मलेशिया में अल्बुमिनुरिया के साथ और बिना टाइप 2 मधुमेह रोगियों में MiRNAs का प्रसार

अमूर्तपरिचय: मधुमेह गुर्दे की बीमारी(डीकेडी) क्रोनिक किडनी रोग का प्रमुख कारण बना हुआ है। परिसंचारी miRNAs के अनियमित विनियमन की सूचना दी गई है, जो DKD में उनकी रोग संबंधी भूमिकाओं का सुझाव देता है। इस अध्ययन का उद्देश्य चयनित मलेशियाई आबादी में एल्बुमिनुरिया के साथ और बिना टाइप 2 मधुमेह मेलिटस (टी2डीएम) रोगियों के सीरा में अलग-अलग व्यक्त miRNAs की जांच करना था।तरीका:एक सामुदायिक क्लिनिक में फॉलो-अप करने वाले इकतालीस T2DM रोगियों को सामान्य- (NA), माइक्रो- (MIC), और मैक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया (MAC) समूहों में विभाजित किया गया था। 12 नमूनों में miRNAs के विभेदक स्तर को पाथवे-केंद्रित (मानव फाइब्रोसिस) miScript miRNA qपीसीआर सरणी का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और miScript कस्टम qपीसीआर सरणी (CMIHS02742) (क्यूजेन जीएमबीएच, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके 33 नमूनों में मान्य किया गया था।परिणाम:एनए वाले रोगियों की तुलना में एमएसी वाले टी2डीएम रोगियों के सीरम में 3 miRNAs, अर्थात् miR{1}}p, miR{2}}p, और miR{3}}p के अपग्रेडेशन के रुझान। miR का सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन- 874-3p (p= 0.04) और miR-101-3pp= 0.01) को सत्यापन समूह में देखा गया था। अनुमानित ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर (ईजीएफआर) और miR{2}}p (के बीच महत्वपूर्ण नकारात्मक सहसंबंध)p= 0.05), miR-101-3पी (p= 0.03), और miR-145-5p (p= 0.05) साथ ही miR{2}}p और उम्र के बीच सकारात्मक सहसंबंध (p= 0.03) को पियर्सन के सहसंबंध गुणांक विश्लेषण द्वारा दिखाया गया था।निष्कर्ष:इस अध्ययन में T2DM रोगियों के सीरम में पहले से ज्ञात miRNA, अर्थात् miR{0}}p, और संभवतः नए, अर्थात्, miR{1}}p और miR{2}}p का अपग्रेडेशन पाया गया। . ईजीएफआर और इन miRNAs के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध था। इस अध्ययन के निष्कर्षों ने इन विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs की अनुमानित भूमिकाओं की आगे की जांच करने के लिए उत्साहजनक सबूत प्रदान किए हैंडीकेडी.

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परिचय

संयुक्त राज्य अमेरिका में अंतिम चरण की गुर्दे की बीमारी की घटनाओं में मधुमेह गुर्दे की बीमारी (डीकेडी) 39% के लिए जिम्मेदार है [1]। इसी तरह, डीकेडी मलेशिया में क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) का प्रमुख कारण बना हुआ है, जिसने 2018 में 69% नए डायलिसिस रोगियों में योगदान दिया है [2]। ऐसा माना जाता है कि डीकेडी की विकृति मुख्य रूप से हाइपरग्लेसेमिया द्वारा संचालित होती है, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग सक्रिय हो जाते हैं और अंततः वृक्क फाइब्रोसिस हो जाता है [3]। प्रबंधन में प्रगति के बावजूद, वर्तमान बायोमार्कर और उपचार अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी में इसकी प्रगति को रोकने में विफल रहते हैं [3]। इसलिए, डीकेडी के मध्यस्थों और तंत्रों की बेहतर समझ की तत्काल आवश्यकता है।

माइक्रोरिबोन्यूक्लिक एसिड (miRNA) छोटे गैर-कोडिंग आरएनए का एक परिवार है जो जीन अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के रूप में उभरा है [4]। miRNAs की अबर शेख़ी अभिव्यक्ति और DKD के सेलुलर तंत्र में उनकी भागीदारी देखी गई है [3]। इस अध्ययन का उद्देश्य एल्बुमिनुरिया के साथ और बिना टाइप 2 मधुमेह मेलिटस (टी2डीएम) रोगियों के सीरा में चयनित miRNAs की अभिव्यक्ति के पैटर्न की पहचान करना है। दुनिया भर में, विभिन्न आबादी में इसी तरह के अध्ययन किए गए हैं, जैसा कि पहले समीक्षा की गई थी [5-7]। हमारा लक्ष्य टी2डीएम रोगियों में फाइब्रोटिक मार्गों से जुड़े एमआईआरएनए के चयन की विभेदक अभिव्यक्ति के पैटर्न की जांच करना है, जिनमें से कुछ का पहले डीकेडी में अध्ययन किया गया है। पिछले अध्ययनों ने miRNA अभिव्यक्ति में जातीय-संबंधित मतभेदों का सुझाव दिया है [8, 9]। इसलिए, पिछले निष्कर्षों की पुष्टि करने में सक्षम होने के अलावा, यह अध्ययन संभावित रूप से नवीन miRNAs को प्रकट कर सकता है, जो शायद मलेशियाई आबादी में विशिष्ट रूप से व्यक्त किया गया है।

सामग्री और तरीके

अध्ययन आबादी

इस क्रॉस-सेक्शनल अध्ययन में जनवरी से अप्रैल 2019 तक सामुदायिक क्लिनिक में अनुवर्ती 41 मौजूदा T2DM रोगियों को शामिल किया गया। इस अध्ययन में एक 2-चरणीय प्रक्रिया शामिल थी: (1) 12 रोगियों के सीरा में miRNAs (स्क्रीनिंग समूह) ) प्रोफाइल किए गए थे और (2) सबसे प्रासंगिक miRNAs को 33 रोगियों के सीरा के साथ मान्य किया गया था (जिन्हें सत्यापन समूह कहा जाता है)। इसमें स्क्रीनिंग समूह के 4 मरीज शामिल थे। व्यक्तिगत रोगियों से लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। इस अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन मेडिकल रिसर्च एंड एथिक्स कमेटी (एमआरईसी), स्वास्थ्य मंत्रालय मलेशिया से प्राप्त किया गया था। समावेशन मानदंड T2DM रोगी और उपलब्ध नैदानिक ​​​​और प्रयोगशाला जानकारी थे। टाइप 1 डीएम वाले मरीज़; गैर-डीकेडी; कैंसर, तीव्र ज्वर संबंधी बीमारी, या हाल ही में हुए संक्रमण जैसी सहवर्ती बीमारियाँ; गर्भावस्था; और प्रसवोत्तर को बाहर रखा गया।

रोगी के मेडिकल रिकॉर्ड से निम्नलिखित जानकारी प्राप्त की गई: (1) उम्र और लिंग सहित जनसांख्यिकीय डेटा; (2) नैदानिक ​​डेटा जैसे रक्तचाप, वजन, टी2डीएम की अवधि, उपचार, और अन्य मधुमेह संबंधी जटिलताएँ; (3) फास्टिंग प्लाज्मा ग्लूकोज, ग्लाइकेटेड हीमोग्लोबिन ए1सी (एचबीए1सी), एल्ब्यूमिन-टू-क्रिएटिनिन अनुपात और सीरम क्रिएटिनिन सहित प्रयोगशाला डेटा। मरीजों को उनके एल्ब्यूमिन्यूरिया स्तर के अनुसार 3 समूहों में विभाजित किया गया था, नॉर्मोएल्ब्यूमिन्यूरिया (एनए), माइक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया (एमआईसी), और मैक्रोएल्ब्यूमिन्यूरिया (एमएसी)।

परिभाषा

इस अध्ययन में,

एनए, एमआईसी और एमएसी को एल्ब्यूमिन-टू-क्रिएटिनिन अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया था<30, between 30 and 300 and >3 स्पॉट मूत्र संग्रहों में से कम से कम 2 में क्रमशः 300 मिलीग्राम/जी क्रिएटिनिन [10]। अनुमानित ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर (ईजीएफआर) की गणना क्रोनिक किडनी रोग-महामारी विज्ञान क्रिएटिनिन समीकरण के आधार पर की गई थी।

सीरम की तैयारी

वैक्यूटेनर ने उपवास (8 घंटे से कम या उसके बराबर) के पूरे रक्त के नमूने {{1}एमएल बीडी®एसएसटीटीएम ट्यूबों (बेक्टन डिकिंसन, फ्रैंकलिन लेक्स, एनजे, यूएसए) में एकत्र किए, जिन्हें कमरे के तापमान पर 30- मिनट के लिए छोड़ दिया गया। 1,9{6}}0 ग्राम पर 10- मिनट सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले थक्का जमना। ऊपरी चरण को काटा गया, 0.{7}}μm मिनीसार्ट®PES फिल्टर (सार्टोरियस, गोटिंगेन, जर्मनी) के साथ फ़िल्टर किया गया, और विश्लेषण तक -80 डिग्री पर भंडारण के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डाला गया।

कुल miRNA

अलगाव कुल miRNA को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार miRNeasy सीरम/प्लाज्मा किट (क्यूजेन GmbH) का उपयोग करके अलग किया गया था। संक्षेप में, विकृतीकरण के लिए सीरम के 200 μL के विभाज्य में क़ियाज़ोल लिसिस अभिकर्मक को जोड़ा गया था, जिसके बाद आरएनए पुनर्प्राप्ति और रिवर्स की निगरानी के लिए miRNeasy सीरम/प्लाज्मा स्पाइक-इन कंट्रोल सी. एलिगेंस miR -39 miRNA मिमिक (क्यूजेन जीएमबीएच) जोड़ा गया था। प्रतिलेखन दक्षता. चरण पृथक्करण के लिए क्लोरोफॉर्म मिलाया गया और इसके बाद ऊपरी जलीय चरण में 100% इथेनॉल मिलाया गया। बफर आरडब्ल्यूटी, बफर आरपीई और 80% इथेनॉल द्वारा कुल्ला कदम हासिल किए गए। RNeasy MinElute स्पिन कॉलम झिल्ली में 14 μL RNase-मुक्त पानी जोड़कर RNA को शुद्ध किया गया। आरएनए मात्रा और गुणवत्ता नैनोड्रॉप 1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक., विलमिंगटन, डीई, यूएसए) द्वारा उपयोग किए जाने तक -80 डिग्री पर भंडारण से पहले निर्धारित की गई थी। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, 6 μL टेम्पलेट आरएनए और 5 μL पतला का उपयोग करके, miRNA से cDNA और प्रीएम्प्लीफिकेशन में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT) क्रमशः miScript RTII किट (Qiagen GmbH) और miScript PreAMP पीसीआर किट (Qiagen GmbH) के साथ किया गया था। सीडीएनए, क्रमशः

मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया विश्लेषण

स्क्रीनिंग समूह के सीरम में प्रसारित miRNAs की पहचान पाथवे-केंद्रित (मानव फाइब्रोसिस) miScript miRNA qपीसीआर सरणी (क्यूजेन GmbH) द्वारा की गई थी, और चयनित miRNAs को बाद में एक कस्टम miScript miRNA qपीसीआर सरणी (CMIHS02742) के साथ सत्यापन समूह में मान्य किया गया था। Qiagen GmbH) निर्माता के निर्देश के अनुसार। प्रत्येक प्रतिक्रिया में 25 μL की कुल मात्रा बनाने के लिए एक सीडीएनए टेम्पलेट, 2x क्वांटिटेक्ट SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स, 10x miScript यूनिवर्सल प्राइमर, 10x miScript प्राइमर परख, और RNase-मुक्त पानी और पतला टेम्पलेट सीडीएनए शामिल था। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर को एपेंडॉर्फ मास्टरसाइक्लर ईपी रियलप्लेक्स 4 पर प्रदर्शित किया गया था, जिसे निम्नानुसार प्रोग्राम किया गया था: 95 डिग्री पर 15 मिनट, 94 डिग्री पर 15 सेकंड, 55 डिग्री पर 30 सेकंड, और 40 चक्रों के साथ 70 डिग्री पर 30 सेकंड।

miRNA की सापेक्ष मात्रा

वास्तविक समय पीसीआर डेटा विश्लेषण क्यूजेन जीन ग्लोब डेटा विश्लेषण केंद्र सॉफ्टवेयर (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/) का उपयोग करके किया गया था। सापेक्ष अभिव्यक्ति (आरई) 2−∆Ct विधि द्वारा प्राप्त की गई थी, जिससे प्रत्येक miRNA की अभिव्यक्ति को हाउसकीपिंग जीन SNORD95 या ग्लोबल सीटी मीन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। गुना परिवर्तन की गणना नियंत्रण समूह (एनए) में सामान्यीकृत miRNA अभिव्यक्ति द्वारा विभाजित प्रत्येक समूह (एमआईसी या एमएसी) में सामान्यीकृत miRNA अभिव्यक्ति से की गई थी। पी मानों की गणना नियंत्रण समूह और परीक्षण समूहों में प्रत्येक जीन के लिए प्रतिकृति आरई (2−∆Ct) मूल्यों के एक स्वतंत्र नमूने टी-परीक्षण के आधार पर की गई थी। क्यूपीसीआर डेटा विश्लेषण का आगे सत्यापन माइक्रोसॉफ्ट विंडोज सॉफ्टवेयर के लिए माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल और आईबीएम एसपीएसएस (सामाजिक विज्ञान के लिए सांख्यिकीय पैकेज; आईबीएम कॉर्प, एआर मोंक, एनवाई, यूएसए) रिलीज 25 का उपयोग करके मैन्युअल रूप से किया गया था।

सत्यापन के लिए स्क्रीनिंग समूह में miRNAs का चयन

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 को नकारात्मक अभिव्यक्ति के रूप में माना गया था, जैसा कि क्यूजेन जीनग्लोब डेटा विश्लेषण केंद्र (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/) द्वारा अनुशंसित है। ऑनलाइन अनुपूरक तालिका 1 (सभी ऑनलाइन आपूर्ति सामग्री के लिए, www.karger.com/doi/10.1159/000518866 देखें) वैश्विक सीटी माध्य के लिए सामान्यीकृत स्क्रीनिंग समूह में 84 miRNAs का आरई दिखाता है। सॉफ़्टवेयर द्वारा परिभाषित, महत्वपूर्ण ±2.0-गुना परिवर्तन और अच्छी गुणवत्ता वाले MiRNAs को सत्यापन के लिए चुना गया था। इसके अलावा, अन्य miRNAs को उनके पी मानों की रैंकिंग और DKD और DKD-संबंधित मार्गों में पिछले अध्ययनों में उनकी भागीदारी के आधार पर चुना गया था, जिसके तहत सबसे अधिक संख्या में अनुमानित मैसेंजर आरएनए लक्ष्यों वाले miRNAs को चुना गया था। ऑनलाइन अनुपूरक तालिका 2 सत्यापन के लिए miRNAs के चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले अतिरिक्त मानदंड दिखाती है। सत्यापन विश्लेषण में, miRNA अभिव्यक्ति को SNORD95 पर सामान्यीकृत किया गया क्योंकि वैश्विक Ct माध्य विधि उपयुक्त नहीं थी और Ct > 35 को एक नकारात्मक अभिव्यक्ति माना गया था। मानकीकरण करने के लिए, हमने SNORD95 सामान्यीकरण के आधार पर स्क्रीनिंग समूह में चयनित miRNA के आरई का पुन: विश्लेषण किया, और इसका उपयोग सत्यापन समूह की तुलना में बाद के विश्लेषण के लिए किया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >2 स्वतंत्र समूह स्वतंत्र नमूनों क्रुस्कल-वालिस परीक्षण (तालिका 1) का उपयोग करके किया गया था। श्रेणीबद्ध चर की तुलना आकस्मिकताओं के χ2 परीक्षण या फिशर के सटीक परीक्षण (तालिका 1) का उपयोग करके की गई थी। चयनित miRNA RE और निरंतर चर (जनसांख्यिकीय और नैदानिक ​​​​डेटा) के बीच सहसंबंध पियर्सन के सहसंबंध गुणांक का उपयोग करके किया गया था। चयनित miRNA RE और इसके महत्वपूर्ण भविष्यवक्ताओं के बीच रैखिक संबंध का विश्लेषण करने के लिए एकाधिक प्रतिगमन परीक्षण का उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय गणना आईबीएम एसपीएसएस (सामाजिक विज्ञान के लिए सांख्यिकीय पैकेज; आईबीएम कॉर्प) माइक्रोसॉफ्ट विंडोज के लिए रिलीज 25 और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर प्रोग्राम पैकेज प्रिज्म 8 (ग्राफपैड, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके की गई थी। सांख्यिकीय महत्व को p <{7}}.05 के रूप में परिभाषित किया गया था।

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