफी कमी आई है। MYLK में एक विशिष्ट मायोसिन डोमेन के फॉस्फोराइलेशन द्वारा निष्पादित एक काइनेज गतिविधि होती है, जिसका नाम मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला है, जो एक्टिन-बाइंडिंग को प्रेरित करने में सक्षम है और इसलिए सेल सिकुड़न को बढ़ावा देता है [6]।bioflavonoidsजब इस प्रोटीन की कम गतिविधि का पता चला, उदाहरण के लिए, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति के कारण, मैट्रिक्स कोलेजन संकुचन [7] और एक्टिन पोलीमराइजेशन [8] की इसी कमी को मापा गया। एक्टिन साइटोस्केलेटन असेंबली न केवल कोशिका गति और अनुबंध करने की क्षमता से जुड़ी हुई है, बल्कि TGF-II रिसेप्टर (TGFBRII) के सक्रियण के माध्यम से ECM मैट्रिक्स प्रोटीन के उत्पादन से भी जुड़ी हुई है।[9]। TGFBRII TGF- सेल सतह रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स से संबंधित है, जो Smad ट्रांसक्रिप्शन कारकों के सक्रियण के माध्यम से, ECM के कई जीन एन्कोडिंग घटकों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जिसमें कोलेजन, लेमिनिन, फ़ाइब्रोनेक्टिन और प्रोटीयोग्लीकैन [10] शामिल हैं। एक्टिन साइटोस्केलेटन डिसएस्पेशन टीजीएफ-आईएल रिसेप्टर को डाउनरेगुलेट करता है। यह डाउन-रेगुलेशन, बदले में, कोलेजन और अन्य ईसीएम प्रोटीन के उत्पादन को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप त्वचीय द्रव्यमान और त्वचा की नाजुकता का नुकसान होता है।

दरअसल, कई कॉस्मेटिक अवयवों का उद्देश्य त्वचीय मैट्रिक्स की सही कॉम्पैक्टनेस और त्वचा के अच्छे संकुचन को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार कई प्रमुख कारकों के संश्लेषण को प्रोत्साहित करना है। इस परिदृश्य में, प्रजाति ओएनोथेरा बिएनिस (इवनिंग प्रिमरोज़) से प्राप्त अर्क, ओनाग्रेसी परिवार से संबंधित हैं, जो फैटी एसिड, फिनोल, ट्राइटरपेन्स और फ्लेवोनोइड्स जैसे जैव सक्रिय यौगिकों की सामग्री के कारण व्यापक रुचि रखते हैं, जो पहले से ही हैं। विभिन्न त्वचा रोग संबंधी रोगों के उपचार में परीक्षण किया गया [11]। इन मेटाबोलाइट्स में से कुछ, बदले में, इंटरल्यूकिन 1 (IL -1), इंटरल्यूकिन 6 (IL -6), साइटोकिन्स, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF-) जैसे सूजन मध्यस्थों को दबाने के लिए सूचित किया जाता है। [12 ]. इसके अलावा, Oenothera biennis हवाई भागों के अर्क ने H, O, से प्रेरित डीएनए क्षति और कोशिका मृत्यु से एचसीएटी कोशिकाओं की रक्षा की, एक तंत्र के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव के कारण सेलुलर क्षति को अवरुद्ध करके जिसमें ROS उन्मूलन और Nrf2 / HO -1 सिग्नलिंग मार्ग शामिल थे। 13]. इसके अलावा, ओएनोथेरा बिएनिस ऑयल, जो लिपिड से भरपूर है, को एक्जिमा के रोगियों के लिए एक अच्छे मॉइस्चराइजर के रूप में प्रस्तावित किया गया है, इसकी वजह से त्वचा में आसानी से प्रवेश करने की क्षमता है [14]। अफसोस की बात है, सौंदर्य प्रसाधनों में लगे खेती वाले पौधों की तैयारी में कुछ नुकसान शामिल हो सकते हैं: पहला, वे जहरीले या एलर्जेनिक पदार्थों जैसे कि कीटनाशकों, उर्वरकों या प्रदूषकों से दूषित हो सकते हैं; फिर, पौधे अप्रत्याशित तनाव और मौसमी परिस्थितियों या पोषक तत्वों की उपलब्धता में भिन्नता के अधीन होते हैं, जो अप्रत्याशित चयापचयों के संश्लेषण को प्रेरित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, अर्क में रोगजनक सूक्ष्मजीव हो सकते हैं, जो अंतिम उत्पादों की गुणवत्ता को कम करते हैं। ये सभी कमियां, बदले में, द्वितीयक चयापचयों की एक परिवर्तनशील सामग्री और कम प्रजनन क्षमता के जोखिम में परिवर्तित हो जाती हैं। इन कमजोरियों को दूर करने के लिए, सौंदर्य प्रसाधनों में पादप कोशिका संवर्धन का उपयोग अधिक लोकप्रिय हो रहा है और इसकी बहुत सराहना की जा रही है, क्योंकि यह उपर्युक्त कई नुकसानों को दूर करता है [15]।

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इस अध्ययन में, ओएनोथेरा बिएनिस सेल संस्कृतियों (ओबीएचईएक्स) के एक हाइड्रोफिलिक अर्क को पूरी तरह से उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक-आधारित दृष्टिकोणों द्वारा चित्रित किया गया है, जो जैव सूचना विज्ञान द्वारा सहायता प्रदान करता है, और कई जैव रासायनिक और जैविक assays में परीक्षण किया गया है। मिश्रण में मुख्य रूप से लिग्नान और ट्राइटरपेन्स के जैव सक्रिय यौगिक होते हैं, जैसे कि अर्जुनोलिक और एशियाटिक एसिड, जो पहले मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट [16,17] में प्रो-कोलेजन I उत्पादन से जुड़ा हुआ है। MYLK की अभिव्यक्ति को बढ़ाने, मैट्रिक्स कोलेजन संकुचन को बढ़ावा देने, एक्टिन पोलीमराइज़ेशन, और TGF-विनियमित ECM प्रोटीन के उत्पादन की क्षमता के लिए अर्क की जांच की गई, जो डर्मिस के संकुचन का पक्ष लेते हैं, इस प्रकार त्वचा की उम्र बढ़ने को धीमा करते हैं।

2. परिणाम

2.1. Oenothera Biennis सेल संस्कृति के पानी में घुलनशील अर्क का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

ओबीएचईएक्स का यूपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण किया गया था और ग्लोबल नेचुरल प्रोडक्ट्स सोशल मॉलिक्यूलर नेटवर्किंग (जीएनपीएस), एक वेब-आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्पेक्ट्रोमेट्रिक डेटा का शोषण किया गया था जो प्राकृतिक उत्पादों की पहचान और एनोटेशन में सहायता करता है। (एनपीएस) [18]। इसका उद्देश्य समुदाय-व्यापी संगठनों और कच्चे, संसाधित, या एनोटेट फ़्रेग्मेंटेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा (एमएस/एमएस) को साझा करने के लिए एक ओपन-एक्सेस ज्ञान आधार होना है। विशेष रूप से, GNPS वर्णक्रमीय पुस्तकालय खोज और एक फ़ीचर-आधारित आणविक नेटवर्किंग (FBMN) कार्य किया गया: पहले विश्लेषण ने हमें प्राकृतिक यौगिकों की पहचान करने की अनुमति दी, उनके MS/MS स्पेक्ट्रा की संरचनात्मक रूप से विशेषता वाले मेटाबोलाइट्स के साथ तुलना की, दूसरा समूह से संबंधित समान MS/MS विखंडन पैटर्न के बाद से एक नेटवर्क के भीतर NPs संरचनात्मक रूप से समान अणुओं [19] द्वारा प्रदर्शित किए गए थे। जैसा कि चित्र 1 और तालिका 1 में दिखाया गया है, कई एनपीएस निस्संदेह माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के कई वर्गों से संबंधित थे, मुख्य रूप से लिग्नन्स (सल्वाडोर एक तरफ और लिरियोडेन्ड्रॉन) और ट्राइटरपेन्स (म्यूरिएटिक एसिड, एरियुनोलिक एसिड, एशियाटिक एसिड, और हेडेरजेनिन)। जीएनपीएस द्वारा पहचाने नहीं जाने वाली रासायनिक प्रजातियों को साहित्य के अनुसार सौंपा गया था।

GNPS के उपयोग के एक उदाहरण के रूप में, FBMN विश्लेषण से प्राप्त नेटवर्क को चित्र 2a में सूचित किया गया है, जिसमें दिखाया गया है कि ObHEx में म्यूरिएटिक एसिड से संबंधित कई अन्य अनैच्छिक ट्राइटरपेन शामिल हैं (18, m/z 503.3389, RT 21.89 मिनट: म्यूरिएटिक एसिड पहचान है इसकी विश्लेषणात्मक मानक के साथ तुलना करके पुष्टि की गई है)। उदाहरण के लिए, एम/जेड 701 और 665 पर विभिन्न पहले से अप्रचलित प्रजातियों को ग्लाइकोसिलेटेड रूपों के रूप में पहचाना गया था जो म्यूरिएटिक एसिड या इसके आइसोमर्स से संबंधित थे, क्रमशः हाइड्रेटेड या एच ओ के दो अणुओं के साथ नहीं।

इसके अलावा, एम/जेड 729, 703, 699,687,685, 683 पर रिपोर्ट किए गए आयन क्रमशः ग्लाइकोसिलेशन से प्राप्त हुए और एच के दो अणु, एम/जेड531, 505,501, 489,487, और 485 पर प्रजातियों के ओ: उनकी एकतरफा पहचान हासिल नहीं की गई है, लेकिन उन सभी को ट्राइटरपेन्स माना जाता है, जो म्यूरिएटिक एसिड या इसके पूर्वजों से संबंधित हैं, उनके एमएसएमएस विखंडन मार्ग के कारण, हाल ही में, एम / 501 और 485 के साथ कई ट्राइटरपेन्स ओएनोथेरा, ओएनोथेरा मैरिटिमा की अन्य प्रजातियों से अलग हो गए थे, और उनकी संरचना है स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा के आधार पर स्पष्ट किया गया है, इस प्रकार हमारे परिणामों [20] के साथ अच्छी तरह से संबंध है।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

एफबीएमएन विश्लेषण ने एम/जेड 617.3862 (एम/जेड 453,145 और 119 पर एमएस2 आयन) पर मेटाबोलाइट्स के बारे में जानकारी प्रदान की, जो चित्रा 2बी में दिखाए गए आणविक नेटवर्क में मौजूद है और ओएनोथेरा प्रजातियों के लिए साहित्य में रिपोर्ट नहीं की गई है। यह m/z मान और इसका विखंडन 2-OEp-coumaroyl apostolic acid या इसके आइसोमर्स के साथ मेल खाता है, जो कम से कम, ट्राइटरपीन Coumaroyl और साथ ही caffeoyl esters की उपस्थिति को साबित करता है। वास्तव में, m/z 649 (RT 25.72 और 27.19) पर प्रजातियों के MS-स्पेक्ट्रा ने m/z 179, 161 और 135 पर कैफिक एसिड की मात्रा के दरार के कारण आयनों की उपस्थिति को दिखाया, जबकि अन्य प्रजातियों के MS2 स्पेक्ट्रा ने चित्र 2b में m/z 633 (RT 26.88,27.20,28.12 और 28.43),649 (RT24.18,24.65,24.83), और 661 (RT 30.28) में रिपोर्ट किए गए आयनों ने m/z 145 और 119 पर आयन दिखाए, जो कि विशिष्ट थे Coumaroyl मौनता के लिए।

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911)परीक्षित सीमाओं के भीतर। इसके अलावा, पता लगाने की सीमा (एलओडी) और परिमाणीकरण की सीमा (एलओओ) ने संकेत दिया कि उपयोग की जाने वाली विधियों को उच्च संवेदनशीलता द्वारा प्रतिष्ठित किया गया था। मात्रात्मक विश्लेषण (तालिका 3) से प्राप्त परिणामों से पता चला है कि लिरियोडेंड्रोन और हेडेरजेनिन क्रमशः लिग्नन और ट्राइटरपीन का मुख्य प्रतिनिधित्व करते थे।

2.3.HDF में MYLK जीन एक्सप्रेशन का विश्लेषण

ओबीएचईएक्स की गतिविधि का परीक्षण एचडीएफ में एमईएलके जीन की अभिव्यक्ति पर किया गया था, जो मायोसिन (चित्रा 3 ए) के प्रकाश श्रृंखला फॉस्फोराइलेशन के लिए जिम्मेदार किनेज के लिए एन्कोड करता है। परिणामों ने संकेत दिया कि दोनों सांद्रता में अर्क के साथ उपचार ने सकारात्मक नियंत्रण TGF- के समान MYLK जीन अभिव्यक्ति में लगभग 50 प्रतिशत की वृद्धि की।

2.4. एक कोलेजन मैट्रिक्स की संकुचन क्षमता का विश्लेषण

कोलेजन फाइबर की सिकुड़ा क्षमता पर ओबीएचईएक्स की गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, हमने कोलेजन जेल डिस्क [21] में फैले एचडीएफ का उपयोग किया। जैसा कि चित्र 3बी में दिखाया गया है, अर्क, कम सांद्रता पर, कोलेजन डिस्क के संकुचन में उल्लेखनीय वृद्धि को प्रेरित करता है, जो कोलेजन दृढ़ता पर संभावित प्रभाव का सुझाव देता है। ML7 (1-(5-आयोडोनाफथलीन-1-सल्फोनील)-1H-hexahydro-1,4-diazepine), एक MYLK अवरोधक के साथ उपचार, इस वृद्धि को समाप्त कर दिया, यह दर्शाता है कि कोलेजन डिस्क संकुचन के लिए अर्क और TGF- दोनों MYLK के माध्यम से कार्य करते हैं।

2.5.एक्टिन पॉलिमराइजेशन स्तर का माप

एक्टिन पोलीमराइजेशन को प्रोत्साहित करने के लिए ओबीएचईएक्स की क्षमता की जांच कोशिकाओं में पोलीमराइज्ड एक्टिन के स्तर को मापने के द्वारा की गई थी, जिसे अकेले और एमएल 7 की उपस्थिति में अर्क और सकारात्मक नियंत्रण टीजीएफ- के साथ इलाज किया गया था। जैसा कि चित्र 3c में दिखाया गया है, अर्क की दोनों सांद्रता के साथ उपचार से पॉलीमर एक्टिन की मात्रा में लगभग 50 प्रतिशत की वृद्धि हुई, जबकि TGF- के 33 प्रतिशत की तुलना में।सिस्टैंच खरीदेंफिर से, ML7com के साथ पूर्व-ऊष्मायन ने इस प्रभाव को पूरी तरह से समाप्त कर दिया, एक्टिन फिलामेंट्स के पोलीमराइजेशन में MYLK की भागीदारी का सुझाव दिया।

2.6. एचडीएफ में टीजीएफ आरआईआई/एसएमएडी पाथवे का विश्लेषण

यह सत्यापित करने के लिए कि क्या ओबीएचईएक्स के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं के एक्टिन पोलीमराइजेशन और कोलेजन संकुचन में वृद्धि भी टीजीएफ आरआईआई द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्ग के सक्रियण से जुड़ी थी, हमने पहले टीजीएफ आरआईआई जीन की अभिव्यक्ति देखी और फिर एसएमएडी के साथ एचडीएफ को ट्रांसफ़ेक्ट किया {{ 0}}लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर प्लास्मिड और ओबीएचईएक्स उपचार के जवाब में लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि में वृद्धि का मूल्यांकन किया। चित्र 3डी, ई में रिपोर्ट किए गए परिणामों ने संकेत दिया कि ओबीएचईएक्स के साथ 0.002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत पर उपचार ने टीजीएफ आरआईआई की अभिव्यक्ति को एक तरह से टीजीएफ के समान बढ़ा दिया- जिसका उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है और समानांतर में, SMAD से जुड़ी लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि में क्रमशः 80 और 40 प्रतिशत की वृद्धि हुई। एक महत्वपूर्ण संकेत कमी तब प्राप्त हुई जब कोशिकाओं को ML7 के साथ व्यवहार किया गया, यह भी दर्शाता है कि यह गतिविधि MYLK से जुड़ी हुई थी।

2.7. प्रो-कोलेजन I, ट्रोपोएलास्टिन और पेरीओस्टिन का विश्लेषण

TGF RII सिग्नल ट्रांसडक्शन एक्टिवेशन के परिणामस्वरूप, हमने HDF में 0.002 प्रतिशत पर मुख्य बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन जैसे प्रोकोलेजन टाइप I, ट्रोपोएलेस्टिन और पेरीओस्टिन के संश्लेषण का विश्लेषण किया। जैसा कि चित्र 3f में दिखाया गया है, सकारात्मक नियंत्रण TGF- के समान, ObHex ने संकेतित प्रोटीन के उत्पादन में क्रमशः लगभग 98 प्रतिशत, 75 प्रतिशत और 51 प्रतिशत की वृद्धि की। एलिसा परख द्वारा उपायों को प्रो-कोलेजन I, ट्रोपोएलास्टिन और पेरीओस्टिन के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया था।

2.8. एक्स-विवो स्किन एक्सप्लांट्स पर MYLK, फॉस्फो-मायोसिन, कोलेजन I और ट्रोपोएलास्टिन का विश्लेषण

जैसा कि चित्र 4a-c में दिखाया गया है, ObHex ने मानव त्वचा के अन्वेषकों में MYLK और फॉस्फोराइलेटेड मायोसिन के उत्पादन में उल्लेखनीय वृद्धि की है।

कोलेजन I और ट्रोपोएलेस्टिन इंडक्शन का विश्लेषण भी त्वचा के अन्वेषकों में किया गया था, जिन्हें ओबहेक्स के साथ दिखाया गया था और फिर कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने का अनुकरण करने के लिए 8 दिनों के लिए हाइड्रोकार्टिसोन के साथ इलाज किया गया था [22]। हाइड्रोकार्टिसोन के साथ उपचार ने कोलेजन I और ट्रोपोएलेस्टिन की मात्रा को 100 प्रतिशत से अधिक कम कर दिया, और 0.002 प्रतिशत ObHex की उपस्थिति ने ट्रोपोएलास्टिन की मात्रा को लगभग 91 प्रतिशत और कोलेजन की मात्रा को 120 प्रतिशत तक बहाल कर दिया। एस्कॉर्बेट का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है (चित्र 4d-f)। यह ObHex के संभावित एंटी-एजिंग प्रभाव का सुझाव देता है, विशेष रूप से त्वचीय मैट्रिक्स घटकों पर कार्य करके त्वचा की दृढ़ता को बढ़ाने में प्रभावी है।

2.9. स्किन एक्सप्लांट्स में परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम)

ओबीएचईएक्स के साथ उपचार द्वारा प्रचारित त्वचा जैव-यांत्रिक गुणों के बारे में अधिक जानकारी एकत्र करने के लिए, हमने लोच का मूल्यांकन किया, जो कि यंग के मोडुली [23] के संदर्भ में त्वचा के नमूनों की एक आंतरिक यांत्रिक संपत्ति है। जैसा कि धारा 4 में वर्णित है, लोचदार मापांक की गणना करने के लिए, उपचारित और अनुपचारित त्वचा के नमूनों दोनों पर, हमने एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) के साथ फोर्स कर्व्स एकत्र किए और उन्हें हर्ट्ज मॉडल [24,25] के साथ फिट किया। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, अर्क के साथ त्वचा के नमूनों के उपचार में अनुपचारित नमूनों की तुलना में यंग के मॉड्यूल मान कम थे, जो त्वचा के लोचदार गुणों में सुधार का सुझाव देते हैं। विशेष रूप से, अनुपचारित त्वचा के नमूनों ने 0.37 ± 0.15 GPa के औसत यंग मापांक मान का खुलासा किया, जबकि ObHex के साथ इलाज किए गए त्वचा के नमूनों ने 0 का निम्न माध्य मान दिखाया।{{11 }}7±0.02 जीपीए। त्वचा के नमूनों के यंग मापांक मूल्य साहित्य [26-28] के अनुसार थे।

3. चर्चा

प्लांट सेल कल्चर व्यावसायिक हित के प्लांट सेकेंडरी मेटाबोलाइट्स के स्थायी उत्पादन के लिए सबसे आशाजनक दृष्टिकोण है, जो बड़े पैमाने पर संस्कृति के माध्यम से सामग्री की निरंतर आपूर्ति की पेशकश करता है और एक स्थायी और पर्यावरण के अनुकूल प्रणाली का गठन करता है [29,30]। पादप कोशिका संवर्धन के अर्क ने स्वास्थ्य देखभाल और कॉस्मेटिक क्षेत्रों में आशाजनक अनुप्रयोग पाए हैं, क्योंकि वे कुछ प्रासंगिक लाभ प्रस्तुत करते हैं; (i) उनमें नियंत्रित विकास प्रयोगशाला स्थितियों में जैव-संश्लेषित मेटाबोलाइट्स होते हैं; (i) वे मानकीकृत उत्पादन प्रक्रियाओं से प्राप्त होते हैं, जो गारंटी देते हैं प्राप्त प्रजातियों की समान गुणात्मक और मात्रात्मक विशेषताएं; (ii) अर्क सूक्ष्मजीवों, जड़ी-बूटियों, कीटनाशकों और कवकनाशी जैसे दूषित पदार्थों से मुक्त हैं; (iv) वे भौगोलिक या पर्यावरणीय उतार-चढ़ाव से स्वतंत्र हैं और पौधों की प्रजातियों को भविष्य के लिए संरक्षित किया जा सकता है पीढ़ियाँ। इस प्रतियोगिता में, एक ओएनोथेरा बिएनिस सेल कल्चर जलीय अर्क (ओबीएचईएक्स) की जांच त्वचा विरोधी उम्र बढ़ने की गतिविधि से संपन्न बायोएक्टिव अणुओं के एक आशाजनक स्रोत के रूप में की गई थी। दरअसल, ओबीएचईएक्स की जांच उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले यूपीएलसी-एमएसएमएस विश्लेषणों द्वारा की गई है, जो एक व्यापक संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण के साथ युग्मित है। पहचान प्रक्रिया को तेज करने के लिए मुख्य रूप से जीएनपीएस का उपयोग करके यौगिक लक्षण वर्णन का एहसास किया गया है, संरचनात्मक रूप से विशेषता वाले मेटाबोलाइट्स के साथ एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की तुलना करें, और इसके अलावा, नई अप्रत्याशित प्रजातियों का खुलासा करें, एक नेटवर्क के भीतर समान एनपी को समूहीकृत करें। इसके अलावा, अवधारण समय, सटीक द्रव्यमान माप, और MS2 विश्लेषण भी मानकों के साथ तुलना किए गए थे, और सभी डेटा का साहित्य के साथ मिलान किया गया था। बायोएक्टिव लिग्नांस और ट्राइटरपेन्स, जैसे साल्वाडोर एक तरफ, लिरियोडेंड्रोन, माय-एंथेमिक एसिड, अर्जुनोलिक एसिड, एशियाटिक एसिड और हेडेरजेनिन की पहचान की गई। लिरियोडेंड्रोन [31] और म्यूरिएटिक एसिड [32] ने मजबूत एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का प्रदर्शन किया, जबकि हेडरजेनिन ने सेलुलर ऑक्सीकरण में कमी और प्रोटीसम फ़ंक्शन [33] के सक्रियण के कारण त्वचा की उम्र बढ़ने के गुण दिखाए। हालांकि, अर्जुनोलिक और एशियाटिक एसिड को निम्नलिखित कुछ परीक्षण गतिविधियों के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार माना गया, क्योंकि वे कोलेजन I संश्लेषण को उत्तेजित करते हैं। वास्तव में, यह प्रदर्शित किया गया है कि ओबीएचईएक्स ने त्वचा के जैव-यांत्रिक गुणों में सुधार किया है, जो ज्यादातर ईसीएम के विभिन्न घटकों की सापेक्ष मात्रा पर निर्भर करता है और इस बात पर निर्भर करता है कि फाइब्रोब्लास्ट त्वचीय तंतुओं को सही तनाव प्रदान करने और अनुबंध करने में कैसे सक्षम हैं।सिस्टैंचवास्तव में, ObHex, MYLK जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के संकुचन बल को बढ़ाकर कोलेजन मैट्रिक्स संकुचन और एक्टिन पोलीमराइजेशन को बढ़ावा देता है। एक्टिन साइटोस्केलेटन की असेंबली टीजीएफ-टाइप II रिसेप्टर को अपग्रेड करती है और टीजीएफ- / स्मैड सिग्नलिंग की उत्तेजना के अनुरूप, टीजीएफ-विनियमित ईसीएम प्रोटीन के स्तर को बढ़ाती है। दरअसल, ObHex टाइप I कोलेजन, पेरीओस्टिन और ट्रोपोएलास्टिन के उत्पादन को प्रेरित करता है। इसलिए, ये सभी गुण त्वचा की दृढ़ता और लोच के उम्र से जुड़े नुकसान से लड़ने के लिए कॉस्मेटिक फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले एक अच्छा आशाजनक उम्मीदवार घटक बनाते हैं। इस धारणा को एएफएम विश्लेषण में प्राप्त परिणामों द्वारा समर्थित किया गया था, जिसमें दिखाया गया था कि ओबीएचईएक्स के साथ त्वचा के स्लाइस के उपचार ने त्वचा यांत्रिक गुणों में सुधार किया है, जिसे यंग के मापांक में कमी के रूप में पाया गया है, जो त्वचा की कठोरता और कठोरता में उल्लेखनीय कमी का संकेत देता है।

4. सामग्री और तरीके

4.1.संयंत्र ऊतक संवर्धन और निकालने की तैयारी

Oenothera biennis पौधे GEEL Floricultura ss द्वारा प्रदान किए गए थे और इतालवी मूल के थे (नागोया प्रोटोकॉल के आवेदन से परहेज)। कॉलस प्राप्त करने तक ठोस अगर प्लेटों पर मेरिस्टेमेटिक कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित करके ओएनोथेरा बिएनिस पौधों की पत्तियों से सेल संस्कृतियों को प्राप्त किया गया था। कोशिकाओं को तरल विकास माध्यम (गैम्बोर्ग बी 5, 24 डाइक्लोरोफेनोक्सीएसेटिक एसिड (1 मिलीग्राम / एल), एडेनिन (1 मिलीग्राम / एल), और किनेटिन (0.01 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक में स्थानांतरित किया गया था। फिर कक्षीय झटकों के तहत कोशिकाओं को निलंबन संस्कृतियों के रूप में विकसित किया गया था। एक बार लगभग 150 g/L की संस्कृतियों को प्राप्त करने के बाद, कोशिकाओं को एकत्र किया गया और एक पानी में घुलनशील अर्क तैयार करने के लिए pH7.4 पर एक फॉस्फेट बफर (पीबीएस) में lysed किया गया, जिसे lyophilized किया गया था। परीक्षण के लिए उपयुक्त सांद्रता में पाउडर को पानी या सेल कल्चर मीडिया में भंग कर दिया गया था।

4.2. रासायनिक विशेषता के लिए यूपीएलसी-एमएसएमएस विश्लेषण

ObHex(5{{10}} mg/mL) तैयार किया गया था और एक बाइफैसिक ब्यूटेनॉल/पानी निकालने के लिए जमा किया गया था। UPLC-MS/MS विश्लेषण से पहले ब्यूटेनॉल अंश को सुखाकर मेथनॉल (10mg/mL) में घोल दिया गया था। यह थर्मो-साइंटिफिक (वॉलथम, एमए, यूएसए) से क्यू-एक्सएक्टिव क्लासिक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया गया था, जो थर्मो साइंटिफिक टीएम अल्टिमेट टीएम 3 000 यूपीएलसी सिस्टम से लैस है। सभी क्रोमैटोग्राफिक रन एक फेनोमेनेक्स लूना सी 18 100 ए 150 × 2.0 मिमी, कण आकार 3 माइक्रोन कॉलम 40 डिग्री सेल्सियस और 0.200 एमएल / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करके किए गए थे। इंजेक्शन की मात्रा 5 μL थी। मोबाइल चरण में ए (रोमिल लिमिटेड, कॉन्वेंट ड्राइव, वाटरबीच, कैम्ब्रिज, यूके से 0.1 प्रतिशत एसिटिक एसिड पर पानी) और बी (रोमिल लिमिटेड, कॉन्वेंट ड्राइव, वाटरबीच, कैम्ब्रिज, यूके से 100 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल) एक ढाल क्षालन का उपयोग करते हुए शामिल थे। 0-5मिनट,5-14प्रतिशत B5-8 मिनट,14-32प्रतिशत B8-11 मिनट, 32-95प्रतिशत बैट {{ 26}} मिनट, 95-98 प्रतिशत चमगादड़32-33 मिनट, 98 प्रतिशत बी 33-38मिनट,98-5प्रतिशत बैट38-39 मिनट, और 5 प्रतिशत बी 33-38 {34}} मि. सभी एमएस और एमएसएमएस विश्लेषण ईएसआई नकारात्मक मोड में 30 (मनमानी इकाइयों) पर म्यान गैस प्रवाह दर, 5 (मनमानी इकाइयों) पर सहायक गैस प्रवाह दर, 3.2 केवी पर स्प्रे वोल्टेज, और केशिका तापमान के साथ किए गए थे। 300 डिग्री पर सहायक गैस हीटर का तापमान। डेटा को पूर्ण MS/dd-MS2 (Top5) मोड के साथ अधिग्रहित किया गया था। पूर्ण एमएस सेटिंग्स थे: 70,000 का संकल्प, 1 × 106 का एजीसी लक्ष्य, 200 एमएमएस का अधिकतम आईटी, और 100 से 800 मीटर/जेड.डीडी-एमएस 2 सेटिंग्स थे: 17.500 का संकल्प, 2 × 105 का एजीसी लक्ष्य, अधिकतम 65 एमएस का आईटी, 1.5 मीटर/जेड का आइसोलेशन विंडो और 35 का एनसीई।

प्राप्त किए गए मैन्युअल रूप से सत्यापित किए गए थे। mzXML डेटा को GNPS पर फ़ीचर-आधारित आणविक नेटवर्किंग (FBMN) कार्य से पहले Mzmine 2.53 का उपयोग करके संसाधित किया गया था। शोर स्तर को 5 × 1 {{1 0}} 3 पर रखते हुए सेंट्रोइड मास डिटेक्टर का उपयोग करके मास डिटेक्शन स्टेप किया गया था। स्वचालित डेटा विश्लेषण पाइपलाइन (ADAP) क्रोमैटोग्राम भवन को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ महसूस किया गया था: 5 के स्कैन की संख्या में न्यूनतम समूह का आकार, 5 × 1 की समूह तीव्रता सीमा {{2 0}} , न्यूनतम उच्चतम तीव्रता 5× 10 प्लस, एम/जेड सहिष्णुता 0।01 मीटर/जेड या 10 पीपीएम। क्रोमैटोग्राम डीकोनवोल्यूशन वेवलेट्स (एडीएपी) का उपयोग एल्गोरिदम के रूप में, 3 की एस / एन थ्रेशोल्ड, 1 × 1 की न्यूनतम सुविधा ऊंचाई 0 5, गुणांक / क्षेत्र थ्रेशोल्ड 5, शिखर अवधि सीमा 0.{{ के रूप में प्राप्त किया गया था। 18}}.00 मिनट, और आरटी तरंगिका रेंज 0.00-0.05. क्रोमैटोग्राम को समस्थानिक चोटियों ग्रॉपर एल्गोरिथ्म का उपयोग करके 0.001 m/z या 5.0 ppm की m/z सहिष्णुता और 0.10 मिनट की RT सहिष्णुता के साथ अलग किया गया था। FBMN का कार्य 0.02 Da के पैरेंट मास टॉलरेंस और 0.02 Da के MS4 फ़्रैगमेंट आयन टॉलरेंस का उपयोग करके किया गया था। किनारों को 0.7 की स्कोर सीमा और न्यूनतम 2 मिलान वाली चोटियों के लिए फ़िल्टर किया गया था। इसके अलावा, प्रत्येक नोड के लिए पड़ोसी नोड्स की अधिकतम संख्या 10 पर सेट की गई थी।

4.4. लिग्नांस और ट्राइटरपेन्स का मात्रात्मक विश्लेषण

गुणात्मक विश्लेषण के लिए रिपोर्ट की गई समान यूपीएलसी स्थितियों का उपयोग लिग्नांस के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया गया था, जबकि ट्राइटरपेन्स के लिए, उन्हें आइसोमर्स, अर्जुनोलिक और एशियाटिक एसिड के दो जोड़े को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया था। विश्लेषण एक क्यू-एक्सएक्टिव क्लासिक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है। पृथक्करण एक फेनोमेनेक्स काइनटेक्स-ईवीओ सी 18 300 ए -15 0 × 2.1 मिमी, कण आकार 5 माइक्रोन） द्वारा किया गया था। मोबाइल चरण में ए (5 मिमी अमोनियम एसीटेट जलीय घोल, पीएच 9. 00 अमोनियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा समायोजित) और बी (1 0 0 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल) शामिल थे, जो 17-28 के ढाल क्षालन का उपयोग कर रहे थे। प्रतिशत बी 0-18 मिनट, 28-65 प्रतिशत बी 18-22 मिनट, 65-75 प्रतिशत बी 22-26 मिनट, 75-95 प्रतिशत {{17 पर }}, 5मिनट, 26 पर 95 प्रतिशत, 5-30 मिनट, 95-17 प्रतिशत 30-30, 1 मिनट, 17 प्रतिशत पर 30, 1-42 मिनट। प्रवाह दर 0.450 एमएल/मिनट थी और इंजेक्शन की मात्रा 5 यूएल थी। लिग्नान और ट्राइटरपेन दोनों के लिए, डेटा को पूर्ण एमएस-सिम और पीआरएम मोड के साथ हासिल किया गया था। पूर्ण MS-SIM सेटिंग्स थीं: 70 का रिज़ॉल्यूशन। 000, 3×106 का AGC लक्ष्य, 200ms का अधिकतम IT, और लिग्नांस के लिए 200 से 800 m/z तक और 400 से 850 m/z तक हो सकता है ट्राइटरपेन्स के लिए। पीआरएम सेटिंग्स थे: 70 का संकल्प। 000, 2 × 10 डिग्री का एजीसी लक्ष्य, 100 एमएस की अधिकतम आईटी, 1.0 मीटर/जेड की आइसोलेशन विंडो, और लिग्नांस के मामले में 35 का एनसीई और उसमें 50 ट्राइटरपेन्स का।ऑस्ट्रेलियाहमने बायोसिंथ कार्बोसिंथ (स्टैड, सेंट गैलेन, स्विटजरलैंड), लिरियोडेंड्रोन (#SMB00181), और अर्जुनोलिक एसिड (#SMB00119) से सल्वाडोर को एक तरफ (#{0}}XS172930) खरीदा। -एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), एशियाटिक एसिड (# 0027) एक्स्ट्रासिंथेस (जेने, ल्यों, फ्रांस) से और हेडरजेनिन (# 89706) फाइटोलैब जीएमबीएच एंड कंपनी केजी (वेस्टेनबर्ग्सग्रेथ, बायर्न-मिटेलफ्रेंकन, जर्मनी) से। Myrianthic एसिड नेपल्स विश्वविद्यालय, प्रो मारिया वेलेरिया डी'औरिया से एक उपहार था। अंशांकन वक्र 0. 25-25 μM लिग्नांस के लिए और 0. 1-25 uM ट्राइटरपेन्स के लिए एकाग्रता रेंज में मानक समाधान इंजेक्ट करके प्राप्त किए गए थे। दोनों शुद्ध सल्वाडोर एक तरफ और लिरियोडेंड्रोन ने दो एलसी-एमएसएमएस चोटियों को दिखाया, शायद समाधान में स्थापित रासायनिक संतुलन के कारण। मानकों के लिए पता लगाने की सीमा (LOD) और परिमाणीकरण की सीमा (LOO) को सिग्नल-टू-शोर (S/N) अनुपात के आधार पर निर्धारित किया गया था।

4.5.स्किन सेल कल्चर और एक्सप्लांट्स

मानव त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट (HDF) को Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, USA) में बनाए रखा गया था, जो 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, यूएसए) के साथ पूरक था। ) 95 प्रतिशत हवा में, 5 प्रतिशत सीओ, और आर्द्र वातावरण 37 डिग्री पर। शल्य चिकित्सा केंद्र विला सिन्ज़िया (नेपल्स, इटली) में स्वस्थ महिला दाताओं (वृद्ध 44-47) की त्वचा से प्राप्त त्वचा की खोज, 24- DMEM / FBS में ट्रांसवेल प्लेटों में और हवा में एंटीबायोटिक दवाओं में सुसंस्कृत थे- 5 प्रतिशत CO2 आर्द्र हवा में 37 डिग्री डिग्री पर तरल की स्थिति। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार, सभी दाताओं ने त्वचा के ऊतकों के उपयोग के लिए अपनी लिखित सूचित सहमति दी थी।

4.6. साइटोटोक्सिसिटी टेस्ट

साइटोटोक्सिसिटी परीक्षण एमटीटीकंपाउंड [{0}}(45-डाइमिथाइल थियाज़ोलिल)-2,5-डिपेनहिलटेट्राजोलियम-ब्रोमाइड] [34] के उपयोग पर आधारित थे। कोशिकाओं को डीएमईएम (डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम) संस्कृति माध्यम में 96-अच्छी तरह से प्लेटों में उगाया गया था, लगभग 8 घंटे के लिए 1 0 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक। 48 घंटे के लिए 0.05 प्रतिशत और 0.0004 प्रतिशत (500 कुरूप/एमएल और 4 कुरूप/एमएल) के बीच ओबीएचईएक्स के साथ उपचार के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस में धोया गया और 100 μL/अच्छी तरह से ऊष्मायन किया गया। "प्रतिक्रिया बफर" युक्त ∶ 10 मिमी हेप्स, 1.3 मिमी CaCl2, 1 मिमी MgSO, ग्लूकोज के 5 मिमी, और पीएच 7.4 पर बफर पीबीएस में एमटीटी वर्णमिति सब्सट्रेट के 0.5 मिलीग्राम/एमएल। 5 प्रतिशत सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 3 घंटे के बाद, पूर्ण आइसोप्रोपेनॉल में एचसीएल के 10 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स100,01 एन युक्त 100 μLof घुलनशील समाधान प्रत्येक कुएं में जोड़े गए थे। 16 घंटे के ऊष्मायन के बाद, विक्टर 3 प्लेट रीडर (पर्किनएल्मर, वॉलथम, एमए, यूएसए) के साथ वर्णमिति प्रतिक्रिया को 595 एनएम पर मापा गया था।

4.7. HDF . में MYLK और TGF6RII जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण

प्रति कुएं, 1×10 एचडीएफ की डिग्री 6-डीएमईएम में 2 प्रतिशत एफबीएस में अच्छी तरह से प्लेटों में उगाई गई थी, 24 घंटे के बाद एफबीएस को 0.5 प्रतिशत तक पतला कर दिया गया था, और कोशिकाओं का इलाज 0.002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत ओबहेक्स और टीजीएफ- 2.5ng/mL के साथ किया गया, इसके बाद MYLK के लिए 2h का ऊष्मायन और TGFRII के लिए 48 का ऊष्मायन किया गया। आरएनए निष्कर्षण के लिए, कंपनी मर्क (डार्मस्टाड, जर्मनी) द्वारा खरीदी गई "जेनएल्यूटएम टोटल आरएनए प्यूरीफिकेशन" किट का उपयोग किया गया था। संकेतित उपचारों के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया, लसीका बफर में एकत्र किया गया, और रिपोर्ट के अनुसार निष्कर्षण प्रक्रिया के अधीन किया गया। जीनोमिक डीएनए संदूषक को हटाने के लिए नमूनों को DNase I (Ambion, Austin, TX, USA) के साथ 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए उपचारित किया गया। प्रत्येक नमूने से, आरएनए (थर्मोसाइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) के लिए एक विशिष्ट मार्कर के संदर्भ में आरएनए की मात्रा को निर्धारित करने के उद्देश्य से लोडिंग डाई की उपस्थिति में 2 μL को जेल 1 प्रतिशत agarose पर लोड किया गया था। GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) का उपयोग परिमाणीकरण के लिए सॉफ्टवेयर के रूप में किया गया है। इसके बाद, कुल आरएनए के 300 एनजी को एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (थर्मोसाइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके रेट्रो-ट्रांसकोड किया गया था। अर्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर को आंतरिक मानकों के रूप में सार्वभौमिक प्राइमरों 18S प्राइमर / प्रतियोगी (एंबियन, ऑस्टिन, TX, यूएसए) की जोड़ी का उपयोग करके आयोजित किया गया था। पीसीआर उत्पादों को 1.5 प्रतिशत agarose जेल पर अलग किया गया था, जिसे रिलायंस टूल (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) का उपयोग करके देखा गया था, और Genetools सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेंसिटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था। प्रवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के क्रम निम्नलिखित थे: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT।

4.8. एक कोलेजन मैट्रिक्स की संकुचन क्षमता का विश्लेषण

एचडीएफ कोशिकाओं के संबंध में, 2.0× 10 डिग्री को 5x डीएमईएम विकास माध्यम (गिब्को, वॉलथम, एमए, यूएसए) में एक 24-वेल प्लेट में और 2 मिलीग्राम/ गोजातीय त्वचा (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से कोलेजन का एमएल समाधान प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था। समाधान का पीएच 7.2 पर समायोजित किया गया था। कोलेजन जेल के जमने की अनुमति देने के लिए प्लेट को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। DMEM को 10 प्रतिशत FBS और/या ML7 25 uM के साथ पूरक किया गया, MYLK प्रोटीन अवरोधक के रूप में, बाद में जोड़ा गया। 16 घंटे के बाद, ML7 को साफ कर दिया गया और 2 प्रतिशत FBS के साथ DMEM में 0.002 प्रतिशत की एकाग्रता को ObHexat जोड़ा गया। TGF- 2.5 ng/mL का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। इसके संकुचन को बढ़ावा देने के लिए एक बाँझ माइक्रो स्पैटुला का उपयोग करके गठित कोलेजन की डिस्क को तुरंत कुएं से अलग कर दिया गया था। प्रत्येक उपचार की डिस्क के क्षेत्रों को समय 0 और 5 घंटे में मापा गया और छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया।

4.9. एक्टिन पॉलिमराइजेशन की डिग्री का विश्लेषण

इसके बाद, 1.5×10 एचडीएफ कोशिकाओं की डिग्री प्रति कुएं को एक 24-वेल प्लेट में उगाया गया और अगले दिन माध्यम को 2 प्रतिशत एफबीएस और साइटोकैलासिन बी के साथ जोड़ा गया, जो एक्टिन का अवरोधक है। पोलीमराइजेशन, 2 माइक्रोन पर 3{{1{{20}}}} मिनट के लिए। 30 मिनट के बाद, कोशिकाओं पर, ObHex（0.002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत ） को TGF- 2.5 ng/mL, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, और ML7 25μM, के साथ एक साथ जोड़ा गया। MYLKenzyme का नकारात्मक नियंत्रण। 30 मिनट के उपचार के बाद, कोशिकाओं को बर्फ पर 30 मिनट के लिए बफर फॉस्फेट में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया गया था। कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और 30 मिनट के लिए 0.2 प्रतिशत पर फॉस्फेट बफर और ट्राइटन-एक्स 100 के समाधान के साथ पारगम्य किया गया। इसके बाद, कोशिकाओं को अंधेरे में 1 घंटे के लिए रोडियामाइन (सांता-क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, डलास, TX, यूएसए) के साथ संयुग्मित फैलोलाइडिन के 0.4 माइक्रोन के समाधान के साथ ऊष्मायन किया गया था।सिस्टैंच लाभसमय पर 0 और 18 घंटे के बाद, विक्टर 3 प्लेट रीडर (पर्किनएल्मर, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को 540/570 एनएम पर मापा गया था। 4.10.SMAD2 पाथवे का विश्लेषण

HDF कोशिकाओं को 96- अच्छी तरह से प्लेटों में 3 × 103 के घनत्व पर रखा गया था और 16 घंटे के बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार Smad2 रिपोर्टर वेक्टर के साथ X-tremeGeneTM HP डीएनए ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को ओबहेक्स या टीजीएफ - 2 .5 एनजी / एमएल, अकेले या एमएल 7 25 माइक्रोन के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था। ऊष्मायन के अंत में, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया था और मल्टीवेल प्लेट रीडर विक्टर निवो (पर्किनएल्मर, वॉलथम, एमए) में स्टेडीग्लो ल्यूसिफरेज परख प्रणाली (पेमरेगा कॉर्पोरेशन, मैडिसन, WI, यूएसए) का उपयोग करके ल्यूसिफरेज की गतिविधि निर्धारित की गई थी। , अमेरीका)।

4.11. प्रो-कोलेजन I, ट्रोपोएलास्टिन और पेरीओस्टिन सिंथेसिस का विश्लेषण

प्रति कुएं, 8×103 HDF को 96-वेल प्लेट्स में उगाया गया और 0.002 प्रतिशत ObHex या TGF 2.5 ng/mL से उपचारित किया गया। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को एलिसा के लिए मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-प्रोकोलेजन टाइप I (sc -166572, सांता-क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, डलास, TX, यूएसए) का उपयोग करके संसाधित किया गया, इसके बाद द्वितीयक एंटी-माउस एंटीबॉडी लेबल के साथ ऊष्मायन किया गया। पेरोक्सीडेज (170-6516, बायोराड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) के साथ। कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला एक अन्य प्लेट पर ट्रोपोएलेस्टिन और पेरीओस्टिन का पता लगाने के लिए एंटी-ट्रोपोएलास्टिन खरगोश एंटीबॉडी (ab21600, Abcam, कैम्ब्रिज, U या एंटी-पेरिओस्टिन माउस एंटीबॉडी (sc -398631), सांता-क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी का उपयोग करके लेपित किया गया था। , डलास, TX, यूएसए), इसके बाद पेरोक्सीडेज (170-6515, बायोराड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए） के साथ लेबल किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी एंटी-खरगोश के साथ ऊष्मायन। वर्णमिति प्रतिक्रिया को एक जलीय घोल के 100 μL जोड़कर विकसित किया गया था। ओपीडी (ओ-फेनिलेनेडियम), 50 एमएम साइट्रेट बफर में 0.35 मिलीग्राम/एमएल, और 0.012 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)। 30 मिनट के बाद, मल्टीपल रीडर विक्टर निवो (पर्किनएल्मर, वॉलथम, एमए) का उपयोग करके 490 एनएम पर अवशोषण मापा गया। अमेरीका)।

4.12. पूर्व विवो टेस्ट

MYLKand फॉस्फोराइलेटेड मायोसिन के इम्यूनोहिस्टोफ्लोरेसेंस (IHF) का मूल्यांकन {0}} वर्षीय दाताओं की त्वचा के अन्वेषकों में किया गया था। मानव त्वचा के अन्वेषकों को 8 मिमी के पंच बायोप्सी इलाज के साथ काटा गया और 24-DMEM में 1 0 प्रतिशत FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया। प्राप्त घूंसे का इलाज 0.002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत ObHex के साथ 24 घंटे के लिए किया गया। उन्हें 15 प्रतिशत सुक्रोज में ऊष्मायन किया गया, फिर 30 प्रतिशत सुक्रोज में, और अंत में जमे हुए। इसके बाद, CM1520 क्रायोस्टेट (लीका माइक्रोसिस्टम्स, वेट्ज़लर, जर्मनी) का उपयोग करके 10 माइक्रोन सेक्शन प्राप्त किए गए। क्रायोसेक्शन वाली स्लाइड्स को पीबीएस में 30 मिनट के लिए हाइड्रेट किया गया और 1 घंटे के लिए "अवरुद्ध" समाधान (6 प्रतिशत बीएसए, 5 प्रतिशत सीरम, 20 मिमी एमजीसीएल, 0.2 प्रतिशत ट्वीन) में रखा गया। क्रायोसेंस को 16 घंटे के लिए प्राथमिक एंटी-एमवाईएलके खरगोश एंटीबॉडी (1: 100, जीनटेक्स, इरविन, सीए, यूएसए) और एंटीबॉडी प्राथमिक एंटी-फॉस्फो-मायोसिन (1: 100, लाइफटेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) के साथ ऊष्मायन किया गया था। 4 डिग्री। स्लाइड्स को 30 मिनट के लिए पीबीएस से धोया गया और फिर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटी-खरगोश एलेक्सा-फ्लोर 546 एंटीबॉडी (1: 1000; ए 11035 थर्मोफिशर, वॉलथम, एमए, यूएसए) के साथ जोड़ा गया। नाभिक को 10 मिनट के लिए पीबीएस में डीएपीआई (4', 6-5 डायमिडीनो -2- फेनिलइंडोल) 1 कुरूप / एमएल के साथ दाग दिया गया था। छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ हासिल किया गया था और ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया था। ट्रोपोएलेस्टिन और कोलेजन I के IHF के लिए, 36- वर्षीय महिला दाताओं की त्वचा की खोज का उपयोग किया गया था। ऊपर वर्णित अनुसार त्वचा की बायोप्सी प्राप्त की गई और 24 घंटे के लिए 0.002 प्रतिशत और 0.006 प्रतिशत ओबहेक्स के साथ पूर्व-उपचार किया गया। ओबीएचईएक्स की उपस्थिति में 8 दिनों के लिए 10 यूजी/एमएल पर हाइड्रोकार्टिसोन के साथ तनाव जोड़ा गया था। बाद में, बायोप्सी को ऊपर वर्णित के रूप में जमे हुए थे और वर्गों को प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-ट्रोपोएलास्टिन खरगोश (1: 1000 ab21600, Abcam, कैम्ब्रिज, यूके) और एंटी-कोलेजन I (1: 100 C2456 मर्क, डार्मस्टैड, जर्मनी) के साथ जोड़ा गया था। 16 घंटे 4 डिग्री पर। ऊपर वर्णित के अनुसार स्लाइड्स का विश्लेषण किया गया था और इमेजेज सॉफ्टवेयर के साथ छवियों का अधिग्रहण और विश्लेषण किया गया था।

4.13. स्किन एक्सप्लांट्स में एटॉमिक फोर्स माइक्रोस्कोपी (एएफएम)

ओबीएचईएक्स के साथ अनुपचारित और इलाज किए गए त्वचा के नमूनों की लोच का मूल्यांकन परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) पर आधारित नैनोमेट्रिक पैमाने में एक विधि द्वारा उनके यंग के तौर-तरीकों को सुनिश्चित करने के लिए किया गया था, न केवल जैविक नमूनों के लिए बल्कि अकार्बनिक लोगों के लिए भी विकसित किया गया था। ये दृष्टिकोण हर्ट्ज़ के मॉडल की मान्यताओं पर आधारित हैं और एएफएम प्रयोग सेटिंग में एक श्रृंखला में नमूना और ब्रैकट को दो स्प्रिंग्स के रूप में माना जाता है। संक्षेप में, स्किन एक्स-प्लांट को 0.0ओबहेक्स के 06 प्रतिशत और अनुपचारित त्वचा के नमूनों के साथ इलाज किया गया, क्रायोस्टेट द्वारा मोटाई में 10 उम के स्लाइस में काटा गया। नमूने 12 डिग्री पर संग्रहीत किए गए, फिर पीबीएस से धोए गए और क्रमशः 22 डिग्री और 55 प्रतिशत के एक निश्चित तापमान और सापेक्ष आर्द्रता पर जांच की गई। प्रत्येक नमूने की जांच नैनोस्कोप IIA AFM द्वारा फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी सिंगल मोड में एक पिरामिड टिप (RESP -20) का उपयोग करके 0.9 N / m के स्प्रिंग स्थिरांक के साथ की गई थी। यंग के मापांक की गणना करने के लिए, एक ही नमूना सतह के दस अलग-अलग बिंदुओं में दस बल वक्र हासिल किए गए थे। प्रत्येक बल वक्र विक्षेपण (वोल्ट) बनाम विस्थापन (एनएम) का एक वक्र है और इसे बल (एन) बनाम पृथक्करण (एनएम) के वक्रों में परिवर्तित किया जा सकता है। वास्तव में, प्रत्येक फोर्स कर्व लोडिंग और अनलोडिंग कर्व्स की रिपोर्ट करता है। वे नमूने के संबंध में टिप की प्रवृत्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं: जब टिप नमूना से दूर होती है जब वे संपर्क में आते हैं और टिप विचलित होने लगती है, और जब यह फिर से दूर हो जाती है। इन वक्रों के केवल पहले भाग की जांच की जा सकती है। वक्र के इन भागों में से प्रत्येक एक मानक हर्ट्ज़ियन मॉडल के साथ फिट था, विशेष रूप से, पिरामिड टिप के लिए विशिष्ट हर्ट्ज़ समीकरण, जीपीए में यंग के मापांक के रूप में जाना जाने वाला लोचदार मापांक निकालने के लिए।

4.14. सांख्यिकीय विश्लेषण

रिपोर्ट किए गए सभी मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत थे, जिनमें से प्रत्येक तीन प्रतियों में किया गया था। तारांकन टी-टेस्ट के अनुरूप गणना किए गए सांख्यिकीय महत्व को दर्शाते हैं: *मतलब मूल्य 0 से कम या उसके बराबर।05;** p मान 0 से कम या उसके बराबर। 01;***p मान 0.001 से कम या उसके बराबर।

यह लेख मेटाबोलाइट्स 2021, 11, 527 से निकाला गया है। https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites