बी सेल इम्यून रेपरटेयर सीक्वेंसिंग द्वारा प्री-ट्रांसप्लांट और पोस्ट-ट्रांसप्लांट किडनी रिजेक्शन रिस्क की विशेषता

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अंग प्रत्यारोपण के संदर्भ में प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का अध्ययन इस बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है कि अनुकूली प्रतिरक्षा कैसे योगदान दे सकती है और भ्रष्टाचार अस्वीकृति को नियंत्रित कर सकती है। यहां हम पहले और बाद में व्यक्तियों के परिधीय रक्त प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की विशेषता बताते हैंगुर्दाएक अनुदैर्ध्य नैदानिक ​​अध्ययन में बी सेल रिसेप्टर अनुक्रमण का उपयोग कर प्रत्यारोपण। जो लोग प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकृति विकसित करते हैं, उनके पास प्रत्यारोपण से पहले एक अधिक विविध प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची होती है, जो पोस्ट-प्रत्यारोपण अस्वीकृति जोखिम के लिए एक पूर्वाग्रह का सुझाव देती है। इसके अतिरिक्त, 2 वर्षों के अनुवर्ती कार्रवाई के बाद, अस्वीकृति विकसित करने वाले रोगियों में विस्तारित क्लोन का एक विशिष्ट सेट प्रदर्शित होता है जो अस्वीकृति के बाद भी बना रहता है। हालांकि परिधीय बी सेल विविधता में समग्र कमी आई है, संभवतः इस कोहोर्ट में सामान्य इम्यूनोसप्रेशन जोखिम में वृद्धि के कारण, सभी अस्वीकार करने वाले रोगियों में विशिष्ट आईजीएचवी जीन उपयोग का पता लगाने का समर्थन करता है कि इम्यूनोजेनिक एंटीजन का एक आम पूल पोस्ट-प्रत्यारोपण अस्वीकृति को चला सकता है। हमारे निष्कर्षों में गुर्दा प्रत्यारोपण अस्वीकृति की भविष्यवाणी और नैदानिक ​​​​प्रबंधन के लिए नैदानिक ​​​​प्रभाव हो सकते हैं।

गुर्दाप्रत्यारोपण अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी (ईएसआरडी) और पुरानी का पसंदीदा उपचार हैगुर्दाबीमारी। भले ही दाता/प्राप्तकर्ता मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (HLA) l के लिए हिस्टोकम्पैटिबिलिटी परीक्षण के आधार पर प्रौद्योगिकियों और ऊतक मिलान में महत्वपूर्ण सुधार हुए हैं, फिर भी भ्रष्टाचार के परिणाम की भविष्यवाणी करना अभी भी एक अनसुलझी समस्या है। अन्य नाबालिग, गैर-एचएलए लोकी23 में मापा गया ऊतक बेमेल भी तीव्र और पुरानी अस्वीकृति के साथ एलोइम्यून चोट को चला सकता है, जिसके परिणामस्वरूप खराब दीर्घकालिक भ्रष्टाचार परिणाम होते हैं। इसके अलावा, लगभग 50 प्रतिशतगुर्दाएलोग्राफ़्ट, बिना किसी बड़े एचएलए बेमेल के, प्रत्यारोपण के 10 वर्षों के भीतर अभी भी खो गए हैं²। हमने पहले अनुमान लगाया है कि गैर-एचएलए लोकी, प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता हैगुर्दाdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 विभिन्न एंटीबॉडी0, जो उन्हें विदेशी प्रतिजनों की एक विशाल सरणी को पहचानने में सक्षम बनाता है। मानव बीसीआर या आईजी में दो समान भारी श्रृंखलाएं (आई) होती हैं जो पांच आइसोटाइप द्वारा गठित होती हैं: आईजीएम, आईजीडी, आईजीए, आईजीई, और आईजीजी, और दो हल्की श्रृंखलाएं। अक्षुण्ण एंटीबॉडी में एक चर और एक स्थिर डोमेन होता है। प्रतिजन बंधन चर डोमेन में होता है, जो चर (वी), विविधता (डी) के एक सेट के पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न होता है, और बी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची बनाने वाले (जे) जीन खंडों में शामिल होता है, और इसकी विविधता मुख्य रूप से केंद्रित होती है पूरक निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3)। आत्मीयता परिपक्वता की प्रक्रिया के दौरान, परिवर्तनशील क्षेत्र में दैहिक अतिपरिवर्तन (SHM) होता है। एक शक्तिशाली अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बी-सेल क्लोन के विस्तार पर निर्भर है और एक प्रक्रिया जिसे आत्मीयता परिपक्वता कहा जाता है, जिसके दौरान आईजी जीन पुनर्व्यवस्था में दैहिक उत्परिवर्तन पेश किए जाते हैं और किसी दिए गए एंटीजन के लिए उच्च आत्मीयता वाले बी कोशिकाओं का चयन किया जाता है।

अंग प्रत्यारोपण में प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि अस्वीकृति प्रक्रिया को क्या ट्रिगर और बनाए रखता है और यह अंततः भ्रष्टाचार की विफलता की दिशा में कैसे तेजी ला सकता है। अगली पीढ़ी की अनुक्रमण और मजबूत कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण की प्रगति के साथ, हम वीडीजे क्षेत्र का विस्तार से अध्ययन कर सकते हैं, 12। तिथि करने के लिए, टी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची विश्लेषणगुर्दाप्रत्यारोपण बहुत सीमित संख्या में रोगियों में किया गया हैl3-15, और भले ही BCRSeq को अन्य बीमारियों और मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर लागू किया गया हो, जैसे कि मल्टीपल sdlerosis6, इन्फ्लूएंजा वैक्सीनl7या इम्युनोडेफिशिएंसी विकार8, प्रत्यारोपण में अध्ययन की कमी है। अस्वीकृति। में एकगुर्दाप्रत्यारोपण, BCRSeq केवल सहिष्णुता के संदर्भ में किया गया है, HLA को संवेदनशील बनाया गया हैगुर्दाडिसेन्सिटाइजेशन थेरेपी के दौर से गुजर रहे ट्रांसप्लांट उम्मीदवार, और बी-सेल घुसपैठ रक्त और ग्राफ्ट 2 एल में क्लोनल विस्तार की तुलना करते हैं। प्रत्यारोपण में BCRSeq पर एक और आवेदन पहले 12 हृदय प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के एक छोटे समूह में प्रकाशित किया गया था।

देर से प्रत्यारोपण अस्वीकृति और पुरानी एलोग्राफ़्ट विफलता में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विनोदी हाथ के महत्व को स्वीकार करते हुए, हम एक संभावित, अनुदैर्ध्य अध्ययन में BCRSeq का उपयोग करके परिधीय रक्त प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची की विशेषता रखते हैं। हम पाते हैं कि प्रत्यारोपण से पहले प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की विविधता उन व्यक्तियों में अधिक है जो अस्वीकार करते हैंगुर्दाअनुवर्ती 24 महीनों के साथ कुछ क्लोनों और IGHVजीनों के विस्तार को भी दिखा रहा है। ये परिणाम engraftment से पहले अस्वीकृति जोखिम की भविष्यवाणी करने में मदद कर सकते हैं और अस्वीकृति ड्राइविंग विशेष एंटीजन का पता लगाने में नैदानिक ​​​​प्रभाव हो सकते हैं।

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परिणाम

विषयों का अध्ययन करें। हमने 27 अद्वितीय रोगियों से 83 परिधीय रक्त के नमूनों में BCRSeq का प्रदर्शन किया और चित्र 1 में दिखाए गए विश्लेषणात्मक पाइपलाइन को निष्पादित किया। नेत्रहीन केंद्रीय विकृति विज्ञान द्वारा परिभाषित तीन नैदानिक ​​​​फेनोटाइप समूह, बैनफ मानदंड द्वारा बनाए गए सीरियल एलोग्राफ़्ट बायोप्सी के पढ़ते हैं और इस अध्ययन में क्रॉनिक एलोग्राफ़्ट डैमेज इंडेक्स (सीएडीआई) स्कोर पर विचार किया गया था: गैर-प्रगतिकर्ता (एनपी; एन =10) तीव्र अस्वीकृति के बिना कम गैर-वृद्धिशील CADI स्कोर था, बिना अस्वीकृति वाले प्रगतिकर्ता (PNR; n =10) ​​के पास अस्वीकृति के बिना 2 वर्षों में वृद्धिशील CADI स्कोर था, और अस्वीकृति के साथ प्रगतिकर्ता (PR; n =7) था। अस्वीकृति एपिसोड के साथ 2 वर्षों में वृद्धिशील उच्च सीएडीआई स्कोर। जनसांख्यिकी, के कारणगुर्दाविफलता, और इम्युनोसुप्रेशन उपयोग तालिका 1 में प्रदान किया गया है। इन रोगियों की कुछ विशेषताओं को उजागर करना महत्वपूर्ण है। माता-पिता का अध्ययन है कि इन रोगियों से नामांकित किया गया था, बायोप्सी-पुष्टि तीव्र अस्वीकृति (औसत {मिनट, अधिकतम} =12 {6,24} महीने अस्वीकृति समय) की कुल कम दर (17 प्रतिशत) थी। ये सभी मरीज़ अस्वीकृति के लिए कम प्रतिरक्षाविज्ञानी जोखिम में थे (पीक पैनल प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी संवेदीकरण स्थिति<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

बी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची अनुक्रमण। BCRSeq 27 . से 81 नमूनों पर रक्त के थक्कों से निकाले गए जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) नमूनों पर किया गया थागुर्दाप्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं को तीन-समय बिंदुओं पर (0, 6,24 महीने)। सीक्वेंसिंग ने गुणवत्ता नियंत्रण के बाद कुल 327,703 रीड्स (मतलब 4045/नमूना) प्राप्त किए (विधि अनुभाग देखें)। परिणामों के सत्यापन और प्रत्येक आइसोटाइप के आगे के मूल्यांकन के लिए, हमने अतिरिक्त रूप से मिलान किए गए PBMC से RNA निकाला, जो 55 नमूनों के लिए उपलब्ध थे, रक्त के थक्के के रूप में एक ही समय में एकत्र किए गए, और 1,773,330 रीडिंग प्राप्त करने के लिए अधिक गहराई पर पूरक डीएनए (cDNA) अनुक्रमण किया। आईजीडी के लिए (मतलब 31,667/नमूना), 1,708,227 आईजीएम के लिए पढ़ता है (मतलब 30,504/नमूना), आईजीए के लिए 973,444 पढ़ता है (मतलब 17,383/नमूना), 139,7345 आईजीजी के लिए पढ़ता है (मतलब 24,953/नमूना), और 29,{{27 }} IgE (मतलब 5178/नमूना) (सप्लीमेंट्री अंजीर 1) के लिए पढ़ता है। प्रत्येक आइसोटाइप के लिए पुस्तकालयों को अलग से प्रवर्धित किया गया और फिर अनुक्रमण के लिए जमा किया गया; इसलिए, तुलनात्मक क्रॉस आइसोटाइप विश्लेषण संभव नहीं है।

जैसा कि चित्र 1बी में दिखाया गया है, हमने एक क्लोन को कोशिकाओं के एक समूह के रूप में परिभाषित किया है जो एक सामान्य पूर्वज अणु से निकला है जिसमें समान IGHV और IGHJ खंड, समान CDR3 लंबाई, और CDR3s के बीच 90 प्रतिशत न्यूक्लियोटाइड पहचान है जैसा कि पहले अनुकूली B के अध्ययन में परिभाषित किया गया था। -सेल प्रतिक्रियाएं'8. यह परिभाषा एलोइम्यूनिटी के संदर्भ में विविधता, साझा या सामान्य शंकु, और क्लोनल विस्तार का अध्ययन करने की अनुमति देती हैगुर्दाप्रत्यारोपण। प्रत्येक समय बिंदु पर प्रति व्यक्ति अद्वितीय शंकुओं की संख्या को पूरक सामग्री (पूरक चित्र 1) में बारप्लॉट के रूप में दिखाया गया है। डेटा विश्लेषण की कठोरता के लिए, हमने नमूनों में छूट दी है<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">गुर्दाप्रत्यारोपण, एपस्टीन बर्र के प्रसार द्वारा विशेषता

अंजीर। 1 समग्र अध्ययन पाइपलाइन। एंटीबॉडी संरचना का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची में उत्पादित विविधता के लिए जिम्मेदार वीडीजे पुनर्संयोजन की प्रक्रिया। बी बी-सेल क्लोन को एक सामान्य पूर्वज से कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है और अध्ययन की विश्लेषणात्मक पाइपलाइन: बी-सेल जीडीएनए और सीडीएनए के लिए अनुक्रमण, क्लोनों की संख्या (समृद्धि) और प्रत्येक क्लोन (शैनन एन्ट्रॉपी), नेटवर्क विश्लेषण, और क्लोनल और आईजीएचवीजीन विश्लेषण की आवृत्ति पर विचार करते हुए विविधता विश्लेषण

वायरस (ईबीवी) संक्रमित बी कोशिकाएं। हमने इस रोगी में 6 समय में क्लोनों की बढ़ी हुई संख्या देखी, पहले कम क्लोनल विविधता के साथगुर्दाप्रत्यारोपण और गुर्दा प्रत्यारोपण के 24 महीने बाद। चूंकि पुस्तकालयों को एक अपरिवर्तनीय मात्रा में टेम्पलेट से प्रवर्धित किया गया था, रक्त में बी कोशिकाओं के एक उच्च अंश के परिणामस्वरूप अनुक्रमित उत्पादों में बड़ी संख्या में क्लोनोटाइप का प्रतिनिधित्व हो सकता है। इस रोगी में विशिष्ट और अनूठी रोग प्रक्रिया के कारण, इस नमूने को भविष्य के विश्लेषण से बाहर रखा गया था।

प्री-ट्रांसप्लांट बी-सेल विविधता अस्वीकृति से जुड़ी है। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 1c, हमने बी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की विविधता की जांच प्रजातियों की समृद्धि (अद्वितीय क्लोनों की संख्या) और शैनन एन्ट्रापी (विधियों से समीकरण (1)) को समय बिंदुओं पर और एक रैखिक प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करके नैदानिक ​​​​परिणामों पर विचार करते हुए की। एक आश्रित चर के रूप में क्लोन या एन्ट्रापी और एक स्वतंत्र कारक चर के रूप में नैदानिक ​​​​परिणाम या SHM। प्रदर्शनों की सूची पहलेगुर्दापीआर में प्रत्यारोपण एनपी (समृद्धि: पी-वैल्यू=0.005, एन्ट्रॉपी: पी-वैल्यू=0.01) की तुलना में काफी अधिक विविध था, उसी प्रवृत्ति के साथ 6 महीने बाद भी जारी रहा।गुर्दाप्रत्यारोपण (समृद्धि: पी-वैल्यू=0। 0 2, एन्ट्रापी: पी-वैल्यू=0.02), और 2 साल के पोस्ट-ट्रांसप्लांट (छवि 2 ए) में कोई अलग समूह अंतर नहीं है। और अनुपूरक चित्र 2)। सीडीएनए अनुक्रमण डेटा पोस्ट-ट्रांसप्लांट ने प्रत्यारोपण के बाद 6 महीने में अधिक से अधिक प्रदर्शनों की विविधता में एक ही प्रवृत्ति दिखाई, मुख्य रूप से आईजीडी आइसोटाइप्स (समृद्धि: पी-वैल्यू=0.02, एन्ट्रॉपी: पी-वैल्यू=0 के लिए। 03) (चित्र। 2 बी और अनुपूरक चित्र। 2)। विभिन्न जनसांख्यिकीय और नैदानिक ​​चर, जैसे प्राप्तकर्ता आयु, लिंग, जाति, दाता स्रोत, इम्यूनोसप्रेशन का प्रकार, एचएलए बेमेल, और गुर्दे की विफलता के कारण से डेटा पर कोई भ्रमित प्रभाव नहीं था। चूंकि 1-वर्ष-पुराने (डेटा में न्यूनतम आयु) और 19-वर्ष (डेटा में अधिकतम आयु) की बी-सेल प्रतिक्रिया बहुत भिन्न हो सकती है, हमने एक संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया विश्लेषण इन दो रोगियों को छोड़कर और परिणाम महत्वपूर्ण बने रहे (एनपी बनाम पीआर समय 0: समृद्धि: पी-वैल्यू=0.01, एन्ट्रॉपी: पी-वैल्यू=0.03)। प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की विविधता के एक अन्य उपाय में, हमने एसएचएम का मूल्यांकन किया, जिसे प्रत्येक वी जीन खंड में उत्परिवर्तन की आवृत्ति के रूप में परिभाषित किया गया, और प्रत्यारोपण से पहले पीआर के लिए एसएचएम की अधिक संख्या के लिए एक प्रवृत्ति और आईजीडी आइसोटाइप में उच्च एसएचएम के लिए एक प्रवृत्ति पाई गई। पीआर में 6 महीने के बाद प्रत्यारोपण (पी-वैल्यू=0.06)।

नैदानिक ​​​​परिणामों द्वारा बी-सेल विविधता समय के साथ बदलती है। यह पता लगाने के लिए कि क्या नैदानिक ​​​​परिणामों द्वारा प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की विविधता समय के साथ बदलती है, हमने नैदानिक ​​​​परिणाम और समय के बीच बातचीत पर विचार करते हुए रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडल का उपयोग करके अनुदैर्ध्य डेटा का मॉडल तैयार किया। हमने पाया कि एनपी और पीआर ने एनपी में विविधता में वृद्धि और पीआर में विविधता में कमी दिखाते हुए ट्रांसप्लांट के बाद समय के साथ अलग-अलग व्यवहार किया, जबकि पीएनआर के लिए विविधता समय के साथ अपरिवर्तित रही। यह जीडीएनए (समृद्धि: पी-वैल्यू=0.007, एन्ट्रॉपी: पी-वैल्यू=0.001, अंजीर। 3 ए) और सीडीएनए के लिए सभी आइसोटाइप के लिए देखा गया था, जिसमें एन्ट्रापी में सबसे महत्वपूर्ण अंतर है। IgM और IgD आइसोटाइप्स के लिए (IgA: P-value=0.07, IgD: P-value=0.02, IgG: P-value=0.05, IgM: P-value=0.04, चित्र 3बी)। संबंधित P -values ​​​​के साथ समृद्धि के लिए भूखंड अनुपूरक चित्र में दिखाए गए हैं। 3. जैसा कि भूखंडों में देखा गया है, एक व्यक्ति के पास 32 महीने के समय में एक अतिरिक्त नमूना होता है, जो परिणामों को तिरछा कर सकता है, इस प्रकार इस नमूने को छोड़कर एक संवेदनशीलता विश्लेषण किया गया था। आईजीजी और आईजीएम आइसोटाइप्स को छोड़कर समान परिणामों का विश्लेषण और अवलोकन करना, जहां संकेत खो गया है (जीडीएनए-एन्ट्रॉपी: पी-वैल्यू=0.004। सीडीएनए-एन्ट्रॉपी: आईजीए: पी-वैल्यू=0.1 , आईजीडी: पी-वैल्यू=0.05, आईजीजी: पी-वैल्यू=0.08, आईजीएम: पी-वैल्यू=0.1)।

जैविक और तकनीकी नमूने से विविधता के उपाय प्रभावित हो सकते हैं। एक नमूने की विविधता एक प्रदर्शनों की सूची में समग्र विविधता से स्पष्ट रूप से भिन्न हो सकती है क्योंकि केवल अरबों कोशिकाओं के एक अंश का प्रतिनिधित्व किया जाता है, जिसे गायब प्रजातियों की समस्या के रूप में जाना जाता है। तकनीकी नमूनाकरण मौजूद हो सकता है क्योंकि प्रत्येक नमूना अनुक्रमण गहराई और कुछ हद तक प्रयोगात्मक त्रुटियों में भिन्न हो सकता है। लुप्त प्रजातियों की समस्या से निपटने के लिए, हमने रिकॉन (अवलोकित संख्याओं से अनुमानित क्लोनों का पुनर्निर्माण) टूल का उपयोग किया, जो समग्र क्लोन आकार वितरण का अनुमान लगाता है। रिकॉन विविधता उपायों के एक सेट के सटीक और मजबूत अनुमानों को आउटपुट करता है, जिसमें समृद्धि और एन्ट्रॉपी शामिल हैं, जिससे व्यक्तियों के बीच विविधता की मजबूत तुलना होती है। अनुक्रमण की गहराई और कुछ हद तक प्रायोगिक त्रुटियों से निपटने के लिए, हमने एक डाउनसैंपलिंग रणनीति का प्रदर्शन किया; प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के विश्लेषण में एक बहुत अच्छी तरह से इस्तेमाल की जाने वाली रणनीति 11,17,30। रिकॉन विश्लेषण (सप्लीमेंट्री अंजीर। एस 4: ए-ई) में, जीडीएनए डेटा के लिए समृद्धि और विविधता दोनों को दोहराया गया था। सीडीएनए डेटा में, टाइम 6 आईजीडी आइसोटाइप प्रवृत्ति को दर्शाता है, लेकिन महत्व तक नहीं पहुंचा, हालांकि आईजीए, आईजीडी, और आईजीजी आइसोटाइप के अनुदैर्ध्य परिणामों को दोहराया गया था। डाउनसैंपलिंग विश्लेषण (सप्लीमेंट्री अंजीर। S4: F-J) में, सब कुछ दोहराया जाता है लेकिन जीडीएनए डेटा के लिए समय 0 है। यह उस प्रतिबंध का परिणाम हो सकता है जो डाउनसैंपलिंग

अंजीर। 2 वायलिन प्लॉट तीन नैदानिक ​​​​परिणामों में क्लोन (समृद्धि) की संख्या दिखाते हैं। कई बार जीडीएनए नमूनों से कई क्लोन 0, 6, और 24। b सीडीएनए नमूनों से आईजीडी आइसोटाइप के लिए समय 6 पर क्लोनों की संख्या। P-मान एक रेखीय प्रतिगमन मॉडल के समायोजन से प्राप्त किए जाते हैं, जो एक आश्रित चर के रूप में क्लोनों की संख्या और एक स्वतंत्र कारक चर (n=27 नमूने) के रूप में नैदानिक ​​​​परिणाम पर विचार करते हैं। वायलिन प्लॉट प्रत्येक मान पर डेटा की संभाव्यता घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। डॉट मार्कर इंटरक्वेर्टाइल रेंज के साथ माध्यिका मान का प्रतिनिधित्व करता है। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है

अंजीर। 3 अनुदैर्ध्य डेटा प्रत्येक नैदानिक ​​​​परिणाम के लिए tted लाइन के साथ प्लॉट किया गया। शैनन एन्ट्रापी द्वारा मापी गई विविधता जीडीएनए में तीन नैदानिक ​​परिणामों (एनपी, पीएनआर, पीआर) द्वारा समय बिंदुओं पर प्रदर्शित होती है। b शैनन एन्ट्रापी द्वारा मापी गई विविधता को सीडीएनए में आइसोटाइप्स द्वारा तीन नैदानिक ​​​​परिणामों (एनपी, पीएनआर, पीआर) द्वारा समय बिंदुओं पर दर्शाया गया है। P-मान एक रेखीय मिश्रित प्रभाव मॉडल (n=27 नमूने) को समायोजित करते हुए समय × नैदानिक ​​​​परिणाम द्वारा परिभाषित अंतःक्रियात्मक शब्द के अनुरूप हैं। प्रत्येक बिंदु समय के साथ प्रति नमूना एन्ट्रापी का प्रतिनिधित्व करता है, इसकी tted रेखा और condence अंतराल के साथ। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है

रणनीतियाँ निहित हैं, विशेष रूप से जीडीएनए डेटा पर जहां अनुक्रमों की संख्या सीडीएनए डेटा की तुलना में बहुत कम है। जीडीएनए में, हमने विश्लेषण को कम से कम 1 0 00 क्लोन वाले व्यक्तियों तक सीमित कर दिया ताकि पर्याप्त अनुक्रमों को संरक्षित किया जा सके। सीडीएनए में 62,173 क्लोनों की तुलना में कम से कम 1062 क्लोनों के लिए डाउन-सैंपलिंग किया गया था। इस सीमा के बावजूद, हमने समय 0 के लिए प्रवृत्ति का अवलोकन किया, जीडीएनए में अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए महत्व का संरक्षण किया, और सीडीएनए में सभी संघों को दोहराया। दोनों विश्लेषणों (पुनर्निर्माण और डाउनसैंपलिंग) में, हमने पहले रिपोर्ट किए गए परिणामों की वैधता दिखाते हुए, यहां कुछ सीमाओं पर प्रकाश डालने के बावजूद, परिणामों को दोहराया।

बी-सेल नेटवर्क क्लोनल विस्तार में अंतर दिखाते हैं। बी-सेल प्रदर्शनों की सूची को स्वाभाविक रूप से अनुक्रम विविधता आधार पर एक नेटवर्क के रूप में दर्शाया जा सकता है। हमारे डेटा में, हमने प्रत्येक नमूने के लिए एक दृश्य नेटवर्क विकसित किया है (चित्र 4 और अनुपूरक अंजीर। 5-7) जहां प्रत्येक शीर्ष एक अद्वितीय बीसीआर का प्रतिनिधित्व करता है, और उनके न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के आधार पर समान बीसीआर की संख्या शीर्ष आकार को परिभाषित करती है। जब वे एक ही क्लोन से संबंधित होते हैं तो कोने के बीच एक किनारा मौजूद होता है, इसलिए बी कोशिकाओं के समूहों को क्लोन बनाने वाले अंतःस्थापित शिखरों के समूह के रूप में दिखाया जा सकता है। नेटवर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने गिनी इंडेक्स का उपयोग किया, जो एक असमानता माप है जिसे शीर्ष और क्लस्टर वितरण पर लागू किया गया था। जब शीर्ष आकार, गिनी (वी) पर लागू किया जाता है, तो समग्र क्लोनल प्रकृति का प्रतिनिधित्व किया जाता है। यदि गिनी (वी) 1 के करीब है, तो उनमें से कुछ का विस्तार असमान है, और 0 के करीब है। जब क्लस्टर आकार पर लागू किया जाता है, तो गिनी (सी), क्लोनल प्रभुत्व का प्रतिनिधित्व किया जाता है। यदि 1 के करीब, क्लस्टर असमान हैं और इसलिए प्रमुख क्लोन का प्रतिनिधित्व करते हैं, यदि 0 के करीब हैं, तो सभी क्लस्टर समान आकार के होते हैं।

अंजीर। 4 में हम तीन अलग-अलग समय बिंदुओं (प्री-ट्रांसप्लांट, और पोस्ट-ट्रांसप्लांट 6 और 24 महीने) में तीन नैदानिक ​​​​परिणाम समूहों में से प्रत्येक के प्रतिनिधि बी-सेल प्रदर्शनों के बीच चिह्नित दृश्य और मात्रात्मक अंतर का एक उदाहरण दिखाते हैं। . पीआर प्रदर्शनों की सूची में, एनपी की तुलना में क्लोन के अधिक और बड़े समूहों को बनाने के बी-सेल अनुक्रमों की बहुतायत है, जबकि पीएनआर बीच में स्थित है। समय के साथ, पीआर समूह एनपी की तुलना में बीसीआर और अद्वितीय क्लोनों की संख्या में कमी दिखाता है। अध्ययन में प्रत्येक व्यक्ति के विस्तृत बी-सेल नेटवर्क को सप्लीमेंट्री अंजीर में प्रदान किया गया है। 5-7. उस व्यक्ति में बी-सेल नेटवर्क के बहुत विविध पैटर्न का निरीक्षण करना दिलचस्प है, जिसने एनपी समूह में पीटीएलडी विकसित किया (सप्लीमेंट्री अंजीर। 5), प्रत्यारोपण से पहले कोई बी-सेल विस्तार नहीं हुआ, इसके बाद बी कोशिकाओं की वृद्धि हुई। 6 24 महीनों के बाद प्रत्यारोपण में विविधता में कमी के साथ महीनों और एक स्पष्ट क्लोनल विस्तार।

गिनी इंडेक्स माप (चित्र 5) के आगे के मूल्यांकन पर, पीआर समूह ने एनपी समूह पर शीर्ष और क्लस्टर दोनों के लिए लगातार उच्च उपाय दिखाए, यह सुझाव देते हुए कि पीआर समूह के रोगियों में बेसलाइन पर उच्च क्लोनल विस्तार था,

अंजीर। समय बिंदुओं पर तीन नैदानिक ​​​​परिणामों का प्रतिनिधित्व करने वाले तीन व्यक्तियों से बी-सेल प्रदर्शनों की सूची नेटवर्क। प्रत्येक शीर्ष एक अद्वितीय बीसीआर का प्रतिनिधित्व करता है जो न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों पर विचार करते हुए समान बीसीआर की संख्या से परिभाषित शीर्ष आकार होता है। शीर्षों के बीच एक किनारा मौजूद होता है जब वे उसी क्लोन से संबंधित होते हैं जैसा कि पहले परिभाषित किया गया था, इसलिए क्लस्टर एक क्लोन बनाने वाले परस्पर जुड़े शीर्षों के समूह हैं। प्रत्येक नमूना शीर्ष आकार (गिनी (वी)) और क्लस्टर आकार (गिनी (सी)) के लिए प्राप्त गिनी सूचकांक दिखाता है। बीसीआर उस विशिष्ट नमूने के लिए कुल बी-सेल रिसेप्टर्स को दर्शाता है और क्लोन अद्वितीय क्लोन की कुल संख्या को दर्शाता है। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है

और प्रमुख क्लोन (पी-वैल्यू [रैखिक प्रतिगमन] <0.05, अंजीर।="" 5)="" के="" एक="" सबसेट="" के="" आगे="" प्रत्यारोपण="" के="" बाद="" का="" विस्तार।="" पीएनआर="" समूह="" एनपी="" और="" पीआर="" के="" बीच="" आता="" है="" जैसा="" कि="" पहले="" दिखाया="" गया="" था,="" हालांकि="" यह="" समय="" 24="" (पी-वैल्यू="" [रैखिक="" प्रतिगमन]=""><0.05) पर="" एनपी="" समूह="" से="" काफी="" अलग="" है।="" हालाँकि="" चित्र="" 5="" के="" लिए="" डेटा="" जीडीएनए="" डेटा="" से="" उत्पन्न="" किया="" गया="" था,="" सीडीएनए="" के="" लिए="" आईजीएम="" आइसोटाइप="" ने="" समान="" अंतर="" (पी-वैल्यू="" [रैखिक="" प्रतिगमन]="0.05)" (सप्लीमेंट्री="" अंजीर।="" 8)="">

कुछ क्लोन और IGHV जीन को अस्वीकृति में फंसाया जाता है।

यद्यपि हमारा प्राथमिक ध्यान नैदानिक ​​​​परिणाम समूहों द्वारा बी-सेल प्रदर्शनों की सूची को चिह्नित करना था, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पूर्व और बाद के प्रत्यारोपण की एक वैश्विक तस्वीर प्रदान करना, हमारे डेटा ने हमें क्लोन और आईजीएचवी पर आईजी अनुक्रम-विशिष्ट विश्लेषण करने में सक्षम बनाया। जीन स्तर।

क्लोनल विश्लेषण के लिए, हमने प्रत्येक समय बिंदु पर नैदानिक ​​​​परिणाम (पीआर, पीएनआर, एनआर) के साथ प्रत्येक विशेष क्लोन (118,223 कुल क्लोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति के संबंध का आकलन किया। फिशर के सटीक परीक्षण को लागू करते हुए, हमने क्रमशः 0, 6, और 24 महीनों में से प्रत्येक में नैदानिक ​​​​परिणामों से जुड़े 8, 4, और 21 क्लोन पाए, (पूरक तालिका 1)। जबकि किसी ने भी कई परीक्षण सुधारों को पारित नहीं किया, मुख्य रूप से शक्ति की कमी के कारण, क्योंकि हमारे पास हजारों मापदंडों (क्लोन) के विश्लेषण में एक सीमित नमूना आकार है, हम देख सकते हैं कि कुछ क्लोन जो महत्वपूर्ण (पी-वैल्यू <{{ 11}}.05)="" को="" केवल="" पीआर="" समूह="" के="" रोगियों="" में="" साझा="" किया="" गया="" और="" 24="" महीने="" के="" बाद="" प्रत्यारोपण="" में="" समृद्ध="" किया="">

हमने यह भी विचार किया कि क्या प्रत्येक नैदानिक ​​​​परिणाम (सप्लीमेंट्री अंजीर। 9) के भीतर कुछ क्लोन नमूने के समय, दूसरों की तुलना में अधिक बने रहे। हम दो अलग-अलग उपायों के लिए जिम्मेदार हैं: (1) स्थायी क्लोनों की संख्या और (2) क्लोनल विस्तार। हमने देखा कि पीआर में जो क्लोन बने हुए थे, वे काफी अधिक विस्तारित थे (पी-वैल्यू [रैखिक प्रतिगमन]=0.01, पीआर बनाम एनपी) और अधिक संख्या में लगातार क्लोन (पी- मान [रैखिक प्रतिगमन]=0.09)। हमने आगे जांच की कि क्या ये लगातार क्लोन प्रत्येक नैदानिक ​​​​परिणाम के भीतर अलग-अलग व्यक्तियों में साझा किए गए थे। खोजे गए 263 लगातार क्लोनों में से 23 व्यक्तियों के बीच साझा किए गए थे। पांच एक ही पीएनआर के भीतर और छह पीआर समूह के भीतर साझा किए गए थे और एनपी समूह के बीच कोई क्लोन साझा नहीं किया गया था। कुल मिलाकर, 12 साझा क्लोन प्रगतिशील क्रोनिक ट्रांसप्लांट की चोट और समय के साथ ब्रोसिस (पीआर और पीएनआर) वाले रोगियों के दोनों समूहों में आम थे। व्यक्तियों में साझा किए गए क्लोनों की सूची पूरक सामग्री (पूरक तालिका 2) में प्रदान की गई है।

हमने अगली बार आईजीएचवी जीन विश्लेषण किया, प्रति नमूना आईजीएचवी जीन उपयोग को देखते हुए, प्रत्येक आईजीएचवी जीन का उपयोग किए जाने की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया, क्लोनों की संख्या (कुछ आईजीएचवी जीनों के नमूने पूर्वाग्रह से बचने के लिए) द्वारा सामान्यीकृत, कम-व्यक्त को बदलना

अंजीर। 5 वर्टेक्स गिनी इंडेक्स को क्लस्टर गिनी इंडेक्स के खिलाफ प्लॉट किया गया। स्कैटर प्लॉट समय पर प्रत्येक नमूने का प्रतिनिधित्व करता है 0, 6, और 24। बॉक्सप्लॉट 24 समय पर गिनी (वी) और गिनी (सी) अंतर दिखाते हैं। पी-मान एक रैखिक प्रतिगमन मॉडल के समायोजन से प्राप्त होते हैं गिनी (वी) और गिनी (सी) को एक आश्रित चर के रूप में और नैदानिक ​​​​परिणाम को प्रत्येक समय बिंदु (एन=27 नमूने) के लिए एक स्वतंत्र कारक चर के रूप में मानते हुए। बॉक्सप्लॉट में केवल समय 24 दिखाया गया है लेकिन समय 0 और 6 जहां एनपी बनाम पीआर के लिए भी महत्वपूर्ण है: समय 0: पी (गिनी (वी))=0.1, पी ( गिनी (सी))=0.05; समय 6 पी (गिनी (वी))=0.02, पी (गिनी (सी))=0.01; समय 24: पी (गिनी (वी))=0.003, पी (गिनी (सी))=0.01। बॉक्स के अंदर का बैंड माध्यिका मान का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स इंटरक्वार्टाइल रेंज (IQR) को परिभाषित करता है, और मूंछें पहले और तीसरे चतुर्थक ± 1.5 × IQR को दर्शाती हैं। स्रोत डेटा स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है

जीन (IGHV जीन उपयोग> {{0}}।05 कम से कम 10 नमूनों में से), और उन जीनों को खोजने के लिए एक रेखीय प्रतिगमन मॉडल लागू करना जो जुड़े हुए थे प्रत्येक नैदानिक ​​​​परिणाम के साथ, प्रत्येक समय बिंदु पर। 27 आईजीएचवी जीनों में से, जिन्होंने निम्न-अभिव्यक्ति फिल्टर को पारित किया, हमने पीआर और एनपी समूह (पी-वैल्यू <{43}}.05) के="" बीच="" महत्वपूर्ण="" जीन="" पाया,="" जिसमें="" तीन="" जीन="" 0,="" 7="" समय="" 6="" और="" 16="" समय="" पर="" थे।="" समय="" 24="" (चित्र="" 6a-c)।="" इन="" जीनों="" में="" से,="" 1="" (ighv3-11)="" समय="" पर,="" 5="" जीन="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" समय="" 6="" और="" 16="" जीन="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" समय="" पर="" 24="" ने="" फाल्स="" डिस्कवरी="" रेट="" (fdr)="" मल्टीपल="" टेस्टिंग="" करेक्शन="" पास="" किया।="" दिलचस्प="" बात="" यह="" है="" कि="" हमने="" पाया="" कि="" एनपी="" बनाम="" पीआर="" तुलना="" (समय="" 0:="" पी-वैल्यू="0.04," समय="" 6:="" पी-="" में="" सभी="" तीन="" समय="" बिंदुओं="" में="" आईजीएचवी="" 3-23="" सबसे="" महत्वपूर्ण="" और="" प्रचुर="" मात्रा="" में="" जीन="" था।="" मान="0.003," समय="" 24:="" p-मान="0.02)" (चित्र="" 6d)।="" इसके="" अलावा,="" हमने="" मूल्यांकन="" किया="" कि="" क्या="" ighv="" 3-23="" अनुक्रमों="" को="" पिछले="" क्लोनल="" विश्लेषण="" से="" साझा="" किए="" गए="" अनुक्रमों="" में="" से="" अधिक="" प्रस्तुत="" किया="" गया="" था।="" हमने="" फिशर="" के="" सटीक="" परीक्षण="" के="" साथ="" एक="" संवर्धन="" विश्लेषण="" का="" उपयोग="" करते="" हुए="" पाया="" कि="" ighv="" 3-23="" अनुक्रम="" दोनों="" में="" महत्वपूर्ण="" रूप="" से="" अधिक="" प्रतिनिधित्व="" करते="" थे,="" व्यक्तियों="" के="" बीच="" साझा="" किए="" गए="" लगातार="" क्लोन="" (पूरक="" तालिका="" 2)="" (पी-मूल्य=""><2.2 ×="" 10="" -="" 16)="" ),="" और="" समय="" पर="" नैदानिक="" ​​​​परिणाम="" से="" जुड़े="" क्लोन="" 24="" (पूरक="" तालिका="" 1)="" (पी-मूल्य=""><2.2 ×="" 10−16)।="" हमने="" देखा="" कि="" एनआर="" समूह="" में="" व्यक्तिगत="" 9,="" जो="" पिछले="" विश्लेषणों="" में="" प्रगतिकर्ताओं="" के="" साथ="" कुछ="" लगातार="" क्लोन="" साझा="" करने="" के="" लिए="" पाए="" गए="" थे,="" को="" सभी="" समय="" बिंदुओं="" पर="" पीआर="" समूह="" के="" साथ="" वर्गीकृत="" किया="" गया="" था।="" विभिन्न="" जनसांख्यिकीय="" और="" नैदानिक="" ​​चर,="" जैसे="" प्राप्तकर्ता="" आयु,="" लिंग,="" जाति,="" दाता="" स्रोत,="" इम्यूनोसप्रेशन="" का="" प्रकार,="" एचएलए="" बेमेल,="" और="" गुर्दे="" की="" विफलता="" के="" कारण="" से="" डेटा="" पर="" कोई="" भ्रमित="" प्रभाव="" नहीं="" था।="" इसके="" अलावा,="" यह="" जीन="" आईजीएम="" (पी-वैल्यू="" [लीनियर="" रिग्रेशन]="0.008)" और="" आईजीडी="" (पी-वैल्यू="" [लीनियर="" रिग्रेशन]="0.05)" आइसोटाइप="" दोनों="" में="" महत्वपूर्ण="" पाया="" गया।="" 24="" महीने="" के="" बाद="" के="" प्रत्यारोपण="" में="" सीडीएनए="" पर="" आधारित,="" पिछले="" परिणामों="" के="" अनुरूप="" इन="" दो="" आइसोटाइप्स="" के="" साथ="" पीआर="" समूह="" में="" सबसे="" अधिक="" समृद्ध="" होने="" के="" साथ="" निरंतरता="" दिखा="" रहा="" है।="" सीडीएनए="" विश्लेषण="" में="" केवल="" तीन="" अन्य="" जीन="" महत्वपूर्ण="" पाए="" गए,="" और="" सभी="" 24="" महीने="" के="" बाद="" आईजीडी="" और="" आईजीएम="" आइसोटाइप="" (आईजीएचवी="" 3-15="" और="" आईजीएचवी="" 4-="" 61="" में="" आईजीडी="" और="" आईजीएचवी="" 4-39="" में="" थे।="">

बहस

विविधता प्रतिरक्षा प्रणाली की एक अनिवार्य विशेषता है, और स्वस्थ मनुष्यों में, रोगों से निपटने के लिए रोगजनकों के खिलाफ महत्वपूर्ण है। अंग प्रत्यारोपण में, जानबूझकर चिकित्सीय हेरफेर को चिकित्सकीय रूप से स्थापित किया जाता है ताकि विदेशी अंग को सक्रिय रूप से अनदेखा किया जा सके या स्वयं के रोगी की प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा स्वीकार किया जा सके ताकि एलोइम्यून प्रतिक्रिया माउंट न हो, जिससे अस्वीकृति हो। बी कोशिकाएं इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक हैं और हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा दिखाया गया है, जो एंटीजन प्रस्तुति 32, 33 और एलोएंटीबॉडी उत्पादन 34, 35 दोनों में महत्वपूर्ण हैं। इस काम में, हमने बी कोशिकाओं की विविधता और क्लोनलिटी को बेहतर ढंग से समझने के लिए उच्च-थ्रूपुट बी-सेल अनुक्रमण का उपयोग किया है।गुर्दाबी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के साथ, प्रत्यारोपण से पहले और अनुवर्ती 24 महीनों के बाद, प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता का संचलन। कुल मिलाकर, हमारा विश्लेषण engraftment से पहले एक उच्च बी-सेल विविधता दिखाता है, क्लोनल विस्तार के साथ विविधता में कमी के साथ अनुदैर्ध्य रूप से अंतर, और उन लोगों के बीच कुछ IGHV जीन उपयोग में वृद्धि जो ग्राफ्ट को अस्वीकार करने के लिए जाते हैं।

अंग प्रत्यारोपण के लिए एक प्रमुख बिना पूर्ति नैदानिक ​​आवश्यकता है, प्रत्यारोपण की चोट और खराब परिणामों की गैर-आक्रामक, संवेदनशील और सटीक भविष्यवाणी की कमी है। यह कार्य इस तथ्य से जटिल है कि ऐसे विविध कारक हैं जो भ्रष्टाचार के अस्तित्व को प्रभावित करते हैं। इस अध्ययन में, हमने पाया कि अंग को अस्वीकार करने वालों की तुलना में स्थिर व्यक्तियों में प्रत्यारोपण से पहले बी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की विविधता कम थी। अगला कदम बी-सेल प्रदर्शनों की विविधता के भविष्य कहनेवाला मूल्य का प्रदर्शन करना चाहिए, जो कि engraftment से पहले अस्वीकृति की भविष्यवाणी के लिए संभावित बेहतर बायोमार्कर प्रदान करता है, और पहले और बाद में नैदानिक ​​​​देखभाल और इम्यूनोसप्रेशन विकल्पों में लागू होने की संभावना है।गुर्दाप्रत्यारोपण। यदि यह विशेषता स्थिर व्यक्तियों में विविधता में कमी में योगदान देने वाले किसी भी कारक का परिणाम है, जैसे पर्यावरणीय या अनुवांशिक कारक, तो हम न केवल अस्वीकृति की भविष्यवाणी कर सकते हैं बल्कि इसे रोक भी सकते हैं। दरअसल, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि प्रतिरक्षा प्रणाली में भिन्नता पर्यावरणीय-मानसिक और आनुवंशिक कारकों द्वारा संचालित होती है 37,38। हमारे अध्ययन में, हम किसी भी जनसांख्यिकीय और अन्य नैदानिक ​​रोगी विशेषताओं (आयु, लिंग, जाति, प्रतिरक्षादमन, अंग स्रोत, एचएलए बेमेल, और ईएसआरडी) के साथ कोई संबंध नहीं खोज सके। इस संबंध में, हमें यह पुष्टि करने के लिए एक नए विश्लेषण की आवश्यकता है कि क्या विशिष्ट कारक बी-सेल प्रदर्शनों की विविधता और प्रत्यारोपण परिणामों को प्रभावित करते हैं।

हमारे अध्ययन में एक और दिलचस्प खोज से पता चलता है कि नैदानिक ​​​​परिणाम समूह के आधार पर प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची समय के साथ अलग-अलग व्यवहार करती है। जो लोग अंग के प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकृति दिखाते हैं, उनके लिए बी-सेल विविधता शुरू में अधिक होती है और फिर समय के साथ घट जाती है, जबकि रिवर्स विविधता प्रवृत्ति उन रोगियों में देखी जाती है जो अस्वीकृति या पुरानी भ्रष्टाचार की चोट का विकास नहीं करते हैं। भले ही सभी व्यक्तियों को प्रत्यारोपण के बाद एक ही प्रतिरक्षा-दमन भार प्राप्त हुआ हो, अस्वीकृति विकसित करने वाले रोगियों में घटी हुई विविधता के लिए कुछ संभावित स्पष्टीकरण इस तथ्य से संबंधित हो सकता है कि इन रोगियों को अस्वीकृति के उपचार के लिए अस्थायी रूप से बहुत बढ़ा हुआ इम्युनोसुप्रेशन लोड प्राप्त होता है और फिर उच्च आधार रेखा पर रखा गया है। हालांकि यह समय के साथ बी-सेल विविधता में कमी की व्याख्या कर सकता है, और 24 महीने के बाद के अंतर को समझा सकता है, यह कारण होने की संभावना नहीं है, क्योंकि पीआर समूह में कम विविधता है

चित्र 6 IGHV जीन उपयोग विश्लेषण के लिए हीटमैप और बॉक्सप्लॉट। एनपी के लिए समय 0 (ए), 6 (बी), और 24 (सी) पर नाममात्र महत्वपूर्ण (पी-वैल्यू <0। 05)="" के="" रूप="" में="" चुने="" गए="" आईजीएचवी="" जीन="" को="" दिखाने="" वाला="" हीटमैप="" बनाम="" जनसंपर्क="" लाल="" रंग="" का="" पैमाना="" नमूनों="" में="" प्रत्येक="" जीन="" की="" अभिव्यक्ति="" का="" प्रतिनिधित्व="" करता="" है।="" शीर्ष="" पर="" बैंड="" नैदानिक="" ​​​​परिणाम="" और="" ईएसआरडी="" का="" कारण="" दिखाते="" हैं।="" एनपी="" बनाम="" पीआर="" (समय="" 0:="" पी-वैल्यू="0.04," समय="" 6:="" पी-वैल्यू="0.003," समय="" 24:="" पी="" के="" लिए="" समय="" बिंदुओं="" पर="" आईजीएचवी="" 3-23="" अभिव्यक्ति="" दिखाने="" वाला="" बॉक्सप्लॉट="" -मान="0.02)" (डी)।="" बॉक्स="" के="" अंदर="" का="" बैंड="" माध्यिका="" मान="" का="" प्रतिनिधित्व="" करता="" है,="" बॉक्स="" इंटरक्वार्टाइल="" रेंज="" (iqr)="" को="" परिभाषित="" करता="" है,="" और="" मूंछें="" पहले="" और="" तीसरे="" चतुर्थक="" ±="" 1.5="" ×="" iqr="" को="" दर्शाती="" हैं।="" पी-मान="" एक="" रेखीय="" प्रतिगमन="" मॉडल="" के="" समायोजन="" से="" प्राप्त="" होते="" हैं="" जो="" वी="" जीन="" को="" एक="" आश्रित="" चर="" के="" रूप="" में="" और="" नैदानिक="" ​​​​परिणाम="" को="" एक="" स्वतंत्र="" चर="" के="" रूप="" में="" मानते="" हैं।="" (एन="12" नमूने)।="" स्रोत="" डेटा="" स्रोत="" डेटा="" फ़ाइल="" के="" रूप="" में="" प्रदान="" किया="" जाता="">

प्रत्यारोपण के 6 महीने बाद भी देखा गया, ऐसे समय में जब रोगियों ने अभी तक अस्वीकृति विकसित नहीं की है, यह सुझाव देते हुए कि अन्य सक्रिय प्रक्रियाओं में शामिल होने की संभावना है। केवल उन रोगियों में अधिक प्रभावी क्लोन के साथ चयनात्मक क्लोनल विस्तार का अवलोकन, जो अस्वीकृति और / या प्रगतिशील क्रोनिक दोनों विकसित करते हैंगुर्दाप्रत्यारोपण की चोट, समय के साथ कुछ क्लोनों के जैविक रूप से प्रासंगिक, एलोएंटीजन संचालित चयन, दृढ़ता और विस्तार का सुझाव देती है, जो अस्थायी विविधता में समग्र कमी के लिए जिम्मेदार है। भले ही हम इस बात की परिकल्पना कर सकते हैं कि इन क्लोनों का विस्तार संभवतः एक एलोइम्यून चोट से जुड़ा हुआ है, प्रत्यक्ष प्रमाण है कि इन क्लोनों का विस्तार एलोइम्यून है इन विट्रो और पशु अध्ययनों में अतिरिक्त की आवश्यकता है।

इम्युनो-सप्रेशन थेरेपी में तेजी से सुधार के बावजूद तीव्र अस्वीकृति दीर्घकालिक ग्राफ्ट अस्तित्व के लिए सबसे मजबूत नकारात्मक कारक बनी हुई है। यह अध्ययन अस्वीकृति के साथ कुछ IGHV जीनों के उपयोग के संबंध को भी ढूंढता है, हालांकि भविष्य के अध्ययनों में कारण लिंक का पता लगाया जाना चाहिए। आईजीएचवी 3-23 जीडीएनए विश्लेषण में सबसे दिलचस्प जीन है क्योंकि यह उन रोगियों में काफी अधिक उपयोग किया जाता है जो सभी मापा समय बिंदुओं में अस्वीकृति विकसित करते हैं और यह व्यक्तियों के बीच साझा किए गए निरंतर क्लोन में अधिक प्रतिनिधित्व करता है और क्लोन समृद्ध होता है। 24 महीने के प्रत्यारोपण के बाद रोगियों को खारिज कर दिया। सीडीएनए विश्लेषण में आईजीडी और आईजीएम दोनों प्रकार के प्रत्यारोपण में 24 महीने के बाद इस जीन को भी मान्य किया गया है। IGHV 3-23 क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया में खराब रोग का निदान के साथ व्यापक रूप से जुड़ा हुआ है और यह दिखाया गया है कि IGHV 3-23 अनुक्रमों के विशाल बहुमत ने सुपरएंटिजेन इंटरैक्शन मध्यस्थता करने की क्षमता को बरकरार रखा है। बी-सेल सुपरएंटिजेन्स वायरस और बैक्टीरिया द्वारा निर्मित होते हैं, जिन्हें पारंपरिक एंटीजन-बाइंडिंग साइटों के बाहर इम्युनोग्लोबुलिन से बांधने के लिए जाना जाता है। एक सुपरएंटिजेन के साथ बी कोशिकाओं के मुठभेड़ों को प्रसार, सक्रियण, प्रवासन और विलोपन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। प्रतिरोपित मेंगुर्दा, ईएसआरडी के कारण के रूप में प्राथमिक vesicoureteric reflux के एटियलजि से संबंधित या तो प्रत्यारोपण मूत्रवाहिनी के पुन: प्रत्यारोपण के बाद माध्यमिक मूत्र reux, या मूत्र पथ के संक्रमण के बाद reflux के कारण, वायरस और बैक्टीरियल एंटीजन के निरंतर संपर्क की संभावना है। जो प्रत्यारोपण के बाद क्रोनिक इम्यूनोसप्रेशन के संपर्क में आने से बढ़ जाता है। हमने अन्य नैदानिक ​​और जनसांख्यिकीय कारकों के बीच, गुर्दे की विफलता के कारणों के लिए विश्लेषण परिणामों को समायोजित किया; पहले चर्चा किए गए परिणाम महत्वपूर्ण बने हुए हैं, हालांकि हमने महसूस किया कि विश्लेषण में एनपी गर्भपात वाले रोगी (चित्र 6) को एक पुन: रोग था। चेंग एट अल। ने पहले भी पाया है कि बी कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ किए गए गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के बायोप्सी ऊतक में क्लोन में अन्य लोगों के बीच आईजीएचवी 3-23 जीन की प्रबलता थी। ग्रोवर एट अल.46 ने प्रदर्शित किया कि इस विशेष जीन के लिए एंटीबॉडी डोनर एचएलए एंटीजन को नहीं पहचान रहे थे, बल्कि ई. कोलाई और मोडेना एट अल के लिए विशिष्ट थे। 47 ने दिखाया कि मूत्र में बैक्टीरिया की संख्या का बोझ रोगियों में बहुत अधिक था। अच्छी तरह से काम कर रहे ग्राफ्ट वाले लोगों की तुलना में बीचवाला फाइब्रोसिस और ट्यूबलर शोष। हम इन निष्कर्षों का विस्तार करते हुए प्रदर्शित करते हैं कि IGHV 3-23 जीन का उपयोग परिधीय रक्त में कई अस्वीकार करने वाले रोगियों में काफी अधिक है और ड्राइविंग अस्वीकृति में विशेष सामान्य एंटीजन को निहित कर सकता है। भविष्य में, IGHV की अभिव्यक्ति 3-23 संभावित रूप से प्रतिरोपित प्रतिरक्षी प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए उपयोग की जा सकती हैगुर्दा.

सीडीएनए अनुक्रमण का उपयोग करके अपने अध्ययन का विस्तार करते हुए, हम अपने अधिकांश परिणामों को दो आइसोटाइप (आईजीएम और आईजीडी) में दोहरा सकते हैं, एनपी में कम विविधता पूर्व-प्रत्यारोपण दिखाते हुए, अनुदैर्ध्य विश्लेषण में दो सबसे महत्वपूर्ण होने के साथ अधिक विस्तार और प्रभावशाली नेटवर्क विश्लेषण में क्लोन और आईजीएचवी 3-23 जीन की प्रतिकृति भी। एक हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उत्पादित होने वाले पहले एंटीबॉडी हमेशा आईजीएम होते हैं और सभी अलग-अलग आइसोटाइप, आईजीडी, आईजीए, आईजीजी, और आईजीई के उत्पादन में तेजी से प्रगति करते हैं लेकिन विशेष रुचि के लिए आईजीडी आइसोटाइप 48 की आवश्यकता होती है। IgD को IgM के साथ सह-व्यक्त किया जाता है और स्रावित IgD मौजूद होता है और रक्त, म्यूकोसल स्राव और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रभावकारी कोशिकाओं जैसे बेसोफिल की सतह पर एक कार्य होता है। बेसोफिल सफेद कोशिकाएं होती हैं जो वायरस, बैक्टीरिया, परजीवी और कवक से लड़ती हैं, और वे गुर्दे की बीमारियों और प्रत्यारोपण अस्वीकृति में शामिल होती हैं। इस प्रकार, एक और सबूत जो बी-सेल प्रतिक्रियाओं को वायरस और बैक्टीरिया के साथ अस्वीकृति प्रक्रिया से संबंधित करता है।

भविष्य के अध्ययनों को प्रदर्शित करने की आवश्यकता है कि यह सक्रियण निदान और चिकित्सा विज्ञान में निहितार्थ के साथ प्राप्तकर्ता माइक्रोबायोम में अंतर के कारण है।

इस अध्ययन ने हमें इनमें से कुछ बीसीआर क्लोनों की प्रासंगिकता की पहचान करने, एलोग्राफ़्ट अस्वीकृति के साथ नैदानिक ​​प्रासंगिकता के बीसीआर क्लोनों की पहचान करने, और यह दिखाने की अनुमति दी कि इन क्लोनों के रोगियों में संवर्धन को देखते हुए, विषम प्रतिरक्षा के साथ इन क्लोनों की संभावित प्रासंगिकता है। प्रत्यारोपण से पहले उपनिवेशित मूत्र पथ और रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं के लिए उनकी जैविक प्रासंगिकता। में प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची व्यवहार की बेहतर समझगुर्दाकम्प्यूटेशनल और सांख्यिकीय पाइपलाइनों के एक मजबूत कार्यान्वयन के साथ संयोजन में BCRSeq के आवेदन के बिना प्रत्यारोपण संभव नहीं होता। फिर भी, हमारे दृष्टिकोण की कई सीमाएँ हैं जिन्हें पहचाना जाना चाहिए: पहला, हमारे नमूने का आकार अत्यधिक चयनित है और बाल रोगियों के एक समूह में अपेक्षाकृत छोटा है और भले ही हम अपने विश्लेषण में सांख्यिकीय महत्व तक पहुँच गए और डेटा के दो अलग-अलग स्रोतों में मान्य हैं, हमारे परिणामों की पुष्टि करने के लिए आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। दूसरे, हमारे परिणाम हमारे विश्लेषण में जैविक और तकनीकी नमूने के प्रभाव से मुक्त नहीं हैं। विविधता के उपाय कई मुद्दों पर निर्भर हैं: तथ्य यह है कि एक प्रदर्शनों की सूची में अरबों कोशिकाओं का केवल एक अंश एक नमूने में दर्शाया गया है, अनुक्रमण गहराई में अंतर और संभावित प्रयोगात्मक त्रुटियां हैं। हमने इन सभी मुद्दों के लिए बड़े पैमाने पर नियंत्रण किया है, पहले प्रयोगशाला में, एक ही बैच में प्रत्येक नमूने के लिए समान मात्रा में रक्त चलाना और दूसरा, कम्प्यूटेशनल और सांख्यिकीय रूप से, समग्र प्रदर्शनों की सूची का अनुमान लगाने के लिए रीकन टूल को लागू करना और अनुक्रमण गहराई को नियंत्रित करने के लिए डाउनसैंपलिंग करना। और प्रयोगात्मक त्रुटियां। तीसरा, हमने दो अलग-अलग स्रोतों, gDNA और cDNA का उपयोग करके BCRSeq का प्रदर्शन किया है। अनुक्रमण जीडीएनए किसी दिए गए आईजी अनुक्रम के क्लोनलिटी के आकलन की सुविधा प्रदान करता है क्योंकि अनुक्रम पढ़ने की संख्या जीडीएनए अणुओं की संख्या के समानुपाती होगी। अनुक्रमण सीडीएनए प्रदर्शनों की सूची में विभिन्न आईजी अनुक्रमों के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान प्रदान करता है। यह दिखाया गया है कि टी-सेल रिसेप्टर्स के लिए, सीडीएनए पर किया गया क्लोनोटाइप लक्षण वर्णन उतना अच्छा नहीं है जितना कि जीडीएनए में दिखाया गया है कि अलग-अलग क्लोनों के सापेक्ष अनुपात में काफी अंतर है या एचआईवी-विशिष्ट क्लोन की ट्रैकिंग केवल जीडीएनए के साथ सफल है, लेकिन mRNA51 नहीं। चौथा, इस प्रकार के विश्लेषण में इम्यूनोसप्रेशन का प्रभाव एक भ्रमित करने वाला कारक हो सकता है। इस अध्ययन में, सभी नमूने एक नैदानिक ​​परीक्षण से आते हैं जहां प्रत्यारोपण के बाद सभी रोगियों द्वारा समान प्रतिरक्षादमन भार प्राप्त किया गया था। फिर भी, हमने यह सुनिश्चित करने के लिए दो प्रकार के स्टेरॉयड-आधारित और स्टेरॉयड-मुक्त द्वारा नियंत्रित किया कि यह कोई समस्या नहीं थी, परिणामों में कोई अंतर नहीं देखा। अंत में, हम यहां जो समूह प्रस्तुत कर रहे हैं, वह बाल प्रत्यारोपण का है। प्रतिरोपित अधिकांश नैदानिक ​​पहलू बच्चों और वयस्कों में समान हैं। उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोसप्रेशन और रेजिमेंस समान हैं, क्रिएटिनिन प्रमुख सीरम बायोमार्कर है, तीव्र अस्वीकृति मुख्य रूप से बैनफ मानदंड के उपयोग के साथ बायोप्सी के माध्यम से निर्धारित की जाती है, और अस्वीकृति तंत्रगुर्दाभ्रष्टाचार आम तौर पर समान होते हैं52, इसलिए वयस्कों या बच्चों में किए गए अधिकांश शोध दोनों पर लागू हो सकते हैं। हालांकि, अन्य पहलू जैसे कि गैर-अनुपालन/प्रतिरक्षादमन का पालन न करना, प्रतिरक्षात्मक पहलू, प्राथमिक गुर्दा रोग, गुर्दे की विफलता की ओर ले जाते हैं, जो अक्सर मूत्र संबंधी मुद्दों से जुड़े होते हैं, और प्रतिरक्षण जो प्रत्यारोपण से पहले आवश्यक होते हैं, भिन्न हो सकते हैं, इसलिए आगे के विश्लेषण में इन निष्कर्षों को सामान्य बनाने के लिए एक वयस्क आबादी की आवश्यकता होगी।

इन सीमाओं के बावजूद, हमारे डेटा से पता चलता है कि उच्च पूर्व-प्रत्यारोपण विविधता उन व्यक्तियों में देखी जाती है जो अंग को अस्वीकार करने के लिए आगे बढ़ते हैं, अस्वीकृति की एक पूर्वसूचना का सुझाव देते हैं, जो कि engraftment, immunosuppression विकल्पों और नैदानिक ​​​​देखभाल से पहले अस्वीकृति के जोखिम की भविष्यवाणी करने में भविष्य के निहितार्थ हो सकते हैं। अभ्यास। 24 महीनों के अनुवर्ती कार्रवाई के बाद, समय के साथ विविधता में एक समग्र कमी, कुछ क्लोनों की दृढ़ता और विस्तार और कई IGHV जीनों के उच्च उपयोग के साथ अस्वीकृति समूह में देखा गया है, जो ड्राइविंग अस्वीकृति में विशेष सामान्य एंटीजन को निहित कर सकता है। अस्वीकृति रोगियों में आईजीएचवी 3-23 जीन के बढ़ते उपयोग के लिए विशेष रुचि देखी गई है क्योंकि यह पहले से जुड़ा हुआ हैगुर्दाप्रत्यारोपण और अस्वीकृति प्रक्रिया को चलाने के लिए एक प्रमुख घटक हो सकता है। यह कार्य इन निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए अधिक अध्ययनों को बढ़ावा देने वाले अंग प्रत्यारोपण में बी-सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का एक अनुदैर्ध्य विश्लेषण प्रस्तुत करता है क्योंकि उनके भविष्यवाणी, नियंत्रण, निगरानी और उपचार में नैदानिक ​​​​प्रभाव हो सकते हैं।गुर्दाअस्वीकृति।

तरीकों

पढ़ाई की सरंचना। हमने जीडीएनए के लिए 81 नमूनों और सीडीएनए के लिए 56 मिलान किए गए नमूनों का अध्ययन लंबे समय तक 0, 6, और 24 महीनों में कुल 27 बाल रोगियों में से किया, जिन्होंने प्राथमिक उपचार प्राप्त किया।गुर्दाप्रत्यारोपण। इस अध्ययन के विषय एक नैदानिक ​​परीक्षण (SNSO1 बहुकेंद्रीय अध्ययन) से आते हैं, जहां विषयों को यादृच्छिक रूप से (1:1) एक पारंपरिक कम-खुराक स्टेरॉयड-आधारित इम्यूनोसप्रेशन रेजिमेन (स्टेरॉयड, मानक डैक्लिज़ुमैब इंडक्शन, दूसरे महीने के पोस्ट-ट्रांसप्लांट तक) में शामिल किया गया था। और टैक्रोलिमस (प्रोग्राफ, एस्टेलस फार्मा) और एमएमएफ (सेलकैप्ट, हॉफमैन-ला रोश) या एक स्टेरॉयड-मुक्त इम्यूनोसप्रेशन रेजिमेन के साथ रखरखाव इम्यूनोसप्रेशन (छठे महीने के पोस्ट-ट्रांसप्लांट, टैक्रोलिमस और एमएमएफ तक लंबे समय तक डैक्लिज़ुमैब इंडक्शन)। सभी विषय थे आईआरबी अनुमोदन के बाद नामांकित किया गया था और सहमति की सूचना दी थी। इस अध्ययन में, 14 रोगियों को एक स्टेरॉयड-परिहार आहार प्राप्त हुआ, जबकि 13 को स्टेरॉयड-आधारित इम्यूनोसप्रेसिव रेजिमेन प्राप्त हुआ53 और इनमें से किसी भी रोगी को प्रत्यारोपण से पहले इम्यूनोसप्रेशन प्राप्त नहीं हुआ क्योंकि यह एक बहिष्करण मानदंड था। अस्वीकृति के लिए उपचार इंट्रावेनस कॉर्टिकोस्टेरॉइड (10 मिलीग्राम / किग्रा) और बेसलाइन इम्यूनोसप्रेशन इंटेंसिकेशन के तीन दालों से मिलकर बनता है।

अध्ययन में उपयोग किए गए सभी नमूनों में एक संबद्ध सीरियल एलोग्राफ़्ट बायोप्सी थी, जिसे एक केंद्रीय रोगविज्ञानी द्वारा अर्ध-मात्रात्मक हिस्टोलॉजिकल स्कोर का उपयोग करके पढ़ा गया था। नैदानिक ​​​​तीव्र अस्वीकृति को एक तीव्र अस्वीकृति प्रकरण के रूप में परिभाषित किया गया था, जो ग्राफ्ट डिसफंक्शन से जुड़ा था, बेसलाइन मूल्यों से सीरम क्रिएटिनिन में 10 प्रतिशत से अधिक की वृद्धि के आधार पर, और अद्यतन बैनफ वर्गीकरण के अनुसार बायोप्सी के केंद्रीय रोग संबंधी रीडिंग के माध्यम से पुष्टि की गई थी। क्रॉनिक एलोग्राफ़्ट डैमेज इंडेक्स (CADI) स्कोर का उपयोग करके क्रॉनिक एलोग्राफ़्ट इंजरी को परिभाषित किया गया था। रोगियों को सीएडीआई स्कोर और अस्वीकृति एपिसोड द्वारा परिभाषित तीन नैदानिक ​​​​परिणामों में वर्गीकृत किया गया था गैर-प्रगतिकर्ताओं (एनपी) के पास 2 वर्षों में तीन सीरियल बायोप्सी पर कम गैर-वृद्धिशील सीएडीआई स्कोर था, तीव्र अस्वीकृति के बिना, बिना अस्वीकृति वाले प्रगतिकर्ताओं (पीएनआर) में उच्च सीएडीआई था 2 वर्षों में उनकी सीरियल बायोप्सी पर स्कोर और अस्वीकृति के बिना समय बिंदुओं में वृद्धिशील और अस्वीकृति के साथ प्रगतिकर्ताओं (पीआर) के पास अस्वीकृति एपिसोड के साथ 2 वर्षों में उनकी सीरियल बायोप्सी पर वृद्धिशील उच्च सीएडीआई स्कोर था। इन रोगियों को 120 रोगियों के एक बड़े समूह से बहुत सावधानी से चुना गया था, जनसांख्यिकीय चर के लिए मिलान, और सभी एनपी, और पीएनआर के लिए अनुपस्थित दाता-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा मापा गया बायोप्सी या सबक्लिनिकल चोट पर कोई सबूत नहीं है। किसी के पास एचएलए या अगुणित भ्रष्टाचार नहीं था क्योंकि यह नामांकन के लिए एक बहिष्करण मानदंड था। आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत 2004 और 2006 के बीच 12 अलग-अलग अमेरिकी बाल चिकित्सा प्रत्यारोपण कार्यक्रमों से सभी नमूने एकत्र किए गए थे। अध्ययन को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान संरक्षण कार्यक्रम (एचआरपीपी) द्वारा बायोबैंक नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए भी अनुमोदित किया गया था। सभी रोगियों/अभिभावकों ने हेलसिंकी की घोषणा के पूर्ण पालन में, अनुसंधान में भाग लेने के लिए सूचित सहमति प्रदान की। रिपोर्ट की जा रही नैदानिक ​​और अनुसंधान गतिविधियां इस्तांबुल की घोषणा के सिद्धांतों के अनुरूप हैं, जैसा कि अंग तस्करी और प्रत्यारोपण पर्यटन पर इस्तांबुल की घोषणा में उल्लिखित है।

जीडीएनए और आरएनए का अलगाव। रक्त के नमूने (4.5 मिली) को 5 मिली रेड टॉप ट्यूब में एकत्र किया गया और थक्का बनने तक 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया। तब नमूना को एक झूलते हुए बाल्टी रोटर का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 2000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सीरम की ऊपरी परत को फिर दूसरे क्रायोट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया और थक्के को उसी ट्यूब में उपयोग करने तक −80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। पूरे रक्त के थक्कों से जीनोमिक डीएनए को क्लॉट्सपिन बास्केट और जेंट्रा प्योरजीनब्लड किट (क्यूजेन, वालेंसिया, सीए) का उपयोग करके निकाला गया था।

से आरएनए निष्कर्षण के लिएगुर्दासुई बायोप्सी (क्यूजेन, वालेंसिया, सीए) और −80 डिग्री पर संग्रहीत; कुल आरएनए को 790 μl TRIzol और 10 μl ग्लाइकोजन के मास्टर मिश्रण का उपयोग करके निकाला गया था। ऊतक के नमूनों को समरूप बनाया गया, 5 मिनट के लिए 15 से 25 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया और चरण पृथक्करण के लिए 160 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ा गया। मिश्रण को 2 मिनट के लिए 25 डिग्री पर फिर से ऊष्मायन किया गया और उसके बाद 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया और आरएनएसी माइक्रो किट (क्यूजेन कैटलॉग नंबर 4004) का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग किया गया। आरएनए मात्रा और अखंडता को क्रमशः थर्मो साइंटिक नैनोड्रॉप एनडी -2000 यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एगिलेंट बायोएनालिज़र के साथ निर्धारित किया गया था।

बी-सेल अनुक्रमण। जीनोमिक डीएनए टेम्प्लेटेड पीसीआर प्रतिक्रियाएं तैयार की गईं

प्रति नमूना छह स्वतंत्र बारकोडेड पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए 100 एनजी जीडीएनए विभाज्य से। बायोमेड -2 डिज़ाइन के अनुसार IgH J या FR1 या FR2 फ्रेमवर्क क्षेत्रों में बहुसंकेतन प्राइमरों का उपयोग किया गया था। प्राइमरों में दस-न्यूक्लियोटाइड 'बारकोड अनुक्रम' का उपयोग नमूना पहचान को इंगित करने और प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए पुस्तकालय पहचान को दोहराने के लिए किया गया था। पीसीआर को निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एम्प्लीटैक गोल्ड (रोच) पोलीमरेज़ के साथ किया गया था: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री; के 35 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री, 45 एस के लिए 60 डिग्री, 90 एस के लिए 72 डिग्री); और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री पर अंतिम विस्तार। यह सुनिश्चित करने के लिए एक दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया की गई कि जेल शुद्धिकरण और अनुक्रमण से पहले पुस्तकालयों को संतृप्ति के लिए प्रवर्धित नहीं किया गया था। कुल मिलाकर, प्रत्येक पहले पीसीआर उत्पाद के 0.4 उल ने 454 लिंकर अनुक्रमों के लिए विशिष्ट बाहरी प्राइमरों का उपयोग करते हुए दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया को टेम्प्लेट किया; विस्तार कार्यक्रम के साथ किया गया था: 15 मिनट के लिए 94 डिग्री, 12 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री, 45 एस के लिए 60 डिग्री, 90 एस के लिए 72 डिग्री), और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री पर अंतिम विस्तार। AmpliTaq Gold की त्रुटि दर का क्लोन से संबंधित अनुक्रमों की पहचान या अनुक्रमों में दैहिक उत्परिवर्तन दर के अनुमान पर न्यूनतम प्रभाव होना चाहिए जैसा कि कहीं और चर्चा की गई है। सीडीएनए को आरएनए के कुल 300 एनजी से यादृच्छिक हेक्सामर्स द्वारा प्राइमिंग के साथ संश्लेषित किया गया था। पीसीआर द्वारा टेम्प्लेट को फ्रेमवर्क 1 (FR1) में बायोमेड IGHV प्राइमरों का उपयोग करके और स्थिर क्षेत्रों के पहले एक्सॉन में स्थित आइसोटाइप-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था। इन प्राइमरों ने 18,57 में क्लस्टर जनरेशन और मिसेक इंस्ट्रूमेंट पर अनुक्रमण के लिए आवश्यक इल्लुमिना लिंकर अनुक्रमों के लगभग आधे को भी एन्कोड किया। नमूना पहचान प्रत्येक प्राइमर में आठ-न्यूक्लियोटाइड मल्टीप्लेक्स पहचानकर्ता बारकोड द्वारा एन्कोड किया गया था। इल्लुमिना क्लस्टर मान्यता के लिए, स्थिर क्षेत्र प्राइमरों में इल्लुमिना लिंकर अनुक्रम के तुरंत बाद प्राइमरों में चार यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड्स को एन्कोड किया गया था। क्रॉस आइसोटाइप काइमेरिक पीसीआर उत्पादों के गठन को रोकने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी आइसोटाइप को एक अलग पीसीआर प्रतिक्रिया में प्रवर्धित किया गया था। पीसीआर को निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एम्प्लीटैक गोल्ड (रोच) के साथ किया गया था और 7 मिनट के लिए 94 डिग्री, 35 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री, 45 एस के लिए 58 डिग्री, 120 एस के लिए 72 डिग्री) और अंतिम के लिए एक प्रोग्राम का उपयोग किया गया था। 10 मिनट के लिए 72 डिग्री पर विस्तार। एक दूसरे पीसीआर चरण का उपयोग इलुमिना लिंकर्स के शेष हिस्से को एम्पलीकॉन्स में जोड़ने के लिए किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूजेन मल्टीप्लेक्स पीसीआर किट (क्यूजेन) के साथ किया गया था, जिसमें पहले पीसीआर उत्पाद के 0.4 माइक्रोलीटर का उपयोग एक टेम्पलेट के रूप में किया गया था। 30 माइक्रोलीटर प्रतिक्रिया। दूसरे पीसीआर चरण के लिए पीसीआर कार्यक्रम 15 मिनट के लिए 94 डिग्री, 12 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री, 45 एस के लिए 60 डिग्री, 90 एस के लिए 72 डिग्री), और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री पर अंतिम विस्तार था। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के उत्पादों को अनुमानित समतुल्य मात्रा में, agarose जैल पर वैद्युतकणसंचलन और QIAquick किट (क्यूजेन) के साथ निकाले गए जेल में जमा किया गया था। टाइटेनियम रसायन विज्ञान का उपयोग करते हुए 454 (रोच) प्लेटफॉर्म पर जीनोमिक डीएनए टेम्प्लेटेड लाइब्रेरी के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था। सीडीएनए पुस्तकालय अनुक्रमण एक इलुमिना मिसेक उपकरण पर 600-चक्र अनुक्रमण किट का उपयोग करके किया गया था। पूरक डेटा 1 में MiSeq (M154 और M155) और 454 टाइटेनियम (T7) के साथ उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की पूरी सूची शामिल है।

सीक्वेंसिंग रीड्स को निम्नानुसार संसाधित किया गया था: पेयर-एंड रीड्स को FLASH58 का उपयोग करके मर्ज किया गया था, जहां सीक्वेंस के बाद बारकोड और IGHV प्राइमर सीक्वेंस को डीमल्टीप्लेक्स और ट्रिम किया गया था। संरेखण कार्यक्रम IgBLAST59 का उपयोग करके V, D, और J क्षेत्रों और V-D (N1), D-J (N2) जंक्शनों की पहचान की गई। गैर-आईजीएच कलाकृतियों, वी जीन सम्मिलन या विलोपन, काइमेरिक अनुक्रमों और गैर-कार्यात्मक अनुक्रमों के साथ अनुक्रमों को हटाने के लिए अनुक्रमों को बदल दिया गया था। नमूना स्तर पर, हमने उन लोगों को बाहर कर दिया जिनके पास<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

विविधता विश्लेषण। प्रति नमूना क्लोनों की संख्या पर विचार करते हुए विविधता को प्रजातियों की समृद्धि से मापा जाता है। यह उपाय प्रत्येक प्रजाति की आवृत्ति पर विचार नहीं करता है, इसलिए हमने विविधता प्रदान करने के लिए शैनन एन्ट्रॉपी (एच) का भी उपयोग किया

जनसंख्या में प्रजातियों के आकार वितरण के बारे में जानकारी। एच के रूप में परिभाषित किया गया है:

जहां एन अद्वितीय क्लोनों की संख्या है और पीआई क्लोन आई की आवृत्ति है। H की सीमा 0 (केवल एक क्लोन के साथ नमूना) से Hmax log2N (क्लोन के एक समान वितरण के साथ नमूना) तक होती है।

फिर, हमने अलग-अलग समय बिंदुओं पर नैदानिक ​​​​परिणामों के साथ समृद्धि और एन्ट्रापी के बीच संबंध का पता लगाने के लिए एक सामान्य रैखिक मॉडल का उपयोग किया। हमने इस मॉडल को तालिका 1 में दिखाए गए सभी नैदानिक ​​​​चर द्वारा समायोजित किया है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि रोगी की कोई भी विशेषता एक भ्रमित कारक थी

डेटा के अनुदैर्ध्य घटक को मॉडल करने के लिए, हमने एक सशर्त विकास मॉडल पर विचार करते हुए एक रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडल लागू किया जैसा कि पूरक चित्र 10 में दिखाया गया है। इस मॉडल को लागू करने के लिए, हमने नैदानिक ​​​​परिणाम और समय के बीच बातचीत पर विचार करते हुए आर में lme4 पैकेज का उपयोग किया। समय के साथ एक यादृच्छिक प्रभाव होने के साथ समृद्धि और विविधता के साथ जुड़ाव।

इस तथ्य से निपटने के लिए कि विविधता के उपाय गायब प्रजातियों की समस्या से प्रभावित हो सकते हैं (एक प्रदर्शनों की सूची में अरबों कोशिकाओं का केवल एक अंश का प्रतिनिधित्व किया जाता है) और अनुक्रमण और प्रयोगात्मक त्रुटियां, हमने पूर्ण डेटा विश्लेषण के अलावा दो रणनीतियों का प्रदर्शन किया। सबसे पहले, हमने लापता प्रजातियों की समस्या से निपटने के लिए रिकॉन (अवलोकित संख्याओं से अनुमानित क्लोनों का पुनर्निर्माण) टूल का उपयोग किया। रिकॉन एक संशोधित अधिकतम संभावना विधि है जो एक नमूने पर माप से एक प्रदर्शनों की सूची की समग्र विविधता को आउटपुट करती है। रिकॉन विविधता उपायों के एक सेट के सटीक और मजबूत अनुमानों को आउटपुट करता है, जिसमें समृद्धि और एन्ट्रॉपी शामिल हैं, जिससे व्यक्तियों के बीच विविधता की मजबूत तुलना होती है। दूसरा, हमने सबसे छोटे अनुक्रमण आकार के बराबर प्रत्येक नमूने के लिए रीड्स का एक यादृच्छिक उपसमुच्चय लेते हुए एक डाउनसैंपलिंग रणनीति का प्रदर्शन किया, इसके बाद अनुक्रमण गहराई से समायोजित करने और संभावित प्रयोगात्मक त्रुटियों से निपटने के लिए बी-सेल क्लोन की पुन: गणना की गई। जीडीएनए के लिए, बहुत कम रीड (<1000) वाले="" नमूने="" हैं,="" और="" कई="" अनुक्रमों="" और="" डेटा="" की="" वास्तविकता="" को="" खोने="" से="" बचने="" के="" लिए,="" हमने="" कुल="" नौ="" नमूनों="" को="" बाहर="" कर="" दिया=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

नेटवर्क विश्लेषण। नेटवर्क जनरेशन एल्गोरिथम 31 से पहले परिभाषित एक के समान है। संक्षेप में, प्रत्येक शीर्ष एक बी-सेल अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है जहां आकार सभी समान अनुक्रमों द्वारा परिभाषित किया जाता है। किनारों की गणना क्लोन परिभाषा (समान V और J खंड, समान CDR3 लंबाई, और CDR3s के बीच 90 प्रतिशत न्यूक्लियोटाइड पहचान) का उपयोग करके की जाती है और क्लस्टर प्रदर्शनों की सूची में प्रत्येक क्लोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्लॉट को जेनरेट करने के लिए लेआउट _ के साथ _ग्राफॉप्ट विकल्प का उपयोग करके आर में ग्राफ पैकेज का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

नेटवर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने शीर्ष आकार और क्लस्टर आकार के लिए गिनी इंडेक्स की गणना की। गिन्नी इंडेक्स असमानता का एक पैमाना है जिसका व्यापक रूप से धन वितरण को मापने के लिए उपयोग किया जाता है। यह बारंबारता बंटन के मूल्यों के बीच असमानता को मापता है। हमने शीर्ष आकार और क्लस्टर आकार वितरण के लिए गिनी गुणांक की गणना करने के लिए आर में एक पैकेज से गिनी फ़ंक्शन का उपयोग किया। शून्य का गिनी गुणांक पूर्ण समानता को व्यक्त करता है और 1 का गिनी गुणांक अधिकतम असमानता को व्यक्त करता है।

क्लोनल विश्लेषण। नैदानिक ​​​​परिणामों से जुड़े विशिष्ट क्लोनों का अध्ययन करने के लिए, हमने सभी क्लोनों के साथ एक मैट्रिक्स बनाया जो प्रत्येक समय बिंदु पर सभी नमूनों द्वारा एक से अधिक नमूने (कुल संख्या=118,223) में मौजूद हैं। हमने तब प्रत्येक विशेष क्लोन के नैदानिक ​​​​परिणामों के साथ संबंध का अध्ययन किया, जो प्रति क्लोन एक चर को वर्तमान / वर्तमान के रूप में परिभाषित करता है। अंत में, हमने प्रत्येक समय बिंदु में प्रत्येक क्लोन के लिए 2 × 3 तालिकाओं में महत्व के लिए फिशर के सटीक परीक्षण को लागू किया। हमने उन क्लोनों द्वारा परिभाषित दृढ़ता क्लोनों का भी अध्ययन किया जो प्रत्येक व्यक्ति में एक से अधिक समय बिंदु पर हैं। फिर, नैदानिक ​​​​परिणामों के अंतर को ध्यान में रखते हुए, हमने एक रैखिक मॉडल लागू किया, जो आश्रित चर के रूप में क्लोनों की संख्या (दृढ़ता में अंतर को मापने के लिए) और प्रत्येक क्लोन की गणना की संख्या (क्लोनल विस्तार को मापने के लिए) और नैदानिक ​​​​परिणाम के रूप में लागू किया। एक स्वतंत्र भविष्यवक्ता।

IGHV जीन उपयोग विश्लेषण। आईजीएचवी जीन का अध्ययन करने के लिए, हमने प्रति नमूना आईजीएचवी जीन उपयोग का आकलन किया क्योंकि कुछ आईजीएचवी जीनों की अधिक प्रस्तुति से बचने के लिए क्लोनों की संख्या से प्रत्येक जीन को सामान्यीकृत किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, हमने कम से कम 10 प्रतिशत नमूनों में उन जीनों को बहुत कम अभिव्यक्ति (IGHV उपयोग/क्लोन <{0}}.05) के="" साथ="" बदल="" दिया।="" कुल="" मिलाकर,="" हमने="" 63="" नमूनों="" के="" अनुरूप="" 27="" ighv="" जीनों="" का="" विश्लेषण="" किया।="" फिर,="" हमने="" उन="" जीनों="" को="" खोजने="" के="" लिए="" एक="" रैखिक="" मॉडल="" लागू="" किया="" जो="" प्रत्येक="" समय="" बिंदु="" में="" नैदानिक="" ​​​​परिणामों="" से="" जुड़े="" थे="" और="" बेंजामिनी="" और="" होचबर्ग="" एफडीआर=""><0.05 का="" उपयोग="" करके="" कई="" परीक्षणों="" द्वारा="" इन="" परिणामों="" को="" ठीक="" किया।="" हमने="" इस="" मॉडल="" को="" तालिका="" 1="" में="" दिखाए="" गए="" सभी="" नैदानिक="" ​​​​चर="" द्वारा="" समायोजित="" किया="" है="" ताकि="" यह="" सुनिश्चित="" हो="" सके="" कि="" रोगी="" की="" कोई="" भी="" विशेषता="" एक="" भ्रमित="" कारक="">

रिपोर्टिंग सारांश। अनुसंधान डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी इस आलेख से जुड़े प्रकृति अनुसंधान रिपोर्टिंग सारांश में उपलब्ध है।

संदर्भ

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