Cistanche डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और अस्थि पुनर्जीवन को कम कर सकता है

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देझी सांग, एट अल

ऑस्टियोपोरोसिस एक चयापचय रोग है जो ऑस्टियोपीनिया और हड्डी के माइक्रोस्ट्रक्चरल बिगड़ने की विशेषता है। ओस्टियोक्लास्ट प्राथमिक प्रभावकारी कोशिकाएं हैं जो हड्डी के मैट्रिक्स को नीचा दिखाती हैं और उनके असामान्य कार्य से ऑस्टियोपोरोसिस का विकास होता है। सेलुलर चयापचय के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) संचय ऑस्टियोक्लास्ट प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है, इसलिए, ऑस्टियोपोरोसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है।सिस्टांचे डेजर्टिकोलापॉलीसेकेराइड (सीडीपी) के पास हैअर्बुदरोधी, एंटी‐भड़काऊ, तथाएंटीऑक्सिडेंट गतिविधि. हालांकि, सीडीपीओन ओस्टियोक्लास्ट का प्रभाव स्पष्ट नहीं है। इस अध्ययन में, टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि सीडीपी ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और हाइड्रोक्सीपाटाइट पुनर्जीवन को रोकता है। इसके अलावा, CDP ने Ctsk, Mmp9, और Acp5 सहित ओस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को भी बाधित किया, और परमाणु कारक B (RANK) अभिव्यक्ति के रिसेप्टर एक्टिवेटर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। यंत्रवत विश्लेषणों से पता चला है कि सीडीपी एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है ताकि ऑस्टियोक्लास्ट में आरएएनसीएल-मध्यस्थता वाले आरओएस उत्पादन को कम किया जा सके और सक्रिय टी कोशिकाओं और माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे सक्रियण के परमाणु कारक को रोकता है। इन परिणामों से पता चलता है कि सीडीपी अत्यधिक ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि के कारण होने वाले ऑस्टियोपोरोसिस के उपचार के लिए एक उम्मीदवार दवा का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

कीवर्ड:हड्डी पुन: शोषण, सिस्टांचेडेजर्टिकोलापॉलीसेकेराइड, एमएपीके, ऑस्टियोक्लास्ट, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां

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1 परिचय

अस्थि निर्माण के बीच संतुलन, ऑस्टियोब्लास्ट द्वारा मध्यस्थता, और अस्थि पुनर्जीवन, अस्थिकोरक द्वारा मध्यस्थता, अस्थि चयापचय होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (मनोलागास, 2000; झू एट अल।, 2018)। जब हड्डी का पुनर्जीवन हड्डी के गठन से अधिक हो जाता है, तो ऑस्टियोपोरोसिस होता है, जो हड्डी के द्रव्यमान में कमी और हड्डी की सूक्ष्म संरचना क्षति (इकेडा, 2008) की विशेषता है। ऑस्टियोपोरोसिस बुजुर्ग व्यक्तियों और पोस्टमेनोपॉज़ल महिलाओं में एक आम बीमारी है और इसके रोगजनन को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है (कूपर एंड मेल्टन, 1992)। एस्ट्रोजन की कमी ऑस्टियोपोरोसिस (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013) का एक प्राथमिक कारण है। इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को परमाणु कारक (बी लिगैंड (आरएएनकेएल) के रिसेप्टर एक्टिवेटर द्वारा प्रेरित किया जा सकता है और ऑस्टियोक्लास्ट गठन (यिप एट अल।, 2005) से जुड़ा हुआ है, और इस प्रकार ऑस्टियोपोरोसिस के विकास में योगदान दे सकता है (मैनोलागास, 2010) ) कुछ अध्ययनों में पाया गया है कि Nrf2-एंटीऑक्सीडेंट की कमी से ROS का स्तर बढ़ जाता है और रैंक-प्रेरित ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013) को बढ़ावा मिलता है। इसलिए, ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव के दौरान आरओएस उत्पादन को कम करने का मूल्यांकन ऑस्टियोपोरोसिस के उपचार के लिए चिकित्सीय रणनीति के रूप में किया जाना चाहिए।

ऑस्टियोक्लास्ट मोनोसाइट या मैक्रोफेज हेमटोपोइएटिक वंश से प्राप्त होते हैं और एकमात्र बहुसंस्कृति कोशिकाएं हैं जो प्रदर्शन करती हैंहड्डी पुन: शोषण(टीटेलबाम, 2000)। इसलिए, ऑस्टियोक्लास्ट के गठन से संबंधित अनुसंधान का प्रभावी उपचार विकसित करने में बहुत महत्व हैहड्डीउपापचयबीमारी(लोरेंजो, 2017)। मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (M‐CSF) और RANKL, ओस्टियोब्लास्ट्स और सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा निर्मित, महत्वपूर्ण साइटोकिन्स हैं जो ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस (किम एंड किम, 2016; टीटेलबाम एंड रॉस, 2003) को नियंत्रित करते हैं। RANKL सक्रिय T कोशिकाओं (NFATc1) के परमाणु कारक की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जो ऑस्टियोक्लास्ट गठन के दौरान सक्रिय एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक है (इशिदेट अल।, 2002)। सक्रिय NFATc1 ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन जैसे टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (TRAcP) और कैथेप्सिन K (CTSK) की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है जो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन (बाल्कन एट अल।, 2009; क्रोटिएट अल।, 2008) को नियंत्रित करता है। इन परिणामों से पता चलता है कि अत्यधिक ऑस्टियोक्लास्टिक अस्थि पुनर्जीवन के कारण होने वाले ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज के लिए सीडीपी का उपयोग किया जा सकता है।

2|सामग्री और तरीके

2.1|सामग्री

CDP (शुद्धता> 98 प्रतिशत) Solarbio (बीजिंग, चीन) से खरीदा गया था और फॉस्फेट-बफर सलाइन (PBS) में 1 mM के स्टॉक एकाग्रता में तैयार किया गया था। एंटीबॉडी c‐Fos के लिए विशिष्ट हैं, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, फॉस्फोराइलेटेड (p) ‐ERK, p‐p38, p‐JNK, और ‐actin सांता से प्राप्त किए गए थे। क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सैन जोस, सीए)। V‐ATPase d2 के लिए एंटीबॉडी का उत्पादन पहले वर्णित (एच। फेंग एट अल।, 2009) के रूप में किया गया था। 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल)-5-(3-कार्बोक्सिमेथोक्सीफेनिल)-2-(4-सल्फोफेनिल)-2H-टेट्राजोलियम (एमटीएस) और ल्यूसिफरेज परख प्रणाली क्रोमेगा (सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) से प्राप्त की गई थी। . रिकॉम्बिनेंट M‐CSF को R&D सिस्टम्स (मिनियापोलिस, MN) से खरीदा गया था। पुनः संयोजक GST-rRANKL प्रोटीन को पहले वर्णित (जू एट अल।, 2000) के रूप में व्यक्त और शुद्ध किया गया था।

2.2|कोश पालन

RAW264.7 कोशिकाएं (माउस मैक्रोफेज कोशिकाएं) अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC, मानस, VA) से प्राप्त की गईं और संशोधित न्यूनतम आवश्यक माध्यम (थर्मो फिशरसाइंटिफिक, स्कोर्सबी, ऑस्ट्रेलिया) में सुसंस्कृत 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 यूजी/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्ण माध्यम)। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स (BMM) को 6-सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से अलग किया गया था, जिन्हें पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया विश्वविद्यालय (RA/3/100/1244) की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार इच्छामृत्यु दिया गया था। लंबी हड्डियों को नरम ऊतकों से मुक्त विच्छेदित किया गया था और अस्थि मज्जा को फीमर और टिबिया से निकाल दिया गया था, जिसे तब M‐CSF (50 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में एक पूर्ण माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था।

2.3|ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस परख

BMMs were plated into 96‐well culture plates at a density of 6 × 103cells per well and treated with a complete medium containing M‐CSF(50 ng/ml) and GST‐rRANKL (100 ng/ml), in the presence or absence of varying concentrations of CDP. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells(>तीन नाभिक) की पहचान ऑस्टियोक्लास्ट के रूप में की गई थी।

2.4|साइटोटोक्सिसिटी परख

बीएमएम को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 6 × 103 कोशिकाओं प्रति कुएं में डाला गया और पालन करने के लिए रात भर छोड़ दिया गया। अगले दिन, कोशिकाओं को सीडीपी की अलग-अलग सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया। एक और 48 घंटे के बाद, एमटीएस समाधान (20 μl / अच्छी तरह से) जोड़ा गया और 2 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन किया गया। 490 एनएम पर अवशोषण एक माइक्रोप्लेट रीडर (मल्टीस्कैनस्पेक्ट्रम; थर्मो लैबसिस्टम्स, चान्तिली, वीए) के साथ निर्धारित किया गया था।

2.5|इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला हो जाना

BMM को रातोंरात M‐CSF (50 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में 6 × 1 0 3 कोशिकाओं प्रति कुएं के घनत्व पर रखा गया था। कोशिकाओं को तब M-CSFand GST-rRANKL (100 एनजी / एमएल) से तब तक उत्तेजित किया गया जब तक कि परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट नहीं बन गए। ऑस्टियोक्लास्ट्स को तब 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ फिक्सिंग करने से पहले 48 घंटे के लिए सीडीपी की अलग-अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100-पीबीएस के साथ पारगम्य, और पीबीएस में 3 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ अवरुद्ध किया गया था। तैयार कोशिकाओं को एफ-एक्टिन के दाग के लिए अंधेरे में 45 मिनट के लिए रोडामाइन-संयुग्मित फैलोलाइडिन के साथ ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं को तब पीबीएस से धोया गया था, नाभिक को 4-6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) के साथ काउंटर किया गया था, और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए कवरस्लिप्स के साथ लगाया गया था।

2.6|हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन परख

ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि को मापने के लिए छह-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित प्लेटों (बीडी बायोकोट; थर्मोफिशर साइंटिफिक) पर सुसंस्कृत बीएमएम (1 × 105 सेल प्रति कुएं) को जीएसटी-आरआरएएनसीएल (100 एनजी / एमएल) और एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया था। ) जब तक परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट उत्पन्न नहीं हुए (झोउ एट अल।, 2016)। सेल पृथक्करण समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग करके कोशिकाओं को प्लेट से धीरे से अलग कर दिया गया था और समान संख्या में परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट को अलग-अलग कुओं हाइड्रॉक्सीपैटाइट-लेपित 96-वेल प्लेट्स (कॉर्निंग ओस्टियोसे, कॉर्निंग, एनवाई) पर रखा गया था। परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट को संकेतित सांद्रता में सीडीपी के साथ या बिना आरआरएएनसीएल और एम-सीएसएफ युक्त माध्यम में ऊष्मायन किया गया था। 48 घंटे के बाद, कुओं के आधे TRAcP गतिविधि के लिए immunohistochemically दाग थे, जैसा कि ऊपर वर्णित है, प्रति कुएं में बहुसंस्कृति कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए। शेष कुओं को 10 मिनट के लिए प्रक्षालित किया गया ताकि कोशिकाओं को हटाया जा सके और पुनर्जीवन क्षेत्रों की माप की अनुमति दी जा सके। मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत पुनर्जीवित क्षेत्रों की तस्वीरें खींची गईं और Ima geJ सॉफ्टवेयर (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी) का उपयोग ओस्टियोक्लास्ट्स द्वारा पुनर्जीवित हाइड्रोक्सीपाटाइट सतह के प्रतिशत क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए किया गया था।

2.7|लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर एसेज़

NFATc1 ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण की जांच करने के लिए, RAW264.7 कोशिकाओं को NFATc1-उत्तरदायी ल्यूसिफरेज रिपोर्टर निर्माण (चेंग एट अल।, 2018; वैन डेर क्रान एट अल।, 2013) के साथ सख्ती से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 48-अच्छी तरह से प्लेटों में 1.5 × 105 कोशिकाओं के घनत्व पर प्रति कुएं में सुसंस्कृत किया गया था और 1 घंटे के लिए सीडीपी के विभिन्न सांद्रता के साथ ढोंग किया गया था। प्रीट्रीटमेंट के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए GST-rRANKL (100 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया था, और निर्माता के प्रोटोकॉल (Promega) के अनुसार ल्यूसिफरेज रिपोर्टर परख प्रणाली का उपयोग करके ल्यूसिफरेज गतिविधि को मापा गया था।

2.8|मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) विश्लेषण

निर्माता के प्रोटोकॉल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के अनुसार ट्राईजोल अभिकर्मक का उपयोग करके कुल आरएनए को कोशिकाओं से अलग किया गया था। पूरक डीएनए को 1 कुरूप आरएनए टेम्पलेट और ओलिगो-डीटी प्राइमरों के साथ मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। विशिष्ट अनुक्रमों का पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन प्रवर्धन निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके किया गया था: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री, इसके बाद 40 एस के लिए 94 डिग्री के 30 चक्र, 40 एस के लिए 60 डिग्री, और 40 एस के लिए 72 डिग्री, और 5 का अंतिम विस्तार चरण 72 डिग्री पर न्यूनतम। विशिष्ट प्राइमरों पर विस्तृत जानकारी तालिका 1 में दिखाई गई है। सापेक्ष मैसेंजर आरएनए स्तरों की गणना हाउसकीपिंग जीन एचएमबीएस की अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण द्वारा की गई थी।

2.9|वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

BMM को छह-अच्छी तरह से प्लेटों में M-CSF के साथ एक पूर्ण माध्यम में सुसंस्कृत किया गया और निर्दिष्ट समय के लिए GST-rRANKL (100 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया। कोशिकाओं को रेडियोइम्यूनोप्रेजर्वेशन लिसीज़ बफर में lysed किया गया था और प्रोटीन को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल किया गया था और पॉली (विनाइलिडीन फ्लोराइड) झिल्ली (जीई हेल्थकेयर, सिल्वरवाटर, ऑस्ट्रेलिया) में स्थानांतरित किया गया था। झिल्लियों को 1 घंटे के लिए 5 प्रतिशत स्किम दूध में अवरुद्ध कर दिया गया और फिर 4 डिग्री पर रात भर हल्के झटकों के साथ विभिन्न विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। झिल्ली को धोया गया और बाद में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया। एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशीलता को तब बढ़ाया गया रसायन विज्ञान अभिकर्मक (एमर्सहम फार्माशिया बायोटेक, पिस्काटावे, एनजे) के साथ पता चला था और एक छवि-मात्रा एलएएस 4000 (जीई हेल्थकेयर) के साथ कल्पना की गई थी।

2.10|इंट्रासेल्युलर आरओएस डिटेक्शन

इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का पता 2′,7-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट सेलुलर आरओएस डिटेक्शन परख किट (एबकैम, मेलबर्न, ऑस्ट्रेलिया) का उपयोग करके लगाया गया था। बीएमएम (5 × 103 सेल प्रति कुएं) को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया और 72 घंटे के लिए RANKL (100 एनजी / एमएल), एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल), और सीडीपी के साथ इलाज किया गया। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों को 2′,7-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट का उपयोग करके मापा गया था, जो आरओएस की उपस्थिति में फ्लोरोसेंट सीएसएफ में ऑक्सीकरण करता है। कोशिकाओं को हांक के बफर में धोया गया और DCFH‐DA के 10 माइक्रोन के साथ 30 मिनट के लिए अंधेरे में ऊष्मायन किया गया। छवियों को confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।

2.11|सांख्यिकीय आंकड़े

सभी डेटा तीन प्रतियों में किए गए कम से कम तीन प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया गया हो। डेटा को माध्य ± SD के रूप में व्यक्त किया जाता है। परिणाम के बीच अंतर के महत्व को निर्धारित करने के लिए छात्र-न्यूमैन-केल्सपोस्ट हॉक परीक्षणों के बाद विचरण का एकतरफा विश्लेषण किया गया, जिसमें p < 0.05="" को="" महत्वपूर्ण="" माना="">

3|परिणाम

3.1|CDP RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्ट फ्यूजन को रोकता है

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या CDP RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्ट गठन को दबा सकता है, हमने सबसे पहले माउस BMM (लियू एट अल।, 2013; सॉन्ग एट अल।, 2016) का उपयोग करके ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस परख किया। CDP की बढ़ती सांद्रता के साथ 5 दिनों के लिए BMM का RANKL और M‐CSF के साथ इलाज किया गया। CDP ने TRAcP- धनात्मक बहुसंस्कृति कोशिकाओं की संख्या कम कर दी जब CDP की सांद्रता 5 µM या उससे अधिक हो गई (चित्र 1a,b)। सीडीपी विषाक्तता का मूल्यांकन करने और यह पुष्टि करने के लिए कि ये परिणाम कोशिका मृत्यु या संख्या का प्रतिबिंब नहीं थे, हमने एमटीएस परख की। BMM को RANKL और M‐CSF के साथ 48 घंटे के लिए CDP की अलग-अलग खुराक के साथ इलाज किया गया। 15 µMor कम (चित्र 1c) की सांद्रता पर BMM प्रसार पर CDP का कोई प्रभाव नहीं था।

ऑस्टियोक्लास्ट फ्यूजन पर सीडीपी के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए, ऑस्टियोक्लास्ट को सीडीपी की अलग-अलग खुराक के साथ या बिना RANKL और M‐CSF उपचार के साथ प्रेरित किया गया था। ओस्टियोक्लास्ट प्रति ऑस्टियोक्लास्ट (चित्रा 2 ए) में नाभिक की संख्या का आकलन करने के लिए रोडामाइन-फालोइडिन और डीएपीआई के साथ दागे गए थे। ऑस्टियोक्लास्ट संख्या और ऑस्टियोक्लास्ट प्रति नाभिक की औसत संख्या सीडीपी उपचार (5-10 µ एम; चित्रा 2बी, सी) के बाद घट गई। इसलिए, सीडीपी का खुराक पर निर्भर तरीके से RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्ट फ्यूजन पर निरोधात्मक प्रभाव था।

3.2|CDP RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टिक हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन गतिविधि को दर्शाता है

ओस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन (चित्रा 3 ए) पर सीडीपी के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक हाइड्रोक्सीपाटाइट पुनर्जीवन परख किया गया था। 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद, नियंत्रण समूहों (चित्रा 3 बी, सी) की तुलना में 5 और 10 माइक्रोन सीडीपी के साथ उपचार द्वारा हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन क्षेत्र में काफी कमी आई थी, जबकि प्रति कुएं ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या में बदलाव नहीं हुआ था। इन परिणामों से पता चलता है कि बिना किसी साइटोटोक्सिक प्रभाव के ऑस्टियोक्लास्ट गठन और ऑस्टियोक्लास्ट पुनर्जीवन गतिविधि दोनों पर सीडीपी का मजबूत निरोधात्मक प्रभाव है।

3.3|सीडीपी ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन अभिव्यक्ति को रोकता है

ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्टिक बोन रिसोर्प्शन पर सीडीपी के निरोधात्मक प्रभावों की और जांच करने के लिए, बीएमएम को सीडीपी की अलग-अलग सांद्रता के साथ 5 दिनों के लिए RANKL और M‐CSF के साथ इलाज किया गया था। फिर ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए RT-PCR का प्रदर्शन किया गया था। ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक Nfatc1 की अभिव्यक्ति, CDP द्वारा खुराक पर निर्भर तरीके से बाधित की गई थी (चित्र 4a)। इसके अलावा, CDP (5 और 10 µM) ने Mmp9, Ctsk, और Acp5 (चित्र 4bd) सहित अस्थि पुनर्जीवन-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को कम कर दिया।

3.4|CDP NFATc1 गतिविधि और डाउनस्ट्रीम प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा देता है

RANKL- प्रेरित NFATc1 गतिविधि पर CDP के प्रभाव की जांच करने के लिए, एक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख की गई। सीडीपी के साथ उपचार, 5 माइक्रोन और अधिक की सांद्रता पर, RANKL- प्रेरित NFATc1 गतिविधि (चित्रा 5 ए) को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करता है। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि सीडीपी ने 3 और 5 दिनों (चित्रा 5 बी) के लिए RANKL और M‐CSF के साथ इलाज किए गए BMM में NFATc1 और c‐Fos की प्रोटीन अभिव्यक्ति को काफी दबा दिया। इसके अलावा, ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन-संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति, जैसे V‐ATPase‐d2 और CTSK, को नियंत्रण समूहों की तुलना में CDP की उपस्थिति में डाउनग्रेड किया गया था। हालाँकि, CDP का RANK अभिव्यक्ति (चित्र 5b) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

3.5|CDP RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान ROS उत्पादन को परिमार्जन करने के लिए एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है

सीडीपी पर निर्भर ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस निषेध के अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए, बीएमएम को 72 घंटे के लिए पीबीएस या सीडीपी के साथ आरएएनसीएल (100 एनजी / एमएल) और एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था। हमने RANKL द्वारा प्रेरित इंट्रासेल्युलर ROS उत्पादन पर CDP के प्रभाव की जांच की। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर आरएएनसीएल उपचार द्वारा बढ़ाया गया था, जिसे सीडीपी (5 और 10 माइक्रोन; चित्रा 6 ए) द्वारा देखा गया था। खुराक पर निर्भर तरीके (चित्रा 6 बी, सी) में सीडीपी उपचार द्वारा आरओएस-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या और आरओएस धुंधला की तीव्रता दोनों को कम किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि बीएमएम में इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (NOS2) की अभिव्यक्ति को दबाते हुए CDP ने थिओरेडॉक्सिन (TRX1) और ग्लूटाथियोन रिडक्टेस (GSR) अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया, जिनका इलाज RANKL और ‐CSF के साथ 3 दिनों (चित्र 6d) के लिए किया गया था।

आगे यह पता लगाने के लिए कि क्या सीडीपी ने आरओएस उत्पादन को कम करके ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव को दबा दिया है, हमने कोशिकाओं में उच्च आरओएस स्थिति की नकल करने के लिए पेरोक्साइड (10 माइक्रोन) के साथ बीएमएम का इलाज किया। BMM को RANKL और M-CSF द्वारा 3 दिनों के लिए प्रेरित किया गया और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और RT-PCR के परिणामों से पता चला कि पेरोक्साइड ने NFATc1 और c-Fos अभिव्यक्ति को नियंत्रण समूहों की तुलना में बढ़ावा दिया। चित्र 5 में परिणामों के अनुरूप, NFATc1 और c‐Fos की अभिव्यक्ति को CDP द्वारा दबा दिया गया था जबकि पेरोक्साइड ने CDP (चित्र 6e, f) के निरोधात्मक प्रभाव को बचाया। इन आंकड़ों ने संकेत दिया कि CDP ने ROS उत्पादन को कम करके NFATc1 और c‐Fos की अभिव्यक्ति को दबा दिया।

3.6|सीडीपी RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान MAPK मार्गों को दबा देता है

इसके बाद, हमने RANKL की मध्यस्थता वाले TRAF6 अभिव्यक्ति और MAPK पाथवे सक्रियण पर CDP उपचार के प्रभाव की जांच की। 2 घंटे के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में ऊष्मायन के बाद, BMM को RANKL के साथ, CDP के साथ या बिना 60 मिनट के लिए प्रेरित किया गया। सीडीपी (10 माइक्रोन) के साथ उत्तेजना का TRAF6 अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और 10 और 20 मिनट (चित्रा 7) पर जेएनके 2 और ईआरके 1/2 के फॉस्फोराइलेशन को क्षीण कर दिया। इसके अतिरिक्त, p38 फॉस्फोराइलेशन को नियंत्रण समूहों (चित्र 7) की तुलना में 60 मिनट के सीडीपी उपचार द्वारा काफी बाधित किया गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सीडीपी ऑस्टियोक्लास्ट गठन और गतिविधि पर इसके निरोधात्मक प्रभाव के अनुरूप, आरएएनसीएल-प्रेरित एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग को दबा देता है।

4|बहस

"रेगिस्तान जिनसेंग" के रूप में जाना जाने वाला सिस्टांचे ने हाल ही में प्रतिरक्षा को संशोधित करने और उम्र बढ़ने और ऑक्सीडेटिव तनाव (जिया एट अल।, 2012; स्नितनिकोवाएट अल।, 2012) के दौरान सुरक्षात्मक रूप से कार्य करने की क्षमता के लिए बहुत ध्यान आकर्षित किया है। फेनिलप्रोपेनाइड-प्रतिस्थापित डिग्लाइकोसाइड्स, सिस्टैंच के प्रमुख सक्रिय घटक, मैक्रोफेज (आह, चाए, चिन, और किम, 2017) में गतिविधि को बाधित करने के लिए दिखाए गए हैं। इसके अलावा, इस्किमिया के बाद रीपरफ्यूज्ड मायोकार्डियम में सिस्टैन्च के अर्क ने ऑक्सीडेटिव तनाव को कम किया और कार्डियोप्रोटेक्शन (यू, ली, और काओ, 2016) के लिए अग्रणी एपोप्टोटिक मार्गों के निषेध में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। Cistanche के एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में, CDP में विभिन्न प्रकार के औषधीय कार्य हैं। हमारे वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि CDP ने RANKL- सक्रिय ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और सक्रियण को ROS उत्पादन के साथ-साथ NFAT और MAPK सक्रियण को भी दबा दिया।

एसिड फॉस्फेट के रूप में, TRAcP विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मौजूद होता है और ऑस्टियोक्लास्ट और वायुकोशीय मैक्रोफेज (स्निप्स, लैम, डोड, ग्रे और कोहेन, 1986) में प्रचुर मात्रा में होता है। TRAcP ऑस्टियोक्लास्ट का एक विशिष्ट एंजाइम है और इसकी अभिव्यक्ति ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन से निकटता से संबंधित है, जिसे ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि और हड्डी पुनर्जीवन (मिंकिन, 1982) के संकेतक के रूप में माना जाता है। हमारे अध्ययन में, CDP ने TRAcP पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को बाधित किया, यह दर्शाता है कि RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को CDP द्वारा अवरुद्ध किया गया था। ऑस्टियोक्लास्ट द्वारा हड्डी के मैट्रिक्स का क्षरण कैथेप्सिन के (सीटीएसके) और सांसदों (ग्रुबर, 2015) पर निर्भर करता है। यहाँ, CDP ने Mmp9, Ctsk, और Acp5 जैसे ऑस्टियोक्लास्ट कार्यात्मक जीनों की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया।

ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन और कार्य कई सिग्नलिंग मार्ग (बॉयल, सिमोनेट, और लेसी, 2003) द्वारा नियंत्रित होते हैं। RANK के लिए बाध्य होने के बाद, RANKL NFATc1 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए एडेप्टर प्रोटीन TRAF6 की भर्ती करता है, जो ऑस्टियोक्लास्ट गठन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक है, जो TRAcP और CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al।) सहित ऑस्टियोक्लास्ट-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है। 2002)। इस अध्ययन में, हमने पाया कि सीडीपी का ऑस्टियोक्लास्ट में RANK और TRAF6 अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। हालाँकि, CDP ने BMM के ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस के दौरान RANKL- प्रेरित NFATc1 सक्रियण को रोक दिया। इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया था कि इलेक्ट्रॉनों को वितरित करने की प्रक्रिया में माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा निर्मित आरओएस, ओस्टियोक्लास्ट के प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है और हड्डी मैट्रिक्स गिरावट को नियंत्रित करता है (हा एट अल।, 2004)। एक हालिया अध्ययन में पाया गया कि RANKL ने Bach1 परमाणु आयात को प्रेरित किया और Nrf2 की मध्यस्थता वाले एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम उत्पादन को कम किया, जिससे चूहों में इंट्रासेल्युलर आरओएस अभिव्यक्ति और ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस में वृद्धि हुई (कंजाकी एट अल।, 2017)। इसके अलावा, होमोसिस्टीन द्वारा बढ़ी हुई इंट्रासेल्युलर आरओएस पीढ़ी ने ऑस्टियोक्लास्ट गठन और गतिविधि को बढ़ाया (कोह एट अल।, 2006)। हमारे अध्ययन में पाया गया कि CDP ने NOS2 अभिव्यक्ति को बाधित करके और TRX1 और ग्लूटाथियोन रिडक्टेस जैसे एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देकर ओस्टियोक्लास्ट में ROS संचय को कम किया। जब हमने इंट्रासेल्युलर आरओएस संचय को बढ़ाने के लिए पेरोक्साइड के साथ बीएमएम का इलाज किया, तो आरओएस को बढ़ाने वाले परिणाम एनएफएटी 1 अभिव्यक्ति में सुधार कर सकते हैं, जिससे पता चला कि आरओएस एनएफएटी 1 के अपस्ट्रीम था। हमने यह भी पाया कि पेरोक्साइड ने सीडीपीओएन एनएफएटी 1 अभिव्यक्ति के निरोधात्मक प्रभाव को बचाया। इसलिए, हमारा डेटा बताता है कि CDP NFATc1 अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए ROS संचय को दबाता है, फिर ऑस्टियोक्लास्ट गठन और कार्य को दबाता है।

ईआरके, जेएनके, और पी38 एमएपीके परिवार से संबंधित हैं, जो ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव (सेगर एंड क्रेब्स, 1995) के नियमन में भी शामिल है। आरएएनसीएल ईआरके, जेएनके, और पी38 (मिजुकामी एट अल) के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाकर एमएपीके मार्ग को सक्रिय करता है। ।, 2002)। हमने प्रदर्शित किया कि CDP ने MAPK मार्ग में प्रमुख प्रोटीनों के RANKL की मध्यस्थता वाले फॉस्फोराइलेशन को दबा दिया, जिससे ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति पर CDPon के निरोधात्मक प्रभाव में योगदान हुआ। हमारे ज्ञान के लिए, यह पहला अध्ययन है जो आरओएस उत्पादन, एनएफएटी, और एमएपीके सक्रियण पर सीडीपी के निरोधात्मक प्रभावों को दर्शाता है, इन विट्रो में सीडीपी की कार्रवाई के उपन्यास तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है।

सारांश में, हमने दिखाया कि सीडीपी ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन और सीटीस्क, एमएमपी 9 और एसीपी 5 सहित ओस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। CDP RANKL की मध्यस्थता वाले ROS उत्पादन, साथ ही NFAT और MAPK सक्रियण (चित्र 8) को दबाने में सक्षम था। सामूहिक रूप से, हमारे परिणाम बताते हैं कि सीडीपी आरओएस ओवरप्रोडक्शन के साथ ऑस्टियोक्लास्ट से संबंधित स्थितियों के उपचार के लिए एक उम्मीदवार दवा का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

आभार

इस अध्ययन को चीन के नेचर साइंस फाउंडेशन (81572164), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख प्रौद्योगिकी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017वाईएफसी1103300), गुआंग्शी प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2016जीएक्सएनएसएफएए380295), और गुआंग्शी प्रांत के विश्वविद्यालय विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। केवाई2015वाईबी054)। इसे गुआंग्शी साइंटिफिक रिसर्च एंड टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्लान प्रोजेक्ट (GKG13349003, 1598013-15), वेस्टर्न ऑस्ट्रेलिया मेडिकल एंड हेल्थ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर फंड, आर्थराइटिस ऑस्ट्रेलिया फाउंडेशन, द यूनिवर्सिटी ऑफ वेस्टर्न ऑस्ट्रेलिया (UWA) रिसर्च कोलैबोरेशन अवार्ड्स, और ऑस्ट्रेलियाई स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC, संख्या 1107828 और 1027932)।

हितों का टकराव

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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