लिओंटोपोडियम एल्पिनम (एडलवाइस) कैलस कल्चर एक्सट्रैक्ट के एंटी-एजिंग इफेक्ट्स ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग पार्ट 2 के माध्यम से

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2.9. त्वचा लोच का मापन

कटोमीटर एमपीए 58 0 'साहस और खज़ाका, कोल्न, जर्मनी' का उपयोग करके त्वचा की लोच का विश्लेषण किया गया था। परीक्षण के लिए इस उपकरण पर 2 मिमी के व्यास के साथ एक जांच लगाई गई थी। मोड 1 या टाइम-स्ट्रेन मोड का उपयोग माप की स्थिति के रूप में किया गया था। ऑन-टाइम 2.0s और ऑफ-टाइम 2.0s को तब मोड 1 कंडीशन (450 बार) के निर्दिष्ट नकारात्मक दबाव पर लागू किया गया था, और माप लगातार तीन बार लिए गए थे। तीन अलग-अलग पैरामीटर मान, R2 (सकल लोच), R5 (शुद्ध लोच), और R7 (जैविक लोच), मापा गया।

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2.10. त्वचीय घनत्व और त्वचा की मोटाई का मापन

गाल पर त्वचीय घनत्व और त्वचा की मोटाई का विश्लेषण 20- मेगाहर्ट्ज सुपरसोनिक तरंगों का उपयोग करके एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग मशीन, डर्मास्कैन-सी (कॉर्टेक्स टेक्नोलॉजी, हैडसुंड, डेनमार्क) का उपयोग करके किया गया था, जो गैर-आक्रामक रूप से परिवर्तनों को देखने में बहुत उपयोगी है। त्वचा की भीतरी परतों तक। हमारे अध्ययन में, बी स्कैनिंग छवि का उपयोग किया गया था।सिस्टांचे न्ज़ूसबसे पहले, हम सुपरसोनिक तरंगों की गति 20 मेगाहर्ट्ज पर सेट करते हैं, परीक्षण के लिए संपर्क जेली फैलाते हैं, जांच को त्वचा के समकोण पर रखते हैं, और गाल क्षेत्र को मापने के लिए इसे थोड़ा दबाते हैं। त्वचा की मोटाई और त्वचीय घनत्व की गणना डर्मास्कैन-सी सॉफ्टवेयर सिस्टम द्वारा की गई थी।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग हो सकता है

चेहरे की छवियों को समान फ़ोटोग्राफ़ी स्थितियों, जैसे समान प्रकाश, उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिजिटल कैमरा और फ़ोटोग्राफ़र के साथ फ़ोटोग्राफ़ किया गया था। उसके बाद, चेहरे की छवियों के आधार पर Moire विश्लेषण का उपयोग करके मुंह के कोने पर चेहरे की लिफ्टिंग की जांच की गई। हमने परीक्षण क्षेत्र के रूप में मुंह के कोने का चयन किया, जहां त्वचा की शिथिलता प्रमुख है। छवियों का उपयोग करते हुए, क्षैतिज रेखा और मुंह के कोने पर खींची गई समोच्च रेखा के बीच के कोण (R) की गणना छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (ImagePro Plus, Rockville, MD, USA) का उपयोग करके की गई थी।

2.11.सांख्यिकीय परीक्षण

हमने नियंत्रण और परीक्षण नमूनों के बीच तुलना के लिए एकतरफा एनोवा परीक्षण किया। परिणाम माध्य और मानक विचलन (मीन ± SEM) के साथ दिखाए गए थे। पी-मान पी<0.05 (*),=""><0.01(*), and=""><0.001 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" declared="" statistically="" significant="" at="" the="" 0.05="" level.="" we="" used="" ibm="" spss="" statistics="" version="" 21.0="" (spss,="" chicago,="" il,="" usa)="" for="" the="" statistical="">

2.12. RNA-Seq और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों की तैयारी

प्रतिलेख विश्लेषण के लिए, 1 × 10 डिग्री कोशिकाओं प्रति कुएं के घनत्व पर HaCaT कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए छह-अच्छी तरह से प्लेट में ऊष्मायन किया गया था। उसके बाद, मानव केराटिनोसाइट कोशिकाओं (उपचार) को 24 घंटे के लिए 1 प्रतिशत LACCE निकालने की अंतिम एकाग्रता के साथ इलाज किया गया था, जबकि नकली स्थिति (नियंत्रण) का इलाज बाँझ पानी से किया गया था। प्रत्येक स्थिति के लिए, तीन अलग-अलग जैविक नमूनों काटा गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार RNeasy Mini Kit (क्यूजेन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके कुल RNA निकाला गया। प्रत्येक नमूने से कुल आरएनए के निष्कर्षण के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रूसेक स्ट्रैंडेड एमआरएनए एलटी सैंपल प्रेप किट द्वारा आरएनए-सेक के लिए छह अलग-अलग पुस्तकालय तैयार किए गए थे। इल्लुमिना के नोवासेक 6000 सिस्टम (मैक्रोजन, सियोल, कोरिया) द्वारा छह अलग-अलग पुस्तकालयों को युग्मित-अंत अनुक्रमित किया गया था। प्राप्त कच्चे अनुक्रम डेटा को निम्नलिखित संबंधित परिग्रहण संख्याओं के साथ नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन (NCBI) सीक्वेंस रीड आर्काइव (SRA) डेटाबेस में जमा किया गया था: SRR9127735, SRR9127736, SRR9127737, SRR9127738, SRR9127733, और SRR9127734।

2.13. विभेदक रूप से व्यक्त जीनों का मानचित्रण, सामान्यीकरण और पहचान

हमने प्रत्येक पुस्तकालय से मानव संदर्भ प्रतिलेख संस्करण GRCh38 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/) में BBMap संरेखक का उपयोग करके डिफ़ॉल्ट मापदंडों (https://sourceforge) के लिए कच्चे अनुक्रम को मैप किया। .net/projects/bbmap/)। बीबीमैप का उपयोग करना। sh विकल्प, हमने प्रत्येक प्रतिलेख के लिए प्रति किलोबेस मिलियन (FPKM) मानों के टुकड़ों की गणना की। प्रत्येक स्थिति से प्राप्त FPKM मूल्यों को विभेदित रूप से व्यक्त जीन (DEGs) के सामान्यीकरण और विश्लेषण के लिए DEBrowser के अधीन किया गया था [19]।लिंग का आकार1 से कम के FPKM मान हटा दिए गए थे। EdgeRविथ TMMसामान्यीकरण विधि और सबसे सटीक प्रकार का उपयोग करते हुए, हमने 0.001 से कम के समायोजित p-मानों के अनुसार विभेदित-व्यक्त जीन की पहचान की और log2 एक से अधिक के परिवर्तित गुना परिवर्तन।

2.14. जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) टर्म एनरिचमेंट एनालिसिस

GO शब्द संवर्धन विश्लेषण के लिए, हमने 0 से कम के समायोजित p-मानों के आधार पर DEG की पहचान की।05 और log2 ने 0.5 से अधिक के गुना परिवर्तन परिवर्तित किए। परिणामस्वरूप, 22 अप-विनियमित और 13 डाउन-विनियमित जीन की पहचान की गई। प्रत्येक जीन सेट को डिफ़ॉल्ट मापदंडों (/cbl-gorilla.cs.Technion.ac.il/) [20] के साथ गोरिल्ला प्रोग्राम का उपयोग करके संवर्धन विश्लेषण के अधीन किया गया था। हमने पृष्ठभूमि सेट के रूप में 11,290 व्यक्त जीनों का उपयोग करते हुए जीन की दो अनारक्षित सूचियों को रनिंग मोड के रूप में चुना।

3। परिणाम

3.1. Edeluweiss से LACCE की तैयारी

LACCE प्राप्त किया गया था जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। संक्षेप में, एडलवाइस के बीजों को पहले निष्फल और अंकुरित किया गया था (चित्र 1क)। कैलस अंकुरित बीजों की पत्तियों से प्रेरित था (चित्र 1ख) और निलंबन कोशिका संवर्धन (चित्र 1सी) के अधीन था। LACCE(चित्रा 1डी)के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए बायोरिएक्टरों में निलंबन कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था।सिस्टैंच पाउडरसंवर्धित कोशिकाओं को काटा गया और आगे के अध्ययन के लिए lyophilized किया गया (चित्र 1E)। LACCE को ऊष्मा निष्कर्षण द्वारा तैयार किया गया था। विभिन्न LACCE सांद्रता का उपयोग इन विट्रो (0.1 प्रतिशत, 0.5 प्रतिशत, और 1 प्रतिशत), विवो (1 प्रतिशत), और ट्रांसक्रिप्टोम (1 प्रतिशत) विश्लेषण में कई assays के लिए किया गया था।

चित्रा 1. बायोरिएक्टर का उपयोग करके एडलवाइस कैलस से लियोन्टोपोडियम एल्पिनम कैलस कल्चर एक्सट्रैक्ट (LACCE) प्राप्त करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रिया। (ए) एडलवाइस के बीजों को निष्फल और अंकुरित किया गया था। (बी) कैलस एडलवाइस पत्ती ऊतक से प्रेरित था। (सी) प्रेरित घट्टा निलंबन-सुसंस्कृत था। (डी) प्राप्त कोशिकाओं को एक बायोरिएक्टर में सुसंस्कृत किया गया था। (ई) कैलस कोशिकाओं को काटा गया और बड़ी मात्रा में लियोफिलाइज़ किया गया।

3.2. एक एंटी-एजिंग एजेंट के रूप में LACCE के विट्रो मूल्यांकन में

हमने उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता का निरीक्षण करने के लिए एक 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-डिपेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख की। LACCE. इस अध्ययन में, हमने निम्नलिखित कारणों से प्राथमिक मानव त्वचा कोशिकाओं के बजाय अमर कोशिकाओं का उपयोग किया। अमर सेल लाइनों के साथ काम करने में आसान, सस्ती और सामग्री की असीमित आपूर्ति सहित कई लाभ हैं।सिस्टैंच साल्सा अर्कइसके अलावा, हम मानव ऊतकों के उपयोग से संबंधित कई नैतिक समस्याओं को छोड़ सकते हैं। इसके अलावा, अमर सेल लाइनों को आरएनए-सीक्वेंसिंग (आरएनए-सेक) जैसी बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अधिमानतः उपयोग किया जाता है। दो अलग-अलग सेल लाइनों, एचसीएटी और डेट्रॉइट551, को तीन अलग-अलग एलएसीसीई सांद्रता (0.1 प्रतिशत, 0.5 प्रतिशत, और 1 प्रतिशत) के साथ इलाज किया गया था। LACCE के साथ उपचार के बाद दोनों HaCaT और डेट्रॉइट551 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता नियंत्रण (चित्रा 2) की तुलना में थी। विस्तार से, HaCaT कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता 98.61 प्रतिशत (0.1 प्रतिशत LACCE से थोड़ी कम हो गई थी। ) से 94.72 प्रतिशत (1 प्रतिशत LACCE) हो गया क्योंकि LACCE की सांद्रता में वृद्धि हुई थी (चित्र 2A)। इसके विपरीत, डेट्रायट551 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता 95.99 प्रतिशत ({21}}.1 प्रतिशत LACCE) से थोड़ी बढ़ कर 99.95 प्रतिशत (1 प्रतिशत LACCE) हो गई क्योंकि LACCE की एकाग्रता में वृद्धि हुई थी (चित्र 2B)।

चित्रा 2. साइटोटोक्सिसिटी और एंटी-ऑक्सीडेंट गतिविधि सहित एंटी-बुजुर्ग एजेंट के रूप में एलएसीसीई के विट्रो मूल्यांकन में। तीन अलग-अलग सांद्रता (0.1 प्रतिशत, 0.5 प्रतिशत, और 1 के लिए सेल व्यवहार्यता। MTT परख द्वारा HaCaT कोशिकाओं (A) और Detroib551 कोशिकाओं (B) में LACCE का प्रतिशत। ग्रे बार आसुत जल से उपचारित कोशिकाओं को इंगित करता है। (सी) एचसीएटी कोशिकाओं को हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज किया गया था। तीन अलग-अलग LACCE सांद्रता के लिए सेल व्यवहार्यता को 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) परख द्वारा मापा गया था। एन-एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। (डी) विभिन्न एलएसीसीई सांद्रता की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को डीपीपीएच परख द्वारा मापा गया था। विटामिन सी (विट। सी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। * और ** क्रमशः 0 से कम के पी-मानों के साथ सांख्यिकीय महत्व को दर्शाता है। 0 5 और 0.01, क्रमशः।सिस्टैंच स्टेम(ई) हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज किए गए प्रत्येक नमूने में कोशिका आकृति विज्ञान को मेथिलीन ब्लू धुंधला के साथ देखा गया था।

इसके अलावा, हमने हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) से प्रेरित MTT परख की। सामान्य तौर पर, हाइड्रोजन पेरोक्साइड ने नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में मजबूत साइटोटोक्सिसिटी (सेल व्यवहार्यता का 42.52 प्रतिशत) का कारण बना, जबकि एन-एसिटाइल सिस्टीन (एनएसी) के अलावा, सेल में एक एंटीऑक्सिडेंट, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (6 {{10) के कारण साइटोटोक्सिसिटी को रोकता है। }}. सेल व्यवहार्यता का 24 प्रतिशत)। जैसे ही LACCE की सांद्रता में वृद्धि हुई, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (चित्र 2C) के जवाब में सेल व्यवहार्यता 45.54 प्रतिशत (0.1 प्रतिशत LACCE) से बढ़कर 60.37 प्रतिशत (1 प्रतिशत LACCE) हो गई। विशेष रूप से, 1 प्रतिशत LACCE निकालने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) अवरोध दर एनएसी की तुलना में थी। इसके अलावा, सेल आकारिकी को मेथिलीन ब्लू के साथ धुंधला होने के बाद भी देखा गया था, जो LACCE (चित्रा 2E) से सेल व्यवहार्यता में वृद्धि दर्शाता है।

इसके बाद, हमने 2,2-डिपेनिल-1-पिक्रिलहाइड्राज़िल (डीपीपीएच) रेडिकल मैला ढोने वाले परख(चित्रा 2डी)का उपयोग करके एक एंटीऑक्सिडेंट परख की। DPPH कट्टरपंथी-मैला ढोने की गतिविधि 2.85 प्रतिशत ({7}}.1 प्रतिशत LACCE) से बढ़ाकर 20.47 प्रतिशत (1 प्रतिशत LACCE) कर दी गई क्योंकि LACCE निकालने की एकाग्रता में वृद्धि हुई थी। विटामिन सी (14.05 प्रतिशत) की तुलना में, 0.1 प्रतिशत और 0.5 प्रतिशत एलएसीसीई सांद्रता ने कम कट्टरपंथी-स्कैवेंजिंग गतिविधि दिखाई, जबकि एलएसीसीई निकालने की 1 प्रतिशत एकाग्रता ने उच्च कट्टरपंथी-स्कैवेंजिंग गतिविधि प्रदर्शित की।

3.3.इन विट्रो मूल्यांकन में LACCE एक विरोधी भड़काऊ एजेंट के रूप में निकालने

LACCE के विरोधी भड़काऊ प्रभाव की जांच करने के लिए, क्रमशः COX -2 और इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (iNOS) को कूटने वाले दो भड़काऊ मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को वास्तविक समय RT-PCR (चित्र 3A, B) के साथ निर्धारित किया गया था। . सामान्य तौर पर, यूवीबी विकिरण ने सीओएक्स -2 जीन एन्कोडिंग की अभिव्यक्ति को विनियमित किया जो एक प्रोटीन है जो सूजन (चित्रा 3 ए) को प्रेरित करता है। नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में, एचसीएटी सेल में एलएसीसीई को जोड़ने से सीओएक्स -2 जीन की अभिव्यक्ति को काफी हद तक दबा दिया गया। हालांकि, विभिन्न LACCE सांद्रता के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे। डेक्सामेथासोन (डेक्स) युक्त सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में, LACCE (0.1 प्रतिशत से 1 प्रतिशत) ने बहुत समान विरोधी भड़काऊ प्रभाव दिखाया। iNOS जीन की अभिव्यक्ति Dex और LACCE (चित्र3B) युक्त सकारात्मक नियंत्रण द्वारा बाधित थी। जैसे ही LACCE निकालने की एकाग्रता में वृद्धि हुई, iNOS जीन की अभिव्यक्ति धीरे-धीरे कम हो गई।

चित्रा 3. वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा एलएसीसीई के विरोधी भड़काऊ, मॉइस्चराइजिंग, और विरोधी शिकन एजेंटों के रूप में इन विट्रो मूल्यांकन में। यूवीबी-उपचारित नमूनों के जवाब में अलग-अलग LACCE सांद्रता में COX2 (A) और iNOS (B), दो भड़काऊ मार्कर जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति को वास्तविक समय RT-PCR द्वारा मापा गया था। डेक्सामेथासोन (डेक्स) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ग्रे और नीली पट्टियाँ क्रमशः यूवीबी उपचार के बिना और साथ में एचसीएटी कोशिकाओं को दर्शाती हैं। (सी) AOP3 की सापेक्ष अभिव्यक्ति, विभिन्न LACCE सांद्रता में मॉइस्चराइजिंग प्रभाव के लिए एक सकारात्मक मार्कर। (डी) यूवीबी के जवाब में विभिन्न एलएसीसीई सांद्रता में एमएमपी {{1 0}}, एक सेल ग्रोथ मार्कर की सापेक्ष अभिव्यक्ति। व्यक्तिगत जीन की अभिव्यक्ति को GAPDH जीन अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किया गया था। * और * क्रमशः 0.05 और 0.01 से कम के p-मानों के साथ सांख्यिकीय महत्व को दर्शाते हैं।

यह लेख जीन 2020, 11, 230 से निकाला गया है; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes