एंटी-एजिंग-क्लोथो जीन-एक्टिवेटेड स्कैफोल्ड मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल में कायाकल्प घाव भरने की प्रतिक्रिया को बढ़ावा देता है

कीवर्ड:बुढ़ापा विरोधी; -क्लोथो; जीन-सक्रिय मचान; वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल; वाहिकाजनन;मैट्रिक्स बयान;कायाकल्प उपचार

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1 परिचय

घाव भरना एक जटिल जैविक प्रक्रिया है जिसके लिए कई कोशिकीय घटनाओं के कड़े आयोजन की आवश्यकता होती है [1]। हालांकि, उम्र बढ़ने वाली आबादी में, सेलुलर घटनाएं बाधित होती हैं, जिससे उपचार में देरी होती है।2]। उपचार तंत्र में व्यवधान आंशिक रूप से अस्थि मज्जा और अन्य प्रचलित चयापचय रोगों जैसे मधुमेह से पूर्वज कोशिकाओं के घर में कम होने के कारण उत्पन्न होता है।3,4]। घाव प्रबंधन में, उपचार के रूप में बायोमटेरियल स्कैफोल्ड्स का उपयोग अधिक आम होता जा रहा है। बायोमटेरियल मचानघाव को संक्रमण से बचाएं, घाव के स्राव को अवशोषित करें, और ऊतक परिगलन को रोकने के लिए घाव को नम रखें [5]। थेराप्यूटिक्स को बायोमटेरियल स्कैफोल्ड्स में भी लोड किया जा सकता है और मुश्किल से ठीक होने वाले घावों में तेजी से उपचार को बढ़ावा देता है [1]। हालांकि, अकेले बायोमटेरियल मचान घाव के भीतर होने वाले कई सिग्नलिंग कैस्केड को प्रभावी ढंग से ऑर्केस्ट्रेट नहीं कर सकते हैं। घाव में जटिल सिग्नलिंग घटनाओं को मॉडरेट करने के लिए कभी-कभी स्टेम सेल को डिलीवर करना एक समाधान के रूप में प्रस्तावित किया जाता है [6]. 

स्टेम कोशिकाएं पेराक्रिन कारकों का स्राव करती हैं और कई ऊतक वंशों की कोशिकाओं में अंतर कर सकती हैं [7]। स्टेम सेल आमतौर पर त्वचा के अंदर इंजेक्शन के माध्यम से घाव में पहुंचाए जाते हैं [6], सामयिक छिड़काव [8], या टिश्यू-इंजीनियर्ड ग्राफ्ट के रूप में [9]। हाल के वर्षों में, जीर्ण घाव भरने के लिए टिश्यू-इंजीनियर्ड ग्राफ्ट के प्रयोग को धीरे-धीरे व्यापक स्वीकृति मिली है क्योंकि घावों को तेजी से भरने की उनकी क्षमता है [9–11]। एप्लिग्राफ® और डर्माग्राफ्ट® जीर्ण घाव के उपचार के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए)-अनुमोदित बायोइंजीनियर निर्माणों में से दो हैं [12,13]। हालांकि, इन ग्राफ्ट के निर्माण के लिए लंबे समय तक सेल कल्चर की आवश्यकता होती है ताकि उच्च सेल संख्या का उत्पादन किया जा सके।14]। स्टेम सेल का उपयोग करते समय, लंबे समय तक संवर्धन सेलुलर जीर्णता को बढ़ा सकता है और स्टेम सेल के स्टेमनेस को कम कर सकता है [15,16]। इसलिए, इष्टतम चिकित्सीय प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए स्टेम सेल के स्टेमनेस को बनाए रखना केंद्रीय है। गैर-वायरल वैक्टर का उपयोग करके स्टेम सेल को चिकित्सीय जीन डिलीवरी स्टेम सेल की कार्यक्षमता बढ़ाने के लिए एक संभावित रणनीति है [17]। परंपरागत रूप से, कोशिकाओं को 2 डी कल्चर में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है और बाद में विवो में ट्रांसप्लांट किया जाता है।18]। हालांकि, जीन-सक्रिय स्कैफोल्ड्स जैसे प्लेटफॉर्म, चिकित्सीय ट्रांसजेन को ले जाने वाले नैनोकणों के साथ क्रियाशील बायोमटेरियल मचानों से युक्त होते हैं [19], कि हमारा समूह एक 3-डी वातावरण के भीतर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान पेश करने में अग्रणी रहा है। यह अध्ययन 3 डी कोलेजन-चोंड्रोइटिन सल्फेट (कोल-सीएस) मचान के जीन-सक्रिय संस्करण को विकसित करने पर केंद्रित है, जिसमें जबरदस्त नैदानिक ​​​​अनुवाद क्षमता है, क्योंकि इसकी संरचना इंटेग्रा के त्वचीय पुनर्जनन टेम्पलेट (डीआरटी) के समान है, जो चिकित्सकीय रूप से अनुमोदित है। जीर्ण घाव भरने के लिए पाड़ [20]। हम मुख्य रूप से स्ट्रोमल-व्युत्पन्न कारक -1 अल्फा और तंत्रिका विकास कारक जैसे विकास कारक जीनों के लिए डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग को संघनित करने के लिए पॉलीइथिलीनमाइन (PEI) नामक एक cationic बहुलक का उपयोग करते हैं और उन्हें आवेशित नैनोकणों में इकट्ठा करते हैं [21–23]। इन चार्ज किए गए नैनोकणों को जीन-सक्रिय मचानों को उत्पन्न करने के लिए हमारे कोल-सीएस मचान में भिगोया जाता है। हमारे पिछले अध्ययनों से यह भी पता चला है कि पीईआई-आधारित जीन-सक्रिय मचान घाव भरने वाली कोशिकाओं की एक श्रृंखला में चिकित्सीय ट्रांसजेन के क्षणिक अतिअभिव्यक्ति का कारण बन सकता है और उनकी पुनर्योजी क्षमताओं को बढ़ावा दे सकता है।21,24,25]। परंपरागत रूप से, जीन-सक्रिय मचान को मेजबान कोशिकाओं को लक्षित करने और स्थानीय मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए विकसित किया गया था।26]। हालांकि, उभरते हुए साक्ष्य इंगित करते हैं कि अकेले जीन-सक्रिय मचानों की तुलना में कोशिका-युक्त जीन-सक्रिय मचानों में जटिल ऊतक संरचनाओं को पुन: उत्पन्न करने की बेहतर क्षमता होती है [27]. 

टिशू-इंजीनियर्ड ग्राफ्ट की पीढ़ी के लिए सेलुलर बहुतायत महत्वपूर्ण आवश्यकताओं में से एक है [28]। वसा ऊतक एक समृद्ध स्रोत है जो बड़ी संख्या में स्टेम सेल की आपूर्ति कर सकता है। वसा ऊतक में अस्थि मज्जा के समान द्रव्यमान के लिए 500 गुना अधिक स्टेम कोशिकाएं होती हैं, जो स्टेम सेल निष्कर्षण के लिए एक पारंपरिक ऊतक स्रोत है [29]। इसके अलावा, स्टेम सेल को न्यूनतम इनवेसिव लिपोसक्शन प्रक्रिया का उपयोग करके वसा ऊतक से निकाला जा सकता है [29]। हमारे हाल के अध्ययन में पाया गया कि मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (ADSCs) कोल-सीएस पाड़ के साथ उत्कृष्ट जैव-अनुकूलता प्रदर्शित करता है। एक प्रो-एंजियोजेनिक जीन-सक्रिय पाड़ का उपयोग करने से ADSCs की पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं में और सुधार हुआ [30]। हालाँकि, ADSCs विस्तार पर अपनी स्थिरता खो देते हैं [31]। पहले, हमने पाया कि एक एंटी-एजिंग प्रोटीन -क्लोथो स्वस्थ और मधुमेह मानव ADSCs के प्रसार में काफी सुधार कर सकता है [32]। अधिकांश अध्ययन आम तौर पर प्राथमिक संस्करण का उपयोग करते हैं -क्लोथो [33–35] और दिखाया है कि प्रोटीन टेलोमेरेज़ ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को सक्रिय करके ADSCs के जीवनकाल को बढ़ा सकता है [33]. -क्लोथो ओवरएक्सप्रेसिंग MSCs को भी Wnt/ के अवरोध के माध्यम से गुर्दे की चोट में मजबूत एंटी-फाइब्रोटिक प्रभाव डालने के लिए पाया गया है। -कैटेनिन सिग्नलिंग [36]। हालांकि की भूमिका -क्लोथो स्टेम सेल में अपेक्षाकृत बेरोज़गार रहता है।

के बीच अनुसंधान फोकस में अंतर के अलावा - और -क्लोथो, बुढ़ापा रोधीक्लोथो प्रोटीन को अभी तक पूरी तरह से ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों में शामिल नहीं किया गया हैघाव भरने के लिए। इसलिए, इस अध्ययन में, हमने ए के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने की मांग की घाव भरने वाले अनुप्रयोगों के लिए मानव ADSCs पर क्लोथो जीन-सक्रिय पाड़। हमसबसे पहले क्लासिकल प्लुरिपोटेंसी कारकों की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों की जांच की (अक्टूबर -4,नैनोग, और सोक्स -2), प्रसार मार्कर (की -67), और घाव भरने वाले नियामक (टीजीएफ- 3 और टीजीएफ- 1) एडीएससी में। हमने तब वातानुकूलित मीडिया की बायोएक्टिविटी का आकलन कियाADSCs से लदी जीन-सक्रिय पाड़ द्वारा इसकी पैरासरीन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उत्पन्न।अंततः, हमने तहखाने की झिल्ली (फाइब्रोनेक्टिन, लेमिनिन) के पुनर्जनन की जांच कीऔर कोलेजन IV) और निशान से जुड़े प्रोटीन ( -SMA और इलास्टिन) ADSCs से लदी मेंनियंत्रित ऊतक परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए जीन-सक्रिय मचान।

2. परिणाम

2.1. -क्लोथो जीन-एक्टिवेटेड स्कैफोल्ड मानव ADSCs स्टेमनेस और प्रो-रिपेरेटिव जीन को क्षणिक रूप से बढ़ाता है

जीन एक्सप्रेशन एनालिसिस ने सबसे पहले दिखाया कि जीन-एक्टिवेटेड स्कैफोल्ड पर ADSCs ने ओवरएक्सप्रेस किया -क्लोथो जीन 172-गुना (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1ए)। इस खोज ने ADSCs की जीन-सक्रिय पाड़ के साथ कुशल संपर्क की पुष्टि की। प्रसार मार्कर Ki -67 के विश्लेषण ने आगे पुष्टि की कि जीन-सक्रिय मचान पर ADSCs ने भी 14 दिनों में एक मजबूत प्रसार क्षमता बनाए रखी (चित्र)1ए)। एंटी-एजिंग के ओवरएक्प्रेशन की पुष्टि करने के बाद -क्लोथो जीन, फिर हमने ADSCs में "प्लुरिपोटेंसी" कारकों की सक्रियता के माध्यम से स्टेम सेल के कायाकल्प का आकलन किया। कुल मिलाकर, हमने 14 दिनों में सभी तीन ट्रांसक्रिप्शन कारकों के एक क्षणिक नियमन पर ध्यान दिया (चित्र1बी)। हालांकि, ADSCs ने केवल अक्टूबर -4 जीन की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई जो 14 दिन तक बनी रही। विशेष रूप से, ADSCs ने 2.5-गुना (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1सी)। प्रो-फाइब्रोटिक टीजीएफ के स्तर- 1 जीन में -क्लोथो ओवरएक्सप्रेसिंग ADSCs को 14 दिनों में जीन-मुक्त पाड़ समूह के बराबर पाया गया। हालांकि, एंटी-फाइब्रोटिक टीजीएफ के स्तर- 3 उल्लेखनीय रूप से (3.6-तह,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -क्लोथो जीन-एक्टिवेटेड स्कैफोल्ड

मानव ADSCs की पैराक्राइन क्षमता को बढ़ाता है2.2.1। प्रो-एंजियोजेनिक बायोएक्टिविटी ADSCs से लदी जीन-सक्रिय मचान द्वारा उत्पन्न CM की बायोएक्टिविटी टेस्ट ने पहली बार दिखाया कि यह HUVECs में चयापचय गतिविधि को अस्थायी रूप से नियंत्रित कर सकता है। दिन 3 सीएम ने एचयूवीईसी में चयापचय गतिविधि को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाया, जबकि 14 दिन से वृद्ध सीएम के उपयोग ने एचयूवीईसी की चयापचय गतिविधि (चित्रा) को महत्वपूर्ण रूप से कम कर दिया।2ए)। इसे देखने के बाद, हमने तब 3 और 14 दिन से CM के प्रो-एंजियोजेनिक प्रभाव का परीक्षण किया, जो कि Matrigel पर आधारित HUVECs पर था। जैसा कि प्रत्याशित था, दिन 3 सीएम जीन-सक्रिय पाड़ समूह से महत्वपूर्ण रूप से (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2बी)। हालांकि, दिन 3 सीएम की तुलना में 14 सीएम के साथ एंजियोजेनिक गतिविधि में कोई और वृद्धि नहीं हुई। इसके अलावा, दोनों समूहों के दिन 14 सीएम ने समान प्रो-एंजियोजेनिक दक्षता (चित्र2सी)। सामूहिक रूप से, हमारी खोज इंगित करती है कि जीन-सक्रिय मचान ADSCs के प्रो-एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया को क्षणिक रूप से तेज करता है।

प्रो-फाइब्रोटिक टीजीएफ- 1. ** और * इंगित करता हैp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± मानक विचलन (n = 3).

चित्र 2. ADSCs से लदी जीन-सक्रिय मचान CM की प्रो-एंजियोजेनिक पाराक्रिन बायोएक्टिविटी। (ए) 14 दिनों में ADSCs से लदी जीन-सक्रिय मचान द्वारा उत्पादित CM ने HUVECs की चयापचय गतिविधि को अस्थायी रूप से नियंत्रित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। (बी) जीन-सक्रिय पाड़ समूह से दिन 3 सीएम ने जीन-मुक्त पाड़ समूह की तुलना में एंडोथेलियल ट्यूब्यूल गठन और इसकी शाखाओं में काफी वृद्धि की है। वरीयता प्राप्त जीन-सक्रिय और जीन-मुक्त मचान, * p <0.05 इंगित करता है। डेटा मतलब दर्शाता है! मानक विचलन (एन=3)

2.2.2। त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट हीलिंग और परिपक्वता

एंजियोजेनेसिस अध्ययन के निष्कर्षों में से एक यह है कि ADSCs से लदी जीन-सक्रिय मचान परिपक्व होने के कारण, यह अब एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा नहीं देता है। इसके अलावा, 14 दिन उनकी एंजियोजेनिक शक्ति जीन-मुक्त पाड़ समूह के समान थी (चित्र 2बी, सी) इसलिए, हमने त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट घाव बंद होने पर वृद्ध दिन 14 सीएम के प्रभाव की जांच की। एंजियोजेनेसिस अध्ययन के परिणाम के समान, दोनों समूहों ने 14 सीएम दिन के साथ फाइब्रोब्लास्ट घाव बंद करने के समान स्तर का प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, दोनों समूहों ने घाव को 12 घंटे में लगभग 40 प्रतिशत तक ठीक कर दिया (चित्र 3क)। इस खोज से पता चला कि परिपक्वता के दौरान, जीन-सक्रिय पाड़ समूह समर्थन करता है लेकिन त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट घाव को बंद करने को बढ़ावा नहीं देता है।

फिर भी, जैसा कि वृद्ध सीएम के साथ फाइब्रोब्लास्ट को उत्तेजित किया गया था, हमने अध्ययन किया कि क्या घाव की परिपक्वता में शामिल मैट्रिक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति का प्रभाव है। जैसा कि प्रत्याशित था, जीन-मुक्त पाड़ समूह से सीएम के साथ उत्तेजित त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट बहुतायत से प्रो-फाइब्रोोटिक कोलेजन I प्रोटीन (चित्रा 3 बी) व्यक्त करते हैं। इसके विपरीत, जीन-सक्रिय मचान समूह से सीएम के साथ उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट्स ने कोलेजन I प्रोटीन के 5 0 प्रतिशत कम अभिव्यक्ति (पी <0.05) का प्रदर्शन किया। इस बीच, दोनों समूहों में सभी एंटी-फाइब्रोोटिक कोलेजन की अभिव्यक्ति का अभाव था, और दोनों समूहों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया। एक साथ लिया गया, इसका तात्पर्य है कि जीन-सक्रिय मचान परिपक्वता के दौरान ADSCswound विनियामक प्रतिक्रिया को बढ़ाता है।

चित्रा 3. त्वचीय उपचार और परिपक्वता पर पाराक्राइन प्रभाव। (ए) वृद्ध दिन 14 सीएम दोनों समूहों से मानव वयस्क त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट में घाव बंद करने की गतिविधि के समान स्तर को 12 घंटे में लगभग 4 0 प्रतिशत तक बढ़ा दिया। (बी) जीन-सक्रिय मचान से सीएम ने अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया। फाइब्रोब्लास्ट्स में प्रो-फाइब्रोटिक कोलेजन का। "इंगित करता है p < 0.05डेटा औसत=मानक विचलन (n=3) का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 3बी में, जीएएस और जीएफएस क्रमशः जीन-सक्रिय मचान और जीन-मुक्त पाड़ के लिए खड़े हैं।

2.3। बी-क्लोथो जीन-एक्टिवेटेड स्कैफोल्ड मानव ADSCs में बेहतर एंटी-फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया के साथ बेसमेंट मेम्ब्रेन रीजनरेशन को बढ़ाता है

ADSCs की कार्यक्षमता के जीन-सक्रिय मचान की नियंत्रित उत्तेजना को देखने के बाद, हमने अंततः ADSCs की त्वचीय मेट्रिसेस और प्रोटीन के उत्थान की प्रतिक्रिया की जांच की। जीन-सक्रिय मचान ने ADSCs के बेसमेंट मेम्ब्रेन के पुनर्जनन को मजबूती से बढ़ाया। विशेष रूप से, जीन-सक्रिय पाड़ ने बेसमेंट झिल्ली घटकों लैमिनिन और कोलेजन IV चित्रा 4ए) के जमाव को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दिया। अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण के बाद, हमने यह भी नोट किया कि मैट्रिक्स जमाव ने जीन-मुक्त पाड़ समूह के सापेक्ष एक प्रवृत्ति का अनुसरण किया। देखी गई प्रवृत्ति फाइब्रोनेक्टिन (1.0-गुना) <लेमिनिन (2.1-गुना,="" p="" <{{10}}.05)=""><कोलेजन iv="" (8.8-गुना,="" p="" <="" 0.01)।="" एक="" बार="" तहखाने="" की="" झिल्ली="" को="" पुनर्जीवित="" करने="" की="" क्षमता="" निर्धारित="" हो="" जाने="" के="" बाद,="" हमने="" बेहतर="" गुणात्मक="" उपचार="" के="" लिए="" महत्वपूर्ण="" प्रोटीन="" की="" अभिव्यक्ति="" का="" आकलन="" किया,="" जैसे="" कि="" निशान="" कम="" होना।="" जीन-सक्रिय="" मचान="" पर="" adscs="" ने="" निशान="" से="" जुड़े="" सिकुड़ा="" हुआ="" प्रोटीन="" a-sma="" की="" काफी="" कम="" अभिव्यक्ति="" (p="" <0.05)="" का="" प्रदर्शन="" किया।="" adscs="" में="" a-sma="" अभिव्यक्ति="" जीन-मुक्त="" पाड़="" समूह="" (चित्र="" 4b)="" के="" सापेक्ष="" 50="" प्रतिशत="" कम="" थी।="" अंत="" में="" घटी="" हुई="" ए-एसएमए="" अभिव्यक्ति="" को="" देखते="" हुए,="" हमने="" लोचदार="" मैट्रिक्स="" प्रोटीन="" इलास्टिन="" की="" अभिव्यक्ति="" का="" आकलन="" किया।="" जीन-सक्रिय="" मचान="" पर="" adscs="" ने="" जीन-मुक्त="" मचान="" पर="" adscs="" की="" तुलना="" में="" इलास्टिन="" के="" एक="" परिपक्व="" रेशेदार="" नेटवर्क="" के="" जमाव="" के="" माध्यम="" से="" अपेक्षाकृत="" बेहतर="" गुणात्मक="" इलास्टिन="" अभिव्यक्ति="" का="" प्रदर्शन="" किया="" (चित्र="">

चित्र 4. दिन 14 पर जीन-सक्रिय मचान में ADSCs द्वारा प्रो-घाव हीलिंग मैट्रिक्स प्रोटीन का जमाव। (A) जीन-सक्रिय पाड़ में ADSCs ने महत्वपूर्ण रीजेन का प्रदर्शन किया। जीन-मुक्त मचान में ADSCs की तुलना में तहखाने की झिल्ली का संचालन। ADSCs मुख्य रूप से कोलेजन IV प्रोटीन का एक अपेक्षाकृत परिपक्व नेटवर्क जमा करते हैं, इसके बाद लैमिनिन और फ़ाइब्रोनेक्टिन आते हैं। (B) जीन-सक्रिय मचान में ADSCs ने जीन में ADSCs की तुलना में SMA प्रोटीन के 2- गुना कम व्यक्त किया -मुक्त मचान। बेसमेंट मेम के साथ संयोजन के रूप में। ब्रान पुनर्जनन, जीन-सक्रिय पाड़ में ADSCs ने गुणात्मक रूप से बेहतर लोचदार मैट्रिक्स जमा किया। सभी छवियों को IX73 ओलंपस माइक्रोस्कोप* का उपयोग करके 20x उद्देश्य के माध्यम से कैप्चर किया गया था और * क्रमशः p <0.01 और p <0.05 इंगित करता है। स्केल बार 50um। डेटा औसत मानक विचलन (एन=3) का प्रतिनिधित्व करता है। -एसएमए और फाइब्रोनेक्टिन डबल-इम्युनोस्टेन्ड थे।

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