बेंजाइलेटेड डायहाइड्रोफ्लेवोन्स और आइसोक्विनोलिन-व्युत्पन्न अल्कलॉइड्स द बार्क ऑफ डिक्लिनानोना कैलीसीना (एनोनेसी) और उनकी साइटोटोक्सिसिटी से
Mar 13, 2022
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सारडिक्लिनानोना कैलीसीना आरई फ्राइज़ जिसे "एनविरो" के नाम से जाना जाता है, ब्राजील के लिए स्थानिकमारी वाले एनोनेसी परिवार की एक प्रजाति है। एनोनेसी अमेज़ॅन पौधों से बायोएक्टिव यौगिकों की हमारी चल रही खोज में, डी.कैलिसीना की छाल की जांच शास्त्रीय क्रोमैटोग्राफी तकनीकों द्वारा की गई थी, जिसमें डी. कैलीसीना के साथ-साथ जीनस डिक्लिनानोना में पहली बार वर्णित तेरह यौगिक (अल्कलॉइड और फ्लेवोनोइड) प्राप्त हुए थे। इन पृथक यौगिकों की संरचना एमएस के साथ संयोजन में 1D/2D-NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके व्यापक विश्लेषण द्वारा स्थापित की गई थी। पृथक एल्कलॉइड की पहचान उपवर्गों से संबंधित के रूप में की गई: सरल आइसोक्विनोलिन, थाली ऑनलाइन (1); एपोर्फिन, एनोनाइन (2);ऑक्सोपोर्फिन, लिरियोडेनिन (3); बेंज़िलटेट्राहाइड्रोइसोक्विनोलिन, (एस) - (प्लस) - रेटिकुलिन (4); डिहाइड्रो-ऑक्सोनोरेटिक्युलिन (3,4-डायहाइड्रो-7-हाइड्रॉक्सी-6-मेथॉक्सी-1-आइसोक्विनोलिनिल)(3-हाइड्रॉक्सी-4-मेथॉक्सीफेनिल)-मीथेनोन)(5 );( प्लस )-1S,2R-रेटिकुलिन एनजी-ऑक्साइड (6); और (प्लस)-1एस,2एस-रेटिक्युलिन एन-ऑक्साइड (7);टेट्राहाइड्रो प्रोटोबेरबेरीन, कोरेक्सिमाइन(8); और पावाइन, बिस्नोरार्गेमोनिन (9)। जबflavonoidsबेंजाइलेटेड से संबंधित हैंडाइहाइड्रोफ्लेवोन्स, isorhamnetin (10), dichamanetin (11), और uvarinol (12) और isouvarinol (13) का मिश्रण। यौगिक 5 को साहित्य में पहली बार प्राकृतिक उत्पाद के रूप में वर्णित किया गया है। मुख्य पृथक यौगिकों की साइटोटोक्सिक गतिविधि का मूल्यांकन कैंसर और गैर-कैंसर सेल लाइनों के खिलाफ किया गया था। परीक्षण किए गए यौगिकों में, सबसे आशाजनक परिणाम बेंजाइलेटेड डाइहाइड्रोफ्लेवोन्स डिचामानेटिन (10), और यूवरिनोल (12) और आइसोवरिनोल (13) के मिश्रण के लिए पाए गए, जो परीक्षण के खिलाफ मध्यम साइटोटोक्सिक गतिविधि प्रस्तुत करते हैं।कैंसर कोशिकारेखाएं (<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I)। Dichamanetin (11) ने HL-60 और HCT116 के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि दिखाई, जिसमें IC50 का मान 15.78 ug·mL-I (33.70 umol·LI) और 18.99 ug∶mL-（40.56 umol था। एल-）, क्रमशः जबकि यूवरिनोल-12） और आइसोवरिनोल (13) के मिश्रण ने एचएल -60 के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि का प्रदर्शन किया, जिसमें IC5 मान 9.74 ugs.mL-1, और HCT116, IC50 के साथ है। 17.31 का मूल्य ug. एमएल-I। इन साइटोटोक्सिक गतिविधियों को इन अणुओं में मौजूद एक या एक से अधिक हाइड्रॉक्सी बेंजाइल समूहों की उपस्थिति के साथ-साथ उस स्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जिसमें ये समूह जुड़े हुए हैं। रेटिक्युलिन, एनोनाइन और लिरियोडेनिन की साइटोटोक्सिक गतिविधियां पहले स्थापित की जा चुकी हैं, जिसमें लिरियोडेनिन सबसे शक्तिशाली यौगिक है।
कीवर्ड: डिक्लिनानोना कैलिसीना; एल्कलॉइड और बेंजाइलेटेड डायहाइड्रोफ्लेवोन्स; साइटोटोक्सिक गतिविधि
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1 परिचय
Annonaceae उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय पेड़ों और झाड़ियों का एक बड़ा परिवार है, जिसमें लगभग 112 पीढ़ी और 2440 प्रजातियां शामिल हैं। कई प्रजातियां अपने खाद्य फलों और औषधीय गुणों के लिए जानी जाती हैं] 2]। एनोनेसी की कुछ प्रजातियों के साथ पिछले फाइटोकेमिकल जांच ने माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के विभिन्न वर्गों के अलगाव और लक्षण वर्णन का नेतृत्व किया, जैसे कि मोनोटेरपेन्स, डाइटरपेन्स, ट्राइटरपेन्स, लिग्नांस,flavonoids, एसारोन-व्युत्पन्न फेनिलप्रोपेनोइड्स, एसिटोजिनिन, और मुख्य रूप से विशिष्ट आइसोक्विनोलिन-व्युत्पन्न एल्कलॉइड [3-7]। एनोनेसी प्रजातियों से पृथक इन माध्यमिक चयापचयों में से कुछ ने महत्वपूर्ण जैविक गतिविधियों का प्रदर्शन किया, जैसे कि विरोधी भड़काऊ और यूरिया-अवरोधक गुण [8,9], ट्रिपैनोसाइडल [10,11], लीशमैनिसाइडल [11,12], मलेरिया-रोधी [4,13] , रोगाणुरोधी [4,14,15], एंटीऑक्सिडेंट और आमवाती क्रिया [9,15] और, विशेष रूप से, विभिन्न मानव ट्यूमर सेल लाइनों के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि [4,6,11,16-21]।
हालांकि एनोनेसी परिवार को एक आदिम और अच्छी तरह से अध्ययन किया जाने वाला परिवार माना जाता है, लेकिन इसकी प्रजातियों के साथ कुछ फाइटोकेमिकल और/या औषधीय अध्ययन किए गए हैं। फाइटोकेमिकल और/या फार्माकोलॉजिकल अध्ययनों ने मुख्य रूप से जेनेरा एनोना, असिमिना और कैनंगा की प्रजातियों पर उनके महान आर्थिक महत्व के कारण, और जेनेरा डुगुएटिया, ग्वाटेरिया, और ज़ाइलोपिया की कुछ प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित किया है। पिछले 20 वर्षों में फाइटोकेमिकल और फार्माकोलॉजिकल अध्ययनों के संबंध में महान वृद्धि के बावजूद, बड़ी संख्या में मान्यता प्राप्त प्रजातियों के संबंध में जांच की गई प्रजातियों की संख्या अभी भी बहुत कम है। वर्तमान में, वेब ऑफ साइंस, स्कोपस, और साइंसफाइंडर वैज्ञानिक डेटाबेस के अनुसार, वर्णित एनोनेसी प्रजातियों में से केवल 15 प्रतिशत के पास कोई भी संबंधित फाइटोकेमिकल और / या औषधीय अध्ययन है।
कम अध्ययन वाली प्रजातियों में डिक्लिनानोना डायल्स जीनस से संबंधित हैं। यह जीन सबफ़ैमिली एनोनोइडाई के जनजाति एनोनी से संबंधित है, और केवल उष्णकटिबंधीय दक्षिण अमेरिका (मुख्य रूप से अमेज़ॅन क्षेत्र में) में होता है। यह केवल तीन प्रजातियों से युक्त एक जीनस है, डिक्लिनानोना कैलिसीना (डायल्स) आरई फ्राइज़ डिक्लिनानोना मैटोग्रोसेंसिस मास और डिक्लिनानोना टेस्मान्नी डायल्स, जो पेड़ों के रूप में होते हैं [22-24]। डी.कैलिसीना (समानार्थी ज़ुलोपिया कैलीसीना डायल्स) एक 8 से 30 मीटर लंबा पेड़, जिसे "एनविरेरा" और "एनविरो" के नाम से जाना जाता है, ब्राजील, पेरू और वेनेजुएला में अमेज़ॅन बेसिन में वितरित किया जाता है [23]। डी.कैलिसीना सतही तौर पर ज़ायलोपिया के समान है, क्योंकि इसके फूल लम्बी और संकरी पंखुड़ियाँ हैं, लेकिन यह इसकी लकड़ी, इंडिसेंट, ग्लोबोज़ और मोटी दीवार वाले मोनोकार्प्स [23,24] के लिए अलग है।
डी. कैलीसीना के साथ पिछला अध्ययन केवल औषधीय अध्ययनों की रिपोर्ट करता है। पहला अध्ययन जेल-प्रसार विधि [25] का उपयोग करके सूक्ष्मजीवों माइकोबैक्टीरियम स्मेग्मैटिस, एस्चेरिचिया कोलाई, स्ट्रेप्टोकोकस सेंगिस, स्ट्रेप्टोकोकस ओरलिस, स्टैफिलोकोकस ऑरियस और कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ मेथनॉलिक, क्लोरोफॉर्म और जलीय अर्क की रोगाणुरोधी गतिविधि की जांच का वर्णन करता है। दूसरा एक कार्बनिक (डाइक्लोरोमेथेन: मेथनॉल 1: 1) की रोगाणुरोधी गतिविधि की जांच की रिपोर्ट करता है और माइक्रोडायल्यूशन ब्रोथ परख (एमडीबीए) और डिस्क डिफ्यूजन परख (डीडीए) [26] का उपयोग करके सूक्ष्मजीव एंटरोकोकस फ़ेकलिस के खिलाफ जलीय अर्क। इस प्रकार, अमेज़ॅन वर्षावन से एनोनेसी से नए जैव सक्रिय प्राकृतिक उत्पादों की हमारी निरंतर खोज में, इस अध्ययन का उद्देश्य डी.कैलिसीना की छाल के फाइटोकेमिकल और औषधीय गुणों की जांच करना है। इस रिपोर्ट में, तेरह यौगिकों (नौ अल्कलॉइड और चार बेंजाइलेटेडडाइहाइड्रोफ्लेवोन्स) को पहली बार डी.कैलिसीना के साथ-साथ जीनस डिक्लिनानोना में अलग किया गया और पहचाना गया। इसके अलावा, मुख्य यौगिकों की साइटोटोक्सिसिटी की जांच बी16-F10, HepG2, K562, और HL{{ के खिलाफ की गई थी। 4}} अलामर ब्लू परख का उपयोग कर ट्यूमर सेल लाइन्स।
2. परिणाम और चर्चा
2.1.यौगिकों की संरचनात्मक व्याख्या
ड्रैगेंडॉर्फ के अभिकर्मक का उपयोग करके मेथनॉलिक अर्क में नाइट्रोजन युक्त यौगिकों की उपस्थिति का पता लगाने के बाद, इसे कोस्टा एट अल की पद्धति के अनुसार एसिड-बेस उपचार के अधीन किया गया था। [12] जिसके परिणामस्वरूप क्षारीय और तटस्थ अंश होते हैं। क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण के अधीन अल्कलॉइडल अंश में नाइट्रोजन युक्त यौगिकों की एक उच्च सांद्रता देखी गई थी। क्रमिक क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण, जैसा कि निष्कर्षण और अलगाव खंड में वर्णित है, ने तेरह रासायनिक घटकों (1-13, चित्र 1), नौ आइसोक्विनोलिन-व्युत्पन्न एल्कलॉइड 1-9, और चार बेंजाइलेटेड डायहाइड्रोफ्लेवोन्स के अलगाव और पहचान का नेतृत्व किया। 10-13. इन पृथक यौगिकों (चित्रा 1) की संरचनाओं को एमएस (सप्लीमेंट्री डेटा) के साथ संयोजन में 1डी और 2डी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके व्यापक विश्लेषण द्वारा स्थापित किया गया था, साथ ही साथ साहित्य से डेटा की तुलना भी की गई थी।
यौगिक 5 को भूरे रंग के अनाकार पाउडर के रूप में प्राप्त किया गया था और ड्रैगेंडॉर्फ के अभिकर्मक के लिए सकारात्मक परीक्षण किया गया था। इसने आणविक सूत्र C18H1NO5 के साथ LR-ESI (plus) MS-संगत में m/z328 [M plus H]' पर एक प्रोटोनेटेड अणु दिखाया। 5 (तालिका 1) के एच और 13सी-एनएमआर स्पेक्ट्रा रेटिकुलिन (4) [27] के अनुरूप थे, नाइट्रोजन-बंधित मिथाइल समूह (सीएच 3- एन) की अनुपस्थिति को छोड़कर और के संकेत स्थिति 1 में मिथाइन समूह, जिसे बीसी 192.8 पर कार्बोनिल समूह से संयुग्मित इमाइन समूह के विशिष्ट 13C-NMR स्पेक्ट्रम में δc 165.1 पर एक संकेत द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। 'H-NMR स्पेक्ट्रम में, तीन डाउनफील्ड हाइड्रोजन्स δH 6.88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} पर हैं। }.0हर्ट्ज, एच-2'）और एच 7.60（1एच, डीडी, जे=8.4 और 2.0 हर्ट्ज, एच-6'） , एक ABX युग्मन प्रणाली की उपस्थिति का पता चला। 6H 6.90(1H,s, H-8) और 6.71(1H, s, H-5) पर दो सिंगलेट संकेतों ने 1,2,4,5-टेट्रासबस्टिट्यूटेड फिनाइल रिंग की उपस्थिति का संकेत दिया। इसके अलावा, 5 के H-NMR स्पेक्ट्रम ने bH 3.93 (3H, s) और 6H 3.95 3H, s） पर गूंजने वाले दो मेथॉक्सी समूहों के लिए संकेत भी दिखाए, और δμ 2.79（2H, t पर प्रतिध्वनित दो मेथिलीन समूहों के लिए संकेत, J=7.8 Hz） और 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), क्रमशः H-4 और H-3 के लिए जिम्मेदार हैं (तालिका 1) . इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि अल्कलॉइड 5 में एक बेंज़िलटेट्राहाइड्रोइसोक्विनोलिन कंकाल [28-30] है।
ये समूह HMBC-NMR प्रयोग (चित्र 2 और तालिका 1) से दो और तीन-बंध 'H-13सहसंबंध मानचित्र के आधार पर स्थापित किए गए थे। इस विश्लेषण से पता चला कि H 3.89 H-3） पर हाइड्रोजन ने 6c130.1（4a） और δc165 पर कार्बन के साथ तीन-बैंड 'H-13C सहसंबंध दिखाया।{ {42}}（C-1）और दो-बंध lH-13C कार्बन atδc 25.4(C-4) के साथ सहसंबंध, अणु में imine समूह की उपस्थिति की पुष्टि करता है। दूसरी ओर, H 7.57 H-2'） और δH 7.60（H-6'） पर संकेतों ने c 124.3（ पर कार्बन के साथ तीन-बंध lH-13C सहसंबंध दिखाया। सी-6'）,5c 151,4（C-4'）और δc192.8（C-7）,and5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') और c 192.8(C-7'), क्रमशः अणु में कार्बोनिल समूह की स्थापना करते हैं (चित्र 2 और तालिका 1)। इसलिए, इन एनएमआर डेटा के आधार पर, यौगिक 5
बेंज़िलटेट्राहाइड्रोइसोक्विनोलिन एल्कलॉइड 34-डायहाइड्रो-7-हाइड्रॉक्सी-6-मेथॉक्सी-1-आइसोक्विनोलिनिल)(3-हाइड्रॉक्सी-4-मेथॉक्सीफेनिल)-मेथेनोन के रूप में स्थापित किया गया था, जो था डीहाइड्रो-ऑक्सोनोरेटिक्युलिन नाम दिया गया है। इस अल्कलॉइड को साहित्य में पहली बार प्राकृतिक उत्पाद के रूप में वर्णित किया गया है। इसका पहला और एकमात्र रिकॉर्ड डोरनेई एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। 1982 में 31】 सिंथेटिक मूल के उत्पाद के रूप में। केवल 'H-NMR डेटा को कुछ अनिर्धारित बहुलताओं के साथ वर्णित किया गया है। इस प्रकार, सभी 1H- और 13C-NMR रासायनिक पारियों के लिए पूर्ण असाइनमेंट एक-बॉन्ड (HSOC) और दो और तीन-बॉन्ड (HMBC) 'H-13C-NMR सहसंबंध प्रयोगों द्वारा स्थापित किए गए थे, और इनका वर्णन किया गया था तालिका एक।
यौगिकों 6 और 7 की पहचान क्रमशः बेंज़िलटेट्राहाइड्रोइसोक्विनोलिन एल्कलॉइड (प्लस) -1 एस, 2 आर-रेटिक्युलिन-एन-ऑक्साइड, और (प्लस) -1 एस, 2 एस-रेटिक्युलिन-एन-ऑक्साइड के रूप में की गई थी। इन एल्कलॉइड के एच-एनएमआर डेटा की तुलना ली एट अल द्वारा वर्णित डेटा से की गई थी। [28] एक ही ड्यूटेरेटेड सॉल्वेंट (CD3OD) का उपयोग करते हुए और कुछ विसंगतियां देखी गईं (तालिका 1), मुख्य रूप से H-1, H-8, और H, C-NO के संबंध में। साहित्य में इन एल्कलॉइड के लिए वर्णित कोई 13सी-एनएमआर डेटा नहीं है। सीमित 1H- और 13C-NMR डेटा के साथ-साथ इन अणुओं के लिए देखी गई अस्पष्टताओं के आधार पर, 'H और 13C 1D और 2D NMR प्रयोग उनके सही असाइनमेंट और बहुलता को निर्धारित करने के लिए किए गए थे।
दोनों समावयवों 6 और 7 के हाइड्रोजन H{0}} और H-1 की सही स्थिति HMBC से तीन-बंध 'H-13C सहसंबंध मानचित्र के आधार पर स्थापित की गई थी। -एनएमआर प्रयोग चित्रा2）। समावयवी 6 के लिए विश्लेषण से पता चला कि H 5.78（H-8 पर हाइड्रोजन ने तीन-बंध 'H-13C को कार्बन के साथ 6c 79.8（C-1）,δc120 पर सहसंबंध दिखाया। .6（4a）, और δc 149.4 C-6）, जबकि δH 4,13 （H-1 पर हाइड्रोजन ने कार्बन के साथ तीन-बंध 'H-13C सहसंबंध दिखाया। c 60.7（C-3）,6c 115.7 （C-8）,δc 120.6（C-4a）, और 131.2 C-1'） पर, इस प्रकार स्थापित करना आइसोमर 6 के लिए हाइड्रोजन H-8 और H-1 की सही स्थिति। इस विशेषता की पुष्टि δH 6.76（H-5） पर हाइड्रोजन के विश्लेषण से की जा सकती है, जिसमें तीन-बंध दिखाया गया था। H-13C 27.0（C-4）c,δc 127.1（C-8a）, और δc 145.7 C-7）（चित्र2） पर कार्बन के साथ सहसंबंध। आइसोमर7 के लिए विश्लेषण से पता चला कि H 6.30 H-8 पर हाइड्रोजन ने तीन-बंध 'H-13c 79.4（C-1）,δc 122.8（ पर कार्बन के साथ सहसंबंध दिखाया। 4a）, और δc 148.9 C-6）, जबकि H 4.46 H-1） पर हाइड्रोजन ने c 62.9 C पर कार्बन के साथ तीन-बंध H-13C सहसंबंध दिखाया। {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a）, और 131.4（C-1'）, इस प्रकार हाइड्रोजन एच की सही स्थिति स्थापित करता है आइसोमर 7 के लिए -8 और H-1। इस विशेषता की पुष्टि δH 6.71 H-5） पर हाइड्रोजन के विश्लेषण से भी हुई, जिसमें तीन-बंध lH-13C दिखाया गया था। δc26.3（C-4）, δc 126.9（C-8a）, और6c 146.1（C-7）(चित्र 2) पर कार्बन के साथ सहसंबंध। NOESY प्रयोग भी आइसोमर्स6 और 7 की सही स्टीरियोकेमिस्ट्री स्थापित करने के लिए किया गया था। इस प्रयोग में, H-1（δH 4.13） और H, CN(5 3.15) के मजबूत NOE सहसंबंध ने संकेत दिया आइसोमर 6. में ऑक्सीजन का -ओरिएंटेशन। दूसरी ओर, एच-1(6H 4.46) और HAC-N(5H 3.20) के बीच कोई स्पष्ट NOE सहसंबंध 7 के लिए 2D-NOESY प्रयोग में नहीं पाया जा सका। आइसोमर 7 (चित्रा 2) में ऑक्सीजन के -ओरिएंटेशन को दर्शाता है। इन आइसोमर्स के रासायनिक बदलावों में ये छोटे अंतर स्पष्ट रूप से ऑक्सीजन की स्थिति और स्थिति से प्रभावित नाइट्रोजन की स्टीरियोकेमिस्ट्री के कारण देखे जाते हैं। यौगिक 6 और 7 के लिए प्राप्त एच-और 13सी-एनएमआर डेटा की तुलना हेक्सापेटालाइन ए और हेक्सापेटालाइन बी [30] जैसी करीबी संरचनाओं वाले अणुओं के डेटा से अस्पष्टता के बिना तालिका 1 में वर्णित डेटा का समर्थन करते हैं।
यौगिकों 1-4 और 8-13 की पहचान थैलिफोलिन (1) [32], एनोनाइन (2) [33]लिरियोडेनिन (3)[10,34], (एस)-( प्लस )-रेटिक्युलिन के रूप में की गई थी ( 4)[27], कोरेक्सिमाइन (8) [34,35], बिस्नोरार्गेमोनिन (9) [36], आइसोचमैनेटिन (10) [37], डाइचामानेटिन (11) [37] और यूवरिनोल (12) और आइसोवरिनोल का मिश्रण (13) [37] उनके स्पेक्ट्रोस्कोपिक प्रोफाइल और साहित्य में मूल्यों के साथ तुलना के आधार पर। एलएच-और 13सी 1डी और 2डी-एनएमआर स्पेक्ट्रा, साथ ही सभी पृथक यौगिकों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा, पूरक सामग्री के रूप में उपलब्ध हैं।
एक कीमोफेनेटिक (प्लांट केमोसिस्टमैटिक्स/प्लांट केमोटैक्सोनॉमी के लिए एक नया शब्द) के दृष्टिकोण से, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सी-बेंजाइलेटेड फ्लेवोनोन्स और सी-बेंजाइलेटेड डाइहाइड्रोक्लोन की उपस्थिति एक विशेष प्रकार के फ्लेवोनोइड्स हैं जो प्रसिद्ध फ्लेवनोन पिनोसेम्ब्रिन से प्राप्त होते हैं। और विशेष रूप से एनोनेसी परिवार [3,38-42] से संबंधित यूरिया जीनस की प्रजातियों में वर्णित किया गया है। डी. कैलीसीना में इन यौगिकों की उपस्थिति उओरिया के साथ घनिष्ठ केमोफेनेटिक संबंधों का सुझाव देती है। दूसरी ओर, पौधे के अन्य भागों के साथ-साथ डाइक्लिनानोना की अन्य प्रजातियों के साथ इस कीमोफेनेटिक संबंध की पुष्टि करने के लिए आगे की जांच की जानी चाहिए। फ्लेवनोन और चेल्कोन उच्च पौधों में व्यापक हैं, लेकिन बेंजाइल समूहों का जोड़ काफी दुर्लभ है और ऐसा लगता है कि एनोनेसी में जीनस उओरिया [3, 39-42] और अब जीनस डिक्लिनानोना तक सीमित है। बेंज़िल समूह संभवतः C6-C1 पथ-मार्ग से उत्पन्न होते हैं, लेकिन o-हाइड्रॉक्सी कार्यक्षमता असामान्य है। उओरिया और डिक्लिनानोना के इन सभी फ्लेवोनोइड्स में बी-रिंग में प्रतिस्थापन की अनुपस्थिति को पोपोविया फूलगोभी [38] के फ्लेवोनोइड्स से संबंधित पिछले अवलोकन से जोड़ा जा सकता है।
इस काम में पृथक और वर्णित आइसोक्विनोलिन-व्युत्पन्न एल्कलॉइड पहले से ही विभिन्न प्रजातियों में एनोनेसी की कई प्रजातियों में पंजीकृत किए जा चुके हैं। इनमें से कुछ, जैसे कि लिरियोडेनिन और एनोनाइन, को कीमोफेनेटिक मार्कर माना जाता है, और डी.कैलिसीना में इन अल्कलॉइड्स की उपस्थिति एनोनेसी परिवार [5-7,15,20,27, में इन कीमोफेनेटिक मार्करों के संबंध को और मजबूत करती है। 33-35,43]।
यह उल्लेखनीय है कि, ज़िडोर्न [44] के अनुसार, कीमोफेनेटिक अध्ययनों को किसी दिए गए टैक्सोन में विशेष माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की सरणी का वर्णन करने के उद्देश्य से अध्ययन के रूप में परिभाषित किया गया है, जैसा कि पहले से ही कई प्रकाशित कार्यों [5-7, 15,20 में देखा गया है। ,27,33-35,43-46]। इस प्रकार, कीमोफेनेटिक अध्ययन, संरचनात्मक, रूपात्मक, और कैरियोलॉजिकल दृष्टिकोणों के समान, कर के फेनेटिक विवरण में योगदान करते हैं, जिन्हें पहले से ही "प्राकृतिक" प्रणालियों की स्थापना के लिए बहुत महत्व के रूप में मान्यता दी गई है, और जो कि अत्यधिक महत्व के बने हुए हैं। आधुनिक आणविक विधियों की सहायता से वर्गीकृत जीवों का विवरण [44]।
2.2. साइटोटोक्सिक परख
यौगिकों 2, 3,5, और 8 (उनकी कम उपज के कारण) को छोड़कर, पृथक यौगिकों (तालिका 2) की इन विट्रो साइटोटोक्सिक गतिविधि का मूल्यांकन किया गया थाकैंसर कोशिकालाइन्स HL-60 (मानव प्रोमायलोसाइटिक ल्यूकेमिया), MCF-7(मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा), HepG2 (मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा), HCT116 (मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा), और गैर-कैंसर कोशिका रेखा MRC{{5} }(मानव फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट) ऊष्मायन के 72 घंटे के बाद अलमर नीले परख का उपयोग कर रहे हैं।
Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1)। Dichamanetin (11) ने HL-60 और HCT116 के खिलाफ IC50 के मान 15.78 ug·mL-1（33.70 μmol·L-1 के साथ साइटोटोक्सिक गतिविधि दिखाई। और 18.99 ug·mL-1（40.56 umol.L-1）, क्रमशः। Uvarinol (12) और isouvarinol (13) के मिश्रण ने HL -60 के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि का प्रदर्शन किया, जिसका ICs0 मान 9.74ug∶mL -1 है, और HCT116, ICs0 मान 17.31 ug∶mL के साथ -60 है। {30}}। बेंजाइलेटेड डाइहाइड्रोफ्लेवोन्स के बीच, केवल आइसोरहैमनेटिन (10) ने हेपजी2 के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि को दिखाया, जिसका आईसी 50 मान 19.79 ugs:mL-1(54.65 umol.L-1) है। साहित्य के अनुसार, बेंजाइलेटेड डाइहाइड्रोफ्लेवोन्स को साइटोटोक्सिक गुणों [39-42] के साथ वर्णित किया गया है। इस काम में वर्णित लोगों में, isorhamnetin (10), dichamanetin (11), और uvarinol (12) को इन विट्रो साइटोटोक्सिक गुणों के भीतर वर्णित किया गया है, जो नासॉफिरिन्क्स (KB) और P -388 लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया के मानव ट्यूमर सेल लाइनों के खिलाफ हैं। (PS) IC50 मानों के साथ 5.3 और 4.1,4.8 और 1.8, और 5.9 और 9.7, ug.mL-1, क्रमशः [39,40]। इन विभिन्न गतिविधियों को अणुओं में मौजूद एक या एक से अधिक हाइड्रॉक्सी बेंजाइल समूहों की उपस्थिति के साथ-साथ उस स्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जिसमें ये समूह जुड़े हुए हैं। हालांकि, इस अवलोकन की पुष्टि के लिए आगे की जांच की जरूरत है।
मेनेजेस एट अल द्वारा हाल ही में आइसोक्विनोलिन-व्युत्पन्न एल्कलॉइड एनोनाइन (2), लिरी-एडेनिन (3), और (एस)-(प्लस)-रेटिकुलिन (4) की इन विट्रो साइटोटोक्सिक गतिविधि का वर्णन किया गया है। }}], सूजा एट अल। [6] और कोस्टा एट अल। [43] लिरियोडेनिन पर जोर देने के साथ, जिसने कैंसर सेल लाइनों बी के खिलाफ शक्तिशाली साइटोटोक्सिक गतिविधि का प्रदर्शन किया {{1 0}} एफ 1 0 (माउस मेलेनोमा), हेपजी 2 (मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा), एचएल {{13 }} (मानव प्रोमायलोसाइटिक ल्यूकेमिया), और K562 (मानव क्रोनिक मायलोसाइटिक ल्यूकेमिया） IC5s0 मान के साथ 10.0 μmol.L-1【43】। Anonaine ने B16-F10, HepG2, HL60 के खिलाफ मध्यम गतिविधि दिखाई। , और K562 19.0 umol.L-1[20] से कम के IC50 मानों के साथ। (S)-( plus )-Reticuline ने केवल HepG2 के खिलाफ मध्यम गतिविधि दिखाई, जिसमें IC50 मान 15.35 μmol L-1【 था। 6,20】.
3. सामग्री और तरीके
3.1. सामान्य प्रायोगिक प्रक्रियाएं
मेथनॉल (MeOH) में ऑप्टिकल घुमाव 589 एनएम पर एक P {{0}} पोलिमीटर (जैस्को, टोक्यो, जापान) के साथ दर्ज किए गए थे। CDCl में 1D और 2D NMR प्रयोग प्राप्त किए गए। (क्लोरोफॉर्म-डी) या सीडीसीएल प्लस ड्रॉप ऑफ सीडी, ओडी (मेथनॉल-डु, और सीडी, सीओसीडी3 (एसीटोन-डी6) 298 K पर एक AVANCE I एचडी एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर (ब्रूकर, बिलरिका, एमए, यूएसए) पर 11.75 टी पर काम कर रहा है। (क्रमशः 500 और 125 मेगाहर्ट्ज पर हाथ 13C) और ब्रूकर एवेंस I 6 पर 0 0 NMR स्पेक्ट्रोमीटर 14.1 T('H and13Cat 60{ पर काम कर रहा है {63}} और 15 0 मेगाहर्ट्ज क्रमशः)। सभी एलएच- और 13 सी-एनएमआर रासायनिक बदलाव पीपीएम में टेट्रामेथिलसिलेन सिग्नल के सापेक्ष 0. 00 पीपीएम पर आंतरिक संदर्भ के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, और युग्मन स्थिरांक (D) Hz में दिए गए हैं। NMR स्पेक्ट्रोमीटर एक z-ग्रेडिएंट के साथ 5-mm मल्टीन्यूक्लियर इनवर्स डिटेक्शन जांच (1D और 2D NMR प्रयोग) से लैस था। एक-बॉन्ड (HSQC) और दो और थ्री-बॉन्ड (HMBC)1H-13C-NMR सहसंबंध प्रयोगों को औसत युग्मन स्थिरांक' JcH और LRJ (क्रमशः 140 और 8 Hz के cH) के लिए अनुकूलित किया गया था। कम-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) विश्लेषण के लिए पृथक यौगिकों के नमूनों को मेथनॉल (एचपीएलसी ग्रेड) में फिर से निलंबित कर दिया गया, जिससे स्टॉक का निर्माण हुआ के समाधान (1 मिलीग्राम · एमएल -1)। स्टॉक सॉल्यूशंस के एलिकोट्स (5 uL) को आगे 5 ug·mL तक पतला किया गया और इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण से लैस ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर, मॉडल TSO क्वांटम एक्सेस (थर्मो साइंटिफिक, सैन जोस, सीए, यूएसए) में प्रत्यक्ष जलसेक द्वारा विश्लेषण किया गया। (ईएसआई) या वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनीकरण (एपीसीआई) स्रोत। ईएसआई-एमएस की स्थिति: स्प्रे वोल्टेज, 5kV; म्यान गैस, 10 मनमानी इकाई (arb); सहायक गैस, 5arb; स्वीप गैस, 0arb; केशिका अस्थायी, 250 डिग्री; केशिका वोल्टेज, 40 वी; ट्यूब लेंस, 70 वी; मास रेंज, एम/जेड 100 से 1000। एपीसीआई-एमएस की स्थिति: डिस्चार्ज करंट, 5 μA; वेपोराइज़र तापमान, 350 डिग्री; म्यान गैस का दबाव, 25 मनमानी इकाई arb）; आयन स्वीप गैस का दबाव, 0.0 अरब; ऑक्स गैस का दबाव, 10 अरब; केशिका तापमान, 250 डिग्री सेल्सियस; ट्यूब लेंस ऑफसेट, 70 वी; स्किमर ऑफ़सेट, 0 वी; मास रेंज, एम/जेड 100 से 1000। आर्गन को टक्कर गैस के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा को 25 से 30 ईवी तक की टक्कर ऊर्जा का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। कॉलम क्रोमैटोग्राफी (सीसी) के लिए सिलिका जेल 60 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सैन लुइस, एमओ, यूएसए, 70-230 मेष) का उपयोग किया गया था, जबकि सिलिका जेल 60 एफ 254 (माचेरी-नागेल, ड्यूरेन, जर्मनी, 0.25 मिमी, एल्यूमीनियम) पतली लेवर क्रोमैटोग्राफी (पीटीएलसी) (माचेरी-नागेल, 1.00 मिमी, ग्लास) के साथ विश्लेषणात्मक और प्रारंभिक के लिए इस्तेमाल किया गया था। यूवी254/365 प्रकाश के तहत एक्सपोजर द्वारा यौगिकों की कल्पना की गई थी, पी-एनिसल्डिहाइड अभिकर्मक के साथ छिड़काव करके और एक गर्म प्लेट पर गर्म करके, और ड्रैगेंडॉर्फ के अभिकर्मक का छिड़काव करके।
3.2.संयंत्र सामग्री
वर्तमान जांच में, डी.कैलिसीना की वनस्पति सामग्री (छाल) 27 मई 2017 को एडॉल्फो डक रिजर्व (भौगोलिक निर्देशांक: 02 डिग्री 53'36.1 एस और 59 डिग्री 58'28.9 "डब्ल्यू), मनौस, अमेज़ॅनस राज्य पर एकत्र की गई थी। , ब्राज़ील, और प्रोफेसर डॉ. एंटोनियो कार्लोस वेबर द्वारा पहचाना गया, जो यूनिवर्सिडेड फ़ेडरल डू अमेज़ॅनस (DB/UFAM) के जीव विज्ञान विभाग के एक प्लांट टैक्सोनोमिस्ट हैं। एक वाउचर नमूना संख्या 10,810 DB/UFAM के हर्बेरियम में जमा किया गया था। एक्सेस (नमूना) को सिस्तेमा नैशनल डी गेस्टाओ डो पैट्रिमोनियो जेनेटिको ई डू कॉन्हेसीमेंटो ट्रेडिशनल एसोसिएडो (SISGEN) में रिकॉर्ड A70EDCD के साथ पंजीकृत किया गया था।
3.3. निष्कर्षण और अलगाव
D.calycina की छाल को शुरू में 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सुखाया गया और फिर 40 डिग्री के तापमान पर 48 घंटे के लिए एक एयर-सर्कुलेटिंग ओवन में सुखाया गया, और बाद में चार-चाकू मिल ग्राइंडर (Marconi, Piracicaba, SP) में चूर्णित किया गया। , ब्राजील) पाउडर सामग्री (1340 ग्राम) प्राप्त करने के लिए। फिर, हेक्सेन (8 × 4 एल) के साथ मेओएच (8 × 4 एल) के साथ एक संपूर्ण मैक्रेशन का प्रदर्शन किया गया। प्राप्त निष्कर्षण समाधान क्रमशः हेक्सेन (24.85 ग्राम) और मेओएच (199.43 ग्राम) अर्क देने के लिए कम दबाव (40-50 डिग्री) पर एक रोटरी बाष्पीकरण में केंद्रित थे।
ड्रैगेंडॉर्फ के अभिकर्मक के साथ प्रकट हुए टीएलसी विश्लेषण ने MeOHextract में एल्का-लॉइड की उच्च उपस्थिति का संकेत दिया। इसलिए, मेओएच निकालने (188.3 0 जी) के एक विभाज्य को शुरू में क्षारीय (5.46 ग्राम) और तटस्थ (4.47 ग्राम) अंश देने के लिए एसिड-बेस निष्कर्षण के अधीन किया गया था। इसके बाद, अल्कलॉइडल अंश (5. 0 जी) का हिस्सा सिलिका जेल क्रोमैटोग्राफिक कॉलम (सीसी) के अधीन था, जिसे पहले 10 प्रतिशत NaHCO3 समाधान [12] के साथ इलाज किया गया था, हेक्सेन (100 प्रतिशत), हेक्सेन-सीएचसीएल, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, और 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 प्रतिशत), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, और 10:90,0/u), EtOAc (100 प्रतिशत), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20) :80, और 10:90, वी/ओ), और अंत में एमओएच 250 अंश (30 एमएल प्रत्येक)। 85:15, और 80:20 एलुएंट सिस्टम (v/o) के रूप में, समान नमूनों को 16 भिन्न (F1 से F16) देने के लिए पूल किया गया था।
हेक्सेन-सीएच, सीएल 2 (50:50 से 10:90, वी / ओ) के साथ प्रारंभिक सीसी से फ्रैक्शन एफ 5 (181.2 मिलीग्राम) को हेक्सेन (100 प्रतिशत), हेक्सेन के साथ उपरोक्त समान पद्धति का उपयोग करके एक नई सिलिका जेल सीसी के अधीन किया गया था। -सीएच, सीएल 2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, और 10:90,वी/ओ), सीएच,सीएल ,(100 प्रतिशत), सीएचसीएल2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, और 10:90) ,o/),EtOAc(100 प्रतिशत), EtOAc-MeOH(85:15,70:30,50:50, 30:70, और 15:85, /ओ), और MeOH (100 प्रतिशत) 118 अंशों की रिकॉर्डिंग ( 15 एमएल प्रत्येक) जो 12 सबफ़्रेक्शन (F5.1 से F5.12) में जमा किए गए थे, TLC विश्लेषण मूल्यांकन के अनुसार CH2Cl 2- MeOH के मिश्रण का उपयोग 95:05 और 90:10 के अनुपात में किया गया था। सबफ़्रेक्शन F5 .1 (28.9 मिलीग्राम) हेक्सेन (100 प्रतिशत) के साथ सीएच, सीएल-मेओएच (95:05, वी / वी, दो एल्यूशन) के साथ 2 (1.4 मिलीग्राम) और 3 (1.7 मिलीग्राम) के साथ एक प्रारंभिक टीएलसी के अधीन था। क्रमश। सबफ्रैक्शंस F5.4 (21.5 मिलीग्राम) हेक्सेन-सीएच, सी (80:20, वीओ), एफ 5.5 (16.7 मिलीग्राम) के साथ हेक्सेन-सीएच, सीएल (80: 20.70: 30.60; 40। और 50:50 के साथ eluted) ,v/), और F5.6(15.4 मिलीग्राम) हेक्सेन-CHCl2 (50:50,40:60, और 30:70, v/o) के साथ मिश्रित (53.6 मिलीग्राम) थे और एक प्रारंभिक टीएलसी के अधीन भी थे। सीएच के साथ, सीएल-मेओएच (95:05, वी/यू, दो रेफरेंस) उपज 3 (8.9 मिलीग्राम)।
हेक्सेन-सीएचसीएल(10:90,v/)), CH2Cl, (100 के साथ प्रारंभिक सीसी से भिन्न F6(2099.1 mg) प्रतिशत ), और CH,Cl2-EtOAc (90:10 से 10:90, o/o) को एक नए सिलिका जेल CC के अधीन किया गया था, जो समान सॉल्वैंट्स सिस्टम के साथ 140 अंशों (30) के साथ समान कार्यप्रणाली का उपयोग कर रहा था। एमएल प्रत्येक)। TLCमूल्यांकन के बाद CH2Cl2-MeOH के मिश्रण का उपयोग करके 95:05, 90:10, और 85:15 के अनुपात में एलुएंट सिस्टम (o/o) के रूप में, इसी तरह के नमूनों को 13 सबफ़्रेक्शन (F6) देने के लिए पूल किया गया था। .1 से F6.13)। सबफ़्रेक्शन F6.6(1541.3 मिलीग्राम) को एक नए सिलिका जेल सीसी के अधीन किया गया था, जो 120 अंशों (30 एमएल प्रत्येक) के समान सॉल्वैंट्स सिस्टम के साथ ऊपर समान कार्यप्रणाली का उपयोग कर रहा था, जिसका विश्लेषण टीएलसी द्वारा किया गया था (उपरोक्त समान पद्धति का उपयोग करके) 12 नए प्रदान करते हुए सबफ्रैक्शंस (F6.6.1 से F6.6.12)। हेक्सेन-सीएच, सीएल, (60:40 और 50:50, वी/वी) से अल्युटेड सबफ्रैक-टियन एफ6.6.2(17.0 मिलीग्राम) को सीएच2सीएल2-मेओएच (90:10, v/o, one क्षालन) जिसके परिणामस्वरूप 3 (1.4mg) होता है। सबफ़्रेक्शन F6.6.3 (643.3 मिलीग्राम) हेक्सेन-सीएच2क्ल2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80, और 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 प्रतिशत), और CH2Cl2-EtOAc(90:10 और 80:20,o/o) को CH2Cl से युक्त एक प्रारंभिक TLC के अधीन रखा गया था2-MeOH (90) :10, vfo, one elution) एक नया सबफ़्रेक्शन F6.6.3.1(161.8 mg) उत्पन्न कर रहा है जो EtOAc-MeOH (90:10, v/o, one क्षालन) से युक्त एक नए प्रारंभिक TLC के अधीन था, जिसकी रिकॉर्डिंग 4(148.2) थी। CH2Cl2-EtOAc (70:30 और 60:40,o/o) से युक्त सबफ़्रेक्शन F6.6.4 (90.2 mg) को CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, एक रेफरेंस) क्रमशः 1 (1.4 मिलीग्राम) और 4 (50.1 मिलीग्राम) उपज देता है। सीएच, सीएल-एटीओएसी (60:40 और 50:50, ओ / ओ) के साथ सबफ़्रेक्शन एफ 6.6.5 (83.4 मिलीग्राम) को सीएच, सीएल 2- मेओएच (90:10, यूएफओ, वन रेफरेंस) क्रमशः 1(1.5 मिलीग्राम) और 4(45.5 मिलीग्राम) की रिकॉर्डिंग करता है। सबफ़्रेक्शन F6.6.6 (101.4 मिलीग्राम) CH, Cl 2- EtOAc (50:50 और 40:60, v/) के साथ eluted CH, Cl-MeOH (90:) के साथ एक प्रारंभिक टीएलसी के अधीन था: 10, vfo, एक रेफरेंस) 8(3.4 mg) और अन्य सबफ़्रेक्शन F6.6.6.1 (48.8 mg) दे रहा है। इस सबफ़्रेक्शन (F6.6.6.1) को प्रारंभिक रूप से EtOAc-MeOH (85) के साथ एक प्रारंभिक TLC सेल्यूटेड किया गया था। :15, वो, एक रेफरेंस) और बाद में CHCl-MeOH (90:10,v/v, one रेफरेंस) जिसके परिणामस्वरूप फिर से 4(37.4 मिलीग्राम) होता है। इस प्रक्रिया-अवधि के लिए, क्रोमैटोग्राफिक प्लेट को शुरू में मोबाइल चरण EtOAc-MeOH (85:15, v/o, one रेफरेंस) के साथ जोड़ा गया था। इस रेफरेंस के बाद, क्रोमैटोग्राफिक प्लेट को सॉल्वेंट को फिर से स्थानांतरित करने के लिए सुखाया गया और बाद में मोबाइल चरण सीएच, सीएल, -मेओएच (90:10, वीएफ, एक रेफरेंस) के साथ एक नए रेफरेंस के अधीन किया गया। 109.0 मिलीग्राम) सीएच, सीएल 2- ईटीओएसी (40: 60,30: 70,20:80 और 10:90, वीएफओ) के साथ सीएच, सीएल 2- मेओएच के साथ एक प्रारंभिक टीएलसी के अधीन था। (90:10,वो, एक रेफरेंस) एक और सबफ़्रेक्शन F6.6.7.1 (24.8 मिलीग्राम) दे रहा है जो एक नए प्रारंभिक टीएलसी के अधीन था जो शुरू में EtOAc-MeOH (85:15, v/o, एक रेफरेंस) के साथ और बाद में तैयार किया गया था। CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, एक रेफरेंस) जिसके परिणामस्वरूप 9 (11.1 मिलीग्राम) होता है। 9 के लिए उपयोग की जाने वाली आइसोलेशन प्रक्रिया वही थी जो पहले 4 के लिए वर्णित थी। EtOAc-MeOH (60:40 और 50:50, v/o) से युक्त सबफ़्रेक्शन F6.6.10(92.0 mg) CH के साथ एक प्रारंभिक TLC सेलुटेड के अधीन था, Cl,-MeOH (90:10, v/o, एक रेफरेंस) उपज 5 (1.7 मिलीग्राम) और 6 (7.8 मिलीग्राम), क्रमशः। EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80, और 10:90,v/o) के साथ सबफ़्रेक्शन F6.6.11(326.0 mg) को CHCl- के साथ एक प्रारंभिक टीएलसी सेलुटेड के अधीन किया गया था- मेओह (90:10, वी/ओ, एक रेफरेंस) क्षेत्र 1 (2.4 मिलीग्राम) और 7 (12.5 मिलीग्राम), क्रमशः।
EtOAc (100 प्रतिशत) और CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15, और 75:25, के साथ प्रारंभिक CCeluted से भिन्न F7 (692.4 मिलीग्राम) एक नए सिलिका जेल के अधीन था सीसी 110 अंशों (30 एमएल प्रत्येक) के समान सॉल्वैंट्स सिस्टम के साथ प्रारंभिक सीसी के लिए वर्णित समान पद्धति का उपयोग करना। सीएच 2 सीएल 2- मेओएच के मिश्रण का उपयोग करके टीएलसी मूल्यांकन के बाद 95:05, 90:10, और 85 के अनुपात में :15 एलुएंट सिस्टम (o/o) के रूप में, समान सैम्पल्स को 12 सबफ़्रेक्शन (F7.1 से F7.12) देने के लिए पूल किया गया था। F7.8 (147.4 mg) CH,Cl के साथ eluted 2- EtOAc (50:50,40:60, और 30:70, v/o प्रतिशत) CHCl-MeOH (95:05, vfo, एक क्षालन) के साथ 10 (5.4 मिलीग्राम) और 11 ( 120.6 मिलीग्राम), क्रमशः। F7.9(144.2 mg) CHCl के साथ 2-EtOAc (30:70, 20:80, और 10:90, v/o प्रतिशत) को भी CH,Cl,-MeOH ( 95:05,vo, one elution) क्रमशः 11(91.2 mg) और 12 और 13 (39.4 mg) का मिश्रण है।
थैलिफोलिन (1): भूरा अनाकार पाउडर;' साहित्य के अनुसार एच-एनएमआर और 13सी-एनएमआर [32]; एलआर-ईएसआई (प्लस) -एमएस [एम प्लस एच]* प्लस एम/जेड 208।
Anonaine (2): भूरा अनाकार पाउडर; 1H-NMR और 13C-NMR साहित्य के अनुसार [33]; एलआर-ईएसआई (प्लस) -एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/जेड 266।
लिरियोडेनिन (3): पीले क्रिस्टल (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR और 13C-NMR साहित्य के अनुसार [10,34]; एलआर-ईएसआई (प्लस) -एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/जेड 276।
(एस) - (प्लस) - रेटिकुलिन (4): ब्राउन अनाकार पाउडर; [ ]p25 प्लस 71,60(c 0.05 g/100 एमएल, MeOH); 1H-NMR और 13C-NMR साहित्य के अनुसार [27;LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 30.
3,4-डायहाइड्रो-7-हाइड्रॉक्सी-6-मेथॉक्सी-1-आइसोक्विनोलिनिल)(3-हाइड्रॉक्सी-4-मेथॉक्सीफेनिल)-मीथेनोन (डीहाइड्रो-ऑक्सोनोरेटिक्युलिन)(5 ): भूरा अनाकार पाउडर; 'एच और 13सी-एनएमआर डेटा, तालिका 1 देखें; एलआर-ईएसआई (प्लस) -एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/जेड 328।
(प्लस){{0}}S,2R-Reticuline N -oxide(6): भूरा अनाकार पाउडर; [ एलपी25 प्लस 136.4 (सी0.146जी/100 एमएल, मेओएच); 1हैंड 13सी-एनएमआर डेटा, तालिका1 देखें;एलआर-एपीसीआई(प्लस)-एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/2346
(प्लस){{0}}S,2S-Reticuline N.-oxide (7): ब्राउन अनाकार पाउडर; [ ]p25 प्लस 394.5 (सी 0.03जी/100 एमएल, मेओएच);'एच और 13सी-एनएमआर डेटा, तालिका 1 देखें;एलआर-एपीसीआई(प्लस)-एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/जेड346।
कोरेक्सिमाइन (8): हल्का पीला अनाकार पाउडर;[ ]p25 प्लस 201.1(c 0.08g/100mL, MeOH)'H-NMR और 13C-NMR साहित्य के अनुसार [34,35];LR- ईएसआई (प्लस) -एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/जेड 328।
बिस्नोरार्गेमोनिन (9): भूरा अनाकार पाउडर; 1H-NMR और 13C-NMR साहित्य के अनुसार [36]; एलआर-एपीसीआई(प्लस)-एमएस [एम प्लस एच] प्लस एम/जेड 328।
आइसोचमानेटिन (10): हल्का पीला अनाकार पाउडर; [p25-12.4(c 0.5 g/100 mL, MeOH)'H-NMRऔर 13C-NMRसाहित्य के अनुसार[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361।
Dichamanetin (11):पीला अनाकार पाउडर;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR और 13C-NMR साहित्य के अनुसार [37]; एलआर-ईएसआई(-)-एमएस [एमएच]-एम/जेड467.
यूवरिनोल(12)और आइसोवरिनोल(13) का मिश्रण: पीला अनाकार पाउडर; साहित्य के अनुसार एच-एनएमआर और 13सी-एनएमआर [37]; एलआर-ईएसआई (-) - एमएस [एमएच] - एम/जेड 573।
3.4.इन विट्रो साइटोटोक्सिक परख
3.4.1.कोशिका
HL-60 (मानव प्रोमायलोसाइटिक ल्यूकेमिया), MCF-7 (मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा), HepG2 (मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा), HCT116 (मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा), और MRC-5 (मानव फेफड़े के फ़ाइब्रोब्लास्ट) सेल लाइनों को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी, मानस, वीए, यूएसए) से प्राप्त किया गया था, और एटीसीसी एनिमल सेल कल्चर गाइड द्वारा अनुशंसित के अनुसार सुसंस्कृत किया गया था। संदूषण से मुक्त कोशिकाओं के उपयोग को मान्य करने के लिए माइकोप्लाज्मा स्टेन किट (सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग करके माइकोप्लाज्मा के लिए सभी सेल लाइनों का परीक्षण किया गया था।
3.4.2. साइटोटोक्सिसिटी परख
साइटोटोक्सिसिटी परख के लिए, सेल व्यवहार्यता को अलमार ब्लू विधि द्वारा निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित [{0}}] था। सभी प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट्स में चढ़ाया गया था। रासायनिक घटकों को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda।, Duque de Caxias, RJ, ब्राज़ील) में भंग कर दिया गया और प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और 72 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। डॉक्सोरूबिसिन (डॉक्सोरूबिसिन हाइड्रोक्लोराइड, शुद्धता 95 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर, प्रयोगशाला आईएमए एसएआईसी, ब्यूनस आयर्स, अर्जेंटीना-को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। उपचार के अंत में, रेसज़ुरिन के स्टॉक समाधान (0.312 मिलीग्राम / एमएल) के 20 μL (सिग्मा-एल्ड्रिच कं) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था। 570 एनएम और 600 एनएम पर अवशोषण को स्पेक्ट्रामैक्स 190 माइक्रोप्लेट रीडर (आणविक उपकरण, सनीवेल, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। अर्ध-निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) को नॉनलाइनियर रिग्रेशन द्वारा प्राप्त किया गया था। सॉफ्टवेयर ग्राफपैड प्रिज्म (विज्ञान के लिए सहज सॉफ्टवेयर; सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके 95 प्रतिशत विश्वास अंतराल (CI95 प्रतिशत) के साथ।
4। निष्कर्ष
डी.कैलिसीना की छाल की फाइटोकेमिकल जांच से तेरह यौगिकों (1-13) का अलगाव और पहचान हुई; नौ आइसोक्विनोलिन-व्युत्पन्न एल्कलॉइड (1-9) और चारflavonoids(10-13)। एल्कलॉइड निम्नलिखित उपवर्गों से संबंधित हैं: सरल आइसोक्विनोलिन, थाली ऑनलाइन (1); एपोर्फिन, एनोनाइन (2); ऑक्सोपोर्फिन, लिरियोडेनिन (3); बेंज़िल-टेट्राहाइड्रोइसोक्विनोलिन, (प्लस) -रेटिक्युलिन(4), डी हाइड्रो-ऑक्सोनोरेटिक्युलिन(3,4-डायहाइड्रो-7-हाइड्रॉक्सी-6-मेथॉक्सी-1-आइसोक्विनोलिनिल)({{13} }हाइड्रॉक्सी-4-मेथॉक्सीफेनिल)-मेथनोन)(5), 1एस,2आर-रेटिक्युलिन एनजी-ऑक्साइड(6), और 1एस,2एस-रेटिक्युलिन एन.-ऑक्साइड (7); टेट्राहाइड्रो प्रोटोबेरबेरिन, कोरेक्सिमाइन (8); और पावाइन, बिस्नोरार्गेमोनिन (9)। जबकि फ्लेवोनोइड्स बेंजाइलेटेड डायहाइड्रोफ्लेवोन्स, आइसोरामनेटिन (10), डिचामानेटिन (11), और यूवरिनोल (12) और आइसोवरिनोल (13) के मिश्रण से संबंधित हैं। पृथक यौगिकों को पहली बार डी.कैलिसीना के साथ-साथ डिक्लिनानोना जीनस में वर्णित किया गया है।
पृथक यौगिकों की साइटोटोक्सिक गतिविधि (एनोनाइन, लिरियोडेनिन, 1,2-डायहाइड्रो-ऑक्सोनोरेटिक्युलिन, और कोरेक्सिमाइन को छोड़कर) का मूल्यांकन कैंसर (एचएल -60, एमसीएफ -7, हेपजी 2, और के खिलाफ किया गया था। HCT116) और गैर-कैंसरयुक्त (MRC-5)कोशिका रेखाएँ। उनमें से, सबसे आशाजनक परिणाम बेंजाइलेटेड डाइहाइड्रोफ्लेवोन्स डिचामानेटिन (10), और . के लिए देखे गए
यूवरिनोल (12) और आइसोवरिनोल (13) का मिश्रण जिसने परीक्षण किए गए कैंसर सेल लाइनों के खिलाफ मध्यम साइटोटोक्सिक गतिविधि को दिखाया<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetin (11) ने HL-60 और HCT116 के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि दिखाई, जिसमें IC50 का मान 15.78ug·mL-1 （33.70 μmol-L-1）और 18.99 ug·mL-I（40.56 μmol है। .L-1）, क्रमशः जबकि uvarinol 12） और isouvarinol (13) के मिश्रण ने HL-60 के खिलाफ साइटोटोक्सिक गतिविधि का प्रदर्शन किया, जिसमें IC50 का मान 9.74 ug∶mL-I और HCT116, IC50 के साथ है। 17.31 ug·mL-1 का मान। ट्यूमर सेल लाइनों पर इन परिणामों को पहली बार बेंजाइलेटेड डाइहाइड्रोफ्लेवोन्स के लिए भी वर्णित किया गया है। रेटिक्युलिन, एनोनाइन और लिरियोडेनिन की साइटोटोक्सिक गतिविधियां पहले स्थापित की गई थीं, जिसमें लिरियोडेनिन सबसे शक्तिशाली यौगिक है।
इस काम में प्राप्त परिणामों से संकेत मिलता है कि परिवार एनोनेसी की प्रजातियां साइटोटोक्सिक गुणों के साथ जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों का एक आशाजनक स्रोत हैं, और जैविक परख के अन्य मॉडलों में उनकी जांच जारी रखने का सुझाव देती हैं।
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