अरिस्टोलोचिक एसिड चूहों में रेनल फाइब्रोसिस और बुढ़ापा को प्रेरित करता है

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सार:उम्र से संबंधित विकारों के लिए गुर्दा सबसे संवेदनशील अंगों में से एक है। आम तौर पर, गुर्दे की उम्र बढ़ने के साथ वृक्क फाइब्रोसिस होता है, जो क्रोनिक . का अंतिम सामान्य मार्ग हैगुर्दा रोग. अरिस्टोलोचिक एसिड (एए), एक नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट, एए नेफ्रोपैथी (एएएन) का कारण बनता है, जो प्रगतिशील गुर्दे फाइब्रोसिस और कार्यात्मक गिरावट की विशेषता है। हालांकि वृक्क फाइब्रोसिस गुर्दे की उम्र बढ़ने के साथ जुड़ा हुआ है, क्या एए गुर्दे की उम्र बढ़ने को प्रेरित करता है यह स्पष्ट नहीं है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य गुर्दे की उम्र बढ़ने के मॉडल के रूप में एएएन के संभावित उपयोग की जांच करना है। यहाँ, हमने AA से C57BL / 6 चूहों को कालानुक्रमिक रूप से प्रशासित करके AAN मॉडल में सेनेकेंस से संबंधित कारकों की जांच की। नियंत्रणों की तुलना में, एए समूह ने उम्र बढ़ने का प्रदर्शन कियागुर्दाफेनोटाइप, जैसे कि वृक्क शोष, वृक्क कार्यात्मक गिरावट और ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल फाइब्रोसिस। इसके अतिरिक्त, एए ने विशेष रूप से में सेलुलर सिनेसेंस को बढ़ावा दियागुर्देऔर वृक्क p16 mRNA अभिव्यक्ति और सेनेसेंस से जुड़ी -गैलेक्टोसिडेज़ गतिविधि में वृद्धि हुई। इसके अलावा, एए-उपचारित चूहों ने समीपस्थ ट्यूबलर माइटोकॉन्ड्रियल असामान्यताओं के साथ-साथ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के संचय का प्रदर्शन किया। क्लोथो, एक एंटी-एजिंग जीन, में भी काफी कमी आई थीगुर्देएए-इलाज चूहों की। सामूहिक रूप से, वर्तमान अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि एए पुरानेपन से संबंधित कारकों को बदल देता है, और यह कि वृक्क फाइब्रोसिस गुर्दे की उम्र बढ़ने से निकटता से संबंधित है।

कीवर्ड:गुर्दे की पुरानी बीमारी; गुर्दे की फाइब्रोसिस; एरिस्टोलोचिक एसिड; उम्र बढ़ने; कोशिकीय जीर्णता

किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टैन्च

परिचयमनुष्यों में लगातार बढ़ती उम्र के साथ, अधिक व्यक्ति उम्र से संबंधित विकारों से पीड़ित हो रहे हैं।गुर्देआम तौर पर उम्र से संबंधित ऊतक क्षति से प्रभावित होते हैं, और पुरानी होने की घटनाओं से प्रभावित होते हैंगुर्दे की बीमारीउम्र के साथ बढ़ता है [1]। गुर्दे की उम्र बढ़ने से समग्र उम्र बढ़ने में तेजी आती है, जिसके परिणामस्वरूप कम उम्र होती है। इसलिए, गुर्दे की उम्र बढ़ने पर शोध आवश्यक है, हालांकि उपयुक्त पशु मॉडल पूरी तरह से विकसित नहीं हुए हैं। गुर्दे की उम्र बढ़ने के साथ विभिन्न रोग संबंधी परिवर्तन होते हैं, जिनमें वृक्क शोष, ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस और ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल फाइब्रोसिस [2] शामिल हैं। रेनल ट्यूबलोइंटरस्टीशियल फाइब्रोसिस प्रगतिशील वृक्क रोग के अधिकांश रूपों में अंतिम सामान्य मार्ग है, जो बताता है कि रीनल फाइब्रोसिस वृद्धावस्था के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है।गुर्दा. उम्र बढ़ने के अनुसंधान में, चूहे मनुष्यों के साथ उनकी आनुवंशिक निकटता, आनुवंशिक रूप से उनके जीनोम में हेरफेर करने की क्षमता और इस तथ्य के कारण एक विश्वसनीय उपकरण हैं कि वे अपने जीवनकाल के दौरान मनुष्यों के लिए समान उम्र बढ़ने से संबंधित फेनोटाइप पेश करते हैं [3]। इनब्रेड चूहों का उपयोग करते हुए अनुदैर्ध्य अवलोकन उम्र बढ़ने के एक मॉडल के रूप में आदर्श हैं, हालांकि चूहों को उनके पूरे जीवनकाल के लिए पालन करने में समय लगता है। इसके अतिरिक्त, उम्र बढ़ने के कई आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल हैं। क्लोथो की कमी वाला माउस समय से पहले बूढ़ा होने का एक मॉडल है जिसका उपयोग उम्र बढ़ने के अनुसंधान में किया जाता है। हालांकि, इस मॉडल में, गुर्दे का कार्य अप्रभावित रहता है, और गुर्दे के अलावा अन्य कई अंग खराब होते हैं [4]। इस प्रकार, यह माउस मॉडल गुर्दे की उम्र बढ़ने पर शोध के लिए अनुपयुक्त हो सकता है।अरिस्टोलोचिक एसिड (एए) प्रशासन एक विशिष्ट प्रकार की गुर्दे की चोट का कारण बनता है जिसे एए नेफ्रोपैथी (एएएन) के रूप में जाना जाता है, जिसे व्यापक अंतरालीय फाइब्रोसिस [5,6] की विशेषता है। एए रीनल ट्यूबलर एपिथेलियम के लिए विषाक्त है क्योंकि यह गुर्दे के ऊतकों में डीएनए व्यसनों के गठन को बढ़ावा देता है [7]। एए मूत्र प्रणाली के अलावा अन्य अंगों को प्रभावित करने की संभावना नहीं है और मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता हैगुर्दा-विशिष्ट परिवर्तन। इसलिए, एए आमतौर पर चूहों [8,9] में वृक्क फाइब्रोसिस के मॉडल स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या एए-प्रेरित परिवर्तन उम्र बढ़ने से संबंधित हैंगुर्दे. इस अध्ययन में, हमने चूहों में AAN में उम्र से संबंधित फेनोटाइप और आणविक कारकों की जांच की

परिणाम 2.1. एए प्रशासन ने महत्वपूर्ण वजन घटाने, वृक्क शोष, और गुर्दे के कार्य में गिरावट को प्रेरित कियाबेसलाइन बॉडी वेट (BW) और सिस्टोलिक ब्लड प्रेशर (BP) वाहन-नियंत्रण और AA समूहों के बीच समान थे। वाहन-नियंत्रण समूह में BW लगातार 8 सप्ताह से अधिक बढ़ा। हालांकि, एए प्रशासन द्वारा वजन बढ़ने को रोक दिया गया था, और एए प्रशासन (चित्रा 1 ए) की शुरुआत के बाद एए समूह ने 4 और 8 सप्ताह में बीडब्ल्यू को काफी कम कर दिया था। वाहन-नियंत्रण और एए समूहों (चित्रा 1बी, सी) के बीच सिस्टोलिक बीपी या हृदय गति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। हृदय भार/बीडब्ल्यू अनुपात ने एए प्रशासन (चित्रा 1डी) की शुरुआत के 8 सप्ताह बाद समूहों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया, जबकिगुर्दाएए प्रशासन (चित्रा 1ई) की शुरुआत के 8 सप्ताह बाद एए समूह में वजन/बीडब्ल्यू अनुपात काफी कम था। हमने अगली बार वाहन-नियंत्रण और एए समूहों में गुर्दे के कार्य की जांच की। एए प्रशासन की शुरुआत के 8 सप्ताह बाद वाहन-नियंत्रण समूह की तुलना में एए समूह में प्लाज्मा क्रिएटिनिन और यूरिया नाइट्रोजन (यूएन) सांद्रता काफी अधिक थी। इसके अतिरिक्त, एए प्रशासन की शुरुआत के 8 सप्ताह बाद वाहन नियंत्रण समूह की तुलना में एए उपचार ने क्रिएटिनिन निकासी को काफी कम कर दिया (चित्र 1एफ-एच)।

2.2. एए प्रशासन ने गुर्दे में फाइब्रोसिस से संबंधित जीन अभिव्यक्ति के ओवरट ट्यूबलोइंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस और महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन को प्रेरित कियाआवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) धुंधला का उपयोग करते हुए हिस्टोलॉजिकल परीक्षा से पता चला है कि वाहन नियंत्रण समूह (चित्रा 2ए) की तुलना में एए समूह में ग्लोमेरुलर क्षेत्र काफी कम हो गया था। मैसन के ट्राइक्रोम (एमटी) धुंधला का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए व्यापक ट्यूबलोइंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस, एए समूह (चित्रा 2 बी) में देखा गया था, साथ ही साथ रीनल फाइब्रोसिस-संबंधित जीन, कोलेजन I और III के एमआरएनए स्तरों के अपग्रेडेशन के साथ, और विकास कारक को बदलना ( टीजीएफ)- (चित्र 2सी-ई)।

2.3.AA प्रशासन त्वरित सेलुलर सेनेसेंस, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, और गुर्दे में प्रतिक्रिया ऑक्सी / जीन प्रजाति (आरओएस) का संचयसेल्युलर सेनेसेन्स का मूल्यांकन करने के लिए, हमने p53, p21, p16, और ग्लूटामिनेज़ (GLS) के रीनल एमआरएनए एक्सप्रेशन की जांच की।गुर्दे(चित्रा 3ए-डी)। इसके अलावा, सेनेसेंस से जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ (एसए - - गैल) में धुंधला तीव्रतागुर्देएए समूह में वृद्धि हुई थी और वाहन नियंत्रण समूह (चित्रा 3ई) में लगभग अनुपस्थित थी। एए समूह में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल क्राइस्टे, माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन, साइटोप्लाज्मिक वैक्यूलाइजेशन, और ऑटोलिसोसोम के गायब होने का खुलासा किया, जो इसके साथ सहवर्ती थे। बीसीएल2/एडेनोवायरस ई1बी 19-केडीए इंटरेक्टिंग प्रोटीन 3(बीएनआईपी3), एक माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित जीन (चित्रा 3एफजी) का डाउनरेगुलेशन। Nox2 की रीनल एमआरएनए अभिव्यक्ति। निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) ऑक्सीडेज का एक घटक, वाहन नियंत्रण समूह (चित्रा 3एच) की तुलना में एए समूह में काफी बढ़ गया था। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला कि AA समूह (चित्र 3I) में वृक्क 4-हाइड्रॉक्सी-2-नाममात्र (4-HNE) स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। इन परिणामों ने संकेत दिया कि एए प्रशासन ने सेलुलर सिनेसेंस, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और आरओएस संचय को प्रेरित कियागुर्दे।

2.4. एए ने रेनल क्लोथो प्रोटीन एक्सप्रेशन को कम कियाहमने वाहन-नियंत्रण और एए समूहों में एंटी-एजिंग प्रोटीन की गुर्दे की अभिव्यक्ति की जांच की। वाहन नियंत्रण समूह (चित्रा 4ए) की तुलना में एए समूह में क्लोथो अभिव्यक्ति काफी कम हो गई थी, जबकि निकोटीनैमाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज (एनएएमपीटी) और सिर्टुइन1 (एसआईआरटी1) के वृक्क भाव समूहों (चित्रा 4बी, सी) के बीच समान थे।

3. चर्चाहमारे ज्ञान के लिए, वर्तमान अध्ययन एएएन में गुर्दे की उम्र बढ़ने से जुड़े परिवर्तनों के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सबसे पहले है, जैसे कि पी 16 और एसए - - गैल गतिविधि। एए उपचार ने वृक्क शोष, ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल फाइब्रोसिस, और वृक्क कार्यात्मक गिरावट को बढ़ावा दिया, जो वृक्क p16 mRNA और SA - - गैल-पॉजिटिव धुंधलापन के अपगमन के साथ थे। इसके अलावा, एए समूह ने गुर्दे की उम्र बढ़ने से संबंधित तंत्र जैसे माइटोकॉन्ड्रियल असामान्यताएं, ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि, और एंटीएजिंग जीन, क्लोथो के डाउनरेगुलेशन की विशेषताओं का प्रदर्शन किया। एक साथ लिया गया, हमारी टिप्पणियों से पता चलता है कि क्रोनिक एए प्रशासन आंशिक रूप से गुर्दे की उम्र बढ़ने की नकल करता है।

सेल्युलर सेनेसेन्स विभिन्न तनावों, जैसे डीएनए क्षति के जवाब में सेल प्रसार की स्थायी गिरफ्तारी है, और उम्र बढ़ने और उम्र बढ़ने से संबंधित बीमारियों में योगदान देता है। p16 की अभिव्यक्ति, एक साइक्लिन-आश्रित किनेज अवरोधक, गुर्दे सहित विभिन्न अंगों में उम्र बढ़ने के साथ सहसंबद्ध है। कैलोरी प्रतिबंध pl6 अभिव्यक्ति [1 0] को बाधित करके जीवनकाल बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, एपी20187, एक एफके506-बाध्यकारी प्रोटीन डिमराइज़र [11] के इंजेक्शन के माध्यम से आईएनके-एटीटीएसी चूहों में सेन्सेंट कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले पी 16- का उन्मूलन, गुर्दे की उम्र बढ़ने के फेनोटाइप के क्षीणन का कारण बनता है, जैसे ग्लोमेरुलर स्केलेरोसिस और गुर्दे कार्यात्मक गिरावट। इसलिए, p16 उम्र बढ़ने से संबंधित सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक है। एसए - -गैल स्टेनिंग का उपयोग करके सेन्सेंट कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है, जो पीएच 6.0 [12] पर बढ़ी हुई-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि को प्रदर्शित करता है, और यह वृद्ध और वृद्ध कोशिकाओं का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला बायोमार्कर है। वृद्ध चूहे में pl16 की गुर्दे की mRNA अभिव्यक्ति बढ़ जाती हैगुर्देऔर वृक्क उपकला में बढ़ी हुई SA- -gal गतिविधि के साथ है [13I. वर्तमान अध्ययन में, हमने बढ़ी हुई वृक्क p16 mRNA अभिव्यक्ति और SA - - गैल-धुंधलापन का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि AA गुर्दे की शिथिलता को प्रेरित करता है। जीएलएस को हाल ही में बढ़ाया ग्लूटामिनोलिसिस और इंट्रासेल्युलर पीएच न्यूट्रलाइजेशन [14] के माध्यम से सीनेसेंट कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए आवश्यक बताया गया था। वृद्ध चूहों में जीएलएस पर निर्भर ग्लूटामिनोलिसिस के निषेध को सेन्सेंट कोशिकाओं को खत्म करने और उम्र से संबंधित अंग की शिथिलता को दूर करने के लिए दिखाया गया था। वर्तमान अध्ययन में, रीनल जीएलएस एमआरएनए के अपग्रेडेशन ने समूह में सेन्सेंट कोशिकाओं के गुर्दे के संचय का संकेत दिया। इस प्रकार, क्रोनिक एए प्रशासन ने गुर्दे में कोशिकीय जीर्णता का कारण बना।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार होगा

सेल्युलर सेनेसेन्स के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन एक आवश्यक तंत्र है जो उम्र से संबंधित ऊतक क्षति को अंतर्निहित करता है और इसके साथ आरओएस संचय [15,16] होता है। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन सेल्युलर सिनेसेंस को चलाता है और बनाए रखता है [17] जबकि सेल्युलर सेनेसेन्स सीधे माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन [18] में योगदान देता है। मुख्य रूप से बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में स्थित Bnip3, ऑक्सीडेटिव तनाव और हाइपोक्सिया के जवाब में सुसंस्कृत गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं में माइटोफैगी के नियमन में भूमिका निभा सकता है। वृद्ध चूहों में, कैलोरी प्रतिबंध ट्यूबलर कोशिकाओं में स्वरभंग को बढ़ाता है, बीनिप 3 के अपगमन के माध्यम से, और गुर्दे की क्रिया के आयु-प्रेरित अध: पतन में सुधार करता है [19]। वर्तमान अध्ययन में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने माइटोकॉन्ड्रियल असामान्यताओं की विशेषताओं का खुलासा किया जो कि वृक्क Bnip3 अभिव्यक्ति या सेलुलर सिनेसेंस में कमी से प्रभावित हो सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया आरओएस का मुख्य इंट्रासेल्युलर स्रोत हैं। वृक्क आरओएस पर माइटोकॉन्ड्रियल असामान्यताओं के प्रभावों का आकलन करने के लिए, हमने 4-HINE के वृक्क संचय की जांच की और एए-प्रेरित आरओएस संचय का प्रदर्शन कियागुर्दे।एनएडीपीएच ऑक्सीडेस आरओएस का एक प्रमुख स्रोत हैं। चूहों में AAN के तीव्र चरण के दौरान, Nox2 के वृक्क mRNA अभिव्यक्ति को ऊंचा किया गया था, और नाइट्रिक ऑक्साइड की उपलब्धता कम हो गई थी, जिसके कारण निरंतर हाइपोक्सिया और इस्किमिया [20. वृद्ध चूहे मेंगुर्दे, ROS का संचय Nox2 [21] की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के साथ है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि एए माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और एनएडीपीएच ऑक्सीडेस के अपचयन के कारण आरओएस संचय के माध्यम से उम्र से संबंधित फेनो-प्रकारों को प्रेरित कर सकता है।

एए समूह में रीनल क्लोथो जीन की अभिव्यक्ति कम हो गई थी, जबकि एनएएमपीटी और एसआईआरटीएल की अभिव्यक्ति समूहों के बीच समान थी। क्लोथो एक एंटीएजिंग जीन है जो एक सिंगल-पास ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को एनकोड करता है जो उम्र बढ़ने के शमनकर्ता के रूप में कार्य करता है। क्लोथो की कमी वाले चूहों में उम्र बढ़ने की प्रक्रिया मनुष्यों में कम उम्र, बांझपन, धमनीकाठिन्य, त्वचा शोष, ऑस्टियोपोरोसिस और वातस्फीति [22] से मिलती जुलती है। हाइपोमोर्फिक म्यूटेंट क्लोथो चूहों ने त्वरित उम्र बढ़ने के एक फेनोटाइप को भी प्रदर्शित किया, जिसे p16 एब्लेशन [23] द्वारा बहाल किया गया था। चूंकि क्लोथो उम्र बढ़ने का एक महत्वपूर्ण कारक है, क्लोथो जीन-संशोधित चूहों का व्यापक रूप से उम्र बढ़ने पर शोध में उपयोग किया गया है। हालांकि, क्लोथो जीन-संशोधित चूहे इन चूहों की प्रणालीगत उम्र बढ़ने से जुड़ी हानियों के कारण गुर्दे की उम्र बढ़ने पर शोध के लिए अनुपयुक्त हो सकते हैं और तथ्य यह है कि गुर्दे का कार्य अप्राप्य है (यानी, क्रिएटिनिन स्तर)। इसके विपरीत, एएएन माउस मॉडल का उपयोग अनुसंधान उद्देश्यों के लिए गुर्दे की उम्र बढ़ने के दवा-प्रेरित मॉडल के रूप में किया जा सकता है, क्योंकि इसके कई फायदे हैं, जैसे कि कार्यान्वयन की सापेक्ष आसानी और गुर्दे की कार्यात्मक गिरावट पर हस्तक्षेप के प्रभावों का अनुमान लगाने की क्षमता। .

वर्तमान अध्ययन की कुछ सीमाएँ थीं। हमने गुर्दे की उम्र बढ़ने का मूल्यांकन किया, मुख्य रूप से सेलुलर सिनेसेंस, माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी और उम्र बढ़ने से संबंधित जीन अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित किया। हालांकि, उम्र बढ़ने के तंत्र जटिल हैं और कम समझ में आते हैं। इसके अतिरिक्त, हालांकि एए की प्रतिक्रिया में क्लोथो जीन की अभिव्यक्ति कम हो गई थी, हम एएएन में रोग परिवर्तनों के साथ एक कारण संबंध प्रदर्शित नहीं कर सके। AAN के विकास में शामिल विभिन्न अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। फिर भी, वर्तमान अध्ययन गुर्दे की उम्र बढ़ने के एक मॉडल के रूप में अवन के उपयोग में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फेनोटाइपिक में परिवर्तन होता हैगुर्दाजीवन काल से गहरा संबंध है। हालांकिगुर्दाउम्र बढ़ने से जुड़े परिवर्तनों से आसानी से प्रभावित होता है, गुर्दे की उम्र बढ़ने का निषेध समग्र जीवनकाल को लंबा कर सकता है। इसलिए, एएएन के मॉडल का उपयोग करके गुर्दे की उम्र बढ़ने पर आगे के शोध से भविष्य में लंबी उम्र बढ़ सकती है।

4. सामग्री और तरीके4.1. जानवरोंयह अध्ययन प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था। सभी पशु प्रयोगों को योकोहामा सिटी यूनिवर्सिटी की पशु अध्ययन समिति (अनुमोदन संख्या: एफए 20-027) द्वारा अनुमोदित किया गया था और आगमन दिशानिर्देशों के अनुपालन में आयोजित किया गया था। इस्तेमाल किए गए जानवरों की संख्या और उनकी पीड़ा को कम करने के प्रयास किए गए। चूहों को 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 12-एच प्रकाश/12-एच अंधेरे चक्र के तहत नियंत्रित वातावरण में रखा गया था। चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे के संक्रमण में सुधार होगा

आठ-सप्ताह के पुरुष C57BL / 6 चूहों को चार्ल्स रिवर लेबोरेटरीज (विलमिंगटन, एमए, यूएसए) से खरीदा गया था और वाहन-नियंत्रण या एए समूहों को 1 सप्ताह के अनुकूलन के बाद सौंपा गया था, चूहों को वाहन या एए (सिग्मा) के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया था। -एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), जो थोड़ी मात्रा में डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड में भंग कर दिया गया था। वर्तमान अध्ययन से पहले, हमने कई प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रारंभिक अध्ययन किया था। पहले प्रोटोकॉल में एए (3 मिलीग्राम/किलोग्राम) से सी57बीएल/6 चूहों का प्रशासन शामिल था, जो बिना रीमॉडेलिंग समय के 4 सप्ताह के लिए सप्ताह में दो बार इंट्रापेरिटोनियल रूप से; इस प्रोटोकॉल में, एए ने तीव्र गुर्दे के घावों का कारण बना, जैसे कि ब्रश सीमा के नुकसान के साथ फैला हुआ समीपस्थ नलिकाएं (पूरक चित्रा एस 1)। दूसरे प्रोटोकॉल में, C57BL/6 चूहों को एए (2.5 मिलीग्राम/किलोग्राम) के साथ सप्ताह में एक बार 4 सप्ताह के लिए इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया था, इसके बाद 4 सप्ताह के लिए रीमॉडेलिंग समय; इन चूहों में प्लाज्मा क्रिएटिनिन था 0.19 ± {{20}}।080 मिलीग्राम/डीएल बनाम 0.18 ± 0.010 मिलीग्राम/डीएल (वाहन-नियंत्रण बनाम एए, क्रमशः; माध्य ± मानक त्रुटि (SEM), p=0।86, अयुग्मित छात्र का t-परीक्षण, n=4 प्रति समूह) और प्लाज्मा UN 31.3 ± 5.95 mg/dL बनाम था 30.4 ± 3.87 मिलीग्राम/डीएल (वाहन-नियंत्रण बनाम एए, क्रमशः; माध्य ± SEM, p=0.90, अयुग्मित छात्र का t-परीक्षण, n=4 प्रति समूह)। इसलिए, हमने निर्धारित किया कि यह प्रोटोकॉल गुर्दे की चोट के मॉडल के लिए उपयुक्त नहीं था क्योंकि एए ने महत्वपूर्ण गुर्दे की कार्यात्मक गिरावट को प्रेरित नहीं किया था। तीसरे प्रोटोकॉल में, C57BL/6 चूहों को एए (3 मिलीग्राम/किलोग्राम) के साथ अंतर्गर्भाशयी रूप से सप्ताह में दो बार 10 सप्ताह के लिए बिना रीमॉडेलिंग समय के प्रशासित किया गया था; इन चूहों में, AA समूह में मृत्यु दर 83 प्रतिशत (n=6) थी, जबकि वाहन-नियंत्रण समूह में किसी भी चूहे की मृत्यु नहीं हुई (n=4)। इस प्रोटोकॉल में, हम उच्च मृत्यु दर के कारण एए द्वारा प्रेरित वृक्क फेनोटाइप का सांख्यिकीय मूल्यांकन नहीं कर सके। चौथे प्रोटोकॉल में, C57BL/6 चूहों को 4 सप्ताह के लिए सप्ताह में दो बार इंट्रापेरिटोनियल रूप से एए (3 मिलीग्राम/किलोग्राम) के साथ प्रशासित किया गया था, इसके बाद 4 सप्ताह के लिए रीमॉडेलिंग समय; इन चूहों [9] में क्रोनिक रीनल घाव, जैसे ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल फाइब्रोसिस, और रीनल फंक्शनल गिरावट देखी गई। इसलिए, इन प्रारंभिक जांचों के परिणामों के आधार पर, हमने वर्तमान अध्ययन में प्रयोगों को करने के लिए चौथा प्रोटोकॉल अपनाया।

4.2.बीपी मापनसिस्टोलिक बीपी और हृदय गति को पहले वर्णित टेल-कफ विधि (बीपी-मॉनिटर एमके -2000; मुरोमाची किकाई कं, टोक्यो, जापान) [24,25] का उपयोग करके मापा गया था। सभी माप 9:00 और 14:00 के बीच किए गए। प्रत्येक माउस में कम से कम 10 माप किए गए, और विश्लेषण के लिए माध्य मान का उपयोग किया गया।

4.3. वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर विश्लेषण ISOGEN (निप्पॉन जीन, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके गुर्दे के ऊतकों से कुल RNA निकाला गया था, और पूरक डीएनए (cDNA) को सुपरस्क्रिप्ट I-फर्स्ट-स्ट्रैंड सिस्टम (Invitrogen, Waltham, MA, USA) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। वास्तविक समय की मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर विश्लेषण CFX96 टच रियल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड लैबोरेट्रीज, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पादों को टैक्मैन पीसीआर मास्टर मिक्स और एक कस्टम टाकमैन के साथ जोड़ा गया था। जांच (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वॉलथम, एमए, यूएसए), जैसा कि पहले बताया गया है [26]। निम्नलिखित जीनों के खिलाफ टैकमैन जांच का इस्तेमाल किया गया: कोलेजन I (एमएम 00801666_ जी 1), कोलेजन II (एमएम 01254476_ एम 1), टीजीएफ- (एमएम 01178819 एम 1), पी 53 (एमएम 00441964 जी1), पी21 ( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1) GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1), और Nox2 (Mm00627011_m1)। mRNA स्तर को निम्न के लिए सामान्यीकृत किया गया 18S राइबोसोमल आरएनए।

4.4. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण पहले वर्णित विधि [27,28] का उपयोग करके ऊतक समरूपों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। सोडियम डोडेसिल सल्फेट युक्त नमूना बफर का उपयोग करके ऊतकों से कुल प्रोटीन अर्क तैयार किया गया था। प्रत्येक नमूने की प्रोटीन सांद्रता को गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ डिटर्जेंट-संगत प्रोटीन परख किट (बायो-रेड लैबोरेट्रीज़, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) और नैनोड्रॉप वन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। मानक। ऊतक के नमूनों से समान मात्रा में प्रोटीन के अर्क को 5-20 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जैल (एटीटीओ कॉर्प, टोक्यो, जापान) पर विभाजित किया गया था। तब अलग किए गए प्रोटीन को सेमी-ड्राई ट्रांसफर सिस्टम (एटीटीओ कॉर्प, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके पॉलीविनाइलिडीन डिफ़्लुओराइड झिल्ली में स्थानांतरित किया गया था। 5 प्रतिशत स्किम-मिल्क पाउडर युक्त फॉस्फेट-बफर खारा के साथ झिल्ली को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था। मेम्ब्रेन को क्लोथो (ab 181373 1: 1000; Abcam, कैम्ब्रिज, यूके), NAMPT (sc -67020 1: 5000; Abcam), SIRT1 (07-131 1: 1000, MilliporeSigma) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लगाया गया था। , बर्लिंगटन, एमए, यूएसए), 4-HINE(MHN-100पी 1:1000; JaICA, फुकुरोई, जापान), और ग्लिसराल्डिहाइड -3- फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) (2118, 1:2000; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए)। झिल्ली को धोया गया और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। एंटीबॉडी-एंटीजन प्रतिक्रियाओं के लिए साइटों को बढ़ाया रसायनयुक्त पदार्थ सब्सट्रेट (मर्क, केनिलवर्थ, एनजे, यूएसए) का उपयोग करके देखा गया था। GAPDH का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। चेमीडॉक टच (बायो-रेड लेबोरेटरीज, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके छवियों का मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था।

4.5. ऊतकीय विश्लेषण पहले वर्णित [29] के रूप में प्रदर्शन किया गया था। चूहों से गुर्दे के ऊतकों को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया और बाद में पैराफिन में एम्बेड किया गया। पीएएस और एमटी दाग ​​के साथ धारा (4 उम मोटी) दागी गई थी। ग्लोमेरुलर क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए, प्रति माउस 50 ग्लोमेरुली को मापा और औसत किया गया। सभी छवियों को BZ -9000 माइक्रोस्कोप (कीनेस कॉर्प, ओसाका, जापान) का उपयोग करके हासिल किया गया था।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे के डायलिसिस में सुधार होगा

4.6. एसए- -अल स्टेनिंग चूहों से गुर्दे के ऊतक तेजी से जमे हुए थे और एक इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक (सकुरा फिनटेक जापान, कं, लिमिटेड, टोक्यो, जापान) में लगाए गए थे। अनुभाग -4 माइक्रोन मोटी-एक क्रायोस्टेट (एचएम 550- वीपीडी; थर्मो फिशर साइंटिफिक) और कांच की स्लाइड्स पर लगाया गया। SA - -गैल गतिविधि को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक सेनेसेंस डिटेक्शन किट (बायो विजन इंक, मिलपिटास, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। BZ-9000माइक्रोस्कोप (कीनेस कॉर्प.. 4.7.इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) का उपयोग करके नमूनों को × 100 आवर्धन पर उज्ज्वल क्षेत्र के तहत देखा गया था।इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण पहले वर्णित [3 0] के रूप में किया गया था। चूहों को आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था और पीएच 7.4 पर 0.1 mol / L फॉस्फेट बफर में हेपरिनिज्ड (5 U / mL) शारीरिक खारा और 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ दाहिने महाधमनी चाप के माध्यम से सुगंधित किया गया था। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूनों को 2 घंटे के लिए 1 प्रतिशत ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में डुबोया गया, क्रमिक रूप से इथेनॉल में निर्जलित किया गया, और एक एपोन मिश्रण में एम्बेडेड किया गया। UlItrathin वर्गों को यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट के साथ दाग दिया गया था और 80 kV (हिताची, लिमिटेड, टोक्यो, जापान) में संचालित हिताची एच -7500 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांच की गई थी। × 5000 आवर्धन पर अनुभाग देखे गए और चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरे का उपयोग करके फोटो खींचे गए।

4.8.जैव रासायनिक विश्लेषणफेड अवस्था में कार्डियक पंचर द्वारा रक्त के नमूने एकत्र किए गए। प्लाज्मा को अलग करने के लिए पूरे रक्त के नमूनों को 3000 rpm (MR -150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Japan) पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। परिणामी प्लाज्मा नमूने -80 डिग्री पर संग्रहीत किए गए थे। प्लाज्मा क्रिएटिनिन, यूएन और मूत्र क्रिएटिनिन के स्तर को हिताची 7180 ऑटोएनालाइज़र (हिताची, लिमिटेड, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके मापा गया था।

4.9. सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। अयुग्मित छात्र के एफ-परीक्षण का उपयोग वाहन-नियंत्रण और एए समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए किया गया था<0.05 was="" considered="" statistically="">

5। निष्कर्षएए प्रशासन कारणगुर्दाबुढ़ापा, ट्यूबलोइंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस और रीनल एट्रोफी के साथ। परिणाम बताते हैं कि वृक्क फाइब्रोसिस गुर्दे की उम्र बढ़ने से निकटता से संबंधित है और यह कि AAN एक के रूप में उपयोगी हो सकता हैगुर्दा-विशिष्ट उम्र बढ़ने का मॉडल।