सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड मेलानोसाइट्स में मेलानोजेनेसिस को प्रेरित करता है, ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करता है और सफेदी को बढ़ावा देता है

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यिबो हू1|जिंहुआ हुआंग1|Yixiao Li2|लिंग जियांग1|युजी औयंग1|लुन यांग1|जिओजियाओ झाओ1|लिहुआ हुआंग3|हांग जियांग3|जिंग चेन1 किंघई ज़ेंग1

सार

रंजकता विकारों के मुख्य भाग के रूप में, त्वचा के अपच संबंधी रोग जैसे कि विटिलिगो और एक्रोमिक नेवस बहुत आम हैं और अब अधिक ध्यान आकर्षित करते हैं। अपचयन के रोगजनन में मेलेनोसाइट शिथिलता और हानि शामिल है, जो संभवतः आनुवंशिकता, स्वप्रतिरक्षा, औरऑक्सीडेटिव तनावs. उनमें से, ऑक्सीडेटिव तनाव एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, कुछ नैदानिक ​​उपचार ऑक्सीडेटिव तनाव से निपट सकते हैं। जैसा कि सूचित किया गया,सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड(सीडीपी) एक प्रभावी एंटीऑक्सीडेंट है; उसके आधार पर, हमने मेलानोसाइट्स में इसकी भूमिका का मूल्यांकन किया और तंत्र का और खुलासा किया। इस अध्ययन में, हमने पाया कि सीडीपी बढ़ावा दे सकता हैमेलानोजेनेसिसमानव एपिडर्मल मेलानोसाइट्स (HEMs) और माउस मेलेनोमा B16F10 कोशिकाओं में, इसने zebrafish में रंजकता को भी प्रेरित किया। आगे,सीडीपीमाइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनसे (MAPK) सिग्नल पाथवे को सक्रिय कर सकता है, फिर माइक्रोफथाल्मिया-जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF) और डाउनस्ट्रीम जीन TYR, TRP1, TRP2 और RAB27A की अभिव्यक्ति को अप-विनियमित कर सकता है। अन्यथा, हमने पाया कि सीडीपी मेलानोसाइट्स में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी और एपोप्टोसिस को शामिल कर सकता है। आगे के सबूतों से पता चला कि सीडीपी एनआरएफ2/एचओ-1 एंटीऑक्सीडेंट मार्ग को बढ़ा सकता है और इंट्रासेल्युलर आरओएस को परिमार्जन कर सकता है। संक्षेप में, सीडीपी प्रचार कर सकता हैमेलानोजेनेसिसऔर मेलानोसाइट्स को रोकता हैऑक्सीडेटिवतनावचोट, यह सुझाव देते हुए कि सीडीपी मेलानोसाइट्स की सामान्य स्थिति को बनाए रखने में मदद करता है। इस प्रकार,सीडीपीअपच संबंधी रोगों के उपचार के लिए एक नई दवा हो सकती है।

कीवर्ड

सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड, डिपिग्मेंटेशन डिजीज, मेलानोसाइट, मेलानोजेनेसिस, NRF2, ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस

ताज़ासिस्टांचे

1|परिचय

त्वचा अपचयन रोग, जैसे कि विटिलिगो और अक्रोमिक नेवस, को पैची या व्यापक त्वचा अपचयन की विशेषता होती है। हालांकि त्वचा के घाव शायद ही कभी गंभीर शारीरिक चोट का कारण बनते हैं, वे रोगी की उपस्थिति को प्रभावित करते हैं और एक गंभीर मनोवैज्ञानिक बोझ, यहां तक ​​कि मानसिक स्वास्थ्य विकार भी पैदा करते हैं। अपचयन में प्रमुख पैथोलॉजिकल परिवर्तनों में मेलेनोसाइट डिसफंक्शन और हानि शामिल है, जो मेलेनिन संश्लेषण और परिवहन को बहुत प्रभावित करता है, जिससे त्वचा में अपर्याप्त मेलेनिन संचय होता है।

अपचयन में शामिल तंत्र वर्तमान में अज्ञात हैं, लेकिन अध्ययनों ने कुछ संबंधित कारकों की पहचान की है। एक ओर, मेलानोसाइट फ़ंक्शन आंशिक रूप से माइक्रोफ़थाल्मिया-संबंधित प्रतिलेखन कारक (MITF) पर निर्भर करता है, जो कि अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है।मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन जिनमें टायरोसिनेस (TYR), टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 (TRP1), tyrosinase-संबंधित प्रोटीन 2 (TRP2), रास-संबंधित प्रोटीन Rab-27a (RAB27A) और फ़ासिन एक्टिन-बंडलिंग प्रोटीन 1 (FSCN1) शामिल हैं। .4 इन जीनों में, टीवाईआर एल-डोपा को डोपाक्विनोन में ऑक्सीडाइज़ करके मेलेनिन संश्लेषण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दूसरी ओर, अध्ययन कई कारकों के संयोजन का सुझाव देते हैं जो आनुवंशिकता, पर्यावरण, ऑटोइम्यूनिटी सहित मेलानोसाइट्स के नुकसान के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। , तथाऑक्सीडेटिव तनाव.6-9 इन कारकों में, ऑक्सीडेटिव तनाव को सबसे महत्वपूर्ण माना जाता है।

के तंत्रऑक्सीडेटिव तनावअपचयन के कारण आंशिक रूप से प्रकट हुए हैं; प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) अधिभार एक प्रमुख कारक है। 10 डीपिग्मेंटेशन में आरओएस अधिभार में प्रो-और एंटीऑक्सिडेंट सिस्टम के बीच एक असंतुलन शामिल है। 11 इस असंतुलन में भाग लेने वाले तत्वों में से एक परमाणु कारक एरिथ्रोइड है 2-संबंधित फ़ैक्टर 2/एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया तत्व (NRF2/ARE) एंटी-ऑक्सीडेंट पाथवे इम्पेयरमेंट। 12 पाथवे में NRF2 और हीम ऑक्सीजनेज़ जैसे एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम होते हैं -1 (HMOX-1, HO-1) , कैटेलेज (CAT), ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज 1 (GPX1), और NAD (P) H क्विनोन डिहाइड्रोजनेज 1 (NQO1)। 13 जब मेलानोसाइट्स अत्यधिक ROS के संपर्क में आते हैं, तो NRF2 नाभिक में स्थानांतरित हो सकता है और संरक्षित ARE से जुड़ सकता है, फिर बढ़ावा देता है एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति। हालांकि, कुछ अपचयन रोगों में, जैसे कि विटिलिगो, एक बिगड़ा हुआ NRF2/ARE एंटीऑक्सीडेंट मार्ग प्रभावी रूप से ROS.14 को परिमार्जन नहीं कर सकता है।

आमतौर पर अपचयन में उपयोग की जाने वाली नैदानिक ​​​​उपचारों में सामयिक या प्रणालीगत कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स, कैल्सीनुरिन अवरोधक, संकीर्ण-बैंड पराबैंगनी बी (एनबीयूवीबी; 311 एनएम), 308- एनएम एक्सीमर लाइट, ऑटोलॉगस एपिडर्मल प्रत्यारोपण और पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) चिकित्सा शामिल हैं। कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स और कैल्सीनुरिन इनहिबिटर असामान्य प्रतिरक्षा सक्रियण को कम कर सकते हैं, 15 जबकि फोटोथेरेपी का उपयोग प्रथम-पंक्ति उपचार के रूप में किया जाता है; विशेष रूप से, NBUVB मेलानोसाइट प्रसार और टी-सेल विनाश को उत्तेजित करता है, 16 जबकि 308- एनएम एक्सीमर लाइट टी कोशिकाओं एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है। इसके अलावा, टीसीएम उपचारों के प्रभाव को बढ़ावा देने से संबंधित हैंमेलानोजेनेसिस.18 कुछ हद तक, ये विधियां अपच में सुधार करने में सहायक हैं, लेकिन रोग की प्रगति को नियंत्रित करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। विशेष रूप से के लिए नए उपचार विकसित करना आवश्यक हैऑक्सीडेटिव तनाव, जो पहले उपेक्षित था।

सिस्टैंच डेजर्टिकोला को 'रेगिस्तान जिनसेंग' के रूप में जाना जाता है। 19 इसके घटक इथेनॉल से प्रेरित जिगर की चोट और आंतों में सूजन हाइपरप्लासिया में उपयोगी होते हैं; यह एक विरोधी थकान, विरोधी भड़काऊ, और एंटी-ट्यूमर अभिकर्मक के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। 20-22 हाल ही में, गुओ एट अल ने बताया किसिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड(सीडीपी), इसके मुख्य घटकों में से एक, एंटीऑक्सीडेंट और हेपेटोप्रोटेक्टिव गतिविधि 20; अन्य दो अध्ययनों ने कोशिकाओं को एक से बचाने में इसकी भूमिका की पहचान कीऑक्सीडेटिव तनावऑक्सीजन-ग्लूकोज की कमी / पुनर्संयोजन और ऑस्टियोपोरोसिस की स्थिति में चोट। 23,24 हालांकि, अपचयन रोगों में सीडीपी की भूमिका को स्पष्ट नहीं किया गया है। यहां, हमने यह पुष्टि करने का लक्ष्य रखा है कि क्यासीडीपीप्रभावित कर सकता हैमेलानोजेनेसिसऔर मेलानोसाइट्स को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाते हैं।

2|सामग्री और विधियां

2.1|रसायन और एंटीबॉडी

सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड(CDP) और l-dopa को Yuanye Biotec (शुद्धता 98 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर; शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2), डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO), NaOH, ट्राइटन X-100, 4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl-2,5-डिपेनहिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड ( MTT), और एक एनेक्सिन V-FITC एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट सिग्मा-एल्ड्रिच से खरीदी गई थी। 4 प्रतिशत न्यूट्रल पैराफॉर्मलडिहाइड Biosharp (हेफ़ेई, चीन) से खरीदा गया था; और एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग किट (एलेक्सा फ्लोर 488) और 2, 7-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन-डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) बायोटाइम बायोटेक (शंघाई, चीन) से खरीदे गए थे। एक फोंटाना-मैसन स्टेन किट और एक न्यूक्लियोप्लाज्मिक प्रोटीन एक्सट्रैक्शन किट स्लोअरबियो (बीजिंग, चीन) से खरीदी गई थी। ह्यूमन मेलानोसाइट ग्रोथ सप्लीमेंट (HMGS), Dulbecco का संशोधित ईगल मीडियम (DMEM), और मीडियम 254 गिब्को से खरीदा गया था। भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) BI (किबुत्ज़ बीट-हैमेक, इज़राइल) से खरीदा गया था। -actin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 और HO -1 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे। MITF के लिए एंटीबॉडी सेंट जॉन्स लेबोरेटरी से खरीदा गया था, p-MITF के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी एफ़िनिटी बायोसाइंसेस से खरीदा गया था, GAPDH के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी बायोवर्ल्ड से खरीदा गया था, और TRP1 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी EMD मिलिपोर से खरीदा गया था।

2.2|सेल कल्चर और उपचार

माउस मेलेनोमा B16F1 0 कोशिकाओं को मध्यम DMEM में 10 प्रतिशत FBS और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक मिश्रण के साथ सुसंस्कृत किया गया था। मानव एपिडर्मल मेलानोसाइट्स (एचईएम) को मानव चमड़ी से अलग किया गया था (हमारे पिछले अध्ययन को देखें) और एचएमजीएस, 5 प्रतिशत एफबीएस, और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक मिश्रण के साथ पूरक मध्यम 254 में सुसंस्कृत किया गया था। सभी कोशिकाओं को 5 प्रतिशत CO2 के साथ 37 डिग्री पर एक गीले इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया गया था। सीडीपी को डीएमएसओ में भंग कर दिया गया था और उपयोग से पहले माध्यम से पतला कर दिया गया था, डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.1 प्रतिशत से कम थी। H2O2 उपयोग करने से पहले माध्यम से पतला था।

2.3|Zebrafish संवर्धन और उपचार

zebrafish भ्रूण और माध्यम EzeRinka Biotech से खरीदे गए थे। प्रायोगिक प्रोटोकॉल को सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था। जेब्राफिश को प्रकाश से 37 डिग्री दूर 12-वेल प्लेट्स में सुसंस्कृत किया गया और सीडीपी के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रतिदिन जेब्राफिश के सिर और पूंछ में मेलेनिन को देखने और रिकॉर्ड करने के लिए किया गया था। अवलोकन के बाद, हमने माध्यम बदल दिया और फिर से जोड़ासीडीपी. जेब्राफिश की पूंछ में मेलेनिन घनत्व को इमेज जे के साथ मापा गया था, और मूल्यों को एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी) के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

2.4|सेल व्यवहार्यता

सेल व्यवहार्यता को एमटीटी परख का उपयोग करके मापा गया था। की साइटोटोक्सिसिटी की जांच करने के लिएसीडीपी, HEMs और B16F1 0 कोशिकाओं को 2 × 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्यारोपित किया गया और तब तक सुसंस्कृत किया गया जब तक कि कोशिकाओं को प्लेटों से जोड़ा नहीं गया। कोशिकाओं को तब अलग-अलग सांद्रता (0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 और 320 ug/mL) के साथ इलाज किया गया था।सीडीपी24, 48 या 72 घंटे के लिए। माप से पहले, प्रत्येक कुएं में 20 μL MTT जोड़ा गया था और प्लेटों को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। उसके बाद, हमने सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया और फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को भंग करने के लिए प्रत्येक कुएं में 160 μL DMSO जोड़ा। 490 एनएम पर अवशोषण मान एक मल्टीमोड प्लेट रीडर (पर्किनएल्मर) द्वारा मापा गया था। H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी स्थिति में CDP के प्रभाव की जांच करने के लिए, HEMs, और B16F10 कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 4 × 103 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर चढ़ाया गया था। कोशिकाओं को विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया थासीडीपी({0}}, 20, 40, या 80 ug/mL) 24 घंटे के लिए, जिस बिंदु पर हमने H2O2 (अंतिम सांद्रता: HEMs के लिए 500 μm और B16F10 कोशिकाओं के लिए 1.0 मिमी) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा और एक और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया। हमने सीडीपी-उपचारित और नकारात्मक नियंत्रण (एनसी) समूह स्थापित किए। पता लगाने के चरण पहले वर्णित के समान थे।

2.5|मेलेनिन सामग्री का NaOH परख

कोशिकाओं को 100-मिमी पेट्री डिश में सुसंस्कृत किया गया और इलाज किया गयासीडीपी48 घंटों के लिए अलग-अलग सांद्रता (0, 20, 40, और 80 ug/mL) पर, फिर ट्रिप्सिन के साथ पचता है और 1.5-mL ट्यूबों में एकत्र किया जाता है। हमने कोशिकाओं को दो बार दोहरे आसुत जल से धोया, उन्हें 1 एमएल इथेनॉल में फिर से निलंबित कर दिया और मेलेनिन को छोड़ने के लिए उन्हें भंवर में डाल दिया। फिर हमने मिश्रण को (200 ग्राम, 5 मिनट) सेंट्रीफ्यूज किया और सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया, प्रत्येक ट्यूब में 10 प्रतिशत डीएमएसओ (1 मिमी NaOH समाधान के साथ पतला) का 1 एमएल जोड़ा और तलछट को निलंबित कर दिया। हमने मेलेनिन को भंग करने के लिए 1 घंटे के लिए 80 डिग्री पर पानी के स्नान में निलंबन को ऊष्मायन किया। अंत में, हमने तरल के 200 μL को एक 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित कर दिया और 470 एनएम पर अवशोषण मान को मापने के लिए एक मल्टीमोड प्लेट रीडर का उपयोग किया।

सिस्टांचेसमीक्षाएँ: रोकता हैमेलेनिनउत्पादन।

2.6|टायरोसिनेस गतिविधि माप

कोशिकाओं को 100-मिमी पेट्री डिश में सुसंस्कृत किया गया और इलाज किया गयासीडीपीमाप से पहले, ट्रिप्सिन के साथ पचता है और 1.5-एमएल ट्यूबों में एकत्र किया जाता है, और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोया जाता है। हमने प्रत्येक नमूने से 106 कोशिकाओं को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित किया और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया, फिर 1 मिली 0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 सेल पेलेट में जोड़ा और संग्रहीत किया 15 मिनट के लिए 0 डिग्री पर मिश्रण। इसके बाद, हमने सब्सट्रेट के रूप में 1 एमएल एल-डोपा (1 मिमी, 0.1 एम फॉस्फेट बफर के साथ पतला) जोड़ा और समाधान मिलाया, मिश्रण के 2 0 0 μL को एक { {16}}वेल प्लेट तुरंत, और 10 मिनट (ए10) पर माप को दोहराते हुए, मल्टीमोड प्लेट रीडर का उपयोग करके 475 एनएम पर अवशोषक मूल्य (ए0) को मापा। टायरोसिनेस गतिविधि की गणना (ए 10- ए 0) / 105 द्वारा की गई थी, और परिणाम प्रतिशत (प्रतिशत) बनाम नकारात्मक नियंत्रण के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

2.7|फोंटाना-मेसन मेलेनिन धुंधला हो जाना

कोशिकाओं को 50 प्रतिशत घनत्व प्राप्त करने तक 12-वेल प्लेट्स में सुसंस्कृत किया गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 प्रतिशत तटस्थ पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया और आसुत जल से धोया गया। फिर हमने प्रत्येक कुएं में 500 μL फोंटाना अमोनिया-चांदी का घोल मिलाया और मेलेनिन को डाई करने के लिए प्लेटों को 16 घंटे के लिए अंधेरे में संग्रहीत किया। इसके बाद, हमने कोशिकाओं को आसुत जल से पांच बार (प्रत्येक बार 1 मिनट) धोया और उन्हें 500 μL हाइपोसल्फाइट में 5 मिनट के लिए भिगो दिया; अंत में, हमने हाइपोसल्फाइट को हटा दिया और 1 मिनट के लिए आसुत जल से कोशिकाओं को फिर से धो दिया। फिर हमने मेलेनिन को देखने और रिकॉर्ड करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया।

2.8|आरएनए निष्कर्षण और मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट्स में सुसंस्कृत किया गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया और 1.5-एमएल ट्यूबों में एकत्र किया गया। हमने पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोया, फिर 1 एमएल लिसिस बफर में जोड़ा, मिश्रण को भंवर में डाल दिया, और कोशिकाओं को पूरी तरह से लाइस करने के लिए 5 मिनट के लिए ट्यूबों को बर्फ पर रखा। RNA को कुल RNA किट (ओमेगा बायो-टेक) और रिवर्स-ट्रांसकोड (RT) का उपयोग करके ReverTra Ace qPCR RT मास्टर मिक्स (TOYOBO) का उपयोग करके निकाला गया था। KODSYBR qPCR मिक्स (TOYOBO) का उपयोग करके मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) प्रति-गठन किया गया था। RT मिश्रण की प्रतिक्रिया मात्रा 20 μL थी, जबकि PCR मिश्रण की प्रतिक्रिया मात्रा 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, प्राइमर F 1 μL, प्राइमर R 1 μL, DEPC H2O को 20 μL में जोड़ें। ) प्रयोग प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे। प्राइमरों के अनुक्रम तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं।

2.9|प्रोटीन निष्कर्षण और पश्चिमी सोख्ता/इम्युनोफ्लोरेसेंस

कोशिकाओं को 100-मिमी पेट्री डिश में सुसंस्कृत किया गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया और 1.5-एमएल ट्यूबों में एकत्र किया गया। हमने पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोया, फिर आरआईपीए लिसीस बफर (थर्मो फिशर) के 500 μL में 1 मिमी फेनिलमेथाइलसल्फोनील फ्लोराइड (थर्मो फिशर) और 1: 100 पतला फॉस्फेटस अवरोधक कॉकटेल (रोच) के साथ पूरक। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार न्यूक्लियोप्लाज्मिक प्रोटीन एक्सट्रैक्शन किट का उपयोग करके परमाणु और साइटोप्लाज्म प्रोटीन को निकाला गया था। हमने ट्यूबों को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा और कोशिकाओं को पूरी तरह से नष्ट करने के लिए हर 5 मिनट में उन्हें भंवर में डाल दिया। हमने कोशिकाओं (200 ग्राम, 4 डिग्री, 15 मिनट) को सेंट्रीफ्यूज किया, सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया, और बीसीए प्रोटीन परख किट (कीजेन बायोटेक) का उपयोग करके कुल प्रोटीन की एकाग्रता को मापा। हमने प्रोटीन को 10 मिनट के लिए 100 डिग्री पर 5× लोडिंग बफर (बायोटाइम बायोटेक, चीन) के साथ उबाला, फिर उन्हें −80 डिग्री पर संग्रहीत किया। Polyacrylamide gel वैद्युतकणसंचलन (PAGE) विधि का उपयोग पश्चिमी सोख्ता में किया गया था, और प्रत्येक समूह के 20 कुरूप प्रोटीन को अलग किया गया था और एक पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली में स्थानांतरित किया गया था। प्रतिजन अवरोधन के बाद, हमने झिल्ली को 1:100 पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में 16 घंटे के लिए 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया, फिर झिल्ली को PBST से धोया और इसे 1:10 000 पतला फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया। . ओडिसी CLx इमेजिंग सिस्टम (LI-COR) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस को प्राथमिक एंटीबॉडी के 1:100 कमजोर पड़ने के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग किट (एलेक्सा फ्लोर 488) का उपयोग करके किया गया था।

सिस्टैंच रेडिट

2.10|सेल एपोप्टोसिस माप

कोशिकाओं को {{0}} मिमी पेट्री डिश में सुसंस्कृत किया गया था और विभिन्न सांद्रता (0, 20, 40, और 80 कुरूप / एमएल) के साथ इलाज किया गया था।सीडीपी24 घंटे के लिए, और H2O2 को जोड़ा गया (अंतिम सांद्रता: 5 0 HEMs के लिए 0 माइक्रोन, B16F10 कोशिकाओं के लिए 1.0 मिमी) प्रत्येक कुएं में और अन्य 24 घंटों के लिए इनक्यूबेट किया गया। हमने सीडीपी-उपचारित और एनसी समूह भी स्थापित किए। उपचार के बाद, हमने EDTA मुक्त ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को पचा लिया और उन्हें ट्यूबों में एकत्र किया, फिर कोशिकाओं को दो बार पीबीएस से धोया और उन्हें पीबीएस के 100 μL में फिर से निलंबित कर दिया। कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के अनुसार एनेक्सिन वी-एफआईटीसी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट के साथ दाग दिया गया था और फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम) द्वारा पता लगाया गया था। फ्लोजो सॉफ्टवेयर का उपयोग एपोप्टोसिस दर का विश्लेषण करने के लिए किया गया था।

2.11|इंट्रासेल्युलर आरओएस माप

कोशिकाओं को {{0}}अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था और विभिन्न सांद्रता (0, 20, 40, और 80 कुरूप/एमएल) के साथ इलाज किया गया था।सीडीपी24 घंटे के लिए, जिसमें हमने प्रत्येक कुएं में H2O2 (अंतिम सांद्रता: 5 0 0 माइक्रोन, B16F10 कोशिकाओं के लिए 1.0 मिमी) जोड़ा, उन्हें 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया और सीडीपी-उपचारित और एनसी समूह स्थापित किए। उपचार के बाद, हमने सभी माध्यम और एफबीएस को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोया, फिर डीसीएफएच-डीए जांच को मध्यम के साथ 1:1000 तक पतला किया और इसे प्रत्येक कुएं में जोड़ा। हमने कोशिकाओं को 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया और उन्हें सीरम-मुक्त माध्यम से तीन बार धोया। हमने एक का इस्तेमाल कियाप्रतिदीप्ति का निरीक्षण और रिकॉर्ड करने के लिए उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, फिर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए ImageJ का उपयोग किया।

2.12|सांख्यिकी और विश्लेषण

इस कार्य में डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया गया है, और सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 7.0) या एसपीएसएस (संस्करण 22.0), और छात्र के उपयोग से किया गया था। कई समूह तुलनाओं के लिए टी-टेस्ट या एकतरफा विश्लेषण (एनोवा) का उपयोग किया गया था। WB प्रोटीन बैंड के ग्रे वैल्यू को GAPDH या -actin के साथ मानकीकृत किया गया था। P <.05 का="" मान="" महत्वपूर्ण="" माना="" गया।="" सभी="" प्रयोग="" को="" कम="" से="" कम="" तीन="" बार="" दोहराया="" गया="">

3|परिणाम

3.1|HEMs और B16F10 कोशिकाओं में CDP प्रेरित मेलानोजेनेसिस

शुरू करने से पहले, हमने HEMs और माउस मेलेनोमा B16F10 कोशिकाओं पर CDP की संभावित साइटोटोक्सिसिटी की जांच के लिए MTT परख का उपयोग किया। कोशिकाओं का इलाज किया गया थासीडीपी24, 48 या 72 घंटों के लिए अलग-अलग सांद्रता में। HEM व्यवहार्यता परीक्षण ने प्रदर्शित किया कि जब सांद्रता 320 ug/mL से कम थी, तो CDP का सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं था; हालांकि, व्यवहार्यता में काफी कमी आई क्योंकि एकाग्रता 24, 48, और 72 घंटे (पी <.05; चित्रा="" 1="" ए)="" पर="" 320="" कुरूप/एमएल="" तक="" पहुंच="" गई।="" b16f10="" कोशिकाओं="" की="" व्यवहार्यता="" भी="" 48="" और="" 72="" घंटों="" में="" घट="" गई="">सीडीपी320 ug/mL (P <.01) तक="" पहुंच="" गया,="" लेकिन="" कम="" सांद्रता="" में="" कोई="" परिवर्तन="" नहीं="" देखा="" गया="" (चित्र="" 1b)।="" हमने="" तब="" प्रारंभिक="" रूप="" से="" सीडीपी="" की="" भूमिका="" का="" पता="" लगाया="">मेलानोजेनेसिसऔर एचईएम में -मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-एमएसएच; सांद्रता: 2 0, 1 0 0, और 400 एनएम) और डीएमएसओ (0.1 प्रतिशत) के प्रभावों की तुलना की। मेलेनिन धुंधला, टायरोसिनेस गतिविधि, और मेलेनिन सामग्री परख के परिणामों ने सुझाव दिया कि सीडीपी मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए -एमएसएच के साथ तुलनीय था, जबकि 0.1 प्रतिशत डीएमएसओ उपचार से कोई फर्क नहीं पड़ा (चित्रा एस 1)।

हमने उसी के अनुसार अपनी खोज को और परिष्कृत किया। एचईएम के साथ इलाज किया गयासीडीपी48 घंटों के लिए अलग-अलग सांद्रता (20, 40, और 80 ug/mL) पर; मेलेनिन धुंधला, मेलेनिन सामग्री, और टायरोसिनेस गतिविधि परख आयोजित किए गए थे, और सभी ने सीडीपी उपचार के बाद एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई जो कि 80 कुरूप/एमएल समूह (पी <.05, चित्रा="" 2ए-सी)="" में="" चरम="" पर="" थी।="" हमने="" तब="" mrna="" और="" प्रोटीन="" के="" स्तर="" को="">मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A, और FSCN1)। सीडीपी ने एचईएम (पी <.05; चित्रा="" एस2ए)="" में="" उन="" जीनों="" के="" एमआरएनए="" स्तर="" में="" काफी="" वृद्धि="" की।="" इसके="" अलावा,="" mitf,="" tyr,="" trp1="" और="" rab27a="" प्रोटीन="" के="" स्तर="" में="" वृद्धि="" हुई,="" जैसा="" कि="" कुल="" mitf="" (p=""><.05) में="" फॉस्फोराइलेटेड="" mitf="" का="" अनुपात="" था,="" जबकि="" trp2="" और="" fscn1="" ने="" कोई="" अंतर="" नहीं="" दिखाया="" (चित्र="" 2d,="" e)।="" परिणामों="" ने="" संकेत="" दिया="" कि="" सीडीपी="" मेलानोजेनेसिस="" को="" बढ़ावा="" दे="" सकता="" है="" और="" मानव="" मेलानोसाइट्स="" में="" मेलेनोजेनेसिस-संबंधित="" जीन="" की="" अभिव्यक्ति="" को="" नियंत्रित="" कर="" सकता="">

इसके अलावा, हमने के प्रभावों को फिर से सत्यापित कियासीडीपीफिर से B16F10 कोशिकाओं के साथ और पाया कि B16F10 कोशिकाओं की मेलेनिन सामग्री में काफी वृद्धि हुई है (P <.01; चित्र="" s2b)।="" इसके="" अलावा,="" सीडीपी="" ने="" के="" एमआरएनए="" स्तर="" में="" काफी="" वृद्धि="" की="">मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन (P <.05; चित्र S2C), और MITF, TYR, TRP1, TRP2, और RAB27A के प्रोटीन स्तर भी CDP उपचार के बाद बढ़े (P <.05; चित्र S2D-E)।

चित्र 1 HEMs और B16F10 कोशिकाओं में CDP की साइटोटोक्सिसिटी।

3.2|सीडीपी ने ज़ेब्राफिश में मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा दिया

जांच करने के लिए कि क्यासीडीपीप्रचार कर सकता हैमेलानोजेनेसिसविवो में , हमने जेब्राफिश भ्रूण का इस्तेमाल किया। zebrafish भ्रूणों को चार समूहों में विभाजित किया गया था और लगातार अलग-अलग सांद्रता (20, 40, और 80 ug/mL) पर अकेले मध्यम (NC) या CDP के साथ इलाज किया गया था; मेलेनिन कणिकाओं का घनत्व और वितरण हर दिन देखा और दर्ज किया गया। जैसे-जैसे जेब्राफिश भ्रूण बढ़े, हमने पाया कि सिर और पूंछ में मेलेनिन घनत्व धीरे-धीरे बढ़ता गया। तीसरे दिन, इंटरग्रुप अंतर अलग-अलग थे, और अंतर तब तक बढ़ता रहा जब तक कि हम 6 वें दिन (चित्रा 3ए) पर प्रयोग समाप्त नहीं कर देते। हमने जेब्राफिश की पूंछ में मेलेनिन घनत्व को मापने के लिए इमेज जे का इस्तेमाल किया; सीडीपी-उपचारित समूहों में मेलेनिन घनत्व नियंत्रण समूह (पी <.05; चित्रा="" 3बी)="" की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="">

3.3|CDP ने HEM और B16F10 कोशिकाओं में MAPK सिग्नल पाथवे को सक्रिय किया

तंत्र को प्रकट करने के लिए जिसके द्वारासीडीपीपदोन्नतमेलानोजेनेसिस, हमने 48 घंटों के लिए अलग-अलग सांद्रता (20, 40, और 80 कुरूप / एमएल) पर सीडीपी के साथ एचईएम का इलाज किया और फिर एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग में ईआरके, जेएनके और पी 38 प्रोटीन के फॉस्फोराइलेटेड और कुल स्तरों की जांच की। जैसा कि वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा मापा गया, सीडीपी उपचार (पी <.05) के="" बाद="" पी-ईआरके,="" पी-जेएनके,="" और="" पी-पी38="" के="" स्तर="" में="" वृद्धि="" हुई,="" जबकि="" उनका="" कुल="" स्तर="" नहीं="" बदला="" (चित्र="" 4ए,="" बी)।="" प्रयोगों="" को="" b16f10="" कोशिकाओं="" के="" साथ="" दोहराया="" गया="" और="" erk,="" jnk,="" और="" p38="" प्रोटीन="" के="" फॉस्फोराइलेटेड="" लेव-एल्स="" को="" बढ़ाया="" गया="" (p=""><.05), लेकिन="" कुल="" mapk="" स्तर="" नहीं="" बदला="" (चित्र="" 4c,="" d),="" परिणामों="" के="" अनुरूप="" एचईएम="">

3.4|CDP ने H2O 2- HEMs और B16F10 कोशिकाओं में प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी और एपोप्टोसिस को देखा

हमने ऑक्सीडेटिव तनाव वातावरण का अनुकरण करने के लिए H2O2 का उपयोग किया और ऑक्सीडेटिव तनाव के तहत मेलानोसाइट्स में सीडीपी की भूमिका का पता लगाया। HEMs में प्रयुक्त H2O2 की अंतिम सांद्रता 5 0 0 माइक्रोन थी, जबकि B16F10 कोशिकाओं में 1.0 मिमी थी। H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी पर CDP के प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने HEMs और B16F10 कोशिकाओं के साथ व्यवहार कियासीडीपी24 घंटे के लिए अलग-अलग सांद्रता (20, 40, और 80 ug/mL) पर, फिर H2O2 जोड़ा और अवलोकन और MTT परख करने से पहले 24 घंटे तक उनका इलाज करना जारी रखा।

एच 2 ओ 2 ने एचईएम में स्पष्ट झिल्ली की सूजन और सेल संकोचन का कारण बना, सीडीपी-प्रीट्रीटेड समूहों में, स्थिति कम हो गई थी। अकेले सीडीपी के साथ उपचार का कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 5ए)। MTT परख ने एक समान परिणाम दिखाया कि H2O2 उपचार ने HEM व्यवहार्यता को कम कर दिया, जबकि CDP ने इस हानिकारक प्रभाव को काफी हद तक कम कर दिया (P <.01); के="" साथ="">सीडीपीअकेले कोई फर्क नहीं पड़ा (चित्र 5C)। हमने तब B16F10 कोशिकाओं में सुरक्षात्मक प्रभाव को फिर से सत्यापित किया। H2O2 उपचार ने स्पष्ट झिल्ली फड़कने और कोशिका संकोचन को प्रेरित किया, जबकि प्रतिकूल स्थिति को भी B16F10 कोशिकाओं (चित्र 5B) में CDP द्वारा संशोधित किया गया था। इस बीच, MTT परख ने दिखाया कि H2O2 उपचार के बाद B16F10 सेल व्यवहार्यता कम हो गई, लेकिन CDP-preट्रीटेड समूहों (P <.05; चित्र="" 5d)="" में="" स्थिति="" में="" काफी="" सुधार="">

इसके अलावा, हमने H2O 2- HEMs और B16F10 कोशिकाओं के प्रेरित एपोप्टोसिस को मापने के लिए FCM का उपयोग किया। परिणामों से पता चला कि H2O2 ने HEMs और B16F10 कोशिकाओं में महत्वपूर्ण एपोप्टोसिस का कारण बना, लेकिन पूर्व-उपचार के साथसीडीपीविभिन्न सांद्रता में एपोप्टोसिस को काफी कम कर सकता है; अन्यथा, अकेले सीडीपी उपचार से कोई फर्क नहीं पड़ा (चित्र 5ई, एफ)। H2O2 उपचार के बाद एपोप्टोसिस दर में वृद्धि हुई लेकिन सीडीपी-प्रीट्रीटेड समूहों में कमी आई, परिवर्तन एचईएम और बी16एफ10 कोशिकाओं (पी <.05, चित्रा="" 5जी,="" एच)="" दोनों="" में="" महत्वपूर्ण="">

चित्र 2 सीडीपी एचईएम में मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा देता है।

3.5|CDP ने H2O 2- को HEMs और B16F10 कोशिकाओं में प्रेरित इंट्रासेल्युलर ROS को परिमार्जन किया

के तंत्र की जांच करने के लिएसीडीपीH2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी और एपोप्टोसिस को कम करने के लिए, हमने आगे DCFH-DA प्रतिदीप्ति जांच का उपयोग करके HEMs और B16F10 कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर ROS का पता लगाया। उपचार ऊपर वर्णित के समान थे, आरओएस स्तर का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा गया था। जैसा कि हमने HEMs में देखा, H2O2 उपचार ROS को ऊपर उठाने में प्रभावी था, लेकिन CDP ने H2O 2- उपचारित समूहों (P <.01; चित्र="" 6a,="" c)="" में="" इंट्रासेल्युलर="" ros="" को="" महत्वपूर्ण="" रूप="" से="" परिमार्जन="" किया;="" इसके="" अलावा,="" अकेले="" सीडीपी="" के="" इस्तेमाल="" से="" कोई="" फर्क="" नहीं="" पड़ा।="" हमने="" b16f10="" कोशिकाओं="" में="" परिणामों="" की="" पुन:="" पुष्टि="" की।="" b16f10="" कोशिकाओं="" में,="" अकेले="" cdp="" के="" साथ="" उपचार="" ने="" ros="" स्तर="" को="" प्रभावित="" नहीं="" किया,="" जबकि="" h2o2="" उपचार="" ने="" ros="" स्तर="" को="" स्पष्ट="" रूप="" से="" बढ़ा="" दिया,="" लेकिन="" यह="" परिवर्तन="" cdp="" प्रीट्रीटमेंट="" (p=""><.05; चित्र="" 6b,="" d)="" द्वारा="" भी="" काफी="" कम="" हो="">

3.6|मेलानोसाइट्स में CDP अप-विनियमित NRF2/HO-1 एंटीऑक्सीडेंट मार्ग

आगे उन तंत्रों को प्रकट करने के लिए जिनके द्वारा CDP ROS को परिमार्जन करता है, हमने सबसे पहले B16F10 कोशिकाओं में NRF2/HO-1 एंटीऑक्सीडेंट पथ-मार्ग के प्रोटीन स्तर को मापा। हमने पाया कि अकेले CDP के साथ उपचार ने NRF2 और HO -1 प्रोटीन को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया, लेकिन H2O 2- उपचारित समूहों में, इन दो प्रोटीनों का स्तर काफी बढ़ गया, औरसीडीपीप्रीट्रीटमेंट ने ऊंचाई को और बढ़ा दिया (p<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">सीडीपीकुछ अंतर दिखाए, जैसा कि हम देख सकते थे कि नाभिक में प्रतिदीप्ति कोशिका द्रव्य की तुलना में अधिक मजबूत थी, और वितरण तीन सीडीपी सांद्रता (चित्रा 7C) के करीब था।

चित्र 3 सीडीपी जेब्राफिश में मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा देता है।

4|विचार विमर्श और निष्कर्ष

इस अध्ययन में, हमने की भूमिका की जांच कीसीडीपीHEMs और B16F10 कोशिकाओं में। पहली बार, हमने पाया कि सीडीपी मेलानोसाइट्स में मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकता है और ज़ेब्राफिश में रंजकता को बढ़ावा दे सकता है। बाद के एक प्रयोग से पता चला कि सीडीपी उपचार के तहत एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग सक्रिय था। हमने आगे इसकी भूमिका की जांच कीऑक्सीडेटिव तनावऔर पाया कि सीडीपी मेलानोसाइट्स में H2O2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी और एपोप्टोसिस को क्षीण कर सकता है; इस बीच, सीडीपी एनआरएफ2/एचओ-1 एंटीऑक्सीडेंट मार्ग को सक्रिय कर सकता है और ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत इंट्रासेल्युलर आरओएस को परिमार्जन कर सकता है।

मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज MITF के नियमन में शामिल एक महत्वपूर्ण मार्ग है, एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक जो की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता हैमेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन और बाद में मेलेनिन संश्लेषण और परिवहन को प्रभावित करता है। हमारे अध्ययन में, सीडीपी उपचार के बाद मेलानोसाइट्स में ईआरके, जेएनके और पी 38 की सक्रियता काफी बढ़ गई थी; इस बीच, MITF/p-MITF और MITF द्वारा संचालित TYR, TRP1, TRP2, और RAB27A के भावों को तदनुसार विनियमित किया गया। इस प्रकार, हम सुझाव देते हैं कि सीडीपी बढ़ावा दे सकता हैमेलानोजेनेसिसMAPK मार्ग को सक्रिय करके, लेकिन कैसेसीडीपीसक्रिय MAPK अज्ञात रहता है। हाल के अध्ययनों के अनुसार, टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (TLR4) मेलानोसाइट्स में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है और इसमें शामिल होता हैमेलानोजेनेसिस.28,29 TLR4 एक महत्वपूर्ण ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है जो विशेष रूप से लिपोपॉलीसेकेराइड (LPS) 30 को बांध सकता है; अध्ययनों ने बताया कि एलपीएस मेलानोजेनेसिस को प्रेरित कर सकता है। 29 दिलचस्प बात यह है कि पौधों या मशरूम से निकाले गए कई पॉलीसेकेराइड कथित तौर पर टीएलआर और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग जैसे एमएपीके और परमाणु कारक कप्पा बीटा (एनएफ-κB) को सक्रिय करते हैं। इसलिए, हमें संदेह है किसीडीपीटीएलआर द्वारा पहचाना और बाध्य किया जा सकता है, फिर डाउनस्ट्रीम एमएपीके सिग्नल-लिंग मार्ग को सक्रिय करता है और बढ़ावा देता हैमेलानोजेनेसिस. इसके अलावा, न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ओलिगोमेराइजेशन डोमेन-जैसे रिसेप्टर्स (एनएलआर) इंट्रासेल्युलर लिगैंड्स को पहचानने और एमएपीके और एनएफ-κबी सिग्नलिंग पाथवे की सक्रियता को चलाने के लिए जाने जाते हैं। जैसा कि रिपोर्ट किया गया है, गैनोडर्मा ल्यूसिडम और एस्ट्रैगलस से निकाले गए पॉलीसेकेराइड कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। और एनएलआर को प्रभावित करते हैं। 35,36 इस प्रकार, यह संभव है कि सीडीपी मेलानोसाइट्स में प्रवेश कर सकता है और एनएलआर के माध्यम से एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग को नियंत्रित कर सकता है। हालांकि, इस परिकल्पना को सत्यापित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

आज तक के कुछ अध्ययनों ने मेलेनिन उत्पादन को बाधित करने के लिए मेलेनोजेनेसिस में हर्बल पॉलीसेकेराइड के आवेदन की सूचना दी। 37,38 हालांकि, इस अध्ययन में,सीडीपीपदोन्नतमेलानोजेनेसिसमेलानोसाइट्स में, और -MSH के साथ तुलना के बाद इस प्रभाव की और पुष्टि की गई। सीडीपी भी जड़ी-बूटियों से निकाला गया एक प्रकार का पॉलीसेकेराइड है, हमें संदेह है कि सीडीपी का विपरीत प्रभाव सीडीपी और अन्य पॉलीसेकेराइड के बीच संरचनात्मक अंतर से संबंधित हो सकता है। पॉलीसेकेराइड मोनोसेकेराइड के पोलीमराइजेशन द्वारा बनते हैं लेकिन मोनोसैकराइड प्रकार, मोनो-सैकराइड संरचना, ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड, साइड-चेन संरचना और आणविक भार में परिवर्तनशील होते हैं;39,40; इन कारकों को उनके जैविक कार्यों को निर्धारित करने के लिए माना जाता है। 41 मौजूदा अध्ययनों ने . की संरचना का प्रस्ताव दिया हैसीडीपीऔर सुझाव दिया कि सीडीपी संरचना बाद में इसके कार्य को प्रभावित करती है। इस प्रकार, सीडीपी को पूरी तरह से समझने और हमारी परिकल्पना की पुष्टि करने के लिए अधिक प्रमाण की आवश्यकता है।

मेलानोजेनेसिसपराबैंगनी क्षति का विरोध करने और शरीर के होमियोस्टैसिस को बनाए रखने का एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक तंत्र है; उसी समय, मेलानोसाइट्स आसानी से प्रतिकूल वातावरण जैसे कि आरओएस अधिभार के संपर्क में आ जाते हैं। 11 यह ज्ञात है कि आरओएस मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा देने में भाग लेता है, एक तंत्र एमएपीके को सक्रिय कर रहा है। 44 लेकिन अध्ययनों से यह भी पता चला है कि यह प्रभाव केवल एक निश्चित आरओएस के भीतर मौजूद है। स्तर, जबकि ROS अधिभार बिगड़ता हैमेलानोजेनेसिसमहत्वपूर्ण रूप से।45 आरओएस, एमएपीके, और मेलानोजेनेसिस के बीच संबंध विभिन्न परिस्थितियों में परिवर्तनशील है, इस प्रकार, प्रो-और एंटी-ऑक्सीडेंट सिस्टम के बीच संतुलन स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण है। विटिलिगो जैसे अपचयन रोगों में, एक असंतुलित एंटीऑक्सिडेंट प्रणाली और अनियंत्रित आरओएस अधिभार मेलानोसाइट्स को नुकसान पहुंचाएगा और सेल व्यवहार्यता को कम करेगा। इस अध्ययन में, हमने कोशिकाओं में आरओएस अधिभार को अनुकरण करने के लिए एच 2 ओ 2 के विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया, और एचईएम ने खराब सहनशीलता दिखाई। B16F10 कोशिकाओं की तुलना में H2O2। जब मेलानोसाइट्स को एच 2 ओ 2 उपचार के अधीन किया गया, तो उनकी व्यवहार्यता और एपोप्टोसिस दर खराब हो गई, लेकिन सीडीपी प्रीट्रीटमेंट आंशिक रूप से प्रवृत्ति को उलट सकता है। उसी समय, आरओएस की सफाई की गई। जैसा कि बताया गया है, NRF2/ARE एंटीऑक्सीडेशन पाथवे सक्रियण त्वचा कोशिकाओं में ROS मैला ढोने का एक प्रमुख तरीका है। 14 हमारे प्रयोगों में, मेलानोसाइट्स में NRF2 और HO -1 के प्रोटीन स्तर को CDP के बिना H2O2 उपचार के बाद विनियमित किया गया था; इसका मतलब है कि H2O2-प्रेरितऑक्सीडेटिव तनावNRF2/HO-1 मार्ग को सक्रिय कर सकता है, लेकिन यह रेडॉक्स संतुलन बनाए रखने और सेल को चोट से बचाने के लिए अपर्याप्त है। हालाँकि, CDP दिखावा ने NRF2/HO -1 एंटीऑक्सीडेशन मार्ग को बढ़ाया और संतुलन को बहाल किया। इस प्रकार, हम सुझाव देते हैं कि सीडीपी एनआरएफ2/एचओ -1 एंटीऑक्सीडेशन मार्ग को सक्रिय करके और आरओएस को साफ करके मेलानोसाइट्स को ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट से बचा सकता है।

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हमने पाया किसीडीपीअकेले उपचार का मेलानोसाइट्स में ROS या NRF2/HO-1 पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। यह परिणाम बताता है कि सीडीपी रेडॉक्स संतुलन को प्रभावित कर सकता है:ऑक्सीडेटिव तनाव, लेकिन सामान्य स्थिति नहीं। इसके अलावा, NRF2/HO-1 एंटीऑक्सीडेशन मार्ग को कथित तौर पर PI3K, NF-κB, और MAPK सिग्नलिंग मार्ग द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हमारे अध्ययन में, CDP MAPK सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करने में सक्षम था। यह संभव है कि सीडीपी अप-विनियमन MAPK के माध्यम से NRF2/HO-1 मार्ग को सक्रिय कर सके। जैसा कि स्लोमिंस्की ने बताया, मेलानोसाइट्स एक नियामक नेटवर्क में शामिल तनाव सेंसर हैं, और पर्यावरण के जवाब में उनके कार्य तेजी से बदल सकते हैं। 49 हम सुझाव देते हैं कि सीडीपी की भूमिका मेलानोसाइट्स की स्थिति से प्रभावित होती है, यह प्रो-मोट कर सकती हैमेलानोजेनेसिससामान्य परिस्थितियों में एंटीऑक्सिडेंट प्रणाली को प्रभावित किए बिना लेकिन ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति में रेडॉक्स संतुलन को बहाल करता है। इसलिए, सीडीपी द्वारा मेलानोसाइट फ़ंक्शन और उत्तरजीविता को दो अलग-अलग तरीकों से बनाए रखा जा सकता है। सीडीपी मेलानोसाइट्स को होमोस्टैसिस बनाए रखने में मदद करता है, जो कि एक महत्वपूर्ण कार्य भी हैमेलानोजेनेसिस.50,51

निष्कर्ष के तौर पर,सीडीपीMAPK सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करके मेलानोसाइट्स के मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकता है। सीडीपी एनआरएफ2/एचओ-1 एंटीऑक्सीडेंट मार्ग को सक्रिय करके और इंट्रासेल्युलर आरओएस के तहत मैला ढोने के माध्यम से मेलानोसाइट अस्तित्व में सुधार कर सकता हैऑक्सीडेटिव तनावस्थितियाँ। हमारे निष्कर्ष सार्थक हैं क्योंकि वे प्रदर्शित करते हैं कि सीडीपी दोनों को बढ़ावा दे सकता हैमेलानोजेनेसिसऔर मेलानोसाइट्स को ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट से बचाते हैं, जो संभवतः मेलानोसाइट डिसफंक्शन और नुकसान के लिए जिम्मेदार है। इस अध्ययन के निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि सीडीपी अपचयन रोगों के उपचार में एक नई दवा हो सकती है।