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अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन यूएचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा प्लांट एक्सट्रैक्ट्स में प्राकृतिक और क्षारीय-ऑक्सीडाइज्ड प्रोएंथोसाइनिडिन की विशेषता

Mar 31, 2022

अधिक जानकारी के लिए। संपर्क Ajay करेंtina.xiang@wecistanche.com

सार: इस अध्ययन में, हमने क्षारीय से पहले और बाद में 55 पौधों के अर्क की प्रोएथोसायनिडिन (पीए) संरचना का विश्लेषण किया।ऑक्सीकरणअल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन UHPLC-MS/MS द्वारा। हमने प्राकृतिक पीए संरचनाओं की विस्तार से विशेषता बताई और संशोधित पीए संरचनाओं में परिष्कृत परिवर्तनों और ऑक्सीकरण के कारण विभिन्न पीए वर्गों के भीतर प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट पैटर्न और मॉडल का अध्ययन किया। प्राकृतिक पीए ए- और बी-टाइप पीसी, पीडी और पीसी / पीडी मिश्रण थे। इसके अलावा, हमने गैलॉयलेटेड पीए का पता लगाया। विभिन्न पौधों के अर्क में बी-टाइप पीसी बल्कि स्थिर थे और के कारण कोई मामूली संशोधन नहीं दिखाक्षारीय ऑक्सीकरण. कुछ नमूनों के लिए, हमने ए-टाइप ईथर लिंकेज बनाने वाले पीसी की इंट्रामोल्युलर प्रतिक्रियाओं का पता लगाया। ए-प्रकार के पीसी भी बिना या मामूली संशोधन के स्थिर थे, लेकिन कुछ पौधों में, अतिरिक्त ईथर का निर्माणलिंकेजपता चला था। पीडी इकाइयों वाले पीए अधिक प्रतिक्रियाशील थे। क्षारीय ऑक्सीकरण के बाद, इन पीए या उनके ऑक्सीकरण उत्पादों का अब एमएस द्वारा पता नहीं लगाया गया था, भले ही यूवी द्वारा 280 एनएम पर एक अलग प्रकार और / या विलंबित पीए कूबड़ का पता लगाया गया था। यदि वे पीसी-आधारित थे, तो गैलॉयलेटेड पीए क्षारीय ऑक्सीकरण के तहत स्थिर थे, लेकिन हमने बी-टाइप से ए-टाइप में इंट्रामोल्युलर रूपांतरण का पता लगाया। गैलॉयलेटेड पीडी अधिक प्रतिक्रियाशील थे और नॉनगैलोलेटेड पीडी के समान प्रतिक्रिया करते थे।

कीवर्ड: उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री; ऑर्बिट्रप; ऑक्सीकरण; टैनिन; यूएचपीएलसी-डीएडी-एमएस/एमएस

1flavonoids antioxidant

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1 परिचय

proanthocyanidins(PAs, syn. संघनित टैनिन) ओलिगोमर्स और पॉलिमर हैं जिनमें फ्लेवन-3-ऑल मोनोमेरिक इकाइयां (चित्र 1) शामिल हैं। पीए संरचनाओं की विविधता मुख्य रूप से उनके हाइड्रॉक्सिलेशन पैटर्न, फ्लेवन के अनुक्रमिक क्रम -3- ओएल इकाइयों, और पोलीमराइजेशन (डीपी) की डिग्री के अलावा, सी 2 और सी 3 में स्टीरियोकेमिस्ट्री में अंतर और स्थान में भिन्नता से प्राप्त होती है। और इंटर . की स्टीरियोकेमिस्ट्रीflavonoidबांड [1]। सबसे आम पीए प्रोसायनिडिन (पीसी) हैं जिनमें (एपीआई) कैटेचिन इकाइयां और प्रोडेलफिनिडिन (पीडी) शामिल हैं जिनमें (एपीआई) गैलोकैटेचिन इकाइयां (चित्रा 1) शामिल हैं। चित्र में प्रस्तुत PA संरचनाओं में C4→C8 संबंध हैं। हालाँकि, PA को C4 → C6 बॉन्ड द्वारा भी जोड़ा जा सकता है, और हम इन दोनों लिंकेज को मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक दूसरे से अलग नहीं कर सकते।

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>एकाधिक 100-किलो टन सालाना), और जैव-बहुलक [2-5] के रूप में रासायनिक और आर्थिक रूप से अधिक आकर्षक हैं। वर्तमान में, उनके उत्पादन के लिए और मुख्य रूप से चमड़े की कमाना, शराब, खनिज की मांगों के लिए, केवल कुछ संसाधनों, जैसे कि मवेशियों की छाल या जंगल, मिमोसा, क्यूब्राचो, ओक, शाहबलूत, मैंग्रोव, सुमाच, हरड़, और तारा का उपयोग किया जाता है। प्लवनशीलता, और तेल ड्रिलिंग उद्योग, पशु पोषण के अलावा, चिपकने वाले तैयार करने के लिए [4,6,7]। हालांकि, उपरोक्त सूचीबद्ध औद्योगिक अनुप्रयोगों से फलों, सब्जियों और वन संसाधनों को संभालने और प्रसंस्करण से अपशिष्ट या उपोत्पाद भी प्राकृतिक पीए [8-11] के लिए एक संभावित स्रोत हो सकते हैं। पीए को उनकी उपयोगिता और जैव गतिविधियों को बढ़ाने के लिए और भी संशोधित किया जा सकता है [12,13]।

(A) A model structure for oligomeric B-type proanthocyanidins (PAs) with C4→C8 linkages: R1 = H, procyanidin, R1 = OH, prodelphinidin. B-type PAs can also be linked by C4→C6 bonds. A-type PAs have an additional C2→O→C7 or C2→O→C5 ether bond. The hydroxyl groups can also be substituted, for example, galloylated or glycosylated. (B) A galloyl group. The chemical properties of PAs can be modified through derivatization reactions [12]. These reactions include, for example, O-acylation by a reaction with acid chlorides or anhydrides or alkylation with alkyl halides. Derivatization modifies the physicochemical properties of PAs for their commercial applications and purification technologies. However, to truly understand the actual reactions happening, several parameters, such as the reagents and solvents used, temperature, pH, and reaction time need to be regulated [12]. A simple and rapid way to improve the usability of plant PAs is to oxidize them to create new PAs with altered molecular structures. Even though the reaction conditions of oxidation are well-known and different reaction mechanisms have been suggested, the corresponding structural changes are mainly known for individual small PAs [14–18]. For example, the oxidation and rearrangement reactions of different monomeric and dimeric flavan-3-ols have been elegantly discussed already 30 years ago, showing that the chemistry of these PAs at alkaline pH is regulated by the formation of A- and/or B-ring quinonemethides as highly reactive intermediates causing the rearrangement reactions and the oxidative conversion of B-type to A-type PAs [15]. Instead, the behavior of PA mixtures in the plant extracts is not known, and this is most probably due to difficulties in the analyzing of structurally different initial PAs, which is challenged even further after oxidation. In our previous study, we tested whether different types of natural PAs could be chemically modified to produce new types of PAs and studied the effects of nonspecific alkaline oxidation mimicking the often-used alkaline extraction process for bark waste [19–23] on 102 PA-containing plant extracts [13]. The results indicated different reactivities for PCs and PDs. The result suggested that plant PAs could be modified at high pH, and the presence of PD groups significantly enhanced the probability of modification reactions. The main reaction route was concluded to be intramolecular, but for PD-rich and galloylated PAs, both intra- and intermolecular reactions were indicated [13]. In addition, other studies have shown that oxidation of PAs includes both intramolecular and intermolecular reactions [14,15,24,25]. The detailed characterization and understanding of natural and oxidized PAs is challenging, but recent advances in ultra-high-performance liquid chromatographic tandem Figure 1. (A) A model structure for oligomeric B-type proanthocyanidins (PAs) with C4→C8 linkages: R1 = H, procyanidin, R1 = OH, prodelphinidin. B-type PAs can also be linked by C4→C6 bonds. A-type PAs have an additional C2→O→C7 or C2→O→C5 ether bond. The hydroxyl groups can also be substituted, for example, galloylated or glycosylated. (B) A galloyl group

पीए के रासायनिक गुणों को व्युत्पन्न प्रतिक्रियाओं [12] के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है। इन प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं, उदाहरण के लिए, एसिड क्लोराइड या एनहाइड्राइड के साथ प्रतिक्रिया द्वारा ओ-एसिलेशन या एल्काइल हैलाइड्स के साथ अल्किलेशन। व्युत्पन्नकरण पीए के भौतिक-रासायनिक गुणों को उनके व्यावसायिक अनुप्रयोगों और शुद्धिकरण प्रौद्योगिकियों के लिए संशोधित करता है। हालांकि, वास्तव में हो रही वास्तविक प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए, कई मापदंडों, जैसे कि अभिकर्मकों और सॉल्वैंट्स का उपयोग, तापमान, पीएच और प्रतिक्रिया समय को विनियमित करने की आवश्यकता है [12]। संयंत्र पीए की उपयोगिता में सुधार करने का एक सरल और तेज़ तरीका है कि उन्हें परिवर्तित आणविक संरचनाओं के साथ नए पीए बनाने के लिए ऑक्सीकरण किया जाए। भले ही ऑक्सीकरण की प्रतिक्रिया की स्थिति प्रसिद्ध है और विभिन्न प्रतिक्रिया तंत्रों का सुझाव दिया गया है, संबंधित संरचनात्मक परिवर्तन मुख्य रूप से व्यक्तिगत छोटे पीए [14-18] के लिए जाने जाते हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न मोनोमेरिक और डिमेरिक फ्लेवन -3- ओल्स के ऑक्सीकरण और पुनर्व्यवस्था प्रतिक्रियाओं पर पहले से ही 30 साल पहले से ही चर्चा की गई है, यह दर्शाता है कि क्षारीय पीएच पर इन पीए के रसायन विज्ञान को ए-और / या के गठन द्वारा नियंत्रित किया जाता है। बी-रिंग क्विनोन-मेथाइड्स अत्यधिक प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती के रूप में पुनर्व्यवस्था प्रतिक्रियाओं और बी-टाइप के ऑक्सीडेटिव रूपांतरण को ए-टाइप पीए [15] का कारण बनता है। इसके बजाय, पौधे के अर्क में पीए मिश्रण का व्यवहार ज्ञात नहीं है, और यह संभवतः संरचनात्मक रूप से विभिन्न प्रारंभिक पीए के विश्लेषण में कठिनाइयों के कारण है, जो ऑक्सीकरण के बाद भी आगे चुनौती दी जाती है। हमारे पिछले अध्ययन में, हमने परीक्षण किया कि क्या विभिन्न प्रकार के प्राकृतिक पीए को नए प्रकार के पीए के उत्पादन के लिए रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और छाल कचरे के लिए अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली क्षारीय निष्कर्षण प्रक्रिया की नकल करने वाले गैर-अल्कलाइन ऑक्सीकरण के प्रभावों का अध्ययन किया है [19-23] पर 102 पीए युक्त पौधे के अर्क [13]। परिणामों ने पीसी और पीडी के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया का संकेत दिया। परिणाम ने सुझाव दिया कि संयंत्र पीए को उच्च पीएच में संशोधित किया जा सकता है, और पीडी समूहों की उपस्थिति ने संशोधन प्रतिक्रियाओं की संभावना को काफी बढ़ा दिया है। मुख्य प्रतिक्रिया मार्ग को इंट्रामोल्युलर माना गया था, लेकिन पीडी-समृद्ध और गैलोवेटेड पीए के लिए, इंट्रा- और इंटरमॉलिक्युलर दोनों प्रतिक्रियाओं का संकेत दिया गया था [13]। इसके अलावा, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि पीए के ऑक्सीकरण में इंट्रामोल्युलर और इंटरमॉलिक्युलर प्रतिक्रियाएं [14,15,24,25] दोनों शामिल हैं।

प्राकृतिक और ऑक्सीकृत पीए का विस्तृत लक्षण वर्णन और समझ चुनौतीपूर्ण है, लेकिन उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास एनालाइज़र के साथ अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफिक टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (यूएचपीएलसी-एमएस / एमएस) इंस्ट्रूमेंटेशन में हालिया प्रगति ने कई अलग-अलग प्लांट पीए के लक्षण वर्णन को सक्षम किया है। [18,26-28]। पीए के लक्षण वर्णन के लिए लोकप्रिय जन विश्लेषक ऑर्बिट्रप [27,28] और चौगुनी हैं

टाइम-ऑफ़-फ़्लाइट (ओटीओएफ) [29,30] उनके उच्च-रिज़ॉल्यूशन गुणों के कारण, जो पौधों के अर्क में अध्ययन किए गए पीए के सटीक द्रव्यमान और संबंधित आणविक सूत्रों के निर्धारण की अनुमति देते हैं। प्रकृति में पाए जाने वाले पीए में आमतौर पर विभिन्न ओलिगो-और पॉलिमरिक संरचनाओं का मिश्रण होता है, जो इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण में कई गुना चार्ज किए गए आयनों का उत्पादन करता है, जो [30-32] का इस्तेमाल किया जाता है। इसके अलावा, पीए के पास प्रसिद्ध विशेषता विखंडन पैटर्न हैं, जिनका उपयोग उनकी पहचान के लिए किया जा सकता है: इनमें क्विनोन-मेथाइड (क्यूएम) दरार, हेट्रोसायक्लिक रिंग विखंडन (एचआरएफ), और रेट्रो-डायल्स-एल्डर (आरडीए) विखंडन शामिल हैं [27, 31-33]। समान विखंडन पैटर्न आमतौर पर ए-टाइप और बी-टाइप पीए दोनों के लिए मौजूद होते हैं, और एक ईथर लिंकेज के साथ ए-टाइप पीए के लिए देखे गए एम / जेड मान संबंधित बी-टाइप पीए से 2 दा से भिन्न होते हैं [26, {{ 19}}].

इस अध्ययन में, हमने यूएचपीएलसी का उपयोग अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ किया ताकि (ए) 55 पीए-समृद्ध पौधों के नमूनों में प्राकृतिक पीए संरचनाओं का विस्तार से अध्ययन किया जा सके, (बी) बाद में संशोधित पीए संरचनाओं में परिष्कृत परिवर्तन देखने के लिए। क्षारीय स्थितियों में हवाई ऑक्सीकरण और (सी) ऑक्सीकरण के कारण विभिन्न पीए वर्गों के भीतर प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट पैटर्न और मॉडल को पहचानने के लिए।

9flavonoids anti viral

2. परिणाम और चर्चा

हमने अपने पिछले अध्ययन [13] के आधार पर प्राकृतिक पीए के दिलचस्प लेकिन जटिल मिश्रण वाले 55 पीए-समृद्ध पौधों के नमूनों का चयन किया। इन पौधों के नमूनों को [13] की तरह क्षारीय परिस्थितियों में हवाई ऑक्सीकरण द्वारा ऑक्सीकृत किया गया था और ऑक्सीकरण के बाद, पीए और भी अधिक जटिल थे। पीए संरचनाओं में परिष्कृत परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इन प्राकृतिक और संशोधित पीए का अध्ययन यहां यूएचपीएलसी-डीएडी द्वारा अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन क्यू-ऑर्बिट्रैप एमएस / एमएस से जुड़ा था। पीए की पहचान उनके एकल और/या बहु आवेशित आयनों के आधार पर उनके संबंधित सटीक द्रव्यमान और आणविक सूत्र के आधार पर की गई थी। विश्लेषण उल्टे-चरण एलसी द्वारा किए गए थे, और इसलिए, ओलिगोमेरिक और पॉलीमेरिक पीए मुख्य रूप से 280 एनएम पर यूवी क्रोमैटोग्राम में अनसुलझे कूबड़ के रूप में मौजूद थे, उदाहरण के लिए चित्र 2ए में रुपरेचिया सैलिसिफोलिया का पत्ता निकालने देखें। कुल आयन क्रोमैटोग्राम में, अन्य फेनोलिक यौगिकों का आयनीकरण पीए की तुलना में अधिक गहन था, और इसलिए, पीए कूबड़ इतना स्पष्ट नहीं था (चित्र 2ख)। हालांकि, ऑर्बिट्रप की सटीकता एमएस परिणामों की व्याख्या को आसान बनाती है क्योंकि बहुगुणित आयनों के समस्थानिक पैटर्न स्पष्ट रूप से परिभाषित होते हैं, और चोटियों के संभावित अतिव्यापीकरण का पता लगाया जा सकता है, इस प्रकार विभिन्न ओलिगो के सटीक द्रव्यमान और आणविक सूत्रों के निर्धारण को सक्षम किया जा सकता है- और बहुलक पीए। उदाहरण के लिए, एम/जेड 441 पर गैलॉयलेटेड (एपीआई) कैटेचिन, गैलॉयलेटेड डिमेरिक पीसीएटी एम/जेड729, और एम/जेड 1017 पर गैलोवेटेड ट्रिमेरिक पीसी चित्रा 2सी-ईमें निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (ईआईसी) में अच्छी तरह से अलग चोटियों को प्रदर्शित करता है, और वे उनके यूवी और मास स्पेक्ट्रा के आधार पर आसानी से पता लगाया जा सकता है, जिसमें सटीक द्रव्यमान और संबंधित आणविक सूत्र शामिल हैं। यहां प्राप्त परिणाम एमएस / एमएस द्वारा प्राप्त पिछले परिणामों के अनुरूप थे, जिसमें दिखाया गया था कि रुपरेक्टिया सैलिसिफोलिया के पत्तों में 24 मिलीग्राम / ग्राम पीए होते हैं, जिनमें से केवल 3 प्रतिशत पीडी युक्त पीए थे, उनमें से कुछ गैलॉयलेटेड थे, और एमडीपी पाया गया था। 7 [13] होना।

UV chromatogram at 280 nm, (B) total ion chromatogram, (C) extracted ion chromatogram (EIC) at m/z 441, (D) EIC at m/z 729, and (E) EIC at m/z 1017 of the leaf extract of Ruprechtia salicifolia. PA = proanthocyanidin, NL = normalized intensity. 2.1. B-Type PCs in the Initial Non-Oxidized Plant Extracts B-type PCs in the plant extracts were detected based on their singly and multiply charged molecular ions in addition to the characteristic fragmentation patterns. For example, PCs in Begonia bowerae

2.1. प्रारंभिक गैर-ऑक्सीडाइज्ड प्लांट एक्सट्रैक्ट्स में बी-टाइप पीसी

संयंत्र के अर्क में बी-प्रकार के पीसी का पता उनके एकल और बहुगुणित आणविक आयनों के आधार पर विशेषता विखंडन पैटर्न के अलावा लगाया गया था। उदाहरण के लिए, बेगोनिया बोवर में पीसी "निग्रा" एक्सट्रेक्ट हैं, जो [एमएच] आयनों की एक अलग श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं, जो 288 दा द्वारा m/z289 से m/z 1729 तक अलग होते हैं, जो मोनोमर से हेक्सामर और [M{{ के बी-टाइप पीसी के अनुरूप होते हैं। 6}}H]' आयनों को 144 Da द्वारा m/z 1008 से m/z 1296 तक अलग किया जाता है, जो B-प्रकार के PC के लिए heptamers से nonamers (तालिका S1) के लिए होता है। मोनोमेरिक पीसी के मास स्पेक्ट्रा, यानी, फ्लैवन -3- ओएलएस कैटेचिन और एपिक्टिन, ने एम/जेड 245 पर एक विशेषता टुकड़ा आयन प्रदर्शित किया जैसा कि पहले बताया गया था [3132,36]।

सामान्य तौर पर, बी-टाइप पीसी डिमर के एमएस/एमएस ने एम/जेड 287 और 289 (क्यूएम क्लीवेज), एम/जेड 425, और 407 (आरडीए विखंडन और अनुक्रमिक जल उन्मूलन) और एम पर आयन उत्पन्न करने वाले विशिष्ट विखंडन पैटर्न दिखाए। /जेड 451 (एचआरएफ; चित्रा 3)। आरडीए विखंडन को बी-टाइप पीसी डिमर के लक्षण वर्णन के लिए सबसे महत्वपूर्ण विखंडन पैटर्न माना जाता है और विस्तार इकाई पर विखंडन को ऊर्जावान रूप से अधिक अनुकूल माना जाता है क्योंकि यह एक बड़े π-hyperconjugated प्रणाली के साथ टुकड़े आयनों का उत्पादन करता है। टर्मिनल इकाई पर आरडीए विखंडन [31-33]।

Characteristic fragmentation pathway and the MS/MS of B-type procyanidin dimer in the leaf extract of Cunninghamia lanceolata. The mechanisms are heterocyclic ring fission (HRF), retro-Diels‒Alder (RDA) fragmentation and quinone methide (QM) cleavage [31–33

2.2. प्रारंभिक गैर-ऑक्सीडाइज्ड प्लांट एक्सट्रैक्ट्स में ए-टाइप पीसी

प्रारंभिक पौधे के अर्क में ए-टाइप पीए की उपस्थिति की पुष्टि बी-टाइप पीए के समान उनके विशिष्ट विखंडन पैटर्न द्वारा की गई थी। उदाहरण के तौर पर, विशेषता विखंडन पथ और ए-टाइप पीसी डिमर और एक ए-टाइप लिंकेज वाले ट्रिमर के एमएस/एमएस डेटा को दिखाया गया है और विस्तार से चर्चा की गई है (आंकड़े 4 और 5)। ए-टाइप पीसी डिमर के विखंडन से चार टुकड़े आयन उत्पन्न हुए (चित्र 4)। टर्मिनल यूनिट के आरडीए विखंडन ने एम/जेड 423 पर एक आयन का उत्पादन किया, जो ए-टाइप लिंकेज [26,34,35] की उपस्थिति की पुष्टि करता है। इसके अलावा, हम सुझाव देते हैं कि विस्तार इकाई के आरडीए विखंडन और पानी की क्रमिक हानि एम/जेड 407 पर आयन का उत्पादन कर सकती है। एम/जेड 449 पर आयन एचआरएफ उत्पादन है, यानी नुकसान का परिणाम फ़्लोरोग्लुसिनॉल इकाई [26]। एम/जेड 285 और 289 पर आयन क्यूएम दरार के अनुरूप हैं। इसी तरह, ए-टाइप पीसी ट्रिमर ने एम/जेड 863 पर एक आणविक आयन और एमएस/एमएस में एम/जेड 711.693.573.559,451,411 और 289 पर विशेषता टुकड़ा आयनों का प्रदर्शन किया जैसा कि सुई एट अल द्वारा पहले रिपोर्ट किया गया था। (2016) ) [26]। ए-टाइप पीसी ट्रिमर के आरडीए विखंडन ने एम/जेड 711 पर एक आयन का उत्पादन किया, जो पिछले अध्ययन [26] के अनुसार फिर से ए-टाइप लिंकेज की उपस्थिति की पुष्टि करता है और संकेत देता है कि ए-टाइप लिंकेज दो एक्सटेंशन के बीच हो सकता है। इकाइयां हम सुझाव देते हैं कि एम/जेड 693 पर आयन पानी के क्रमिक नुकसान से मेल खाता है और ए-टाइप लिंकेज की स्थिति का समर्थन करता है, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। इसके अलावा, हम सुझाव देते हैं कि हेट्रोसायक्लिक सी-रिंग का अतिरिक्त आरडीए टर्मिनल फ्लेवन-3-ol इकाई आयन को m/z559 पर प्रदर्शित करती है। यह आयन हमारी पढ़ाई में मामूली था। एम/जेड573 और 289 पर आयन निचले इंटर फ्लेवेनॉइड बॉन्ड [26] के क्यूएम दरार के अनुरूप हैं। हमने m/z 575 और 287 पर आयनों का भी पता लगाया। हम प्रस्ताव करते हैं कि m/z 451 और 411 पर आयन मध्य फ्लैवन के हेट्रोसायक्लिक सी-रिंग के एचआरएफ के अनुरूप हो सकते हैं -3-ऑल यूनिट के स्थान का समर्थन करते हैं चित्र 5 के अनुसार विस्तार इकाइयों के बीच ए-टाइप लिंकेज।

2.3. क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण पौधों के अर्क में बी-टाइप पीसी का संशोधन

ऑक्सीकरण के बाद, विभिन्न पौधों के अर्क में बी-टाइप पीसी को अलग तरह से संशोधित किया गया था। कुछ नमूनों में कोई मामूली बदलाव नहीं दिखा; चित्र 6ए, बी देखें, उदाहरण के लिए, बेगोनिया बोवर के लीफ एक्सट्रैक्ट में छोटे बी-टाइप पीसी ओलिगोमर्स के लिए ऑक्सीकरण से पहले और बाद में "निग्रा" हैं। जब इस प्रकार के पौधों के अर्क को ऑक्सीकृत किया गया, तो प्रारंभिक और ऑक्सीकृत पौधों के अर्क का कुल द्रव्यमान स्पेक्ट्रा समान था। हालांकि, विस्तृत मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डेटा में छोटे अंतर पाए गए। उदाहरण के लिए, एम/जेड 577 पर पीसी डिमर को एम/जेड575 के साथ और पीसी ट्रिमर को एम/जेड 865 पर एम/जेड 863 के साथ जोड़ा गया था। जब ऑक्सीकरण से पहले पीसी की मात्रा कम थी, तो ऑक्सीकरण के बाद उनके संकेत मास स्पेक्ट्रा से लगभग गायब हो गए, यह संकेत देते हुए कि वे ऑक्सीकरण के कारण अज्ञात या अवक्रमित हो गए थे। उदाहरण के लिए, इस घटना को देखा गया था, उदाहरण के लिए, कॉम्ब्रेटम इंडिकम और यूफोरबिया चरैसिया के पत्ते के अर्क के लिए जिसमें कुछ छोटे पीसी ओलिगोमर्स की कम मात्रा होती है और पिछले एमएस / एमएस डेटा द्वारा समर्थित होता है जो दर्शाता है कि पीए सामग्री 4 मिलीग्राम / एमएल से घटकर 1 मिलीग्राम हो गई है। /mL और 7 mg/mL से 1 mg/mL, क्रमशः ऑक्सीकरण के कारण [13]। यह घटना प्रयोग की गई प्रायोगिक स्थितियों से संबंधित हो सकती है, जिसका अर्थ है कि प्रारंभिक पीए सामग्री कम होने पर वे अधिक गंभीर थे। कुछ नमूनों में, बी-टाइप पीसी के एक हिस्से को और अधिक संशोधित किया गया था, उदाहरण के लिए, चित्रा 6सी, डी देखें, ऑक्सीकरण से पहले और बाद में साइपरस ओवोई के लीफलेट एक्सट्रैक्ट में छोटे बी-टाइप पीसीओलिगोमर्स के लिए। जब इस प्रकार के पौधों के अर्क को ऑक्सीकृत किया गया था, तो कुल द्रव्यमान स्पेक्ट्रा में दृश्य अंतर का पता चला था, जो प्रारंभिक पीसी (चित्रा 6सी, डी, टेबल एस2) की तुलना में 2 दा का द्रव्यमान अंतर दिखा रहा था।

Figure 4. Characteristic fragmentation pathway and the MS/MS of A-type procyanidin dimer in the leaf extract of Aglaonema crispum. The mechanisms are heterocyclic ring fission (HRF), retro-Diels-Alder (RDA) fragmentation and quinone methide (QM) cleavage [26,34]. The ion at m/z407 is a tentative suggestion for the RDA fragmentation and the sequential water elimination of the extension unit.

Figure 5.Characteristic fragmentation pathway and the MS/MS of A-type procyanidin trimer in the leaflet extract of Tectaria macrodonta. The mechanisms suggested are heterocyclic ring fission(HRF), retro-Diels-Alder(RDA)fragmentation and quinone methide (QM) cleavage.

f non-oxidized (A) and oxidized (B) leaf extract of Begonia bowerae

यह सर्वविदित है कि ओ-डायहाइड्रॉक्सी पॉलीफेनोल्स का ऑक्सीकरण, यानी पीसी के कैटेचोल बी-रिंग, आमतौर पर 2 दा के बड़े अंतर के साथ ओ-क्विनोन उत्पन्न करता है। वास्तव में, हमने देखा है कि इस प्रकार का ऑक्सीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषणों में भी हो सकता है। आयनीकरण के दौरान पीसी के क्विनोन रूपों के संभावित ऑक्सीकरण या गठन के अनुरूप पीसी के एम/जेड मान से एम/जेड मान 2 डी छोटा होने वाले मास स्पेक्ट्रा में मामूली संकेत हो सकते हैं (डेटा प्रकाशित नहीं)। यह संभव है कि यहाँ क्षारीय ऑक्सीकरण में, o-dihydroxy polyphenols पहले o-quinones बनाते हैं। हालांकि, बनने वाले 0-क्विनोन रूप अस्थिर होते हैं और संभवत: जल्दी से आगे प्रतिक्रिया करते हैं। एक संभावित परिणाम बी-टाइप पीसी का ए-टाइप पीसी में ऑक्सीडेटिव रूपांतरण हो सकता है, जैसा कि पहले साहित्य में बताया गया था [15]। बी-टाइप पीसी के ए-टाइप पीसी में परिवर्तन में प्रारंभिक चरण के रूप में सी-रिंग के सी 2 पर हाइड्राइड आयन का ऑक्सीडेटिव निष्कासन शामिल है: मौजूदा बुनियादी स्थितियां बी-रिंग की ओ-डायहाइड्रॉक्सी कार्यक्षमता के ऑक्सीकरण को प्रेरित करती हैं। एक ओ-क्विनोन के लिए, जो बाद में एक के रूप में कार्य करता हैऑक्सीडेंटबी-टाइप प्रोसायनिडिन डिमर को ए-टाइप वन [15] (चित्र 7) में बदलने के लिए। इस क्विनोन मेथाइड तंत्र को अलग-अलग तापमानों, पीएच और उत्प्रेरक स्थितियों [37] में, 1,1-डिपेनिल-2-तटस्थ परिस्थितियों में पिक्रिलहाइड्राज़ाइल रेडिकल्स का उपयोग करके [38] और लैकेस द्वारा ( ईसी1.10.3.2) [39]।

The suggested mechanism for the conversion of B-type procyanidin dimer to A-type dimer according to [15,37].

जब हमने ऑक्सीकृत अर्क में 2 Da के बड़े अंतर के साथ संशोधित पीसी का अध्ययन किया और एमएस/एमएस द्वारा प्राप्त उनकी प्रस्तुतियों का अध्ययन किया, तो वे ए-प्रकार के पीसी और उनके टुकड़े आयनों के समान होने के लिए निष्कर्ष निकाला गया (जैसा कि धारा 2.2 में ऊपर चर्चा की गई है), m/z 285 और 289 (QM दरार), m/z 423 (RDA विखंडन) और m/z449 (HRF) पर आयन देने वाले विशेषता विखंडन पैटर्न दिखा रहा है। एक उदाहरण के रूप में, हम चित्र 8 में माइक्रोग्रामा मॉरिटानिया के लीफलेट एक्सट्रैक्ट के बी-टाइप पीसी डिमर का ए-टाइप पीसी डिमर में रूपांतरण दिखाते हैं।गैर ऑक्सीकरणनिकालने के लिए, हमने एम/जेड मान 577 (चित्रा 8ए) के साथ चार बी-टाइप पीसी डिमर का पता लगाया, लेकिन एम/जेड मान 575 (चित्रा 8बी) के साथ कोई ए-टाइप पीसी डिमर नहीं। एम/जेड575 पर ईआईसी में छोटी चोटियां आयन स्रोत में बी-टाइप पीसी के ऑक्सीकरण के अनुरूप होती हैं क्योंकि अवधारण समय बी-टाइप पीसी के समान ही होता है। ऑक्सीकृत अर्क में, हमने एम/जेड 577 (चित्रा 8सी) पर प्रारंभिक बी-प्रकार के पीसी के केवल निशान का पता लगाया, लेकिन इसके बजाय, हमने एम/जेड 575 पर ए-टाइप पीसी के अनुरूप बाद के प्रतिधारण समय पर गहन चोटियों का पता लगाया। 8D)। EIC में छोटी चोटियाँ m/z577 पर समान अवधारण समय वाले m/z 575 के समस्थानिक संकेतों के अनुरूप हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह अध्ययन गुणात्मक था, जिसका अर्थ है कि आयनों की प्रचुरता नहीं हो सकती है के रूप में तुलना की जाती है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बी-टाइप पीसी का ए-टाइप पीसी में रूपांतरण हमेशा इस उदाहरण की तरह पूर्ण नहीं था और सभी बी-टाइप पीसी को ए-टाइप पीसी में परिवर्तित नहीं किया गया था; मोटे तौर पर अनुमान लगाया गया था कि ए-टाइप और बी-टाइप पीसी ओलिगोमर्स के आयनों की प्रचुरता समान थी। दूसरी ओर, कुछ नमूनों में, हमने 2 दा के अधिक अंतर का पता लगाया; उदाहरण के लिए, एम/जेड 2017 पर पीसी हेप्टामर को एम/जेड2015 और 2013 में आयनों के साथ जोड़ा जा सकता है, जो क्रमशः एक और दो ए-टाइप लिंकेज के गठन पर इशारा करता है।

Extracted ion chromatograms (EICs) of the non-oxidized leaflet extract of Microgramma mauritiana (A) the ions at m/z 577.11–577.17 showing the presence of B-type procyanidin dimers, (B) the ions at m/z 575.09–575.15 and of the oxidized extract of Microgramma mauritiana (C) the ions at m/z 577.11–577.17 and (D) the ions at m/z 575.09–575.15 showing the presence of A-type procyanidin dimers. (*) the ion corresponds to the isotopic signal of a doubly charged molecular ion for a tetrameric procyanidin. (**) the ion has the same elemental composition as A-type PC dimers but different fragment ions, NL = normalized intensity. Note that this study was qualitative, and the intensities cannot be compared as such

भले ही बी-टाइप पीसी का ए-टाइप में रूपांतरण मुख्य प्रतिक्रिया तंत्र लग रहा था, हम अन्य संशोधन प्रतिक्रियाओं को पूरी तरह से बाहर नहीं कर सकते हैं। पीए प्रारंभिक गैर-ऑक्सीकरण वाले अर्क में जटिल मिश्रण के रूप में मौजूद थे, और ये मिश्रण क्षारीय ऑक्सीकरण के बाद एमएस डेटा की एक बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के बाद और भी अधिक जटिल थे। उदाहरण के लिए, पीए के बेस-उत्प्रेरित ऑक्सीकरण और पुनर्व्यवस्था प्रतिक्रियाओं पर पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पीसी डिमर सी-रिंग आइसोमेराइजेशन के विभिन्न उत्पादों में बातचीत कर सकते हैं, जिसमें टेट्राहाइड्रॉक्सीपाइरानोक्रोमेनेस भी शामिल है, जिसे फ़्लोरोटैनिन [15] भी कहा जाता है। ये उत्पाद 577 पर बहुत समान एम/जेड मान प्रदर्शित करेंगे लेकिन एलसी में अलग-अलग प्रतिधारण समय और एमएस में विभिन्न विखंडन पैटर्न प्रदर्शित करेंगे। एम/जेड 577 पर ईआईसी के आधार पर, हमने इस्तेमाल की गई प्रतिक्रिया स्थितियों में इस तरह की पुनर्व्यवस्था का पता नहीं लगाया। पुनर्व्यवस्था और हेट्रोसायक्लिक सी-रिंग के खुलने से रेजीओ-आइसोमेराइज़ेशन, एपिमराइज़ेशन, या 13-एरिल माइग्रेशन [15] के माध्यम से अन्य उत्पाद भी तैयार हो सकते हैं। एपिमेराइज़ेशन मुख्य रूप से निर्माण प्रक्रियाओं से संबंधित है और, उदाहरण के लिए, कोको के भूनने से संबंधित उच्च तापमान से फ्लेवन -3-ऑल लॉस होता है, लेकिन फ्लेवन-3-ऑल मोनोमर्स, डिमर के एपिमराइज़ेशन के लिए भी। , और ट्रिमर [40]। इसके अलावा, यह बताया गया है कि केले के फल के मांस में पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज (-) - एपिगैलोकैटेचिन से (-) - गैलोकैटेचिन [41] के एपिमेराइजेशन का कारण बना। हमने m/z289 पर EIC का उपयोग करते हुए फ्लेवन -3- ols के संभावित एपिमेराइज़ेशन को देखा, और सामान्य तौर पर, हमने उपयोग किए गए क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण होने वाले महत्वपूर्ण एपिमराइज़ेशन का पता नहीं लगाया। हालाँकि, हम एपिमेराइज़ेशन को पूरी तरह से बाहर नहीं कर सकते हैं क्योंकि हमने प्रारंभिक गैर-ऑक्सीडाइज़्ड अर्क (चित्रा S1) की तुलना में पैवोनिया फूलगोभी के फूलों के ऑक्सीकृत अर्क में (-) - एपिकेचिन के संबंध में (प्लस) -कैटेचिन की उच्च मात्रा का पता लगाया था। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑक्सीकृत अर्क को यूएचपीएलसी-एमएस/एमएस से पहले निष्प्रभावी कर दिया गया था, जो रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं का कारण हो सकता है। ऑक्सीकृत रूपों में, क्विनोन इलेक्ट्रोफाइल होते हैं जो मौजूद न्यूक्लियोफिलिक पानी के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, और इसका परिणाम केवल बी-टाइप पीसी को कम करने वाली प्रतिक्रिया में हो सकता है, जो यह भी बता सकता है कि क्यों कुछ बी-टाइप पीसी अप्रभावित लग रहे थे।

flavonoids cardiovascular cerebrovasular

2.4. क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण प्लांट एक्सट्रैक्ट्स में ए-टाइप पीसी का संशोधन

विभिन्न पौधों के अर्क में ए-प्रकार के पीसी क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण अलग तरह से प्रतिक्रिया करते हैं। कुछ नमूनों में कोई मामूली बदलाव नहीं दिखा। जब इस प्रकार के पौधों के अर्क को क्षारीय ऑक्सीकरण के अधीन किया गया था, तो कुल द्रव्यमान स्पेक्ट्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था (उदाहरण के लिए, ऑक्सीकरण से पहले और बाद में एग्लोनिमा कम्यूटेटम वेर। मैक्युलैटम के पत्ती निकालने में देखे गए प्रमुख आयनों के लिए तालिका एस 3 देखें)। हालांकि, विस्तृत मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डेटा में 2 दा के द्रव्यमान अंतर वाले छोटे अंतर का पता लगाया जा सकता है और यह संकेत देता है कि अतिरिक्त ए-टाइप ईथर लिंकेज बन सकते हैं। ए-टाइप पीसी वाले कुछ नमूनों के लिए यह घटना अधिक स्पष्ट थी; इन ए-टाइप पीसी को क्षारीय ऑक्सीकरण (चित्रा 9) के कारण अतिरिक्त ए-टाइप ईथर लिंकेज बनाने के लिए देखा गया था। जब इस प्रकार के पौधों के अर्क का ऑक्सीकरण किया गया, तो कुल द्रव्यमान स्पेक्ट्रा में अलग-अलग अंतर पाए गए, जो प्रारंभिक ए-टाइप पीसी की तुलना में 2 दा का द्रव्यमान अंतर दिखाते हैं। एम/जेड 863 पर [एमएच]-आयन एक पीसी ट्रिमर के लिए मेल खाता है जिसमें एक ए-टाइप ईथर बॉन्ड होता है और आयन एम/जेड 861 पर दो ईथर लिंकेज वाले पीसी ट्रिमर के लिए होता है (चित्र 9ए) ) इसी तरह, एक, दो और तीन ईथर लिंकेज वाले टेट्रामेरिक पीसी का पता [एम-एच]-आयनों द्वारा क्रमशः एम/जेड 1151, 1149, और 1147 पर लगाया गया (चित्र 9बी)। अनुपात में, पेंटामेरिक और हेक्सामेरिक पीसी में एक , दो और तीन ईथर बांडों को [एम-एच]-आयनों द्वारा m/z 1439, 1437, और 1435 और m/z 1727,1725, और 1723 पर क्रमशः पता लगाया गया था (चित्र 9सी, डी; हालांकि, [एम -2एच]2-आयन पर एम/जेड 861 एक पीसी हेक्सामर स्पष्ट रूप से एम/जेड 1723 पर [एमएच]-आयन की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में था और इसलिए, में दिखाया गया है आकृति)।

Molecular ions with corresponding exact masses and molecular formulae for procyanidin oligomers with one or more A-type linkages from the leaflet extract of Tectaria macrodonta: (A) trimers, (B) tetramers, (C) pentamers, and (D) hexamers. The first ion of each oligomer (having one ether bond) is taken from the non-oxidized extract, and the other ions of the oligomer (having two or more ether bonds) from the oxidized extract. For A-type procyanidin hexamer with three ether bonds, the doubly charged ion was more abundant. Figure 9. Molecular ions with corresponding exact masses and molecular formulae for procyanidin oligomers with one or more A-type linkages from the leaflet extract of Tectaria macrodonta: (A) trimers, (B) tetramers, (C) pentamers, and (D) hexamers. The first ion of each oligomer (having one ether bond) is taken from the non-oxidized extract, and the other ions of the oligomer (having two or more ether bonds) from the oxidized extract. For A-type procyanidin hexamer with three ether bonds, the doubly charged ion was more abundant

अतिरिक्त ए-प्रकार के लिंकेज के गठन ने इन ओलिगोमर्स के अवधारण समय को भी प्रभावित किया। पीसी के पोलीमराइजेशन की डिग्री बढ़ने के साथ अतिरिक्त ईथर लिंकेज की संख्या में कुछ हद तक वृद्धि हुई है, जिसकी उम्मीद है क्योंकि अतिरिक्त बॉन्ड के लिए अधिक स्थान हैं। हालांकि, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि आयनीकरण के दौरान संभावित ऑक्सीकरण या पीसी के क्विनोन रूपों के गठन के अनुरूप 2 दा के द्रव्यमान अंतर के साथ मामूली संकेत हो सकते हैं, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है। ये चोटियाँ ए-टाइप पीसी के अनुरूप मुख्य चोटियों से पहले चित्र 9 में मास स्पेक्ट्रा में भी दिखाई देती हैं। आयनों की प्रचुरता, समस्थानिक पैटर्न के आकार, और एमएस/एमएस द्वारा प्राप्त विशेषता टुकड़ा आयनों ने अतिरिक्त ए-टाइप ईथर लिंकेज के अवलोकन की पुष्टि की। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि देखी गई इन इंट्रामोल्युलर प्रतिक्रियाओं ने पोलीमराइजेशन की औसत डिग्री को प्रभावित नहीं किया क्योंकि गैर-ऑक्सीडाइज्ड अर्क की तुलना में ऑक्सीडाइज्ड अर्क में उच्च पीए ओलिगोमर्स या पॉलिमर का पता नहीं लगाया गया था। अवलोकन मौल्स एंड फुलक्रैंड (2012) [14] द्वारा समर्थित है।

2.5. पीए के साथ पौधे के अर्क जिनमें पीसी और पीडी दोनों सबयूनिट होते हैं और एकलाइन ऑक्सीडेशन के कारण उनके संशोधन होते हैं

कई नमूनों में दोनों (एपीआई) कैटेचिन और (एपीआई) गैलोकैटेचिन इकाइयों के साथ पीए शामिल थे, यानी, पीए पीसी / पीडी मिश्रण थे। क्षारीय ऑक्सीकरण के माध्यम से संशोधन के कारण इन पीसी/पीडी मिश्रणों का भाग्य पीसी की तुलना में अलग था। यूवी और एमएस दोनों द्वारा ऑक्सीकरण से पहले संयंत्र के अर्क में पीसी / पीडी मिश्रण स्पष्ट रूप से पाए गए थे; देखें, उदाहरण के लिए, पोडोकार्पस मैक्रोफिलस के प्रारंभिक पत्ती निकालने में छोटे पीए ओलिगोमर्स (चित्र 10ए और तालिका एस4)। ऑक्सीकरण के बाद, संशोधित पीए अभी भी यूवीएटी 280 एनएम द्वारा एक अलग प्रकार और/या विलंबित कूबड़ (चित्रा एस 2) के रूप में पाए गए थे, लेकिन एमएस द्वारा अब उनका पता नहीं लगाया गया था, उदाहरण के लिए, ऑक्सीकृत पत्ती में लापता पीए ओलिगोमर्स देखें। Podocarpus microphallus का अर्क (चित्र 10B और तालिका S4)। हमने न तो किसी अन्य संकेत का पता लगाया जो संशोधित पीसी / पीडी मिश्रण के अनुरूप हो और न ही उनके संभावित गिरावट उत्पादों के अनुरूप हो। उदाहरण के लिए, एम/जेड 577 पर पीसी डिमर के लिए, हम ऑक्सीकृत अर्क में एम/जेड 575 पर संबंधित ए-टाइप पीसी डिमर का पता लगा सकते हैं, लेकिन पीसी/पीडी डिमर या ट्रिमर के लिए इसी तरह के अलग-अलग अवलोकन नहीं किए जा सकते हैं (चित्र। 10बी)। ईएसआई-एमएस में पता लगाने योग्य पीसी/पीडी ओलिगोमर्स के नुकसान का कारण, उदाहरण के लिए, पीए [13-15,24,25] के बीच अंतर-आणविक प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। अंतर-आणविक प्रतिक्रियाओं को दो अलग-अलग ओलिगोमेरिक श्रृंखलाओं के कनेक्शन द्वारा संशोधित पीए के गठन के परिणामस्वरूप जाना जाता है, और आम तौर पर, वे पोलीमराइजेशन की औसत डिग्री में वृद्धि की ओर ले जाते हैं [14]। उदाहरण के लिए, वर्नहेट एट अल। (2014) ने छोटे-कोण एक्स-रे स्कैटरिंग प्रयोगों द्वारा देखा है कि यदि पीए को केंद्रित समाधानों में ऑक्सीकृत किया जाता है, तो संशोधित पीए लंबे रैखिक या शाखित श्रृंखला [25] के साथ उच्च बहुलक होते हैं। इसके अलावा ऑक्सीकरण से विभिन्न पीए [24] के ए और बी रिंगों के बीच चक्रीकरण भी हो सकता है। इसके अलावा, यह नोट किया गया है कि ये नए बंधन और संरचनाएं एसिड-उत्प्रेरित दरार के प्रतिरोधी हैं, और इसलिए, पोलीमराइज़ेशन की औसत डिग्री में वृद्धि का अनुमान केवल गैर-डिपोलीमराइज़िंग विधियों द्वारा लगाया जा सकता है [14,24। हालांकि, हमारे परिणामों से पता चला है कि इन संशोधित पीए को पीए (चित्रा 10) के लिए उपयोग की जाने वाली मानक ईएसआई-एमएस शर्तों के तहत या तो नहीं पाया गया है। अपने पिछले अध्ययन में, हमने गैर-ऑक्सीकरण और ऑक्सीकृत नमूनों में पीए का पता लगाने के लिए ट्रिपल क्वाड्रुपोल द्वारा चयनित प्रतिक्रिया निगरानी के आधार पर एक विधि का उपयोग किया और देखा कि क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण सबयूनिट संरचना बदल गई है, इसलिए विधि अब पता लगाने में सक्षम नहीं थी। संशोधित पीए [13]। वर्तमान उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस परिणाम ट्रिपल क्वाड्रुपोल द्वारा हमारी पिछली टिप्पणियों का समर्थन करते हैं कि ऑक्सीकृत अर्क में संशोधित पीए गैर-ऑक्सीडाइज्ड अर्क में प्रारंभिक पीए की तुलना में बहुत अधिक जटिल हैं और वे समान यूपीएलसी-एमएस / एमएस स्थितियों के तहत नहीं पाए जाते हैं। [13]।

The mass spectra of small mixed B-type oligomeric procyanidins (PCs) and prodelphinidins (PDs) in the non-oxidized (A) and oxidized (B) leaf extract of Podocarpus macrophyllus. The exact masses of main ions are listed in Table S4. The abundances of the ions are fixed to normalized intensity of 6.9 × 106

साहित्य में पीए के ऑक्सीकरण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियाँ हमारी पद्धति से भिन्न हैं, और इसलिए, परिणाम सीधे तुलनीय नहीं हो सकते हैं [14,24,25]। पिछले अध्ययनों में, वाइन पीएच की नकल करने के लिए पीएच 3.5 पर ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड के साथ अम्लीकृत पानी में ऑक्सीकरण किया गया है, और कई दिनों तक हवा की उपस्थिति में नमूने को हिलाकर वास्तविक ऑक्सीकरण प्राप्त किया गया है [14,24, 25]। हमने केवल एक घंटे के लिए पीएच 10 पर कार्बोनेट बफर द्वारा क्षारीय ऑक्सीकरण का उपयोग किया।

अधिकांश पौधों के अर्क में पीसी और पीडीसबयूनिट्स दोनों के साथ पीए शामिल थे, और केवल दो नमूनों में, पीए को लगभग पीडी शुद्ध माना जा सकता था। ये दो नमूने कैलिसिया जेंटली वेरेलेगन्स और पेलिया ऊटा के अर्क थे। कैलिसिया सौम्य संस्करण में बी-टाइप पीडी का पता लगाया गया था। एलिगेंस ऑक्सीकरण से पहले निकालते हैं; उदाहरण के लिए, तालिका S5 में छोटे पीडी ओलिगोमर्स देखें, लेकिन ऑक्सीकरण के बाद, इन पीडी को अब एमएस द्वारा नहीं पाया गया था। हमने न तो किसी अन्य संकेत का पता लगाया जो संशोधित पीडी के अनुरूप हो और न ही उनके संभावित गिरावट उत्पादों के अनुरूप हो। हालांकि, कुछ संशोधित पीए अभी भी यूवी द्वारा 280 एनएम पर कम और विलंबित कूबड़ (चित्रा S3) के रूप में पाए गए थे। दिलचस्प बात यह है कि ऑक्सीकरण से पहले, पेलिया डेटा एक्सट्रैक्ट में ए-टाइप ट्रिमेरिक पीडी का पता लगाया गया था, और ऑक्सीकरण के बाद भी ये संकेत मौजूद थे, लेकिन उनकी तीव्रता काफी कम थी।

एमएस द्वारा और, इसके अलावा, पीडी ट्रिमर में अतिरिक्त ए-टाइप लिंकेज के गठन के अनुरूप एम / जेड मान ए-टाइप पीसी (टेबल एस 6) के समान पाए गए थे। यह संकेत दे सकता है कि बी-प्रकार के होमो-और विषम पीडी के लिए देखी गई इंटरमॉलिक्युलर प्रतिक्रियाओं के अलावा, ए-टाइप पीडी में भी इसी तरह की इंट्रामोल्युलर प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं जो ए-टाइप पीसी के लिए पाई गई थीं।

2.6. क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण पौधों के अर्क और उनके संशोधनों में गैलोलेटेड पीए

कुछ पौधों में गैलॉयलेटेड पीए थे। पौधों के अर्क में आवंटित पीसी, पीडी और पीसी / पीडी की उपस्थिति की पुष्टि उनके विशिष्ट विखंडन पैटर्न द्वारा की गई थी। सामान्य तौर पर, एमएस विश्लेषण में गैलोवेटेड पीए का विखंडन आरडीए, एचआरएफ, और क्यूएम तंत्र के माध्यम से समान रूप से हुआ जैसा कि ऊपर [31-33] पर चर्चा की गई है। एक उदाहरण के रूप में, Ruprechtia salicifolia के लीफ एक्सट्रेक्ट में गैलॉयलेटेड पीसी डिमर के विशेषता विखंडन मार्ग और MS/MS डेटा को दिखाया गया है और विस्तार से चर्चा की गई है (चित्र 11)। गैलॉयल समूह की स्थिति केवल सांकेतिक है, और इसे टर्मिनल इकाई में किसी अन्य मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूह से जोड़ा जा सकता है। एम/जेड603 पर आयन एचआरएफ उत्पादन है। एम/जेड 287 और 441 पर आयन क्यूएम दरार के अनुरूप हैं। इसके अलावा, हमने गैलॉयल समूह की दरार का पता लगाया जिसके परिणामस्वरूप आयन एम/जेड577 पर पीसी डिमर के अनुरूप होता है और बाद में एम/जेड425 पर आयन के साथ आरडीए विखंडन और एम/जेड 407 पर आयन के साथ पानी की आगे की दरार। एम/जेड 577 के एचआरएफ ने एम/जेड 451 पर फ्रैगमेंट आयन का उत्पादन किया। इसके अलावा, हमने एम/जेड 109,123, और 125 पर छोटे टुकड़े आयनों का पता लगाया, जो सुगंधित रिंगों के अनुरूप हैं। गैलॉयलेटेड पीए में उनकी संरचनाओं (तालिका S7) में कई गैलॉयल समूह हो सकते हैं।

ntation pathway and the MS/MS of a galloylated procyanidin dimer in the leaf extract of Ruprechtia salicifolia. The position of the galloyl group is only indicative and could be any free OH group in the terminal unit. The mechanisms are heterocyclic ring fission (HRF), retro-Diels‒Alder (RDA) fragmentation and quinone methide (QM) cleavage. Figure 11. Characteristic fragmentation pathway and the MS/MS of a galloylated procyanidin dimer in the leaf extract of Ruprechtia salicifolia. The position of the galloyl group is only indicative and could be any free OH group in the terminal unit. The mechanisms are heterocyclic ring fission (HRF), retro-Diels-Alder (RDA) fragmentation and quinone methide (QM) cleavage.

अलग-अलग गैलॉयलेटेड पीए ने क्षारीय परिस्थितियों में हवाई ऑक्सीकरण के दौरान अलग तरह से व्यवहार किया। गैलॉयलेटेड पीसी बल्कि स्थिर थे और नॉनगैलोलेटेड पीसी के समान प्रतिक्रिया करते थे। उदाहरण के लिए, नेपेंथेस मैक्सिमा (तालिका S7) के ऑक्सीकृत पत्ती के अर्क में उनकी संरचनाओं में एक गैलॉयल समूह वाले गैलॉयलेटेड पीसी के लिए कोई उल्लेखनीय परिवर्तन नहीं पाया गया। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दो या दो से अधिक गैलॉयल समूहों वाले गैलॉयलेटेड पीसी के लिए आयनों की तीव्रता नेपेंथेस मैक्सिमा के ऑक्सीकृत अर्क में कम थी और, उदाहरण के लिए, कई गैली समूहों के साथ गैलॉयलेटेड पीसी पेंटामर्स अब पता लगाने योग्य नहीं थे (तालिका) एस7)। कुछ गैलॉयलेटेड पीसी के लिए पूर्णांक m/z मान PC/PDs के लिए m/z मान के समान होते हैं और इसलिए, अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन MS की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, m/z 881 दो PC और एक PD इकाई (C4sH3; O19, m परिकलित 882.20074) और दो गैलॉयल समूहों (C44H34O20, m परिकलित, 882.16435) वाले गैलॉयलेटेड पीसी डिमर से मिलकर बने एक ट्रिमेरिक PA से मेल खाती है। कुछ नमूनों में, जैसे कि कोकोकोबा यूविफेरा के ऑक्सीकृत पत्ती के अर्क में, गैलॉयलेटेड पीसी को ऑक्सीकरण के कारण ए-प्रकार के गैलॉयलेटेड पीसी में बदल दिया गया था, भले ही प्रारंभिक अर्क में गैलॉयलेटेड पीए नेपेंथेस मैक्सिमा के समान लग रहे थे। उदाहरण के लिए, आवंटित पीसी डिमर जिसमें एक गैलॉयलग्रुप होता है और एक आयन m/z 729 (टेबल S7) प्रदर्शित करता है, नेपेंथेस मैक्सिमा के लीफ एक्सट्रैक्ट में क्षारीय ऑक्सीकरण के दौरान स्थिर था, लेकिन आंशिक रूप से कोकोलोबा यूगिफेरा के लीफ एक्सट्रैक्ट में संशोधित किया गया था, जो एम दोनों में आयनों को प्रदर्शित करता है। /z 727 और 729। पूर्व आयन एक गैलॉयलेटेड ए-टाइप पीसीडीमर (एम/जेड727.13148, सी37एच2ओ16) के अनुरूप था और ए-टाइप लिंकेज का समर्थन करने वाले विशेषता एमएस / एमएस टुकड़े दिखाए: एम / जेड 601 (एम / जेड का एचआरएफ उत्पाद 727), 575 (ए-टाइप पीसीडीमर), 557 (एम/जेड575 से पानी की दरार), 449 (एम/जेड575 का एचआरएफ, चित्र 4 देखें), 423 (एम/जेड 575 का आरडीए, चित्र 4 देखें), 285 (एम/जेड575 का क्यूएम, चित्र 4 देखें), 169 (गैलिक एसिड), 125 (चित्र 11 देखें) और 109 (चित्र 11 देखें)। पौधों के अर्क के बीच समान पीए में इन अंतरों का एक कारण अर्क में मौजूद अन्य यौगिक हो सकते हैं और पीए की प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं।

गैलॉयलेटेड पीसी / पीडी मिश्रण और पीडी प्रतिक्रियाशील थे और नॉनगैलोलेटेड पीसी / पीडी मिश्रण और पीडी के समान संशोधित किए गए थे। ऑक्सीकरण के बाद, एमएस द्वारा इन पीए का पता नहीं लगाया गया था, हालांकि वे अभी भी यूवी पर 280 एनएम पर दिखाई दे रहे थे। हमने न तो किसी अन्य संकेत का पता लगाया जो इन संशोधित पीए के अनुरूप हो सकता है और न ही उनके संभावित गिरावट उत्पादों के अनुरूप हो सकता है। एक नमूने में, बबूल कररू के पत्तों में, यूवी द्वारा 280 एनएम पर संशोधित गैलॉयलेटेड और नॉनगैलोलेटेड पीडी का पता नहीं लगाया गया था।

हमारे पिछले अध्ययन [13] में, जहां गैर-ऑक्सीकृत और ऑक्सीकृत अर्क में पीए का विश्लेषण चयनित प्रतिक्रिया निगरानी विधियों द्वारा किया गया था, हमने देखा कि ऑक्सीकृत नमूनों में गैलॉयल विशिष्ट एमएस / एमएस विधि के साथ एक स्पष्ट गैलॉयल कूबड़ का पता चला था, लेकिन आकार कूबड़ बदल गया था और यूवी क्रोमैटोग्राम में देखे गए कूबड़ के अनुसार स्थानांतरित हो गया था। मूल गैलोवेटेड पीए को इस तरह से संशोधित किया गया था कि गैलॉयलग्रुप को अभी भी चयनित प्रतिक्रिया निगरानी विधि [13] के साथ पता लगाया जा सकता है। (-) - एपिगैलोकैटेचिन गैलेट और (-) - एपिगैलोकैटेचिन पर पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ट्राइहाइड्रॉक्सीफेनिल बी-रिंग ऑक्सीकरण के लिए कार्रवाई का प्रमुख स्थल है और गैलॉयल मौएटिटी [42] के ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप कोई पता लगाने योग्य उत्पाद नहीं हैं। हालांकि, उपयोग की गई प्रतिक्रिया की स्थिति और प्राप्त ऑक्सीकरण उत्पाद हमारे अध्ययन की तुलना में काफी भिन्न थे क्योंकि ऑक्सीकरण एज़ो सर्जक 2,2'-एज़ोबिस (2, 4- डाइमिथाइलवालेरोनिट्राइल) के थर्मोलिसिस द्वारा उत्पन्न पेरोक्सिल रेडिकल के साथ किया गया था। [42]।

गैलॉयलेटेड पीए के अलावा, दो नमूने, अर्थात् सेफलोटैक्सस हैरिंग्टोमिया सबस्प। ड्रुपेसियस लीफलेट्स और लौरस नोबिलिस के पत्तों में ग्लाइकोसिलेटेड पीसी होते हैं जिनमें एक पीसी संरचना से जुड़ी एक चीनी इकाई होती है। इनमें से कुछ ग्लाइकोसिलेटेड बी-टाइप पीसी को चीनी इकाई के दरार के बिना क्षारीय ऑक्सीकरण के दौरान ग्लाइकोसिलेटेड ए-टाइप पीसी में परिवर्तित करने के लिए देखा गया था। इसके अलावा, ए-टाइप पीसी के लिए अतिरिक्त ईथर लिंकेज के गठन का पता चला था।

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3. सामग्री और तरीके

पादप सामग्रियों का संग्रह, उनका प्रसंस्करण, और निष्कर्षण, इसके अलावा, पीएच 1{{10}} पर ऑक्सीकरण के लिए, जैसा कि पहले बताया गया था [13] किया गया था। प्रारंभिक अध्ययन में 1 0 2 नमूने थे, जिनमें से हमने कुल मिलाकर 55 नमूनों का विश्लेषण किया (तालिका S8)। हवाई ऑक्सीकरण के लिए, 20μLof प्रत्येक अर्क को 18{{40}}PH 1 के uL {{60}}बफर के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऑक्सीकृत किया गया था। 0.6 प्रतिशत जलीय HCOOH के 100 uL को जोड़कर ऑक्सीकरण को रोक दिया गया था। इसके अलावा, गैर-ऑक्सीकरण और ऑक्सीकृत दोनों नमूनों के लिए 300 uL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए विश्लेषण से पहले प्रारंभिक गैर-ऑक्सीकरण के 20 μL में 280 μLof पानी जोड़ा गया था। अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण एक UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS द्वारा किया गया था। इस उपकरण में एक एक्विटी यूपीएलसी सिस्टम (वाटर्स कॉर्प, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) शामिल था, जो क्वाड्रुपोल-ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर (क्यूएक्सएक्टिव टीएम, थर्मो फिशर साइंटिफिक जीएमबीएच, ब्रेमेन, जर्मनी) के साथ मिलकर बना था। इस्तेमाल किया गया कॉलम एक एक्विटी यूपीएलसी बीईएच फिनाइल कॉलम (2.1 × 100 मिमी, 1.7 um, वाटर्स कॉर्प, वेक्सफ़ोर्ड, आयरलैंड) था। एलुएंट्स ए=एसीटोनिट्राइल और बी =0 .1 प्रतिशत एचसीओओएच थे। 0.5 एमएल मिनट -1 की प्रवाह दर का उपयोग किया गया था, और रेफरेंस प्रोफाइल इस प्रकार था: 0-0। बी में 5 मिनट, 0.1 प्रतिशत ए (आइसोक्रेटिक); } बी में प्रतिशत ए (रैखिक ढाल); 6-6.1 मिनट, 35-90 बी में प्रतिशत ए (रैखिक ढाल); 6.1-9.5 मिनट, कॉलम वॉश और री-इक्विलिब्रेशन। इंजेक्शन की मात्रा 5μL थी। पूरे विश्लेषण के दौरान यूवी =190-500एनएम） और एमएस डेटा दर्ज किए गए। नकारात्मक आयनीकरण का उपयोग गर्म ईएसआई स्रोत में -3.0 केवी के स्प्रे वोल्टेज, म्यान गैस (एन2) प्रवाह दर 60, सहायक गैस (एन2) प्रवाह दर 20, स्वीप गैस प्रवाह दर 0, के साथ किया गया था। प्लस 380 डिग्री के केशिका तापमान और 30 ईवी के इन-सोर्स टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी)। पूर्ण स्कैन MS के लिए, ऑर्बिट्रप की द्रव्यमान सीमा m/z150-2250, रिज़ॉल्यूशन 35,000, और स्वचालित लाभ नियंत्रण3×10* थी। MS/MS विश्लेषणों के लिए, अर्थात् dd-MS2 (टॉपएन), पैरामीटर निम्नलिखित थे: टॉपएन 3; चरणबद्ध सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा 20, 50, और 80 ईवी, संकल्प 17,500, और स्वचालित लाभ नियंत्रण 1 × 105। अंशांकन पियर्स ईएसआई नेगेटिव आयन कैलिब्रेशन सॉल्यूशन (थर्मो फिशर सेंटिफिक इंक, वॉलथम, एमए, यूएसए) द्वारा किया गया था। डेटा को थर्मो एक्सकैलिबर ओरल ब्राउजर सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.0.63, थर्मो फिशर साइंटिफिक इंक, वॉलथम, एमए, यूएसए) के साथ संसाधित किया गया था। चूंकि ऑक्सीकृत नमूने सोडियम कार्बोनेट बफर (पीएच 10) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, सोडियम ने यूएचपीएलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के दौरान फॉर्मिक एसिड के साथ क्लस्टर आयनों का गठन किया। इसलिए, ऑक्सीकृत नमूनों के प्रत्येक कुल आयन क्रोमैटोग्राम की शुरुआत में, सोडियम फॉर्मेट क्लस्टर के एक मजबूत शिखर का पता चला था (तालिका S9)। पैटर्न का आसानी से पता लगाया गया और पीए के विश्लेषण को प्रभावित नहीं किया। छोटे PA oligomers के MS/MS फ़्रैगमेंट आयन तालिका S10 में प्रस्तुत किए गए हैं।

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4। निष्कर्ष

इस अध्ययन में, हमने अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन UHPLC-MS/MS (तालिका S8) द्वारा क्षारीय ऑक्सीकरण से पहले और बाद में 55 पौधों के अर्क की PA संरचना का विश्लेषण किया। प्राकृतिक पीए संरचनाओं में आवंटित लोगों के अलावा ए-और बी-प्रकार के पीसी, पीडी, और पीसी/पीडीमिक्स्चर शामिल थे। पीए रचनाएं जटिल थीं, और विविध पीए के सटीक द्रव्यमान और संबंधित आणविक सूत्रों को मापने के लिए अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन एमएस की आवश्यकता थी। विभिन्न पौधों के अर्क में बी-टाइप पीसी बल्कि स्थिर थे और क्षारीय ऑक्सीकरण के कारण कोई मामूली संशोधन नहीं दिखा। कुछ नमूनों के लिए, हमने ए-टाइप ईथर लिंकेज बनाने वाले पीसी की इंट्रामोल्युलर प्रतिक्रियाओं का पता लगाया। ए-टाइप पीसी भी बिना या मामूली संशोधन के स्थिर थे, लेकिन, कुछ पौधों में, अतिरिक्त ईथर लिंकेज के गठन का पता चला था। पीए (या तो शुद्ध पीडी या पीसी/पीडी मिश्रण) में पीडी इकाइयों वाले पौधे के अर्क अधिक प्रतिक्रियाशील थे। क्षारीय ऑक्सीकरण के बाद, इन पीए या उनके ऑक्सीकरण उत्पादों का अब एमएसईवन द्वारा पता नहीं लगाया गया था, हालांकि यूवी द्वारा 280 एनएम पर एक अलग प्रकार और / या विलंबित पीए कूबड़ का अभी भी पता लगाया गया था। पीए के बीच अंतर-आणविक प्रतिक्रियाओं ने संभवतः इन पीए को संशोधित किया ताकि मानक ईएसआई-एमएस शर्तों के तहत उनका पता नहीं लगाया जा सके। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इन संशोधित पीए का अध्ययन या तो क्षरण विधियों द्वारा नहीं किया जा सकता है। इसलिए, उनकी पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एक नई विश्लेषणात्मक पद्धति की आवश्यकता होगी। गैलॉयलेटेड पीए क्षारीय ऑक्सीकरण के तहत अपेक्षाकृत स्थिर थे यदि वे पीसी-आधारित थे, लेकिन अतिरिक्त ईथर लिंकेज का गठन गैलॉयलेटेड बी-टाइप पीए को गैलोइलेटेड ए-टाइप पीए के रूपांतरण का समर्थन करने के लिए किया गया था। दो या दो से अधिक गैलॉयल समूह वाले पीए केवल एक समूह वाले लोगों की तुलना में अधिक प्रतिक्रियाशील थे। गैलोवलेटेड पीसी/पीडी मिश्रण और पीडी अधिक प्रतिक्रियाशील थे और नॉनगैलोलेटेड वाले के समान प्रतिक्रिया करते थे। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इंट्रा- और इंटरमॉलिक्युलर प्रतिक्रियाएं अपवर्जनात्मक नहीं थीं, और ये प्रतिक्रियाएं एक साथ हो सकती हैं। इसके अलावा, मौजूद पादप मैट्रिक्स और अन्य यौगिकों ने इन अंतःक्रियाओं को प्रभावित किया।


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