CaWRKY30 रक्षा-संबंधित जीन भाग 1 को संशोधित करके रालस्टोनिया सोलानासीरम इनोक्यूलेशन के खिलाफ CaWRKY40 को लक्षित करके काली मिर्च की प्रतिरक्षा को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है

अमूर्त:

WRKY ट्रांसक्रिप्शन कारक (TFs) नेटवर्क WRKY TFs के सबसेट से बना है, जो पौधों के प्रतिरक्षा नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालाँकि, WRKY TFs के नेटवर्क के कार्य स्पष्ट नहीं हैं, विशेष रूप से गैर-मॉडल पौधों जैसे काली मिर्च (शिमला मिर्च वार्षिक एल) में। रालस्टोनिया सोलेनेसीरम संक्रमण के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरोधक क्षमता के लिए इस अध्ययन में कार्यात्मक रूप से CaWRKY30- समूह III काली मिर्च WRKY प्रोटीन का एक सदस्य है। CaWRKY30 को नाभिक में पाया गया था, और इसके ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन के स्तर को R. solanacearum inoculation (RSI), फोलियर एप्लिकेशन एथिलीन (ET), एब्सिसिक एसिड (ABA), और सैलिसिलिक एसिड (SA) द्वारा काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। CaWRKY30 के वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (VIGS) ने काली मिर्च की भेद्यता को RSI में बढ़ा दिया।

इसके अतिरिक्त, VIGS द्वारा CaWRKY30 की साइलेंसिंग ने RSI द्वारा ट्रिगर की गई HR जैसी सेल डेथ से समझौता किया और CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1, और CaWRKY40 जैसे रक्षा से जुड़े मार्कर जीन को डाउनग्रेड किया। इसके विपरीत, काली मिर्च के पत्तों में CaWRKY30 की क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन ने एचआर जैसी कोशिका मृत्यु को उकसाया और रक्षा संबंधी मार्कर जीन को अपग्रेड किया। इसके अलावा, CaWRKY30 के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन ने CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर को बढ़ा दिया।

दूसरी ओर, CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन ने CaWRKY30 के ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन लेवल को अपग्रेड किया। परिणाम अनुशंसा करते हैं कि नई विशेषता वाले CaWRKY30 रालस्टोनिया हमले के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है, जो कि ET, ABA, और SA जैसे फाइटोहोर्मोन द्वारा सहक्रियात्मक रूप से मध्यस्थता संकेत द्वारा नियंत्रित होता है, और WRKY TFs नेटवर्क में ट्रांसक्रिप्शनल रूप से आत्मसात होता है, जिसमें CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 शामिल हैं। . सामूहिक रूप से, हमारा डेटा काली मिर्च की प्रतिरक्षा और आरएसआई की प्रतिक्रिया के बीच क्रॉसस्टॉक के अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने में मदद करेगा।

प्रतिलेखन कारक प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जीन अभिव्यक्ति के नियमन को नियंत्रित करते हैं और विशिष्ट सेल प्रकारों के गठन को नियंत्रित करते हैं। निम्नलिखित प्रतिलेखन कारकों और प्रतिरक्षा के बीच संबंध है:

1. प्रतिलेखन कारक - NF-κB: NF-κB एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक है जो टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं के अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के नियमन में शामिल है। NF-κB सक्रियण भड़काऊ प्रतिक्रिया, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सेल एपोप्टोसिस को बढ़ावा दे सकता है।

2. प्रतिलेखन कारक- STATs: STATs प्रतिलेखन कारक हैं जो वाहक संकेतन और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को मध्यस्थ करते हैं। एसटीएटी को सक्रिय किया जा सकता है, सक्रिय टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और प्रतिरक्षा सेल प्रसार, भेदभाव और सक्रियण जैसी प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं।

3. प्रतिलेखन कारक - एपी -1: एपी -1 विभिन्न सेलुलर कार्यों और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के नियमन में शामिल प्रतिलेखन कारकों का एक परिवार है। एपी -1 सक्रियण सेल प्रसार, विभेदन और परिवर्तन जैसी प्रक्रियाओं को बढ़ावा दे सकता है, साथ ही एंटीवायरल और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बनाए रख सकता है।

4. प्रतिलेखन कारक- CEBPs: CEBPs विभिन्न ऊतक कोशिकाओं में CEBP, आदि सहित प्रतिलेखन कारकों का एक बड़ा परिवार है। प्रतिरक्षा प्रणाली में, सीईबीपी मैक्रोफेज के सक्रियण और साइटोकिन्स की रिहाई के साथ-साथ बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं के भेदभाव और सक्रियण में शामिल है।

एक साथ लिया गया, प्रतिलेखन कारक प्रतिरक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विभिन्न सेल प्रकारों और कार्यों में प्रतिरक्षा प्रणाली गतिविधि के विनियमन और रखरखाव में भाग लेते हैं। इसलिए हमें अपने दैनिक जीवन में रोग प्रतिरोधक क्षमता में सुधार पर भी ध्यान देने की जरूरत है। Cistanche प्रतिरक्षा बढ़ा सकता है, और मांस में पॉलीसेकेराइड मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित कर सकते हैं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तनाव क्षमता में सुधार कर सकते हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रभाव के नसबंदी को बढ़ा सकते हैं।

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कीवर्ड:

काली मिर्च (शिमला मिर्च वार्षिक); राल्सटोनिया सोलनसीरम; सीएडब्ल्यूआरकेवाई30; WRKY TFs।

1 परिचय

पौधे अपने स्थिर प्रकृति [1,2] के कारण अपने जीवन काल के दौरान अक्सर विभिन्न जैविक और अजैविक तनावों के संपर्क में आते हैं। प्रमुख पारिस्थितिक और पर्यावरणीय बाधाओं से बार-बार चयन दबाव के जवाब में पौधों ने कई रक्षा तंत्र विकसित किए हैं। ट्रांसक्रिप्शनल स्तर [3,4] पर इन क्लासिक रक्षा तंत्रों को विनियमित करने के लिए परिष्कृत ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क विकसित करने के लिए विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल कारक (TFs) आपस में जुड़ते हैं। विभिन्न तनावों के लिए रक्षा प्रतिक्रियाएं ठीक से सिंक्रनाइज़ और नियंत्रित होती हैं क्योंकि वे ऊर्जा व्यय और विकास [5] के रूप में पौधों के लिए महत्वपूर्ण हैं। रक्षा तंत्र विभिन्न पौधों की प्रजातियों में भिन्न हो सकते हैं क्योंकि विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियां उनके अनुकूलन [6-8] को प्रभावित करती हैं।

इसलिए, मॉडल संयंत्रों द्वारा नियोजित रक्षा प्रणाली पूरी तरह से गैर-मॉडल संयंत्रों के लिए निहित नहीं हो सकती है। इसलिए, पौधों की रक्षा प्रणाली पिछले दशकों के दौरान एक प्रमुख फोकस रही है; हालाँकि, ये अध्ययन ज्यादातर मॉडल पौधों, यानी अरबिडोप्सिस थलियाना और चावल (ओरिज़ा सैटिवा एल।) पर केंद्रित थे। फिर भी, पौधों के विभिन्न तनावों की प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए इन ट्रांसक्रिप्शनल कॉम्प्लेक्स के कार्यात्मक सिंक्रनाइज़ेशन की खराब जांच की गई है, मुख्य रूप से गैर-मॉडल पौधों में।

WRKY प्रोटीन में पौधों में सबसे बड़ा TFs परिवार शामिल है। WRKY TFs में एक या दो WRKY डोमेन होते हैं और आमतौर पर N-टर्मिनस पर WRKYGQK अनुक्रम होता है, इसके बाद C2HC या C2H2 जिंक फिंगर मोटिफ [4,9,10] होता है। WRKY प्रोटीन phylogenetically कई WRKY डोमेन और जिंक-फिंगर मोटिफ की संरचना के आधार पर तीन मुख्य समूहों (यानी, समूह I-III) में विभाजित हैं।

WRKY TFs के समूह II को फिर से पांच उप-समूहों (IIa, IIb, IIc, IId, और IIe) [11–13] में विभाजित किया गया है। WRKY सदस्य मुख्य रूप से W-बक्से [TTGAC(C/T)] के साथ जुड़ते हैं, जो विभिन्न लक्ष्य जीनों के प्रमोटर क्षेत्रों में पाया जाता है, जो दूसरे b स्ट्रैंड पर WRKY GQK मोटिफ द्वारा डीएनए के प्रमुख ग्रूव [14] में एक विशेष वेज को लंबवत रूप से सम्मिलित करता है, जो उत्तेजित करता है। लक्ष्य जीन [14-16] की अभिव्यक्ति का ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन। WRKYs पौधों में कई जैविक प्रणालियों में शामिल हैं, जिनमें बीज निष्क्रियता, बीज अंकुरण, जीर्णता और बीज विकास शामिल हैं। इसी तरह, ये भी जैविक और अजैविक तनावों की प्रतिक्रिया में शामिल हैं और अपने लक्ष्य जीन [17-20] के प्रतिलेखन को बदलते हैं।

यह बताया गया है कि केवल एक तनाव से प्रेरित WRKY TFs या एक WRKY TF का एक समूह कई तनावों को नियंत्रित करता है। डब्ल्यू-बॉक्स प्रवर्तक क्षेत्रों [21-24] के अंदर समृद्ध हैं। ये अध्ययन एक विशेष तनाव, या दो या दो से अधिक के संयोजन के जवाब में फंसे WRKY नेटवर्क की उपस्थिति को दर्शाते हैं। पिछले एक दशक में जैविक और अजैविक तनावों के जवाब में WRKY प्रोटीन और अंतर्निहित तंत्र की भूमिका की अक्सर जांच की गई है; हालांकि, मॉडल पौधों में एक तनाव के जवाब में इन अध्ययनों का जोर मुख्य रूप से एक जीन पर था, उदाहरण के लिए, ए थालियाना और ओ सैटिवा। हाल ही में, विभिन्न पौधों की प्रजातियों से WRKY TFs के करीबी समरूपों के बीच एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक भिन्नता का सुझाव दिया गया है [24,25]। एकल या संयुक्त तनावों के जवाब में कैप्सिकम एन्युम एल जैसे गैर-मॉडल पौधों में WRKYs और WRKY वेब के कार्यों की अब तक खराब जांच की गई है।

काली मिर्च विश्व स्तर पर अपने आर्थिक महत्व के लिए जानी जाती है। इसे समशीतोष्ण मौसम [26,27] के दौरान ऊपरी इलाकों में बोया जाता है। काली मिर्च मिट्टी से पैदा होने वाली विभिन्न बीमारियों जैसे काली मिर्च झुलसा और बैक्टीरियल रोगजनकों, यानी, फाइटोफ्थोरा शिमला मिर्च और रालस्टोनिया सोलानेसीरम के कारण होने वाले बैक्टीरियल विल्ट के संपर्क में आती है, [28,29]। इन रोगजनकों का संयोग उच्च तापमान और उच्च आर्द्रता (HTHH) के तहत काली मिर्च के उत्पादन पर विनाशकारी प्रभाव डालता है। एचटीएचएच, आर प्रोटीन द्वारा मध्यस्थ काली मिर्च की प्रतिरक्षा को कम करता है और रोगज़नक़ वृद्धि और विकास को गति देता है। इसके अलावा, रोगज़नक़ का हमला और HTHH एक साथ काली मिर्च पर प्राकृतिक चयन दबाव डालते हैं, जिसने अतीत में काली मिर्च के विकास को प्रभावित किया है [30-32]। इसके विपरीत, रोगज़नक़ संक्रमण और HTHH की एक साथ होने वाली घटना ए थलियाना और ओ सैटिवा जैसे मॉडल पौधों के विकास को प्रभावित नहीं कर सकती है। इसलिए, काली मिर्च जैविक या अजैविक तनावों, यानी आरएसआई या एचटीएचएच के खिलाफ प्रतिरक्षा के संबंध में अनुसंधान के लिए अधिक उपयुक्त लगती है।

रालस्टोनिया सोलेनेसीरम कई फसलों, जैसे काली मिर्च, टमाटर, आलू आदि में जीवाण्विक मुरझान का कारण बनता है। यह जाइलम के ऊतकों में तेजी से उपनिवेश बनाता है, जिससे संक्रमित पौधों में बैक्टीरियल विल्ट रोग होता है [34]।

जैविक और अजैविक तनाव के लिए पौधों की प्रजातियों की प्रतिक्रियाओं को फाइटोहोर्मोन [35] द्वारा नियंत्रित किया जाता है। फाइटोहोर्मोन पौधे के विकास नियमन, पौधे के प्रजनन और अस्तित्व में शामिल छोटे अणु हैं। सैलिसिलिक एसिड (एसए) और जैस्मोनिक एसिड (जेए) पौधों की प्रजातियों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन दोनों को रोगजनकों के खिलाफ पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण आधार के रूप में माना जाता है। जैवसंश्लेषण और एसए का सिग्नलिंग बायोट्रोफिक रोगजनकों के खिलाफ रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि जेए नेक्रोट्रोफिक रोगजनकों [36,37] के खिलाफ रक्षा प्रदान करता है। एथिलीन (ET) कई प्लांट-पैथोजेन इंटरैक्शन [37] के खिलाफ रक्षा प्रतिक्रियाओं में सहायता करता है।

उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों की विभिन्न स्वदेशी काली मिर्च की किस्में एचटीएचएच [38] के तहत भी त्वरित रोग प्रतिरोधक क्षमता प्रदर्शित करती हैं। गर्मी से संबंधित सीआईएस-तत्व एचएसई आमतौर पर एसए, जेए, ईटी, एबीए, या रोगज़नक़ से संबंधित सीआईएस-तत्वों सहित अधिकांश एमएपीके और सीडीपीके के प्रवर्तक क्षेत्रों में फाइटोहोर्मोन के साथ सह-अस्तित्व रखता है [39-41]। यह प्रतिरक्षा और HTHH के बीच क्रॉसस्टॉक की उपस्थिति की अनुशंसा करता है। ए. थालियाना और ओ. सैटिवा की तुलना में काली मिर्च का जीनोम क्रमशः 27 और 7.5 गुना बड़ा है। हालाँकि, इसमें केवल 73 WRKY जीन हैं, जबकि A. थलियाना और O. sativa के छोटे जीनोम में क्रमशः 72 और 122 WRKY जीन हैं [9,42,43]। हमने पहले पता लगाया था कि CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45], और CaWRKY58 [46] आरएसआई के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिक्रिया में शामिल रहे हैं।

इनमें से, CaWRKY6, -22, -27, और -40 पौधों की प्रतिरक्षा के सकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य करते हैं, जबकि CaWRKY58 एक नकारात्मक नियामक है। इन जीनों में उनके प्रवर्तक क्षेत्र में एचएसई तत्वों और डब्ल्यू-बक्सों का एक सबसेट और अन्य डब्ल्यूआरकेवाई टीएफ के प्रवर्तक होते हैं, जो आरएसआई के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिक्रिया के नियमन में डब्ल्यूआरकेवाई नेटवर्क की भूमिका का उल्लेख करते हैं। इसके अतिरिक्त, CaWRKY40 को सीधे CaWRKY6 [44] और CabZIP63 [16] द्वारा नियंत्रित किया गया था, जबकि CaWRKY40 को अप्रत्यक्ष रूप से CaCDPK15 [47] द्वारा नियंत्रित किया गया था। इसके विपरीत, काली मिर्च के अधिकांश WRKY TFs को रोगज़नक़ हमलों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के लिए अभी तक चित्रित नहीं किया गया है।

वर्तमान अध्ययन में, काली मिर्च के WRKY TFs परिवार के लिए एक पूर्ण-लंबाई वाले सीडीएनए को अलग किया गया और CaWRKY30 नाम दिया गया। हमने इसे अभिव्यंजक और कार्यात्मक रूप से चित्रित किया और पाया कि CaWRKY30 RSI और SA, JA, ET, और ABA के पर्णीय अनुप्रयोग से प्रेरित था। काली मिर्च के पत्तों में CaWRKY30 की क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन से एचआर जैसी कोशिका मृत्यु और H2O2 उत्पादन शुरू हो गया। काली मिर्च में CaWRKY30 की साइलेंसिंग ने काली मिर्च की प्रतिरोधक क्षमता को RSI से समझौता कर दिया। इन परिणामों से पता चलता है कि CaWRKY30 RSI के प्रति काली मिर्च की प्रतिरोधक क्षमता को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है।

2. परिणाम

2.1। CaWRKY30 का क्लोनिंग और अनुक्रम विश्लेषण

जीनोम-वाइड विश्लेषण द्वारा एक नए WRKY जीन CaWRKY30 (CA01g34480) की पहचान की गई। CaWRKY30 जीन को कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए चुना गया था क्योंकि टीजीए (टीजीएसीजी मोटिफ-बाइंडिंग फैक्टर), टीजीएसीजी-मोटिफ, टीएटीसी-बॉक्स, टीएटीएबॉक्स, और डब्ल्यू-बॉक्स जैसे इम्युनिटी-संबंधित सिस-तत्वों के अस्तित्व में प्रवर्तक क्षेत्र में इसकी संभावना को नामित किया गया है। काली मिर्च की प्रतिरक्षा में भूमिका (चित्र S1)। 924 बीपी ओपन-रीडिंग-फ्रेम (ओआरएफ) के सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 (सीए01जी34480) का एक सीडीएनए टुकड़ा जीन-विशिष्ट प्राइमरों (टेबल एस1) का उपयोग करके क्लोन किया गया था। CaWRKY30 के कटे हुए अमीनो एसिड अनुक्रम की लंबाई 307 अमीनो एसिड अवशेष थी, जिसमें संरक्षित WRKY डोमेन था, और इसे समूह III (चित्र 1) में वर्गीकृत किया गया था। अनुमानित प्रोटीन का आकार और सैद्धांतिक पीआई क्रमशः 34.55 केडीए और 7.32 है। CaWRKY30 NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53, और StWRKY53 के साथ क्रमशः 88, 60, 68, और 57 प्रतिशत अमीनो एसिड पहचान साझा करता है (चित्र S2)।

2.2। RSI के तहत CaWRKY30 की ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति और विभिन्न फाइटोहोर्मोन के साथ उपचार

CaWRKY30 के प्रवर्तक क्षेत्र में प्रतिरक्षा से जुड़े सीआईएस-तत्वों की उपस्थिति ने काली मिर्च की प्रतिरक्षा आरएसआई में इसकी संभावित भूमिका का संकेत दिया। धारणा की जांच करने के लिए, RSI पर CaWRY30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों का आकलन करने के लिए qRT-PCR विश्लेषण किया गया था। मॉक-उपचारित पत्तियों (चित्र 2ए) की तुलना में रालस्टोनिया-उपचारित पत्तियों में CaWRKY30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर में वृद्धि हुई थी। संवर्धित CaWRKY30 ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तर 0 घंटे से 48 घंटे के बाद के उपचार (एचपीटी) के बीच संगत थे। उच्चतम ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तर 48 एचपीटी (चित्रा 2ए) में दर्ज किए गए थे।

ईटी, एबीए, एसए और जेए-मध्यस्थता वाले सिग्नलिंग मार्ग सहित फाइटोहोर्मोन, जैविक और अजैविक तनावों के लिए पौधों की प्रतिक्रियाओं के प्रमुख नियामक हैं। phytohormones-मध्यस्थता संकेत पथों द्वारा CaWRKY30 के विनियमन का अध्ययन ET, ABA, SA, और JA के पर्णीय अनुप्रयोग द्वारा qRT-PCR विश्लेषण का उपयोग करके किया गया। परिणामों ने संकेत दिया कि मॉक की तुलना में CaWRKY30 के सापेक्ष ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तर को 100 µM ET के साथ 0 h से 48 hpt तक बढ़ाया गया था। ये ट्रांसक्रिप्शनल स्तर ET (चित्र 2B) के साथ 48 hpt पर उच्चतम थे। मॉक की तुलना में 100 µM ABA के पर्णीय अनुप्रयोग ने CaWRKY30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों में काफी वृद्धि की। ट्रांसक्रिप्शनल स्तर एबीए (चित्रा 2सी) के साथ 12 एचपीटी पर उच्चतम स्तर पर पहुंच गया। परिणामों ने संकेत दिया कि मॉक की तुलना में सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 का ट्रांसक्रिप्शनल संचय 1 एमएम एसए के आवेदन के बाद काफी बढ़ गया था। ये संवर्धित ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तर 24 एचपीटी (चित्रा 2डी) पर उच्चतम थे।

चित्र 2. काली मिर्च के पत्तों में CaWRKY30 सापेक्ष ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तरों की क्यूआरटी-पीसीआर परख रालस्टोनिया सोलानेसीरम इनोक्यूलेशन (आरएसआई) और विभिन्न फाइटोहोर्मोन के पर्णीय अनुप्रयोग के अधीन है। क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण का उपयोग आरएसआई (ए), 100 माइक्रोन ईटी (बी) के आवेदन, 100 माइक्रोन एबीए (सी) के आवेदन और 1 मिमी के आवेदन सहित विभिन्न उपचारों के अधीन काली मिर्च के पत्तों में सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर की जांच के लिए किया गया था। एसए (डी) अलग-अलग समय अंतराल पर। RSI-उपचारित पत्तियों में ट्रांसक्रिप्शनल बहुतायत की तुलना MgCl2 -उपचारित नियंत्रण पत्तियों (मॉक) से की गई थी, जिसका सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर "1" पर सेट किया गया था। (बी-डी) फाइटो-हार्मोन-उपचारित पत्तियों में ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना डीडीएच2ओ-उपचारित पत्तियों (मॉक) से की गई थी, जिसका अभिव्यक्ति स्तर "1" पर सेट किया गया था। बार की ऊंचाई माध्य इंगित करती है और त्रुटि बार माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती है। सलाखों के ऊपर अलग-अलग अक्षर फिशर के संरक्षित एलएसडी परीक्षण के आधार पर साधनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं।

2.3। CaWRKY30 नाभिक में स्थानीयकृत पाया गया

WoLFPSORT का उपयोग करके अनुक्रम विश्लेषण ने दर्शाया कि अनुमानित CaWRKY30 प्रोटीन अनुक्रम में एक परमाणु परमाणु स्थानीयकरण संकेत (चित्र 1) है, जो नाभिक में अपना संभावित लक्ष्यीकरण दिखा रहा है। इस धारणा को मान्य करने के लिए, एक CaWRKY30 GFP संलयन निर्माण उत्पन्न किया गया था जो कि CaMV35S के एक संवैधानिक प्रवर्तक द्वारा संचालित था। बाद में, इस गठित वेक्टर को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेनGV3101 में स्थानांतरित कर दिया गया। हमने क्षणिक रूप से A. tumefacient इंजेक्शन द्वारा Nicofiamabenthamiana की पत्तियों में CaWRKY30 GFP निर्माण को अभिव्यक्त किया, और GFP संकेतों की जांच confocal fluores.science खुर्दबीन द्वारा की गई। परिणाम दर्शाते हैं कि सीएडब्लूआरकेवाई 30-जीएफपी के जीएफपी सिग्नल नाभिक में मौजूद थे, जबकि साइटोप्लाज्म और नाभिक (चित्र 3) जैसे विभिन्न उपकोशिकीय भागों में नियंत्रण के जीएफपी का पता चला था।

चित्र 3. CaWRKY30 का उपकोशिकीय स्थानीयकरण। CaWRKY30 निकोटियाना बेंथमिन्ना पत्तियों के केंद्रक में पूरी तरह से स्थित है। हरा रंग GFP दर्शाता है नीला रंग नाभिक के DAPI धुंधला को प्रदर्शित करता है। सियान रंग हरे सीएफपी और नीले डीएपीआई-सना हुआ नाभिक के संलयन को प्रदर्शित करता है। CPP सिग्नाग्रीन) नियंत्रण के लिए, पूरे सेल में N. बेंटहैमियाना पत्तियों का पता लगाया गया। छवियों को 48 घंटे पोस्ट-इनोक्यूलेशन पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कैप्चर किया गया था। बार्स=25 उम।

2.4। VIGS द्वारा CaWRKY30 की साइलेंसिंग ने RSI और डाउनरेगुलेटेड इम्यूनिटी एसोसिएटेड मार्कर जीन के लिए काली मिर्च की प्रतिरक्षा को कम कर दिया।

काली मिर्च प्रतिरक्षा में इसकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए CaWRKY30 को वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (VIGS) द्वारा खामोश कर दिया गया था। कुल 50 CaWRKY30-अनसाइलेंस्ड (TRV:00) और 50 CaWRKY30- साइलेंटेड (TRV: CaWRKY30) प्लांट्स का अधिग्रहण किया गया। छह सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड पौधों को संगत विषाणु आर सोलानेसीरम स्ट्रेन की कोशिकाओं के साथ रूट इनोक्यूलेशन द्वारा जीन साइलेंसिंग की उनकी दक्षता की जांच करने के लिए यादृच्छिक रूप से चुना गया था। हमारे निष्कर्षों ने संकेत दिया कि रालस्टोनिया-उपचारित सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड पौधों में सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर ~30 प्रतिशत तक कम हो गए थे, जबकि अनसिल्टेड पौधों की तुलना में, सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 (चित्रा 4ए) की साइलेंसिंग को मान्य किया गया था।

सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड प्लांट्स ने बिना साइलेंटेड प्लांट्स की तुलना में आरएसआई के प्रति काफी अधिक संवेदनशीलता दिखाई। रोगज़नक़ों के लिए काली मिर्च की संवेदनशीलता रालस्टोनिया जनसंख्या वृद्धि में वृद्धि दिखा कर बढ़ गई थी, सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड काली मिर्च के पौधों में उच्च सीएफयू मूल्यों द्वारा चिह्नित 3 डी और 5 दिनों के पोस्ट इनोक्यूलेशन (डीपीआई) (चित्रा 4बी) में बिना साइलेंस वाले पौधों की तुलना में। H2O2 उत्पादन और Ralstonia inoculated CaWRKY30 साइलेंटेड (TRV: CaWRKY30), और unsilenced (TRV:00) काली मिर्च के पत्तों में सेल नेक्रोसिस का पता लगाने के लिए हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग टेस्ट किया गया था। एक डार्क डीएबी स्टेनिंग (एच2ओ2 उत्पादन का संकेत) और एचआर जैसी कोशिका मृत्यु, डार्क ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा इंगित की गई, 48 एचपीआई (घंटों के पोस्ट इनोक्यूलेशन) पर बिना साइलेंट काली मिर्च के पत्तों में देखी गई। इसके विपरीत, ट्रायपैन ब्लू और डीएबी स्टेनिंग की सांद्रता CaWRKY30 खामोश काली मिर्च के पत्तों (चित्र 4C) में काफी कम हो गई थी। विद्युत चालकता - आयन रिसाव का एक संकेतक - आरएसआई के बाद प्लाज्मा झिल्ली क्षति और कोशिका मृत्यु का अध्ययन करने के लिए गणना की गई थी।

परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि आरएसआई के साथ इलाज किए गए बिना साइलेंस वाले पौधों ने 24 और 48 डीपीआई (चित्रा 4डी) पर रालस्टोनिया-उपचारित सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड पौधों की तुलना में उच्च आयन रिसाव का प्रदर्शन किया। आरएसआई (सप्लीमेंट्री टेबल S2) के बाद साइलेंट और अन-साइलेंटेड पौधों में रोग के स्तर का अनुमान लगाने के लिए सापेक्ष रोग सूचकांक का अनुमान 10 डीपीआई तक लगाया गया था। सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड प्लांट्स में 10 डीपीआई पर प्रमुख रोग लक्षण देखे गए, जबकि अनसाइलेंटेड प्लांट्स ने थोड़ा रोग लक्षण व्यक्त किया (चित्र 4ई)। छह CaWRKY 30- साइलेंट और अन-साइलेंट पौधों को बेतरतीब ढंग से चुना गया और फेनोटाइप परख के लिए जड़ों में आर सोलानेसीरम के साथ घुसपैठ किया गया। 10 डीपीआई पर सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 साइलेंटेड पेपर में स्पष्ट मुरझाने वाले रोग के लक्षण देखे गए, जबकि बिना साइलेंस किए गए पौधों ने बहुत कमजोर मुरझाने के लक्षण व्यक्त किए (चित्र 4एफ)। प्रतिरक्षा-संबंधित मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल संचय का अध्ययन करने के लिए क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण किया गया था और परिणाम व्यक्त किए गए थे कि सीएपीआर1, सीएएनपीआर1, सीएडीईएफ1, सीएएबीआर1, और सीएएचआईआर1 जैसे प्रतिरक्षा-संबंधित मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तर सीएडब्ल्यूआरकेवाई {{{ में कम हो गए थे। 25}}48 डीपीआई (चित्र 4जी) पर अन-साइलेंट पौधों की तुलना में साइलेंट प्लांट्स।

चित्र 4. VIGS द्वारा CaWRKY30 की साइलेंसिंग ने RSI के लिए काली मिर्च के प्रतिरोध को कम कर दिया और प्रतिरक्षा से जुड़े मार्कर जीन को अपग्रेड कर दिया। R. solanacearum-inoculated, नकली (MgCl2 समाधान के साथ टीका लगाया गया) CaWRKY 30- खामोश काली मिर्च के पौधों (TRV: CaWRKY30), और नियंत्रण पौधों (TRV: 00) में CaWRKY30 अभिव्यंजक स्तरों की qRT-PCR परख (ए)। 3 और 5 डीपीआई (बी) पर आर. सोलानेसीरम के साथ लगाए गए काली मिर्च के पौधों के बीच सीएडब्ल्यूआरकेवाई30-साइलेंट और अन-साइलेंटेड (नियंत्रण) के बीच आर. सोलानेसीरम की वृद्धि में अंतर। R. solanacearum-inoculated CaWRKY30-silenced (TRV: CaWRKY30) और un-silenced (TRV:00) काली मिर्च की पत्तियों में 48 dpi पर हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग (DAB और ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग)। स्केल बार=50 µm (C)। CaWRKY30-silenced (TRV: CaWRKY22) और un-silenced (TRV:00) काली मिर्च के पौधों की 24 और 48 hpi पर पत्ती डिस्क में सेल-डेथ प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए आयन चालकता के रूप में इलेक्ट्रोलाइट रिसाव माप आर. सोलनसीरम (डी) के साथ और उसके बिना। CaWRKY30-VIGS द्वारा साइलेंसिंग ने काली मिर्च के पौधों की R. सोलानेसीरम संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता को बढ़ाया।

समय के साथ रोग सूचकांक में काफी वृद्धि हुई। CaWRKY30-silenced (TRV: CaWRKY30) पौधों ने समय के साथ un-silenced (TRV:00) पौधों की तुलना में R. solanacearum संक्रमण के प्रति उच्च संवेदनशीलता व्यक्त की। औसत प्रति प्रतिकृति (ई) पांच पौधों के साथ चार जैविक प्रतिकृति पर आधारित हैं। CaWRKY 30- साइलेंट (TRV: CaWRKY30) और अन-साइलेंटेड (TRV: 00) काली मिर्च के पौधों पर 10 dpi (F) पर R. सोलानेसीरम उपचार का फेनोटाइपिक प्रभाव। CaWRKY30-silenced (TRV: CaWRKY30) और un-silenced (TRV:00) काली मिर्च के पौधों में R के साथ 48 घंटे के बाद टीका लगाने के बाद रक्षा से जुड़े मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर की qRT-PCR परख। सोलनसीरम (जी)। मॉक-ट्रीटेड अन-साइलेंट प्लांट्स का रिलेटिव ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन लेवल "1" पर सेट किया गया था। बार की ऊंचाई माध्य इंगित करती है और त्रुटि बार माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती है। डेटा चार जैविक प्रतिकृति से ± SE का मतलब दर्शाता है। सलाखों के ऊपर अलग-अलग अक्षर साधनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं।

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