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ग्लियोब्लास्टोमा कीमो-इम्यूनोथेरेपी के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट रिस्पॉन्सिव नैनोड्रग्स की कार-न्यूट्रोफिल मध्यस्थता डिलीवरी

Nov 27, 2023

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मनुष्यों में सबसे आक्रामक और घातक ठोस ट्यूमर में से एक है। जबकि उभरते हुए काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-टी कोशिकाओं और कीमोथेराप्यूटिक्स जैसे प्रभावशाली उपचारों को विभिन्न कैंसर के इलाज के लिए विकसित किया गया है, जीबीएम उपचार में उनकी प्रभावशीलता रक्त-मस्तिष्क बाधा और रक्त-मस्तिष्क-ट्यूमर बाधाओं से काफी हद तक बाधित हुई है। मानव न्यूट्रोफिल प्रभावी ढंग से शारीरिक बाधाओं को पार करते हैं और रोगजनकों के खिलाफ प्रभावशाली प्रतिरक्षा प्रदर्शित करते हैं लेकिन प्राथमिक न्यूट्रोफिल के छोटे जीवनकाल और जीनोम संपादन के प्रतिरोध ने इम्यूनोथेरेपी में उनके व्यापक अनुप्रयोग को सीमित कर दिया है। यहां हम टी-विशिष्ट CD3ζ या न्यूट्रोफिल-विशिष्ट-सिग्नलिंग डोमेन के साथ विभिन्न एंटी-जीबीएम कार निर्माणों को व्यक्त करने के लिए CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन नॉक-इन के साथ आनुवंशिक रूप से मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को इंजीनियर करते हैं। सर्वोत्तम एंटी-ट्यूमर गतिविधि वाले सीएआर-न्यूट्रोफिल ट्यूमर साइटों पर अतिरिक्त सूजन उत्पन्न करने की आवश्यकता के बिना जीबीएम को लक्षित करने के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट-उत्तरदायी नैनो दवाओं को विशेष रूप से और गैर-आक्रामक रूप से वितरित करने और जारी करने के लिए उत्पादित होते हैं। यह कॉम्बिनेटरी कीमो-इम्यूनोथेरेपी बेहतर और विशिष्ट एंटी-जीबीएम गतिविधियों को प्रदर्शित करती है, ऑफ-टार्गेट दवा वितरण को कम करती है, और मादा ट्यूमर-असर चूहों में जीवनकाल बढ़ाती है। साथ में, यह बायोमिमेटिक सीएआर-न्यूट्रोफिल दवा वितरण प्रणाली जीबीएम और संभवतः अन्य विनाशकारी बीमारियों के इलाज के लिए एक सुरक्षित, शक्तिशाली और बहुमुखी मंच है।


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सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-एंटीट्यूमर के लाभ

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) की विशेषता उच्च मृत्यु दर, छोटा जीवनकाल और पुनरावृत्ति की उच्च प्रवृत्ति के साथ खराब पूर्वानुमान है। सर्जरी और कीमो-दवाओं दोनों की चिकित्सीय प्रभावकारिता मुख्य रूप से मस्तिष्क की बारीक संरचना और शारीरिक रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) या रक्त-मस्तिष्क-ट्यूमर बाधा (बीबीटीबी) 3-5 से बाधित होती है। विशेष रूप से, ब्रेन ट्यूमर के इलाज के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तक दवा पहुंचाना बहुत चुनौतीपूर्ण है:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

जीबीएम सहित विभिन्न कैंसर12-16 के खिलाफ न्यूट्रोफिल की जन्मजात प्रतिरक्षा और प्लास्टिसिटी, दवा वितरण8-10 में सेल वाहक के रूप में उनके आवेदन की तुलना में कम खोजी गई थी। रक्त में न्यूट्रोफिल घूमते हुए हाइपोक्सिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) में चले जाते हैं, जहां वे विषम ट्यूमर से जुड़े न्यूट्रोफिल (टीएएन) बन जाते हैं, जो इम्यूनोस्प्रेसिव टीएमई का एक आवश्यक घटक है जो कैंसर की प्रगति और चिकित्सीय प्रतिरोध 12,17 में योगदान देता है। मैक्रोफेज के समान, एंटी-ट्यूमर एन1 और टीएएन के प्रो-ट्यूमर एन2 फेनोटाइप हाइपोक्सिक टीएमई18-21 के भीतर पाए गए। न्यूट्रोफिल की कमी या अवरोध पर ध्यान केंद्रित करने के साथ सीधे न्यूट्रोफिल को लक्षित करने के लिए विभिन्न चिकित्सीय रणनीतियाँ विकसित की गई हैं, जिससे कई नैदानिक ​​परीक्षण (उदाहरण के लिए, एनसीटी03274804 में सीसीआर5 अवरोधक मारविरोक) हुए हैं। इस प्रकार, नैनोकैरियर के रूप में अनुपचारित न्यूट्रोफिल का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग कैंसर रोगियों के लिए एक अतिरिक्त जोखिम पैदा कर सकता है, जिसमें ड्रग-तस्करी वाले न्यूट्रोफिल को ट्यूमर साइटों पर घर जाने के बाद टीएमई के भीतर इम्यूनोसप्रेसिव प्रो-ट्यूमर एन 2 फेनोटाइप में पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है। इसके अलावा, कीमोथेराप्यूटिक्स के साथ संयोजन में दवा वाहक के रूप में उपयोग किए जाने पर एक अनुकूलित चिकित्सीय प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए भोले न्यूट्रोफिल की आंतरिक ट्यूमर-विरोधी गतिविधियों का पता लगाया जाना चाहिए और बढ़ाया जाना चाहिए।

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सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) संशोधन ने प्रतिरक्षा टी या प्राकृतिक किलर (एनके) कोशिकाओं की ट्यूमर-विरोधी गतिविधियों को काफी हद तक बढ़ा दिया है। हालाँकि, अपेक्षाकृत कम तस्करी और ट्यूमर प्रवेश क्षमता के कारण ठोस ट्यूमर में उनकी प्रभावकारिता अभी भी सीमित है। शारीरिक बीबीबी और बीबीटीबी की उपस्थिति मस्तिष्क में जीबीएम के खिलाफ इन उभरते उपचारों की प्रभावकारिता को और बाधित करती है। हमने अनुमान लगाया कि सीएआर इंजीनियरिंग और अत्यधिक गतिशील न्यूट्रोफिल का संयोजन उनके एंटी-ट्यूमर एन 1 फेनोटाइप को बनाए रख सकता है और जीबीएम के उपचार में उत्कृष्ट चिकित्सीय प्रभावकारिता प्रदान कर सकता है। प्राथमिक न्यूट्रोफिल अल्पकालिक होते हैं और जीनोम एडिटिंग28 के प्रति प्रतिरोधी होते हैं, जिससे सीएआर-निर्देशित इम्यूनोथेरेपी में उनका अनुप्रयोग सीमित हो जाता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं (एचपीएससी), जो जीन संपादन के लिए अधिक सुलभ हैं और बड़े पैमाने पर न्यूट्रोफिल में अंतर करने में सक्षम हैं, रासायनिक रूप से परिभाषित, ज़ेनो-मुक्त स्थितियों29 के तहत लक्षित इम्यूनोथेरेपी के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सीएआर-न्यूट्रोफिल का असीमित स्रोत प्रदान कर सकती हैं। न्यूट्रोफिल खुरदरी या लंबी सतहों वाले फागोसाइटोज माइक्रोबियल रोगजनकों को भी प्राथमिकता देते हैं, जैसे कि एस. ऑरियस और ई. कोली30, जिन्हें न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता वाली दवा वितरण में नैनोकण डिजाइन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए। दरअसल, सफ़ारी एट अल। हाल ही में न्यूट्रोफिल परिचालित करके, जटिल सतह संशोधन के बिना, अंतःशिरा प्रशासित विस्तारित कणों के पसंदीदा फागोसाइटोसिस की सूचना दी गई। दवा से भरे नैनोकणों में इस तरह का एक आसान और बायोप्रेरित डिज़ाइन न्यूट्रोफिल में दवा लोडिंग को अधिकतम कर सकता है और लक्षित साइटों पर दवा वितरण के चिकित्सीय स्तर की अनुमति दे सकता है।

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>प्रशासित नैनोड्रग्स का 20% सीएआर न्यूट्रोफिल द्वारा मस्तिष्क ट्यूमर तक पहुंचाया जाता है, जबकि 1% मुफ्त नैनोड्रग्स द्वारा पहुंचाया जाता है। संक्षेप में, हमारी बायोमिमेटिक सीएआर-न्यूट्रोफिल दवा वितरण प्रणाली जीबीएम और अन्य विनाशकारी बीमारियों के इलाज के लिए एक सुरक्षित, शक्तिशाली और बहुमुखी मंच है।

effects of cistance-antitumor (2)

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-एंटीट्यूमर के लाभ

परिणाम

बढ़ी हुई एंटी ट्यूमर गतिविधियों के लिए न्यूट्रोफिल-विशिष्ट सीएआर संरचनाओं की स्क्रीनिंग

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, और अधिकांश लक्षित क्लोन विषमयुग्मजी हैं (पूरक चित्र 1ए-डी)। इंजीनियर्ड एचपीएससी पर सीएआर अभिव्यक्ति की पुष्टि आरटी-पीसीआर और सीएलटीएक्स-आईजीजी4 (अनुपूरक चित्र 1ई-जी) के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा की गई। जैसा कि अपेक्षित था, CAR-व्यक्त करने वाले hPSCs ने OCT4, SSEA4, और SOX2 (अनुपूरक चित्र 1f) सहित प्लुरिपोटेंट मार्करों के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को बरकरार रखा।

डे नोवो सीएआर-न्यूट्रोफिल का उत्पादन करने के लिए, सीएआर-व्यक्त करने वाले एचपीएससी को पहले मल्टीपोटेंट हेमेटोपोएटिक और फिर स्टेज-विशिष्ट साइटोकिन उपचार 35 (छवि 2 सी) के साथ माइलॉयड पूर्वजों में विभेदित किया गया था। जी-सीएसएफ और रेटिनोइक एसिड एगोनिस्ट एएम580 के बाद के उपयोग ने मजबूत न्यूट्रोफिल उत्पादन को बढ़ावा दिया36। परिधीय रक्त (पीबी) में उनके समकक्षों के समान, एचपीएससी-व्युत्पन्न सीएलटीएक्स-सीएआर न्यूट्रोफिल ने विशिष्ट न्यूट्रोफिल आकृति विज्ञान और सतह मार्कर सीडी 16, सीडी 11 बी, एमपीओ, सीडी 15, सीडी 66 बी और सीडी 18 (पूरक छवि 2) प्रस्तुत किए। इसके बाद हमने इन विट्रो में ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) यू87एमजी कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन करके एचपीएससी-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल की एंटी ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी पर सीएआर अभिव्यक्ति के प्रभावों को निर्धारित किया। जैसा कि अपेक्षित था, एचपीएससी-व्युत्पन्न सीएलटीएक्स-सीएआर न्यूट्रोफिल ने पीबी न्यूट्रोफिल (छवि 2 डी) की तुलना में बेहतर ट्यूमर-हत्या क्षमता प्रस्तुत की, जो सीएलटीएक्स सीएआर-टी कोशिकाओं में पिछले अवलोकनों के अनुरूप है। इन विभिन्न सीएआर के बीच, सीएआर #1 ने एचपीएससी-न्यूट्रोफिल में बेहतर ट्यूमर-हत्या गतिविधियों की मध्यस्थता की। विशेष रूप से, -चेन-आधारित सीएआर #4 न्युट्रोफिल-मध्यस्थ ट्यूमर-हत्या को ट्रिगर करने में सबसे कम प्रभावी है, जो ζ-सबयूनिट की तुलना में आईटीएएम की कम प्रतिलिपि और सेल सतह 28 पर -असर सीएआर की कम अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है। न्यूट्रोफिल लक्ष्य कोशिकाओं को मारने के लिए साइटोटॉक्सिक रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर- (टीएनएफ-) छोड़ते हैं। विभिन्न न्यूट्रोफिल से आरओएस और टीएनएफ- (छवि 2ई, एफ) का उत्पादन उनके बढ़े हुए साइटोलिसिस के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है। जैसा कि अपेक्षित था, सामान्य एसवीजी पी12 ग्लियाल कोशिकाओं के साथ सहसंवर्धन के बाद विभिन्न न्यूट्रोफिल से आरओएस और टीएनएफ का उत्पादन नकारात्मक नियंत्रण समूह (पूरक छवि 3 ए, बी) जितना कम रहा। इसके अलावा, सीएआर-न्यूट्रोफिल की बढ़ी हुई एंटी-ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी केवल जीबीएम कोशिकाओं के साथ सह-ऊष्मायन में देखी गई, जिसमें यू87एमजी, प्राथमिक वयस्क जीबीएम43, और बाल चिकित्सा एसजे-जीबीएम2 कोशिकाएं (अनुपूरक चित्र 3सी) शामिल हैं, जो हमारे सीएलटीएक्स की उच्च विशिष्टता को प्रदर्शित करता है। -कार। विशेष रूप से, सीएआर न्यूट्रोफिल ने सामान्य एसवीजी पी12 ग्लियाल कोशिकाओं, एचपीएससी और एचपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पूरक छवि 3डी) के साथ उच्च जैव अनुकूलता प्रदर्शित की, जो पिछले अवलोकन के अनुरूप है कि निष्क्रिय प्राथमिक न्यूट्रोफिल स्वस्थ कोशिकाओं को नहीं मारते हैं। सामूहिक रूप से, एचपीएससी-व्युत्पन्न सीएआर न्यूट्रोफिल, विशेष रूप से सीडी3ζ-असर सीएआर-न्यूट्रोफिल, ने एंटी-ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाया और इन विट्रो में अधिक आरओएस और टीएनएफ का उत्पादन किया, जो लक्षित इम्यूनोथेरेपी में उनकी क्षमता को उजागर करता है।

Fig. 1 | Schematic of enhanced anti-glioblastoma efficacy using combinatory immunotherapy of CAR-neutrophils and tumor microenvironment responsive nano-drugs. Human pluripotent stem cells were engineered with CARs and differentiated into CAR-neutrophils that are loaded with rough silica nanoparticles (SiO2 NPs) containing hypoxia-targeting tirapazamine (TPZ) or other drugs, as a dual immunochemotherapy. b Systemically administered CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs first attack external normoxic tumor cells by forming immunological synapses and kill tumor cells via phagocytosis. After apoptosis, CAR-neutrophils could then release R-SiO2-TPZ NPs, which are overtaken by tumor cells. Afterward, nano-prodrugs respond to the hypoxic tumor microenvironment and effectively kill tumor cells. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.


चित्र 1|सीएआर-न्यूट्रोफिल और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट रेस्पॉन्सिव नैनो-ड्रग्स की कॉम्बिनेटरी इम्यूनोथेरेपी का उपयोग करके बढ़ी हुई एंटी-ग्लियोब्लास्टोमा प्रभावकारिता का योजनाबद्ध। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को सीएआर के साथ इंजीनियर किया गया था और सीएआर-न्यूट्रोफिल में विभेदित किया गया था, जो दोहरी इम्यूनोकेमोथेरेपी के रूप में हाइपोक्सिया-टारगेटिंग तिरापज़ामाइन (टीपीजेड) या अन्य दवाओं से युक्त रफ सिलिका नैनोकणों (SiO2 NPs) से भरे हुए हैं। बी प्रणालीगत रूप से प्रशासित CAR-neutrphil@R-SiO2- TPZ NPs पहले इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स बनाकर बाहरी नॉरमॉक्सिक ट्यूमर कोशिकाओं पर हमला करते हैं और फागोसाइटोसिस के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं को मारते हैं। एपोप्टोसिस के बाद, सीएआर-न्यूट्रोफिल आर-सीओओ 2-टीपीजेड एनपी जारी कर सकते हैं, जो ट्यूमर कोशिकाओं से आगे निकल जाते हैं। इसके बाद, नैनो-प्रोड्रग्स हाइपोक्सिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट पर प्रतिक्रिया करते हैं और ट्यूमर कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से मार देते हैं। टीईओएस टेट्राएथिल ऑर्थोसिलिकेट, बीटीईएस बीआईएस[3-(ट्राइथॉक्सीसिलिल) प्रोपाइल] टेट्रासल्फाइड, टीपीजेड टिरापाज़ामाइन, बीटीजेड बेंज़ोट्रायज़िनिल।

सीएआर-न्यूट्रोफिल ने इम्यूनोस्प्रेसिव ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण के तहत बेहतर एंटी-ट्यूमर गतिविधियों को बनाए रखा

मैक्रोफेज के समान, ट्यूमर से जुड़े न्यूट्रोफिल के एंटी-ट्यूमर एन1 और प्रो-ट्यूमर एन2 फेनोटाइप इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट17 के भीतर पाए गए। प्रो-ट्यूमर एन2 न्यूट्रोफिल ट्यूमर एंजियोजेनेसिस, मेटास्टेसिस और इम्यूनोसप्रेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन इस कोशिका प्रकार का चिकित्सीय लक्ष्यीकरण चुनौतीपूर्ण रहा है।

प्रणालीगत कमी रणनीति22 के बजाय, यहां हमने न्यूट्रोफिल के एंटी-ट्यूमर फेनोटाइप को बनाए रखने में सीएआर-इंजीनियरिंग की क्षमता का मूल्यांकन किया। सीएआर एचपीएससी-व्युत्पन्न और पीबी न्यूट्रोफिल को हाइपोक्सिया (3% ओ 2) और टीजीएफ के साथ इलाज किया गया था, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट 37,38 के इम्यूनोसप्रेशन में योगदान देता है, ताकि उनकी निरंतर ट्यूमर-हत्या गतिविधि का आकलन किया जा सके। जबकि पीबी न्यूट्रोफिल ने इम्यूनोस्प्रेसिव स्थितियों के तहत जीबीएम कोशिकाओं के खिलाफ साइटोलिसिस में काफी कमी की, सीएआर-न्यूट्रोफिल ने उच्च ट्यूमर-हत्या गतिविधियों को बनाए रखा (पूरक छवि 4 ए)। इम्यूनोस्प्रेसिव और सामान्य परिस्थितियों में पीबी या सीएआर-न्यूट्रोफिल से टीएनएफ रिलीज और आरओएस पीढ़ी (पूरक छवि 4 बी, सी) में भी इसी तरह के अवलोकन किए गए थे। हाइपोक्सिक और टीजीएफ स्थितियों के तहत न्यूट्रोफिल फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए, हमने फ्लो साइटोमेट्री (पूरक चित्र) द्वारा पृथक न्यूट्रोफिल पर एन 1- विशिष्ट आईएनओएस और एन 2- एन 2- विशिष्ट आर्गनेज की अभिव्यक्ति को मापा। 4डी-एफ)। नॉर्मोक्सिया, इम्यूनोस्प्रेसिव हाइपोक्सिया और टीजीएफ की तुलना में आईएनओएस के अभिव्यक्ति स्तर में काफी कमी आई और पीबी न्यूट्रोफिल में आर्गिनेज के स्तर में वृद्धि हुई, जबकि सीएआर न्यूट्रोफिल ने आईएनओएस के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को बरकरार रखा। पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि Syk-Erk सिग्नलिंग मार्ग के सक्रिय होने से ROS उत्पादन होता है। इसलिए, हमने अनमॉडिफाइड न्यूट्रोफिल और सीएआर-न्यूट्रोफिल में Syk-Erk सक्रियण का पता लगाया और तुलना की, और हमारे परिणामों ने हाइपोक्सिया (अनुपूरक चित्र 5a-d) के तहत CAR-न्यूट्रोफिल में Syk-Erk मार्ग के काफी अधिक सक्रियण का सुझाव दिया, जो कायम रह सकता है। हाइपोक्सिया के तहत सीएआर-न्यूट्रोफिल का अपरिवर्तित आरओएस उत्पादन। एक साथ लेने पर, सीएआर-न्यूट्रोफिल ने एक एंटी-ट्यूमर फेनोटाइप बनाए रखा और इन विट्रो में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने वाली स्थितियों के तहत उच्च एंटी-ट्यूमर गतिविधियों को बनाए रखा, जो लक्षित इम्यूनोथेरेपी में उनकी क्षमता को उजागर करता है।

Fig. 2 | Screening neutrophil-specific chimeric antigen receptor (CAR) structures with enhanced neutrophil-mediated anti-tumor activities. a Schematic of various CAR structures. b Schematic of CAR #1 construct and targeted knock-in strategy at the AAVS1 safe harbor locus of human pluripotent stem cells (hPSCs). The vertical arrow indicates the AAVS1 targeting sgRNA. Red and blue horizontal arrows indicate primers for assaying targeting efficiency and homozygosity, respectively. HDR: homologous recombination repair. c Schematic of optimized neutrophil differentiation from hPSCs under chemically defined conditions. d Cytotoxicity assays against U87MG glioblastoma cells were performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, two-tailed Student's t-test. Reactive oxygen species (ROS) generation (e) and ELISA analysis of TNFα release (f) from different neutrophils after coculturing with U87MG cells were determined. n = 5 biologically independent samples. The data are represented as mean ± SD, two-tailed Student's t-test. Source data are provided as a Source Data file.


चित्र 2|बढ़ी हुई न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता विरोधी ट्यूमर गतिविधियों के साथ न्यूट्रोफिल-विशिष्ट काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) संरचनाओं की स्क्रीनिंग। विभिन्न कार संरचनाओं का एक योजनाबद्ध विवरण। बी मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) के एएवीएस1 सुरक्षित हार्बर लोकस पर सीएआर #1 निर्माण और लक्षित नॉक-इन रणनीति का योजनाबद्ध। ऊर्ध्वाधर तीर AAVS1 को sgRNA को लक्षित करने का संकेत देता है। लाल और नीले क्षैतिज तीर क्रमशः लक्ष्यीकरण दक्षता और समरूपता परख के लिए प्राइमरों को दर्शाते हैं। एचडीआर: सजातीय पुनर्संयोजन मरम्मत। सी रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत एचपीएससी से अनुकूलित न्यूट्रोफिल भेदभाव की योजनाबद्ध। डी U87MG ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के खिलाफ साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण संकेतित न्यूट्रोफिल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल-टू-ट्यूमर लक्ष्य के विभिन्न अनुपातों में किया गया था। डेटा को पांच स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट के माध्य ± एसडी के रूप में दर्शाया गया है। U87MG कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति के बाद विभिन्न न्यूट्रोफिल से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) पीढ़ी (ई) और टीएनएफ रिलीज (एफ) का एलिसा विश्लेषण निर्धारित किया गया था। n=5 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने। डेटा को माध्य ± एसडी, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट के रूप में दर्शाया गया है। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

तिरापज़ामाइन (टीपीजेड) युक्त SiO2 नैनोकणों से भरे एचपीएससी कार-न्यूट्रोफिल की तैयारी और लक्षण वर्णन

पीबी न्यूट्रोफिल का उपयोग ब्रेन ट्यूमर8-10 में इमेजिंग और चिकित्सीय दवाएं पहुंचाने के लिए सेलुलर वाहक के रूप में किया गया है, हालांकि लक्षित न्यूट्रोफिल घुसपैठ के लिए सर्जरी की आवश्यकता होती है - या प्रकाश-प्रेरित सूजन और ऑफ-टारगेट दवा वितरण एक चिंता का विषय हो सकता है। सीएआर-न्यूट्रोफिल की ट्यूमर-विरोधी गतिविधियों को और बेहतर बनाने के लिए, हमने कीमोथेराप्यूटिक या विकिरण दवाओं को न्यूट्रोफिल में लोड करने के लिए खुरदरी या चिकनी सतह के साथ सिलिका नैनोकण (SiO 2- NP) तैयार किया। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) छवियों से पता चला कि दोनों SiO2 नैनोकण अच्छी तरह से फैले हुए थे और एक समान आकार के साथ गोलाकार आकारिकी प्रदर्शित करते थे (चित्र 3 ए, अनुपूरक चित्र 6 ए)। ऊर्जा-छितरी हुई एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस) के साथ टीईएम (एसटीईएम) को स्कैन करके संरचना वितरण विश्लेषण से पता चला कि सल्फर (एस) तत्व पूरे मोटे SiO2 नैनोकणों (आर-सीओओ 2) (छवि 3 बी) के भीतर समान रूप से वितरित किया गया था। नाइट्रोजन (एन2) सोखना-उजाड़ना इज़ोटेर्म और संबंधित छिद्र आकार वितरण विश्लेषण का उपयोग करके, आर- और एसएसआईओ2 एनपी के छिद्र आकार को क्रमशः 25 एनएम और 35 एनएम (छवि 3 सी, अनुपूरक छवि 6 बी) के रूप में मापा गया था। उच्च सतह क्षेत्र और बड़े छिद्र आकार को देखते हुए, चिकित्सीय दवाओं को प्रभावी ढंग से आर- और एस-सीओओ 2 एनपीएस दोनों में लोड किया जा सकता है, जैसा कि हाइपोक्सिया-उत्तरदायी प्रो-ड्रग तिरापज़ामाइन (टीपीजेड) (चित्र 3 डी, अनुपूरक चित्र 6 सी) द्वारा उदाहरण दिया गया है। . टीपीजेड लोडिंग के बाद, टीईएम और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण (पूरक छवि 6 डी, ई) का उपयोग करके आर-सीओओ 2- टीपीजेड के फैलाव, आकारिकी और आकार में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखे गए। R-SiO2 NPs में शामिल टेट्रा-सल्फाइड बॉन्ड रिडक्टिव वातावरण के प्रति संवेदनशील होते हैं और ट्यूमर कोशिकाओं के भीतर मौजूद ग्लूटाथियोन (GSH) की बड़ी मात्रा से तेजी से नष्ट हो सकते हैं। हमने अगली बार 10 mM, 1 mM और 10 μM GSH की उपस्थिति में R-SiO2-TPZ NPs की GSH उत्तरदायी गिरावट का निर्धारण किया, जो क्रमशः कैंसर कोशिकाओं, सामान्य कोशिकाओं और बाह्य कोशिकीय वातावरण की इंट्रासेल्युलर स्थितियों के समान थे। 10 एमएम जीएसएच उपचार पर, आर-सीओ2-टीपीजेड एनपी की प्रारंभिक गोलाकार संरचना 24 घंटे के बाद गंभीर रूप से नष्ट हो गई थी (पूरक छवि 6 एफ, जी)। 48 घंटे के बाद नैनोकण पूरी तरह से छोटे मलबे में विघटित हो गए, जिसके परिणामस्वरूप टीपीजेड जीएसएच-उत्तरदायी तरीके से जारी हुआ (चित्र 3ई)। R-SiO2 NPs के मलबे ने इन विट्रो में परीक्षण की गई कोशिकाओं में कोई महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी नहीं पैदा की (पूरक छवि 6h), जो R-SiO2 NPs की सापेक्ष सुरक्षा को दर्शाता है।

Desert ginseng—Improve immunity (2)

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हमने अगली बार बढ़ी हुई चिकित्सीय प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए एक संयोजन कीमोइम्यूनोथेरेपी के रूप में चिकित्सीय दवाओं को सीएआर-न्यूट्रोफिल में लोड करने के लिए SiO2-TPZ NPs का उपयोग करने की व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, हमने एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (छवि 3 एफ, जी) का उपयोग करके न्यूट्रोफिल द्वारा SiO2-TPZ NPs के सेलुलर अवशोषण को मापा, और S-SiO2 की तुलना में R-SiO2-TPZ NPs के अधिक महत्वपूर्ण सेलुलर अवशोषण का पता लगाया। न्यूट्रोफिल द्वारा टीपीजेड एनपी। न्यूट्रोफिल में सेलुलर Si सामग्री को क्रमशः युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ICP-MS) द्वारा चिकनी और खुरदरी SiO2 NPs@TPZ (चित्र 3h) के लिए 11.3 और 19.1 ng Si/ug प्रोटीन के रूप में मापा गया था। न्यूट्रोफिल में उनकी उच्च लोडिंग क्षमता को देखते हुए, R-SiO2-TPZ NPs को बाद के प्रयोगों के लिए नियोजित किया गया था। हमने R-SiO2-TPZ NPs को लोड करने के बाद CAR न्यूट्रोफिल के शारीरिक कार्यों का परीक्षण करने की कोशिश की। R-SiO2 लोड करने से पहले या बाद में सेल व्यवहार्यता (छवि 3i, अनुपूरक छवि 6i), ट्रांसवेल माइग्रेशन क्षमता (छवि 3j), केमोटैक्सिस, और सीएआर-न्यूट्रोफिल के संबंधित वेग (छवि 3k, एल) में कोई बदलाव नहीं देखा गया। -टीपीजेड एनपी, उनकी उच्च जैव अनुकूलता को प्रदर्शित करता है। समय-निर्भर नैनो-ड्रग लोडिंग विश्लेषण भी किया गया था और सेल-एनपी ऊष्मायन (पूरक छवि 7 ए) के बाद अधिकतम लोडिंग सामग्री 1 घंटे पर पहुंच गई थी। 95% से अधिक CAR-न्यूट्रोफिल को R-SiO2-TPZ NPs (अनुपूरक चित्र 7 बी) के साथ सफलतापूर्वक लोड किया गया था। CD11b का अभिव्यक्ति स्तर, एक न्युट्रोफिल सतह प्रोटीन जो सूजन वाले अणु उत्तेजना पर आसंजन और माइग्रेशन फ़ंक्शन में मध्यस्थता करता है, R-SiO के साथ या उसके बिना CAR-न्यूट्रोफिल पर नहीं बदला गया था टीपीजेड लोडिंग (पूरक छवि 7 सी, डी)। रोगाणुओं और ट्यूमर कोशिकाओं44 को मारने के लिए सक्रिय न्यूट्रोफिल से सुपरऑक्साइड या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) जारी की जाती हैं। जैसा कि अपेक्षित था, एन-फॉर्मिलमेथिओनिन-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी) उपचार के बाद सीएआर-न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन में काफी वृद्धि हुई थी, और आर-सीओओ लोड करने से पहले और बाद में सीएआर-न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन में महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। टीपीजेड (चित्र 3एम)। एक साथ लेने पर, हमारे डेटा से पता चला कि R-SiO2-TPZ लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल जंगली-प्रकार के न्यूट्रोफिल की शारीरिक गतिविधियों को बनाए रखते हैं और सक्रिय रूप से सूजन संबंधी उत्तेजनाओं की ओर पलायन कर सकते हैं, जो लक्षित कैंसर कीमोइम्यूनोथेरेपी में उनकी क्षमता को उजागर करते हैं।

R-SiO2-TPZ नैनोकणों से भरे हुए CAR-न्यूट्रोफिल ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से मार देते हैं

हमने अगली बार CAR-न्यूट्रोफिल की ट्यूमर-हत्या क्षमता पर R-SiO2-TPZ के प्रभाव का मूल्यांकन किया। न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता साइटोलिसिस के लिए अंतरंग प्रभावकार-लक्ष्य संपर्क एक शर्त थी। जैसा कि अपेक्षित था, CAR-neutrphils@R-SiO2-TPZ ने 2 घंटे के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षा सिनैप्स का गठन किया और दवा-मुक्त CAR-न्यूट्रोफिल (छवि 4 ए, अनुपूरक चित्र 8) के समान प्रभावकार-लक्ष्य इंटरैक्शन संख्या प्रदर्शित की। . उल्लेखनीय रूप से, CAR-neutrphils@RSiO2-TPZ और गैर-कैंसरयुक्त दैहिक कोशिकाओं (अनुपूरक चित्र 8) के बीच कोई अवलोकनीय अंतःक्रिया नहीं पाई गई, जो मस्तिष्क ट्यूमर के खिलाफ CLTX-CAR की विशिष्टता को उजागर करती है। इसके अलावा, R-SiO2-TPZ NPs को सह-संस्कृति के 12 घंटे बाद न्यूट्रोफिल से संस्कृति माध्यम (पूरक छवि 9 ए, बी) में जारी किया गया और शेष ट्यूमर कोशिकाओं (छवि 4 ए) में प्रवेश किया गया। ट्यूमर कोशिकाओं के साथ SiO2-TPZ NP-लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल के सह-ऊष्मायन के चौबीस घंटे बाद, 95% तक ट्यूमर कोशिकाओं में R-SiO2-TPZ NPs (चित्र 4a, अनुपूरक चित्र 9c) शामिल थे, जो सफल होने का संकेत देता है। परिवहन कैस्केड में वाहक न्यूट्रोफिल शामिल होते हैं जो अपने प्रभावकारी कोशिका कार्य को बढ़ाते हैं और एपोप्टोसिस से गुजरते हैं, जिससे लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं को निष्क्रिय रूप से R-SiO2-TPZ NPs जारी होता है। हमने ट्यूमर कोशिकाओं के भीतर प्रो-ड्रग टीपीजेड के हाइपोक्सिक रिस्पॉन्सिव फ़ंक्शन और साइटोटॉक्सिसिटी को टीपीजेड (सप्लीमेंट्री छवि 9डी) से रेडिकल्स जेनरेशन के इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक रेजोनेंस (ईपीआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण और ट्यूमर पर TOPRO-3 के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा मान्य किया है। हाइपोक्सिया और नॉरमोक्सिया के तहत कोशिकाएं (पूरक चित्र 9ई)। R-SiO2-TPZ NP-लोडेड CAR न्यूट्रोफिल के साइटोलिसिस को निर्धारित करने के लिए, हमने इन विट्रो नॉरमोक्सिया-हाइपोक्सिया ट्यूमर रीचैलेंजिंग मॉडल (छवि 4 बी) लागू किया। नॉर्मोक्सिक कोकल्चर के चौबीस घंटे बाद, आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी से भरे सीएआर-न्यूट्रोफिल या समान एंटी-ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी (छवि 4 सी) प्रदर्शित नहीं हुए, और दोनों आर से भरे पीबी-न्यूट्रोफिल से अधिक थे। -SiO2-TPZ NPs या नहीं और R-SiO2- TPZ NPs अकेले। बढ़ी हुई साइटोटॉक्सिसिटी मुख्य रूप से सीएआर इंजीनियरिंग के बाद न्यूट्रोफिल की बढ़ी हुई ट्यूमर-लक्ष्यीकरण क्षमता के कारण है। ट्यूमर कोशिकाओं के साथ अतिरिक्त 12 और 24- घंटे के हाइपोक्सिक सहसंस्कृति के बाद, आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी-लोडेड सीएआर-न्यूट्रोफिल ने अन्य समूहों की तुलना में बेहतर ट्यूमर-विरोधी क्षमता प्रदर्शित की (चित्र 4डी, ई)। इसके अलावा, R-SiO2-TPZ NPs से भरे हुए CAR न्यूट्रोफिल ने पुन: बीजित ताजा ट्यूमर कोशिकाओं (चित्र 4f) के खिलाफ उत्कृष्ट साइटोलिसिस का प्रदर्शन किया, जो जारी R-SiO2-TPZ की ट्यूमर-विरोधी क्षमता को दर्शाता है। न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस के बाद नैनोकण।

फिर हमने सीएआर एक्सप्रेशन और आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी द्वारा न्यूट्रोफिल के बढ़े हुए एंटी-ट्यूमर साइटोलिसिस के अंतर्निहित संभावित आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं पर आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) विश्लेषण किया। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि नियंत्रण और R-SiO 2-TPZ NPs की तुलना में, R-SiO के साथ या उसके बिना लोड किए गए CAR-न्यूट्रोफिल्स 2-TPZ NPs ने ट्यूमर कोशिकाओं में साइटोप्लाज्म और झिल्ली जीन की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया है ( अनुपूरक चित्र 10ए, चित्र 4जी), सहसंवर्धन पर ट्यूमर कोशिकाओं के उनके फागोसाइटोसिस का समर्थन करता है। जबकि सभी प्रयोगात्मक समूहों ने ट्यूमर कोशिकाओं में सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ाया, आर-सीओओ 2-टीपीजेड-लोडेड सीएआर-न्यूट्रोफिल ने ऑक्सीडेटिव तनाव सिग्नलिंग को ट्रिगर करने में अन्य समूहों को बेहतर प्रदर्शन किया। इसके अलावा, R-SiO2-TPZ-लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल ने एपोप्टोसिस को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दिया और ट्यूमर कोशिकाओं में प्रसार को कम किया। R-SiO2-TPZ-लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल की बढ़ी हुई एंटी-ट्यूमर गतिविधियों को और समझने के लिए, हमने एक फागोसाइटोसिस अवरोधक साइटोकैलासिन डी और एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) स्वेवेंजर एन-एसिटाइल-सिस्टीन (एनएसी) लागू किया और ट्यूमर-न्यूट्रोफिल सहसंस्कृति के लिए एक आरओएस अवरोधक जीएसके2795039। सीएआर-न्यूट्रोफिल द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं के साइटोलिसिस को 5 μM साइटोकैलासिन डी, 5 मिमी एनएसी, और 100 एनएम जीएसके2795039 (पूरक छवि 10 बी, सी) द्वारा काफी कम किया गया था, जो सीएआर न्यूट्रोफिल-मध्यस्थ ट्यूमर-सेल में फागोसाइटोसिस और आरओएस की प्रमुख भूमिका को दर्शाता है। मारना। न्युट्रोफिल और एनएसी या जीएसके2795039 की उपस्थिति में शेष 40%-50% ट्यूमर कोशिका लसीका न्युट्रोफिल-मध्यस्थ ट्यूमर-हत्या में आरओएस-स्वतंत्र तंत्र की भागीदारी को इंगित करता है जो आगे की जांच के लायक है।

Fig. 3 | Preparation and characterization of hPSC CAR-neutrophils loaded with tirapazamine (TPZ)-containing SiO2 nanoparticles. a–e Transmission electron microscope (TEM) (a) and energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental mapping images (b) of rough SiO2 nanoparticles are shown. c Nitrogen adsorption-desorption isotherm of rough SiO2 nanoparticles along with Barrett-JoynerHalenda (BJH) pore size distribution plot is shown. Biological triplicates were performed independently. TPZ loading content in SiO2 nanoparticles (d) and glutathione (GSH)--responsive TPZ release (e) were measured at the indicated time. n = 3 biologically independent samples. One-way analysis of variance (ANOVA) for (e). Fluorescence images (f) and flow cytometry analysis (g) of neutrophils loaded with smooth and rough SiO2-TPZ. Biological triplicates were performed independently. h Cellular SiO2 content in hPSC-derived CAR-neutrophils was measured. n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. Cellular viability (i), n = 3 biologically independent samples, transmigration (j), n = 5 biologically independent samples, chemoattraction abilities (k, l), n = 20 biologically independent samples, and ROS generation ability (m) of hPSC-derived CAR-neutrophils loaded with or without rough SiO2-TPZ were shown, n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. PMA: phorbol myristate acetate. All data in this figure are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file.


चित्र 3|तिरापज़ामाइन (टीपीजेड) युक्त SiO2 नैनोकणों से भरे एचपीएससी कार-न्यूट्रोफिल की तैयारी और लक्षण वर्णन। ए-ई ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) (ए) और ऊर्जा फैलाव स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस) खुरदुरे SiO2 नैनोकणों की मौलिक मैपिंग छवियां (बी) दिखाई जाती हैं। सी बैरेट-जॉयनर हैलेंडा (बीजेएच) छिद्र आकार वितरण प्लॉट के साथ खुरदरे SiO2 नैनोकणों का नाइट्रोजन सोखना-उजाड़ना इज़ोटेर्म दिखाया गया है। जैविक त्रिप्रतिकृतियों का स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया गया। SiO2 नैनोकणों (डी) और ग्लूटाथियोन (जीएसएच) में टीपीजेड लोडिंग सामग्री को संकेतित समय पर मापा गया था। n=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने। (ई) के लिए विचरण (एनोवा) का एक-तरफ़ा विश्लेषण। चिकने और खुरदरे SiO2-TPZ से भरे न्यूट्रोफिल की प्रतिदीप्ति छवियां (एफ) और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (जी)। जैविक त्रिप्रतिकृतियों का स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया गया। एचपीएससी-व्युत्पन्न सीएआर-न्यूट्रोफिल में सेलुलर SiO2 सामग्री को मापा गया था। n=5 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने, दो-पूंछ वाले छात्र का टी-परीक्षण। सेलुलर व्यवहार्यता (i), n=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने, स्थानान्तरण (j), n=5 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने, कीमोआकर्षण क्षमता (k, l), n=20 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने, और रफ SiO के साथ या उसके बिना लोड किए गए hPSC-व्युत्पन्न CAR-न्यूट्रोफिल की ROS उत्पादन क्षमता (m) TPZ को दिखाया गया, n=5 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने, दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट। पीएमए: फोर्बोल मिरिस्टेट एसीटेट। इस आंकड़े में सभी डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में दर्शाया गया है। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

इन विट्रो में बायोमिमेटिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल का उपयोग करके नैनो दवाओं से भरे सीएआर-न्यूट्रोफिल का कार्यात्मक मूल्यांकन

R-SiO 2- TPZ NP-लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल की गतिविधियों का और अधिक आकलन करने के लिए, हमने मानव सेरेब्रल माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (छवि 5 ए, अनुपूरक चित्र) का उपयोग करके एक ट्रांसवेल-आधारित रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) ट्यूमर मॉडल लागू किया। .11ए). जैसा कि अपेक्षित था, आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी-लोडेड सीएआर-न्यूट्रोफिल ने इन विट्रो बीबीबी मॉडल (छवि 5 बी) में उत्कृष्ट स्थानांतरण क्षमता का प्रदर्शन किया, जो नॉर्मोक्सिक और हाइपोक्सिक दोनों स्थितियों के तहत स्थानांतरण के बाद लक्षित ट्यूमर कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से मारता है (चित्र 5 सी) , डी), और अधिक सूजन वाले साइटोकिन्स जारी करता है (चित्र 5e) जो ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए अन्य प्रभावकारी कोशिकाओं को आकर्षित कर सकता है। इसके अलावा, सीएआर न्यूट्रोफिल ने ट्रांसमाइग्रेशन के बाद एंडोथेलियल कोशिकाओं की व्यवहार्यता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया (पूरक छवि 11 बी)। R-SiO2-TPZ NP-लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल ने दूसरे ट्रांसमाइग्रेशन प्रयोग (चित्र 5f) के दौरान उत्कृष्ट ट्रांसमाइग्रेशन क्षमता और अन्य समूहों (चित्र 5g) की तुलना में बेहतर एंटी-ट्यूमर क्षमता बरकरार रखी। आर-सीओओ टीपीजेड एनपी-लोडेड सीएआर-न्यूट्रोफिल (छवि 5 एच) की ट्यूमर प्रवेश क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक त्रि-आयामी (3 डी) ट्यूमर गोलाकार मॉडल को नियोजित किया गया था। सीएआर-न्यूट्रोफिल धीरे-धीरे ट्यूमर गोलाकार के केंद्र की ओर चले गए और ऊष्मायन के 8 घंटे के बाद गोलाकार में समान रूप से वितरित हो गए (चित्र 5i)। CAR न्यूट्रोफिल और R-SiO2-TPZ NPs के बीच उच्च स्तर का सह-स्थानीयकरण देखा गया (पूरक चित्र 12a-c), यह दर्शाता है कि R-SiO2-TPZ NPs को CAR में स्थिर रूप से संपुटित किया गया था। -न्यूट्रोफिल उनके साइटोलिसिस से पहले ट्यूमर घुसपैठ के दौरान। न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता वितरण के बिना, R-SiO2-TPZ NPs केवल ट्यूमर स्फेरॉइड की बाहरी परत पर पाए गए। R-SiO2-TPZ NPs और CAR-न्यूट्रोफिल की तुलना में, R-SiO2-TPZ NP-लोडेड CAR न्यूट्रोफिल ने 3D ट्यूमर मॉडल (चित्र 5j) में बेहतर एंटी-ट्यूमर साइटोलिसिस प्रदर्शित किया। CAR-neutrphils@R-SiO2 NPs को क्लिनिकल टेम्पोज़ोलोमाइड (TMZ) और JNJ - 64619187 सहित अन्य दवाओं को 3D ट्यूमर मॉडल में वितरित करने और GBM कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक मारने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है (पूरक छवि 12d-f)। एक साथ लेने पर, कॉम्बिनेटरी सीएआर न्यूट्रोफिल और नैनो ड्रग्स ने इन विट्रो में स्थितियों की नकल करते हुए बायोमिमेटिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में उत्कृष्ट एंटी-ट्यूमर गतिविधियां प्रदर्शित कीं, जो कॉम्बिनेटरी न्यूट्रोफिल-आधारित कीमोइम्यूनोथेरेपी की चिकित्सीय क्षमता को उजागर करती हैं।

Desert ginseng—Improve immunity (9)

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

सीएआर न्यूट्रोफिल-डिलीवर आर-सीओओ 2- टीपीजेड नैनोकणों का विवो वितरण

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >प्रशासित नैनोड्रग्स का 20% सीएआर-न्यूट्रोफिल द्वारा मस्तिष्क ट्यूमर में पहुंचाया गया, जबकि 1% मुफ्त नैनोड्रग्स द्वारा दिया गया, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है। सीएआर-न्यूट्रोफिल द्वारा बीबीबी में मेजबान मस्तिष्क को आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी की लक्षित डिलीवरी की भी ऊतक विज्ञान विश्लेषण (चित्र 6डी) द्वारा पुष्टि की गई थी। इसके विपरीत, अकेले R-SiO2-TPZ NPs मुख्य रूप से यकृत और प्लीहा में जमा होते हैं। सामूहिक रूप से, हमारे डेटा ने ट्यूमर साइट पर अतिरिक्त सूजन उत्पन्न करने की आवश्यकता के बिना सीएआर न्यूट्रोफिल द्वारा आर-सीओओ टीपीजेड एनपी की बढ़ी हुई लक्षित डिलीवरी का प्रदर्शन किया, जो कैंसर के उपचार में न्यूट्रोफिल-आधारित कीमोइम्यूनोथेरेपी की व्यवहार्यता और सुरक्षा पर प्रकाश डालता है।

सीएआर-न्यूट्रोफिल और आर-सीओओ 2- टीपीजेड नैनोकणों की संयुक्त कीमोइम्यूनोथेरेपी ने विवो में उत्कृष्ट एंटी ग्लियोब्लास्टोमा गतिविधियों का प्रदर्शन किया

R-SiO2-TPZ NP-लोडेड CAR न्यूट्रोफिल की चिकित्सीय प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) चूहों में ल्यूसिफरेज़ व्यक्त U87MG कोशिकाओं का उपयोग करके ग्लियोब्लास्टोमा का एक इन सीटू ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल स्थापित किया गया था। ट्यूमर वाले चूहों को साप्ताहिक रूप से 5 × 106 न्यूट्रोफिल प्रशासित किया गया (छवि 7 ए), और मेजबानों में ट्यूमर का बोझ मापा गया और मात्रा निर्धारित की गई (छवि 7 बी, सी)। पीबीएस या पीबी-न्यूट्रोफिल-उपचारित चूहों की तुलना में, सीएआर-न्यूट्रोफिल और सीएआर न्यूट्रोफिल@आर-सीओ2-टीपीजेड एनपी के साथ उपचार ने ट्यूमर के विकास को प्रभावी ढंग से धीमा कर दिया। CAR न्यूट्रोफिल्स@R-SiO2-TPZ NPs ने किसी भी अन्य प्रायोगिक समूह की तुलना में बहुत अधिक एंटी-ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित की। इसके विपरीत, पीबी-न्यूट्रोफिल ने मस्तिष्क में ट्यूमर के विकास को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दिया, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर वाले चूहों की 23 दिन की शुरुआत में ही मृत्यु हो गई (चित्र 7 डी), यह सुझाव देता है कि गैर-इंजीनियर्ड न्यूट्रोफिल अतिरिक्त जोखिम पैदा कर सकते हैं। इसके बाद हमने विभिन्न प्रायोगिक माउस समूहों के प्लाज्मा में मानव साइटोकिन रिलीज को मापा (चित्र 7ई)। सभी गैर-पीबीएस प्रयोगात्मक समूहों ने 5वें दिन से 26वें दिन तक प्लाज्मा में पता लगाने योग्य टीएनएफ और आईएल-6 का उत्पादन किया, जो ट्यूमर उत्तेजना पर मानव न्यूट्रोफिल के सक्रियण का सुझाव देता है। देखी गई उच्च ट्यूमर वृद्धि दर के अनुरूप, असंशोधित न्यूट्रोफिल धीरे-धीरे अधिक आईएल -6 और टीएनएफ जारी करते हैं, जिससे रोगियों में साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम हो सकता है और आईएल -6 ब्लॉकर्स46,47 के साथ अधिक गहन सुरक्षा अध्ययन की आवश्यकता होती है। . विशेष रूप से, CAR-neutrphils@RSiO2-TPZ NPs ने बाद के समय बिंदुओं (दिन 19 और दिन 26) पर साइटोकिन उत्पादन क्षमता में कमी प्रदर्शित की, जो CAR-न्यूट्रोफिल आधारित कीमोइम्यूनोथेरेपी से इलाज किए गए रोगियों में साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम के संभावित कम जोखिम का सुझाव देता है। शरीर के वजन के साप्ताहिक माप और चूहों के प्रमुख अंगों में रोग संबंधी परिवर्तनों की निगरानी के माध्यम से कॉम्बिनेटरी सीएआर-न्यूट्रोफिल और आर-सीओ2-टीपीजेड एनपी की जैव अनुकूलता का मूल्यांकन किया गया था। CAR न्यूट्रोफिल@R-SiO2-TPZ एनपी-उपचारित चूहों और किसी भी अन्य प्रयोगात्मक समूह (छवि 7f) के बीच शरीर के वजन में कोई अंतर नहीं देखा गया, जो न्यूनतम प्रणालीगत विषाक्तता और CAR-न्यूट्रोफिल@R-SiO2-TPZ NPs की उत्कृष्ट जैव अनुकूलता का संकेत देता है। 28 दिन का इलाज. 30वें दिन चूहों से काटे गए प्रमुख अंगों के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला कि CAR-neutrphils@R-SiO2-TPZ NP-उपचारित चूहों के हृदय, यकृत, प्लीहा, फेफड़े और गुर्दे में ध्यान देने योग्य असामान्यता या अंग क्षति नहीं हुई (पूरक चित्र)। 13), कॉम्बिनेटरी सीएआर-न्यूट्रोफिल और आर-सीओ2-टीपीजेड एनपी की सुरक्षा की पुष्टि करता है।

Fig. 4 | CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles effectively kill glioblastoma cells. Representative images of immunological synapses indicated by polarized F-actin accumulation at the interface between CAR-neutrophils and tumor cells at 6, 12, and 24 h were shown. R-SiO2-TPZ nanoparticles released from CAR-neutrophils upon tumor cell phagocytosis were up-taken by tumor cells. Triplicates were performed independently. b Schematic of neutrophil-mediated anti-tumor cytotoxicity assay. Cytotoxicity against U87MG glioblastoma cells was performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils at 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), and 72 h (f). n = 3 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD, one-way analysis of variance (ANOVA). g Bulk RNA sequencing analysis was performed on U87MG cells under various conditions. Heatmap shows expression levels of selected cytoplasm, membrane, oxidative stress, apoptosis, and proliferation-related genes in the indicated glioblastoma cells. n = 2 biologically independent samples. Source data are provided as a Source Data file.

चित्र 4|R-SiO2-TPZ नैनोकणों से भरे CAR-न्यूट्रोफिल ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से मार देते हैं। 6, 12, और 24 घंटे पर सीएआर-न्यूट्रोफिल और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच इंटरफेस पर ध्रुवीकृत एफ-एक्टिन संचय द्वारा इंगित प्रतिरक्षाविज्ञानी सिनैप्स की प्रतिनिधि छवियां दिखाई गईं। ट्यूमर सेल फागोसाइटोसिस पर सीएआर-न्यूट्रोफिल से जारी आर-सीओओ 2- टीपीजेड नैनोकणों को ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा ग्रहण किया गया था। त्रिप्रतिकृतियों का प्रदर्शन स्वतंत्र रूप से किया गया। बी न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता विरोधी ट्यूमर साइटोटोक्सिसिटी परख की योजनाबद्ध। U87MG ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के खिलाफ साइटोटॉक्सिसिटी 24 एच (सी), 36 एच (डी), 48 एच (ई), और 72 एच (एफ) पर संकेतित न्यूट्रोफिल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल-टू-ट्यूमर लक्ष्य के विभिन्न अनुपात में किया गया था। n=3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने। डेटा को माध्य ± एसडी, विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण (एनोवा) के रूप में दर्शाया गया है। जी बल्क आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण विभिन्न परिस्थितियों में U87MG कोशिकाओं पर किया गया था। हीटमैप संकेतित ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में चयनित साइटोप्लाज्म, झिल्ली, ऑक्सीडेटिव तनाव, एपोप्टोसिस और प्रसार-संबंधी जीन के अभिव्यक्ति स्तर को दर्शाता है। n=2 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

Fig. 5 | Functional evaluation of CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles using biomimetic glioblastoma (GBM) models in vitro. a Schematic of our in vitro tumor model of GBM with blood-brain-barrier (BBB), which is composed of endothelial cells on the cell insert membrane and tumor cells in the bottom of the same transwell. b Transwell migration analysis of neutrophils at 12 h is shown. Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 24 h (c) and 36 h (d) was measured and quantified. e ELISA analysis of IL-6 and TNFα released from indicated neutrophils at 36 h was performed. f Second migration of different neutrophils at 48 h is shown. g Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 60 h was measured and quantified. h–j Schematic of neutrophil-infiltrated three-dimensional (3D) tumor model in vitro was shown in (h). Representative fluorescent images of infiltrated neutrophils in the 3D tumor models were shown. DAPI was used to stain the cell nuclear and CD45 was used to stain neutrophils. Scale bars, 200 μm. Biological triplicates were performed independently. j The corresponding tumor-killing ability of indicated neutrophils was measured and quanti- fied using a cytotoxicity kit. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, one-way analysis of variance (ANOVA). Source data are provided as a Source Data file.


चित्र 5|इन विट्रो में बायोमिमेटिक ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मॉडल का उपयोग करके आर-सीओओ टीपीजेड नैनोकणों से भरे सीएआर-न्यूट्रोफिल का कार्यात्मक मूल्यांकन। ब्लड-ब्रेन-बैरियर (बीबीबी) के साथ जीबीएम के हमारे इन विट्रो ट्यूमर मॉडल का एक योजनाबद्ध, जो एक ही ट्रांसवेल के निचले भाग में सेल इंसर्ट झिल्ली और ट्यूमर कोशिकाओं पर एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना है। बी 12 घंटे पर न्यूट्रोफिल का ट्रांसवेल माइग्रेशन विश्लेषण दिखाया गया है। 24 घंटे (सी) और 36 घंटे (डी) पर संकेतित न्यूट्रोफिल की एंटी-जीबीएम साइटोटॉक्सिसिटी को मापा और निर्धारित किया गया था। 36 घंटे पर संकेतित न्यूट्रोफिल से जारी आईएल -6 और टीएनएफ का एलिसा विश्लेषण किया गया। f 48 घंटे पर विभिन्न न्यूट्रोफिल का दूसरा प्रवास दिखाया गया है। 60 घंटे पर संकेतित न्यूट्रोफिल की जी एंटी-जीबीएम साइटोटॉक्सिसिटी को मापा और निर्धारित किया गया। एच-जे इन विट्रो में न्यूट्रोफिल-घुसपैठित त्रि-आयामी (3 डी) ट्यूमर मॉडल का योजनाबद्ध (एच) में दिखाया गया था। 3डी ट्यूमर मॉडल में घुसपैठ किए गए न्यूट्रोफिल की प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां दिखाई गईं। डीएपीआई का उपयोग कोशिका परमाणु को दागने के लिए किया गया था और सीडी45 का उपयोग न्यूट्रोफिल को दागने के लिए किया गया था। स्केल बार, 200 μm. जैविक त्रिप्रतिकृतियों का स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया गया। जे संकेतित न्यूट्रोफिल की संबंधित ट्यूमर-हत्या क्षमता को साइटोटॉक्सिसिटी किट का उपयोग करके मापा और मात्राबद्ध किया गया था। डेटा को पांच स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के माध्य ± एसडी के रूप में दर्शाया गया है, विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण (एनोवा)। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

जबकि CAR-neutrphil@R-SiO2–TPZ NPs ने ज़ेनोग्राफ़्ट चूहों में ट्यूमर के विकास को काफी धीमा कर दिया है, CAR-neutrphils, SiO2–TPZ NPs और CAR-neutrphil@R-SiO2–TPZ NPs के प्रयोगात्मक समूहों में जानवरों के जीवित रहने में अंतर नगण्य है। (पी > 0.05), जो संभवतः कोशिका की तैयारी और इंजेक्शन के दौरान अल्पकालिक न्यूट्रोफिल की मृत्यु के कारण होता है। हमने आगे इन तीन समूहों पर ध्यान केंद्रित किया और निर्धारित किया कि क्या सेल तैयार करने का समय कम करने और सीएआर-न्यूट्रोफिल और नैनो दवाओं की बढ़ी हुई खुराक से जानवरों के अस्तित्व में कोई फर्क पड़ेगा (चित्र 7 जी)। जब व्यवस्थित रूप से 6 बार प्रशासित किया गया, तो CAR-neutrphil@R-SiO2-TPZ NPs ने ट्यूमर-असर चूहों (छवि 7h) के जीवनकाल को बढ़ाने में अन्य दो समूहों को बेहतर प्रदर्शन किया, जबकि CAR-न्यूट्रोफिल और SiO2- के समूहों में जानवरों के जीवित रहने का अंतर टीपीजेड एनपी महत्वहीन रहे। जबकि इन दो स्वतंत्र पशु अध्ययनों के बीच आर-सीओओ 2- टीपीजेड समूह का एक समान अस्तित्व वक्र देखा गया, पहले 4 न्यूट्रोफिल के दौरान कोशिका अलगाव और इंजेक्शन की तैयारी में कुल ~4 घंटे से 1 घंटे तक का समय कम हो गया। खुराक से 32 दिन से पहले सीएआर-न्यूट्रोफिल समूहों में पशु अस्तित्व में सुधार हुआ। सामूहिक रूप से, हमारे डेटा ने न्यूट्रोफिल चिकित्सीय के भविष्य के नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों में न्यूट्रोफिल तैयारी और खुराक अनुकूलन के महत्व को प्रदर्शित किया।

बहस

माउस न्यूट्रोफिल को एक शक्तिशाली वाहक के रूप में प्रदर्शित किया गया है जो सूजन वाले पोस्ट-ऑपरेटिव ब्रेन ट्यूमर8,9 में नैनोड्रग्स को कुशलतापूर्वक वितरित करता है। फिर भी, दवा वितरण में मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की व्यवहार्यता और सुरक्षा मायावी बनी हुई है। चिकित्सीय लाभ प्राप्त करने के लिए इन अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली माउस न्यूट्रोफिल की बड़ी मात्रा (चूहों में परिसंचारी न्यूट्रोफिल की कुल संख्या से 10 गुना अधिक) उनके नैदानिक ​​​​अनुवाद में और बाधा उत्पन्न कर सकती है क्योंकि कैंसर रोगियों से बड़ी संख्या में न्यूट्रोफिल के निष्कर्षण से न्यूट्रोपेनिया और स्थिति हो सकती है। अन्य जोखिम. इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हमने असीमित डे नोवो मानव न्यूट्रोफिल29 प्राप्त करने में स्व-नवीकरणीय एचपीएससी की शक्ति का उपयोग किया। हमने सीएआर-इंजीनियरिंग29 के साथ एक शक्तिशाली बायोइंस्पायर्ड न्यूट्रोफिल-मध्यस्थ दवा वितरण प्रणाली विकसित की और हड़ताली एंटी-ट्यूमर गतिविधियों के साथ नैनोकैरियर के रूप में इंजीनियर मानव सीएआर-न्यूट्रोफिल का उपयोग किया। रफ SiO2 NPs, CAR-न्यूट्रोफिल वाहकों में चिकने SiO2 NPs की तुलना में बेहतर काम करते हैं, जो पिछले अवलोकनों के अनुरूप है कि न्यूट्रोफिल अधिमानतः रफ माइक्रोबियल रोगजनकों30 को फैगोसाइटोज करते हैं। बताया गया कि न्यूट्रोफिल ग्लियोमा कोशिकाओं48 के प्रसार और प्रगति को बढ़ावा देते हैं। हमने अपने पशु अध्ययन में असंशोधित न्यूट्रोफिल का एक समान प्रो-ट्यूमर प्रभाव देखा, जो दवा वितरण और अन्य चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उनकी सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए न्यूट्रोफिल में सीसीएआर इंजीनियरिंग या अन्य संशोधनों की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। विशेष रूप से, हमारी सीएआर-न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता वाली दवा वितरण पूरी तरह से जीबीएम की मूल कीमो-आकर्षक क्षमता पर निर्भर करती है, लेकिन शल्य चिकित्सा के बाद बढ़े हुए सूजन संकेतों पर नहीं, जो गहराई से घुसपैठ किए गए ग्लियोमास को खत्म करने में हमारी दवा-वितरण प्रणाली की उच्च विशिष्टता और चिकित्सीय क्षमता का सुझाव देती है। जिसे सर्जरी द्वारा हटाया नहीं जा सकता। चूंकि सर्जिकल रिसेक्शन और सहायक कीमोथेरेपी/रेडियोथेरेपी जीबीएम12 के लिए प्राथमिक नैदानिक ​​​​हस्तक्षेप हैं, सीएआर न्यूट्रोफिल नैनोकैरियर और सर्जरी/रेडियोथेरेपी के साथ संयोजन उपचार इष्टतम चिकित्सीय प्रभावकारिता प्राप्त कर सकता है और आगे की जांच के लायक है। टी और एनके कोशिकाओं की ट्यूमर-विरोधी गतिविधियों को बढ़ाने के लिए टी और एनके सेल-विशिष्ट सीएआर निर्माणों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, लेकिन न्यूट्रोफिल-विशिष्ट सीएआर जो न्यूट्रोफिल के ट्यूमर-विरोधी कार्यों में सुधार करते हैं, उनका वर्णन नहीं किया गया है। CD4ζ और CD4 काइमेरिक प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स को पहले इन विट्रो में एचआईवीएनवी-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के खिलाफ न्यूट्रोफिल के साइटोलिसिस को बढ़ाने के लिए रिपोर्ट किया गया था। फिर भी, 10:128 के प्रभावकार-से-लक्ष्य (ई: टी) अनुपात पर लसीका दक्षता केवल ~10% थी। एफसी आरआईआईए (सीडी32ए) मोनोमेरिक आईजीजी के लिए एक कम आत्मीयता वाला एकल-श्रृंखला ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर है जो न्यूट्रोफिल (30,000 से 60,000 अणु/कोशिका31) में अत्यधिक व्यक्त होता है, और इसका बंधाव एफसी को प्रेरित करता है - न्यूट्रोफिल में निर्भर कार्य, जैसे कि ग्रेन्युल सामग्री की रिहाई, सीए 2+ गतिशीलता, एंटी-ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी, और फागोसाइटोसिस49। न्यूट्रोफिल के सक्रियण और कार्य में CD32a की प्रमुख भूमिका को देखते हुए, हमने CD32a-आधारित CAR निर्माणों को डिज़ाइन और परीक्षण किया। हालाँकि, हमारे परिणामों ने प्रदर्शित किया कि CD3ζ hPSC-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल में व्यक्त होने पर CD32a की तुलना में काफी बेहतर साइटोलिसिस की मध्यस्थता करता है, जो आंशिक रूप से CD32a की तुलना में CD3ζ में ITAMs की उच्च प्रतियों के कारण हो सकता है: क्रमशः तीन और एक प्रतियां, और उच्च अभिव्यक्ति स्तर ζ न्यूट्रोफिल28 की कोशिका सतह पर। CD32a की तरह, Fc RIII (CD16b) मोनोमेरिक IgG के लिए एक और कम-आत्मीयता रिसेप्टर है और न्यूट्रोफिल31 पर CD32a की तुलना में बहुत उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है। जबकि CD16b का क्रॉस-लिंकिंग केवल Ca2+ गतिशीलता और क्षरण को प्रेरित करता है, लेकिन न्यूट्रोफिल28,50 में फागोसाइटोसिस और साइटोलिसिस को प्रेरित नहीं करता है, फिर भी CD3ζ- और CD16b की क्षमताओं पर एक व्यवस्थित तुलना करना भविष्य के अध्ययनों में रुचिकर होगा। -न्यूट्रोफिल के एंटी-ट्यूमर कार्यों को ट्रिगर करने और बढ़ाने में सीएआर।

imageFig. 6 | In vivo distribution of CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs). a Schematic of intravenously administered Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs for in vivo cell tracking study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with PBS, 5 × 106 Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs. b Time-dependent biodistribution of Cy5+ neutrophils in the whole body, brain, and other organs was determined and quantified by fluorescence imaging at the indicated hours. c Biodistribution of CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs in mice at 24 h post-injection was analyzed by inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) based on Si element, and data was expressed as the percentage of injected dose per gram of tissue (%ID/g). n = 5 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file. d Representative fluorescence images of CD45 and SiO2 in the indicated glioblastoma xenografts isolated from tumor-bearing mice were shown. Scale bars, 100 μm. Biological triplicates were performed independently.

चित्र 6|सीएआर न्यूट्रोफिल-डिलीवर आर-सीओओ 2- टीपीजेड नैनोकणों (एनपी) का विवो वितरण। विवो सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए अंतःशिरा रूप से प्रशासित Cy5-लेबल CAR न्यूट्रोफिल@R-SiO2 NPs और R-SiO2 NPs का एक योजनाबद्ध। 5 × 105 लूसिफ़ेरेज़ (लूसी)-व्यक्त करने वाली यू87एमजी कोशिकाओं को एनआरजी चूहों के दाहिने अग्रमस्तिष्क में स्टीरियोटैक्टिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। 4 दिनों के बाद, चूहों को अंतःशिरा में पीबीएस, 5 × 106 Cy 5- लेबल CAR न्यूट्रोफिल@R-SiO2 NPs और R-SiO2 NPs के साथ इलाज किया गया। बी पूरे शरीर, मस्तिष्क और अन्य अंगों में Cy5+ न्यूट्रोफिल का समय-निर्भर जैववितरण संकेतित घंटों में प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा निर्धारित और मात्राबद्ध किया गया था। सी इंजेक्शन के 24 घंटे बाद चूहों में सीएआर न्यूट्रोफिल@आर-सीओ2 एनपी और आर-सीओ2 एनपी के जैव वितरण का विश्लेषण सी तत्व के आधार पर प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा-ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-ओईएस) द्वारा किया गया था, और डेटा को प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। ऊतक के प्रति ग्राम इंजेक्शन की खुराक (%आईडी/जी)। n=5 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने। डेटा को माध्य ± SD के रूप में दर्शाया गया है। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है। डी ट्यूमर-असर चूहों से पृथक संकेतित ग्लियोब्लास्टोमा ज़ेनोग्राफ़्ट में CD45 और SiO2 की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां दिखाई गईं। स्केल बार, 100 μm. जैविक त्रिप्रतिकृतियों का स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया गया।

Fig. 7 | In vivo anti-tumor activities of combinatory CAR-neutrophils and R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs) were assessed via intravenous injection. a Schematic of intravenously administered PBS, PB-neutrophils, CAR-neutrophils, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor-killing study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with indicated neutrophils weekly for a month. Time-dependent tumor burden was determined (b) and quantified (c) by bioluminescent imaging (BLI) at the indicated days. Data are mean ± SD for mice in (b) (n = 5), one-way analysis of variance (ANOVA). d Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups (n = 5) was shown. Released human tumor necrosis factor-α (TNFα) and IL-6 in the peripheral blood (e) and body weight (f) of different mouse groups were measured at the indicated days. Data are mean ± SD, n = 5 biologically independent samples. g, h Anti-tumor activity of increased dosage frequencies of CAR-neutrophils and RSiO2-TPZ NPs was assessed. g Schematic of intravenously administered CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor killing study. h Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups was shown (n = 5). Kaplan–Meier curves were analyzed by the log-rank test. Source data are provided as a Source Data file.


चित्र 7|विवो में कॉम्बिनेटरी सीएआर-न्यूट्रोफिल और आर-सीओओ टीपीजेड नैनोकणों (एनपी) की ट्यूमर-विरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से किया गया था। विवो ट्यूमर-हत्या अध्ययन के लिए अंतःशिरा रूप से प्रशासित पीबीएस, पीबी-न्यूट्रोफिल, सीएआर-न्यूट्रोफिल, और सीएआर-न्यूट्रोफिल @ आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी का एक योजनाबद्ध। 5 × 105 लूसिफ़ेरेज़ (लूसी)-व्यक्त करने वाली यू87एमजी कोशिकाओं को एनआरजी चूहों के दाहिने अग्रमस्तिष्क में स्टीरियोटैक्टिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। 4 दिनों के बाद, चूहों को एक महीने के लिए साप्ताहिक रूप से संकेतित न्यूट्रोफिल के साथ अंतःशिरा उपचार किया गया। संकेतित दिनों में बायोलुमिनसेंट इमेजिंग (बीएलआई) द्वारा समय-निर्भर ट्यूमर का बोझ निर्धारित (बी) और मात्रा निर्धारित (सी) किया गया था। (बी) (एन=5) में चूहों के लिए डेटा का मतलब ± एसडी है, विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण (एनोवा)। संकेतित प्रयोगात्मक समूहों (n=5) के अस्तित्व को प्रदर्शित करने वाला डी कपलान-मेयर वक्र दिखाया गया था। संकेतित दिनों में विभिन्न माउस समूहों के परिधीय रक्त (ई) और शरीर के वजन (एफ) में जारी मानव ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर- (टीएनएफ) और आईएल -6 को मापा गया। डेटा माध्य ± एसडी, एन=5 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने हैं। जी, एच सीएआर-न्यूट्रोफिल और आरएसआईओ 2- टीपीजेड एनपी की बढ़ी हुई खुराक आवृत्तियों की ट्यूमर-विरोधी गतिविधि का आकलन किया गया था। जी विवो ट्यूमर हत्या अध्ययन के लिए अंतःशिरा रूप से प्रशासित सीएआर-न्यूट्रोफिल, आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी, और सीएआर-न्यूट्रोफिल @ आर-सीओओ 2- टीपीजेड एनपी की योजनाबद्ध। संकेतित प्रायोगिक समूहों के अस्तित्व को दर्शाने वाला कपलान-मायर वक्र दिखाया गया (n=5)। लॉग-रैंक परीक्षण द्वारा कपलान-मेयर वक्रों का विश्लेषण किया गया। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

हमने यहां एक मॉड्यूलर और बहुमुखी एचपीएससी न्यूट्रोफिल दवा वितरण मंच भी प्रस्तुत किया है जिसे भविष्य में अन्य मानव रोगों के इलाज के लिए अन्य न्यूट्रोफिल-आधारित प्रयासों का समर्थन करने के लिए फिर से इंजीनियर और ट्यून किया जा सकता है। सबसे पहले, सीएआर इंजीनियरिंग प्राथमिक प्रतिरक्षा टी कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल की तुलना में एचपीएससी में अधिक सुलभ है। विभिन्न सीएआर29 की स्थिर और समरूप अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए केवल एक बार के जीनोम संपादन की आवश्यकता होती है। सीएलटीएक्स सीएआर के अलावा, हमने स्थिर एचपीएससी लाइनों का भी निर्माण किया है जो एक सार्वभौमिक एंटी-फ्लोरेसिन (एफआईटीसी)51 या एंटी-पीडी-एल1 सीएआर52 को व्यक्त करते हैं, दोनों का उपयोग सार्वभौमिक ठोस ट्यूमर-लक्ष्यित नैनोकैरियर सीएआर-न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। अन्य आनुवंशिक संशोधन, जैसे एंटी-एफएपी सीएआर53 को लक्षित करने वाले फाइब्रोसिस, मस्तिष्क आघात और कार्डियक फाइब्रोसिस सहित घातक अपक्षयी बीमारियों के इलाज के लिए न्यूट्रोफिल नैनोकैरियर्स को निर्देशित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, सीएआर-व्यक्त करने वाले एचपीएससी को सीएआर-टी या सीएआर-एनके कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, और सीएआर-न्यूट्रोफिल नैनोकैरियर्स के साथ इन इम्यूनोथेरेपी के संयोजन से इष्टतम चिकित्सीय एंटी-ट्यूमर लाभ प्राप्त हो सकते हैं। अंत में, हमारा बायोइंस्पायर्ड ट्यूमर ग्लूटाथियोन (जीएसएच)-रेस्पॉन्सिव नैनोड्रग सिस्टम लक्षित दवा वितरण के लिए आशाजनक कीमोथेराप्यूटिक या रेडियोधर्मी दवाओं को सीएआर-न्यूट्रोफिल में लोड करने के लिए एक मॉड्यूलर और बहुमुखी मंच है, जैसा कि क्लिनिकल टीएमजेड, जेएनजे64619187 और प्रो-ड्रग टीपीजेड द्वारा उदाहरण दिया गया है। अन्य नैनोकणों के परीक्षण पर भविष्य के अध्ययन से न्यूट्रोफिल में अनुकूलित दवा लोडिंग प्राप्त हो सकती है और विवो चिकित्सीय प्रभावकारिता में अधिकतम प्राप्त किया जा सकता है।

जबकि हमने बीबीबी में मस्तिष्क ट्यूमर के लिए कीमो-दवाओं को विशेष रूप से और कुशलता से वितरित करने के लिए सीएआर-न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की चिकित्सीय अवधारणा का प्रदर्शन किया है, इस अध्ययन में कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, चिकित्सीय जांच के लिए नैदानिक ​​​​परिदृश्य की नकल करने वाले ट्यूमर को स्थापित करने के लिए दिन में ट्यूमर सेल टीकाकरण पर्याप्त नहीं हो सकता है, और विभिन्न ट्यूमर टीकाकरण अवधियों के साथ भविष्य में काम करना ग्लियोब्लास्टोमा विकास के विभिन्न चरणों और विभिन्न में चिकित्सीय प्रतिक्रिया को दोहराने के लिए आवश्यक है। मरीज54,55. दूसरा, जिन इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों का हमने यहां उपयोग किया है उनमें अनुकूली प्रतिरक्षा की कमी है, और बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली वाले अन्य प्रीक्लिनिकल मॉडल, जैसे कि सहज ग्लियोमा56 वाले पालतू कुत्ते, इन विट्रो में उत्पादित सीएआर-न्यूट्रोफिल की सुरक्षा और प्रभावकारिता का बेहतर आकलन करने के लिए आवश्यक हैं। विशेष रूप से, कम जीवनकाल के बावजूद, साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम, न्यूरोटॉक्सिसिटी और सीएआर-टी कोशिकाओं में देखी गई ऑन-टारगेट ऑफ-ट्यूमर विषाक्तता सहित, संक्रमित जानवरों में नैनो दवाओं के साथ या बिना लोड किए गए सीएआर-न्यूट्रोफिल की ऑफ-टारगेट विषाक्तता प्रोफाइलिंग की आवश्यकता होती है। न्यूट्रोफिल का. जबकि व्यवहार्य दृष्टिकोण, जैसे कि इंजीनियरिंग हाइपोइम्यूनोजेनिक यूनिवर्सल डोनर एचपीएससी58-61 और बैंकिंग मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए)-होमोज्यगस एचपीएससी लाइब्रेरी62, ग्राफ्ट-बनाम-होस्ट रोग (जीवीएचडी) के संभावित जोखिम से बचने के लिए आसानी से उपलब्ध हैं, प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल एक के साथ हमारे न्यूट्रोफिल उपचार विज्ञान की अनुवादात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए अभी भी अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली की आवश्यकता है। अंत में, सीमित एंटी-ट्यूमर साइटोटॉक्सिसिटी और सीएआर-न्यूट्रोफिल नैनोड्रग थेरेप्यूटिक्स के पशु जीवनकाल का विस्तार देखा गया। इसलिए, अधिक प्रभावी कीमोथेरेपी दवाओं या रेडियोसेंसिटाइज़र की भविष्य की खोज, और क्लासिक सीएआर-टी और सर्जिकल रिसेक्शन के साथ संयोजन चिकित्सा सीएआर-न्यूट्रोफिल चिकित्सीय की अधिकतम ट्यूमर-विरोधी प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, तंत्र-आधारित डिज़ाइन पर एक हालिया अध्ययन ने एक अधिक प्रभावी दवा केएल -50 का नेतृत्व किया है जो नैदानिक ​​टीएमजेड दवा 63 में देखी गई अधिग्रहित प्रतिरोध पर काबू पाती है और इस प्रकार इसे संभावित रूप से हमारे मॉड्यूलर सीएआर-न्यूट्रोफिल नैनोड्रग प्लेटफॉर्म में शामिल किया जा सकता है। बेहतर चिकित्सीय प्रभावकारिता. CLON-G (कैस्पैसेस-लाइसोसोमल मेम्ब्रेन परमेबिलाइजेशन-ऑक्सीडेंट-नेक्रोप्टोसिस इनहिबिशन प्लस ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-स्टिम्युलेटिंग फैक्टर64) उपचार और/या CAR-न्यूट्रोफिल में दीर्घकालिक नियंत्रित दवा रिलीज प्रणाली का उपयोग करके न्यूट्रोफिल के शेल्फ जीवन को 5 दिनों तक बढ़ाया जा सकता है। न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस के बाद विवो एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता में निरंतर प्राप्त करें। सामूहिक रूप से, हमारे निष्कर्षों ने स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया कि R-SiO2-TPZ लोडेड CAR-न्यूट्रोफिल एंटी-ट्यूमर N1 फेनोटाइप को बनाए रख सकते हैं और इन विट्रो में विभिन्न ट्यूमर आला जैसी स्थितियों के तहत ट्यूमर कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक मार सकते हैं। विवो में जीबीएम को लक्षित करने के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट-रेस्पॉन्सिव नैनो दवाओं को सटीक रूप से वितरित करने के लिए इंजीनियर एचपीएससी से बड़ी मात्रा में कार्यात्मक सीएआर-न्यूट्रोफिल का उत्पादन किया जा सकता है, जिससे मजबूत और विशिष्ट एंटी-जीबीएम गतिविधियों और न्यूनतम ऑफ-टारगेट दवा वितरण के साथ एक संयोजन कीमोइम्यूनोथेरेपी हो सकती है। ट्यूमर धारण करने वाले चूहों में लंबा जीवनकाल।

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