मानव त्वचा की दीर्घायु के लिए पदार्थ पी-आधारित हाइड्रोजेल की एंटी-एजिंग क्षमता

कीवर्ड:पदार्थ Cistanche; विरोधी उम्र बढ़ने प्रभाव; विरोधी भड़काऊ प्रभाव; त्वचा का अवशोषण; 3डी मानव त्वचा मॉडल;कॉस्मेटिक घटक

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1 परिचय

त्वचा की उम्र बढ़नाविभिन्न प्रक्रियाओं के कारण होता है, जिसमें आंतरिक (सेलुलर चयापचय, हार्मोनल परिवर्तन और आनुवंशिक उत्परिवर्तन) और बाहरी कारक (टॉक्सिन, रसायन और पराबैंगनी (यूवी) विकिरण) शामिल हैं [1-3]।वृद्ध त्वचाअसंगठित और कम कोलेजन और इलास्टिन [4,5] के साथ बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के घटकों की सामान्य गिरावट से जैविक रूप से विशेषता है। इसके अतिरिक्त, एभड़काऊ घटनाआमतौर पर हैउम्र बढ़ने वाली त्वचा में प्रेरित, कारणडर्मिस की झुर्रियां और मोटा होनाऔरएपिडर्मिस. भड़काऊ कोशिकाओं से जारी प्रो-भड़काऊ मध्यस्थमैट्रिक्स मेटेलोप्रोटीनिस (एमएमपी) नाम के कोलेजनैस की सक्रियता को बढ़ा सकता है, इस प्रकार कोलेजन क्षरण [6-8] हो सकता है। कोलेजन संश्लेषण को बढ़ाने की क्षमता रखने वाली कई एंटी-एजिंग सामग्रियों का हाल के दिनों में सुझाव दिया गया है। प्रसिद्ध सामग्रियों में से एक विकास कारक है। त्वचा के घाव भरने के लिए विकास कारकों का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है [9]। उनमें से कई, जैसे प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक (वीईजीएफ), एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), और केराटिनोसाइट विकास कारक, इंटर और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग पाथवे [9,10] के नेटवर्क के माध्यम से कोलेजन संश्लेषण को सीधे प्रभावित करते हैं। हालांकि, शीर्ष रूप से लागू विकास कारक अपने बड़े आणविक आकार के कारण एंटी-एजिंग एजेंटों के रूप में बहुत मददगार नहीं रहे हैं, जो तंग स्ट्रेटम कॉर्नियम [11] में प्रवेश करने की उनकी क्षमता को सीमित करता है। विकास कारकों के अलावा, कम आणविक भार के कई एंटी-एजिंग पेप्टाइड भी विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, पामिटॉयल ट्राइपेप्टाइड्स एमएमपी1 और 3 [12] जैसे कोलेजेनेजेस द्वारा कोलेजन की कमी में हस्तक्षेप करके कोलेजन अवक्रमण को रोकते हैं। इसके अलावा, कॉपर ट्राइपेप्टाइड्स, सबसे अच्छी तरह से जांचा गया पेप्टाइड्स, प्रोकोलेजन संश्लेषण को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है [13]।

हालांकि कई अध्ययनों ने शीर्ष रूप से लागू विकास कारकों और पेप्टाइड्स द्वारा कोलेजन संश्लेषण को बढ़ावा देने का संकेत दिया है, लेकिन विरोधी भड़काऊ प्रभाव के बिना कोलेजन संश्लेषण का एकल प्रभाव, एंटी-एजिंग प्रदर्शन में नैदानिक ​​रूप से सुधार करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। अधिक स्पष्ट प्रभावों के लिए, यौगिक को त्वचा की गहरी परतों में पहुँचाने की आवश्यकता होती है। इसलिए, नई सामग्री के विकास की एक मजबूत आवश्यकता है, जिसमें त्वचा के अवशोषण में वृद्धि के साथ-साथ कोलेजन संश्लेषण और विरोधी भड़काऊ प्रभाव के दोहरे कार्य होते हैं। पदार्थ सिस्टैंच (सीपी), एक छोटे आकार का पेप्टाइड जिसमें 11 अमीनो एसिड होते हैं, संभावित घाव भरने की गतिविधि को प्रदर्शित करता है, जो सेल प्रसार, कोलेजन संश्लेषण और विरोधी भड़काऊ प्रभाव [14-16] के प्रेरण के माध्यम से होता है। हालांकि, सीपी का उपचारात्मक अनुप्रयोग इसकी कम स्थिरता द्वारा सीमित किया गया है, जो इसके उपचार गुणों [17-19] में देरी कर सकता है। हमारे पिछले अध्ययन में, हमने सीपी जेल के रूप में जाना जाने वाला सीपी का एक नया सूत्रीकरण विकसित किया, जो विभिन्न भंडारण स्थितियों [20] के तहत सीपी की स्थिरता को बढ़ाता है। इसकी स्थिरता के अलावा, सीपी जेल ने केराटिनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट प्रसार को बढ़ाकर अकेले सीपी की तुलना में अधिक प्रभावी घाव भरने वाला दिखाया है। वर्तमान कार्य में, हमने सीपी जेल के लक्षण वर्णन को बढ़ाया है और एंटी-एजिंग प्रदर्शन के लिए कोलेजन संश्लेषण और विरोधी भड़काऊ प्रभाव को बढ़ावा देने का प्रदर्शन किया है। सीपी जेल द्वारा त्वचा के अवशोषण और रंजकता की भी आगे जांच की गई। हमारे निष्कर्ष अकेले सीपी की तुलना में सीपी जेल की उच्च एंटी-एजिंग क्षमता को प्रदर्शित करते हैं, त्वचा के अवशोषण प्रभाव में वृद्धि के साथ, और इसलिए, व्यापक कॉस्मेटिक प्रयोज्यता।

2. परिणाम

2.1। सीपी जेल की इन-विट्रो विषाक्तता

सीपी जेल एंटी-एजिंग एप्लिकेशन के लिए, मानव त्वचा के खिलाफ कम विषाक्तता के साथ संयुक्त उच्च गतिविधियां वांछनीय होंगी। इसलिए, सीपी जेल की इन-विट्रो विषाक्तता का मूल्यांकन मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट (एचडीएफ) और एक पुनर्निर्मित 3डी मानव त्वचा, केरास्किन®-एफटी का उपयोग करके किया गया था। सबसे पहले, हमने एचडीएफ (चित्रा 1ए) का उपयोग करके लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) परख द्वारा अकेले सीपी के संबंध में सेल झिल्ली पर सीपी जेल के हानिकारक प्रभावों का आकलन किया। पिछले 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाजोल-2-वाईएल)-2,5-डिफेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) के अलावा एलडीएच परख का और उपयोग किया गया था। परख [20], सीपी जेल के अधिक सटीक विषाक्तता माप के लिए। परिणामों से पता चला कि न तो सीपी जेल और न ही अकेले सीपी ने सभी परीक्षण किए गए सांद्रणों पर एचडीएफ के खिलाफ कोई कोशिका झिल्ली क्षति दिखाई। इसके अलावा, सीपी की कमी वाले वाहन के उपचार का केवल पीबीएस वाले माध्यम के सापेक्ष कोशिका झिल्ली पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। सीपी जेल के कारण मानव त्वचा पर संभावित जलन का और अधिक परीक्षण करने के लिए, हमने बाद वाले को, विभिन्न सांद्रता पर, पूर्ण-मोटाई वाली त्वचा मॉडल, केरास्किन®-एफटी (चित्र 1बी, सी) पर कुल 24 घंटे के लिए लागू किया। ऊतक व्यवहार्यता पर प्रभावों की तुलना करने के लिए, 5 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), एक ज्ञात अड़चन, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सीपी जेल (1-10 माइक्रोग्राम/एमएल) केरास्किन®-एफटी के लिए गैर-विषैला था, जैसा कि एमटीटी परख (चित्र 1बी) द्वारा प्रदर्शित किया गया था, जो नियंत्रण (पीबीएस उपचार) की तुलना में संभावित त्वचा की जलन का संकेत नहीं देता है। इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा से पता चला कि केरास्किन®-एफटी को सीपी जेल (चित्रा 1सी) द्वारा कोई नुकसान नहीं हुआ है। अकेले सीपी (चित्रा S1) के साथ इलाज किए गए समूह में समान परिणाम प्राप्त किए गए थे। इन परिणामों के आधार पर, CP जेल (CP का 10 µg/mL) की उच्च सांद्रता भी गैर-विषैले होने का निष्कर्ष निकाला गया, जिससे त्वचा में कोई जलन नहीं हुई।

चित्र 1, एचडीएफ और इन-विट्रो पुनर्निर्मित 3डी मानव त्वचा की व्यवहार्यता पर सिस्टैंच (सीपी) जेल का प्रभाव, केरास्किन@-एफटी। (ए) कोशिका झिल्ली पर सीपी जेल निर्माण के हानिकारक प्रभावों के लिए, एचडीएफ को पीबीएस के साथ इलाज किया गया था। (Con; control), CP अकेले, या CP जेल (1-10 ug/mL) 24 घंटे के लिए, और सेल व्यवहार्यता LDH परख द्वारा निर्धारित की गई थी। (बी, सी) त्वचा की चिड़चिड़ापन का परीक्षण सीपी जेल (1-10 यूजी/एमएल) का उपयोग करके इन विट्रोरिकंस्ट्रक्टेड 3डी मानव त्वचा, केरास्किन@-पीटी पर किया गया। सीपी जेल-उपचारित समूह में ऊतक व्यवहार्यता का विश्लेषण एमटीटी परख (बी) और हिस्टोलॉजिकल परीक्षा (सी) द्वारा किया गया था, पीबीएस को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मीर प्लस एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक मान की तुलना छात्र के परीक्षण (** p <0.01) का उपयोग करके नियंत्रण से की गई थी। स्केल बार=500 उम। एचडीएफ, मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट; एलडीएच, लैक्टेट डीहाइड्रोजनेजएमटीटी, 3-(4.5-डाइमिथाइलथियाजोल-2-वीएल)-2 .5-डिफेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड: पीबीएस, फॉस्फेट-बटरड सेलाइन एसडीएस, सोडियम डोडेसिल सल्फेट।

2.2. Eसीमांत बलकोलेजन के उत्पादन पर सीपी जेल के ect

त्वचा पर कोलेजन संश्लेषण पर सीपी जेल के प्रभाव की जांच करने के लिए, एचडीएफ का सीपी जेल के साथ इलाज किया गया। हमारे परिणामों ने प्रदर्शित किया कि CP जेल, जिसमें CP का 1-10 µg/mL था, उल्लेखनीय रूप से (p <0.01) ने टाइप I प्रोकोलेजन उत्पादन को बढ़ाकर 128.05 ± 5.19, 145.19 ± 6.80, और 150.68 कर दिया। ± 16.70 प्रतिशत, नियंत्रण उपचार (पीबीएस) (चित्रा 2ए) की तुलना में । अन्यथा, जैसा कि चित्र 2ए में दिखाया गया है, अकेले सीपी के 1 माइक्रोग्राम/एमएल के साथ इलाज किए गए एचडीएफ में प्रकार I कोलेजन उत्पादन में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं देखा गया था। जबकि सीपी अकेले कोलेजन उत्पादन पर 5-10 μg/mL (119.96 ± 3.8 और 124.77 ± 8.87 प्रतिशत) की सांद्रता पर कुछ प्रभाव डालता है, यह प्रभाव सीपी जेल के मुकाबले महत्वपूर्ण रूप से (पी <0.01) कम था।

चित्रा 2. एचडीएफ में सीपी जेल के कोलेजन-बढ़ते प्रभाव। टाइप 1 कोलेजन (ए) एमएमपी -1 (बी), और टीआईएमपी -1 (सी) पर सीपी जेल के प्रभाव को एचडीएफ में मापा गया। HDFs को 24 घंटे के लिए अकेले PBS (Con; control)CP, या CP जेल (1-10 ug/mL) से उपचारित किया गया, और प्रकार [प्रोकोलेजेन, MMP-1, और TIMP{{8} की अभिव्यक्ति }}को क्रमशः प्रोकोलेजन प्रकार आईसी-पेप्टाइड (पीआईपी) ईआईए किट, मानव एमएमपी {{10}} एलिसा किट, और आईआईएमपी -1 एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया था। पीबीएस का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य प्लस SD का प्रतिनिधित्व करते हैं। * p <0.05, ** p <0.01 बनाम PBS युक्त माध्यम बिना CP के, # p <0.05# y <0.01 बनाम अकेले CP। एचडीई, मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट; पीबीएस, फॉस्फेट-बफर खारा; एमएमपी -1 मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज -1; TIMP -1, मेटालोप्रोटीनेज -1 के ऊतक अवरोधक; ईएल आईएसए, एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख।

बाद में। CPwegel- उपचारित HDEs में कोलेजन गिरावट से जुड़े स्तरों का आकलन किया गया। हमारे परिणामों से पता चला है कि CP जेल में 1-10 ug/mL ऑफ CP महत्वपूर्ण रूप से (p <0.01) है, जो MMP-1 के स्तर को 62.88 प्लस 6.54, 59.54 प्लस 8.35, और 57.44 प्लस तक बाधित करता है। नियंत्रण एचडीएफ (पीबीएस उपचार) (चित्र 2बी) की तुलना में 7.69 प्रतिशत। जैसा कि अपेक्षित था, अकेले CP, जिसमें CP का 1-10 ug/mL था, ने भी MMP-1 के स्तर को 80.18 प्लस 2.88, 78.48 प्लस 6.19, और 79.84 प्लस 15.08 प्रतिशत तक बाधित किया, हालांकि ये प्रभाव काफी कम थे सीपी जेल की तुलना में। CP जेल से उपचारित HDFs में, 1-10 ug/mL के CP सांद्रता पर, मेटालोप्रोटीनेज (IIMP) -1 के ऊतक अवरोधक के अभिव्यक्ति स्तर, जो MMP -1 के निषेध का कारण बनता है, थे नियंत्रण उपचार (पीबीएस) (चित्रा 2सी) की तुलना में बढ़कर 113.41 प्लस 4.74, 116.76 प्लस 3.31, और 115.8 प्लस 10.13 प्रतिशत हो गया। इन परिणामों ने एक साथ सुझाव दिया कि सीपी जेल एमएमपी -1 को बाधित करके और एचडीएफ में टीआईएमपी -1 अभिव्यक्ति को बढ़ाकर टाइप I प्रोकोलेजेन उत्पादन को तेज कर सकता है। अकेले सीपी जेल और सीपी के तुलनात्मक विश्लेषण से सीपी जेल अकेले सीपी की तुलना में कोलेजन उत्पादन को प्रेरित करने में अधिक प्रभावी साबित हुआ।

2.3. Effiत्वचा की सूजन में सीपी जेल की कैसी

प्रभाव की जांच करने के लिएभड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति पर सीपी जेल की, हमने जांच की कि क्या सीपी जेल में आईएल -1 अल्फा या -6 को कम करके और आईएल -10 को बढ़ाकर या विकास कारक (टीजीएफ) को बदलकर एक विरोधी भड़काऊ भूमिका थी )-बीटा 1 एसडीएस-प्रेरित मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स (HEKs) में। पीबीएस-उपचारित कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण माना जाता था जबकि एसडीएस-उत्तेजित कोशिकाओं को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया जाता था। जैसा कि आकृति में दिखाया गया है3सीपी जेल के साथ ए, 24-एच उपचार (5µg/सीपी जेल में सीपी का एमएल) उल्लेखनीय रूप से (p < 0.01) ने आईएल -1 अल्फा और आईएल -6 की एसडीएस-प्रेरित अभिव्यक्ति को कम कर दिया। दूसरी ओर, सीपी जेल उल्लेखनीय रूप से (p < 0.01) ने आईएल -10 और टीजीएफ-बीटा 1 की एसडीएस-प्रेरित अभिव्यक्ति में वृद्धि की (चित्र3बी)। ये परिणाम एक विरोधी भड़काऊ प्रभाव का सुझाव देते हैंHEKs पर CP जेल की।

चित्रा 3. एसडीएस-उत्तेजित एचईके में सीपी जेल का विरोधी भड़काऊ प्रभाव। HEK को एक साथ 0.0015 प्रतिशत SDS और CP जेल के साथ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला काटा गया और एलिसा किट के साथ भड़काऊ कारकों के स्तर को मापा गया। प्रो-भड़काऊ कारकों, आईएल -1 अल्फा और आईएल -6 (ए), और विरोधी भड़काऊ कारकों, आईएल -10 और टीजीएफ-बीटा 1 (बी) की सापेक्ष गुना वृद्धि का पता चला था प्रायोगिक प्रक्रियाओं में वर्णित के रूप में; पीबीएस का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। सभी मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य प्लस एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। ** पी <0.01 बनाम। बिना सीपी के पीबीएस युक्त माध्यम। # पी <0.01 बनाम केवल एसडीएस-उपचारित एचईके। HEK, मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट; एसडीएस, सोडियम डोडेसिल सल्फेट; एलिसा, एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख; पीबीएस, फॉस्फेट-बफर खारा; आईएल, इंटरल्यूकिन.आईजीएफ, ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर।

2.4। इन विट्रो में सीपी जेल के त्वचा अवशोषण गुण

एंटी-एजिंग गुणों के लिए सीपी जेल के संभावित नैदानिक ​​​​अनुप्रयोग का मूल्यांकन करने के लिए, हमने सीपी जेल की त्वचा की सबसे बाहरी परत स्ट्रेटम कॉर्नियम (एससी) में अवशोषित होने और एपिडर्मिस और डर्मिस में प्रवेश करने की क्षमता की जांच की। इस पहलू को संबोधित करने के लिए, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) लेबल वाले सीपी के 5 यूजी/एमएल युक्त सीपी जेल को पुनर्निर्मित 3डी मानव त्वचा, केरास्किन@-एफटी(चित्रा 4ए) पर शीर्ष रूप से लागू किया गया था। जैसा कि चित्र 4बी में दिखाया गया है, आवेदन के 1 घंटे के बाद, एफटीसी-लेबल वाले सीपी-युक्त जेल के साथ इलाज किए गए त्वचा वर्गों ने एपिडर्मिस में एक महत्वपूर्ण हरे रंग की फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन किया, साथ ही त्वचीय ऊतक में डिफ्यूज फ्लोरेसेंस के साथ, सीपी जेल की अवशोषित होने की क्षमता का सुझाव दिया। SC में और एपिडर्मिस और डर्मिस में आंतरिक हो जाते हैं। 6 और 24 घंटे के बाद, सीपी जेल के साथ इलाज किए गए त्वचा वर्गों के एपिडर्मिस और डर्मिस में एक पशु चिकित्सक अधिक प्रमुख हरी प्रतिदीप्ति देखी गई। इसके विपरीत, कोई महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति तब नहीं देखी गई जब केवल पीबीएस को शीर्ष पर लागू किया गया था।

चित्र 4. सीपी जेल की त्वचा का इन-विट्रो में पुनर्निमित 3डी मानव त्वचा में अवशोषण, keraskin@-FI। (APBS या CP जेल (FITC-लेबल वाले CP युक्त) को keraskin@-FTB के स्ट्रेटम कॉर्नियम पर लगाया गया था) प्रतिदीप्ति छवियों ने CP जेल के अवशोषण की सीमा का प्रदर्शन किया। पीबीएस (अनुपचारित) या सीपी जेल जिसमें एफआईटीसी-लेबल सीपी शामिल है) को संकेतित अवधि के लिए शीर्ष पर लागू किया गया था। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत त्वचा के मुद्दों के जमे हुए खंड देखे गए। स्केल बार=1 मिमी

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