सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण को रोककर आंतों की उम्र बढ़ने में सुधार करता है

 

 

उम्र बढ़ने से कई शारीरिक कार्यों में धीरे-धीरे गिरावट आती है और उम्र से संबंधित बीमारियों का खतरा बढ़ जाता है [1]। अध्ययनों से पता चला है कि उम्र बढ़ने का आंतों की संरचना और कार्य पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है [2]। पाचन, चयापचय और प्रतिरक्षा रक्षा के लिए मुख्य अंग के रूप में, आंत की उम्र बढ़ने से पोषक तत्वों की कमी, चयापचय संबंधी विकार और कमजोर प्रतिरक्षा समारोह हो सकता है [3-4], जिससे गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों की संभावना बढ़ जाती है [5]। पुरानी सूजन आंतों की उम्र बढ़ने की पहचान है, लेकिन इसके आणविक तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हुए हैं। वर्तमान में, एंटी-एजिंग एजेंटों में मुख्य रूप से बीटा-निकोटिनमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड (एनएमएन), रैपामाइसिन, डेसैटिनिब प्लस क्वेरसेटिन और अन्य शामिल हैं [3]। इनमें से, एनएमएन आवश्यक कोएंजाइम एनएडी+ का एक प्रमुख अग्रदूत है, और कई अध्ययनों ने पुष्टि की है कि यह स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में आंतों की उम्र बढ़ने में काफी देरी करता है; इसे क्षेत्र में एक प्रभावी हस्तक्षेप के रूप में व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है [4-5]। इसलिए, प्रासंगिक तंत्र और हस्तक्षेप रणनीतियों की खोज करना बहुत महत्वपूर्ण है।

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न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेराइजेशन डोमेन-जैसे रिसेप्टर परिवार पाइरिन डोमेन-युक्त 3 (एनएलआरपी 3) इन्फ्लेमसोम जन्मजात प्रतिरक्षा का एक प्रमुख नियामक है और उम्र बढ़ने से संबंधित बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके सक्रियण के लिए दो संकेतों की आवश्यकता होती है। पहला संकेत: रोगज़नक़-संबंधित आणविक पैटर्न (पीएएमपी) और क्षति-संबंधित आणविक पैटर्न (डीएएमपी) एनएलआरपी 3 की अभिव्यक्ति और इंटरल्यूकिन -1 (प्रो-IL-1) के अग्रदूत को प्रेरित करते हैं। दूसरा संकेत (जैसे कि पोटेशियम इफ्लक्स और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति) इन्फ्लेमसोम असेंबली को ट्रिगर करता है, कैस्पेज़ -1 को सक्रिय करता है, और परिपक्व IL-1 और IL-18 उत्पन्न करने के लिए प्रो-IL-1 और प्रो-IL-18 को विभाजित करता है, जिससे सूजन उत्पन्न होती है [6]। उम्र बढ़ने के दौरान, आंतों का होमियोस्टैसिस बाधित हो जाता है, जिससे लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) जैसे प्रो-इंफ्लेमेटरी कारकों की रिहाई होती है, जो लगातार एनएलआरपी 3 इनफ्लेमसोम को सक्रिय करता है, जिससे क्रोनिक निम्न-श्रेणी की सूजन होती है। यह आंतों की बाधा क्षति और डिस्बिओसिस को और बढ़ा देता है, तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बदल देता है, आंतों की पारगम्यता को बढ़ाता है, और आंतों की उम्र बढ़ने में तेजी लाता है [7-10]।

सिस्टैंच डेजर्टिकोला, एक बेशकीमती पारंपरिक चीनी औषधीय और खाद्य-समजात जड़ी बूटी जिसे "रेगिस्तान के जिनसेंग" के रूप में जाना जाता है, किडनी यांग को टोन करता है, सार और रक्त को पोषण देता है, और कब्ज से राहत देने के लिए आंतों को नम करता है। इसके सक्रिय पॉलीसेकेराइड एंटी-एजिंग, एंटीऑक्सिडेंट और आंत-सुरक्षात्मक गुण प्रदर्शित करते हैं [11-12]। आंतों की सुरक्षा के संदर्भ में, सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड्स (सीडीपी) टोल-लाइक रिसेप्टर 4 (टीएलआर4)/न्यूक्लियर फैक्टर-कप्पा बी (एनएफ-κबी) मार्ग की सक्रियता को रोककर आंत माइक्रोबायोटा संतुलन को नियंत्रित कर सकता है, जिससे एलपीएस स्तर कम हो जाता है और आंतों के अवरोध कार्य की मरम्मत होती है [13-14]। सीडीपी एएमपी-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एएमपीके)/सिर्टुइन 1 (एसआईआरटी1) मार्ग के सक्रियण के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में सुधार कर सकते हैं, सेलुलर बुढ़ापा में देरी कर सकते हैं, लिपिड चयापचय को नियंत्रित कर सकते हैं, और आंतों के उपकला कोशिकाओं में लिपोटॉक्सिक चोट को कम कर सकते हैं [15]।

यद्यपि सीडीपी के आंतों के सुरक्षात्मक प्रभावों का प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि क्या वे एनएलआरपी 3 इन्फ्लैमसोम मार्ग को दबाकर आंतों की उम्र बढ़ने में सुधार करते हैं। इस अध्ययन का उद्देश्य उस तंत्र की जांच करना है जिसके द्वारा सीडीपी एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण को रोकता हैआंतों की उम्र बढ़ने में सुधार.

सामग्री

 

1.1 प्रायोगिक जानवर

पचास स्वस्थ नर C57BL/6J चूहे (2 महीने की उम्र में 10; 20 महीने की उम्र में 40) बीजिंग स्पीफू बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदे गए थे। उत्पादन लाइसेंस: SYXK (बीजिंग) 2023-0011। पारंपरिक चीनी चिकित्सा के हेबै प्रांतीय अस्पताल की प्रायोगिक पशु सुविधा में जानवरों को निम्नलिखित परिस्थितियों में एक बाधा वातावरण में रखा गया था: तापमान 22 ± 2 डिग्री, सापेक्ष आर्द्रता 50% ± 10%, और 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरा चक्र। सभी चूहों को 1 सप्ताह के लिए आदी बनाया गया। इस अध्ययन को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के हेबै प्रांतीय अस्पताल (IACUC-HPHCM-2025001) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

 

1.2 उपकरण और अभिकर्मक

 

क्रायोस्टेट (थर्मो फिशर; क्रायोस्टार NX50)

लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप (निकॉन; एएक्स)

वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली (थर्मो फिशर; 7500)

मल्टीमोड प्लेट रीडर (टेकन; स्पार्क)

बीटा-निकोटिनमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड (बोंटैक, चीन; कैट. BT05N120A005)

एसए- -गैल स्टेनिंग किट (सोलरबियो, बीजिंग; कैट. 250003003)

माउस एलपीएस एलिसा किट (CUSABIO/Huamei, वुहान; Cat. CSB-E13066m)

ट्रांसज़ोल अप प्लस आरएनए किट (ट्रांसजेन बायोटेक, बीजिंग; कैट. ER501-01-V2)

मोनएम्प केमोएचएस क्यूपीसीआर मिक्स (मोनैड; कैट. MQ00501S)

Lgr5 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (वुहान सैनयिंग; कैट. 30007-1-एपी)

ZO-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एनएलआरपी3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, कैस्पेज़-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एएससी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, जीएपीडीएच मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, Ki67 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एबीकैम; कैट्स। ab307799, ab263899, ab179515, ab309497, ab8245, ab15580)

तरीकों

 

2.1 सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड की तैयारी

सिस्टैंच सामग्री (50 ग्राम) को 8 गुना मात्रा में पानी के साथ काढ़े द्वारा दो बार निकाला गया, हर बार 1 घंटा। फ़िल्ट्रेट को मिलाया गया और कमरे के तापमान तक ठंडा किया गया। वर्षा के लिए निर्जल इथेनॉल को 80% की अंतिम सांद्रता में जोड़ा गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दिया गया। अवक्षेप को पानी में घोला गया, डायलाइज़ किया गया, फिर नमूना प्राप्त करने के लिए लियोफिलाइज़ किया गया।

 

2.2 पशु समूहन और प्रशासन

अनुकूलन के बाद, चालीस 20-महीने के C57BL/6J चूहों को यादृच्छिक रूप से सौंपा गया: प्राकृतिक उम्र बढ़ने वाला समूह, कम खुराक वाला CDP समूह (2.5 g·kg−1), उच्च खुराक वाला CDP समूह (5.0 g·kg−1), और NMN समूह (200 mg·kg−1)। अतिरिक्त दस 2 महीने पुराने SPF C57BL/6J चूहों ने एक युवा नियंत्रण समूह के रूप में कार्य किया। निम्न और उच्च सीडीपी खुराक क्रमशः 2.5 ग्राम·किलो-1 और 5.0 ग्राम·किलो-1 पर मौखिक गैवेज द्वारा दी गई थी। शरीर की सतह क्षेत्र रूपांतरण और 12 [16] के मानव-से-चूहे रूपांतरण कारक का उपयोग करते हुए, ये लगभग 1× और 2× वयस्क नैदानिक ​​​​समतुल्य खुराक के अनुरूप हैं। एनएमएन समूह को गैवेज द्वारा एनएमएन 200 मिलीग्राम·किग्रा−1 प्राप्त हुआ। युवा नियंत्रण और प्राकृतिक उम्र बढ़ने वाले समूहों को समान मात्रा में शारीरिक खारा (10 एमएल·किलो-1) प्राप्त हुआ। 2 महीने तक लगातार उपचार किया गया।

 

2.3 जमे हुए अनुभागों की तैयारी

चूहों को सोडियम पेंटोबार्बिटल (30 मिलीग्राम·किलो-1) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश किया गया और इच्छामृत्यु दी गई। पेट को तेजी से खोला गया, मेसेंटरी को अलग किया गया, और इलियल ऊतक को एकत्र किया गया और जमे हुए वर्गों के लिए 5 माइक्रोन पर विभाजित किया गया [17]।

 

आंतों-गैलेक्टोसिडेज़ गतिविधि के लिए 2.4 एसए - - गैल परख

धुंधलापन SA- -gal किट निर्देशों के अनुसार किया गया था। ऊष्मायन के बाद, दाग समाधान हटा दिया गया था और वर्गों को पीबीएस से धोया गया था। छवियाँ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र की गईं।

 

2.5 बुढ़ापे से जुड़े स्रावी फेनोटाइप (एसएएसपी) के लिए वास्तविक समय पीसीआर

ट्रांसज़ोल अप प्लस किट का उपयोग करके इलियल ऊतक से कुल आरएनए निकाला गया। निम्नलिखित परिस्थितियों में गोस्क्रिप्ट प्रणाली के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया: 15 मिनट के लिए 42 डिग्री, 15 मिनट के लिए 70 डिग्री, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री। निम्नलिखित साइक्लिंग के साथ MonAmp ChemoHS qपीसीआर मिक्स का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर का संचालन किया गया: 95 डिग्री 10 मिनट; फिर 95 डिग्री 15 सेकेंड, 60 डिग्री 1 मिनट के 40 चक्र। पिघल वक्र: 95 डिग्री 15 सेकंड, 60 डिग्री 15 सेकंड, 95 डिग्री 15 सेकंड। GAPDH ने आंतरिक संदर्भ के रूप में कार्य किया, और सापेक्ष परिमाणीकरण ने 2^-ΔΔCt विधि का उपयोग किया। प्राइमर क्रोमेगा से खरीदे गए थे। प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं।

 

2.6 ZO-1 अभिव्यक्ति के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग

इलियल ऊतक को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में और पैराफिन-सेक्शन को 5 माइक्रोन पर तय किया गया था। अनुभागों को 15 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन X-100 के साथ पारगम्य बनाया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10% बकरी सीरम के साथ अवरुद्ध किया गया। ZO-1 (1:200) के विरुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी को 4 डिग्री पर रात भर लगाया गया। पीबीएस धोने के बाद, Cy3-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। नाभिक को 5 मिनट के लिए डीएपीआई से प्रतिदागित किया गया। स्लाइडों को एंटीफेड माध्यम से लगाया गया और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया। इमेज-प्रो सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित की गई थी।

2.7 Ki67 और Lgr5 अभिव्यक्ति के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

IHC किट प्रोटोकॉल का पालन करते हुए अवैध वर्गों को प्राथमिक एंटीबॉडी Ki67 (1:1000) और Lgr5 (1:200) के साथ रात भर 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया, फिर संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ। क्रोमोजेनिक विकास के लिए डीएबी का उपयोग किया गया था। परिणाम प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए। इमेज-प्रो सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके माध्य ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित किया गया था।

 

एलपीएस स्तरों के लिए 2.8 एलिसा

मानक और नमूने (प्रति कुएं 100 μL) प्लेट में जोड़े गए और 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किए गए। फिर एचआरपी-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन समाधान (प्रति कुएं 100 μL) जोड़ा गया और 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। सब्सट्रेट को प्रकाश-संरक्षित परिस्थितियों में जोड़ा गया और 30 मिनट तक प्रतिक्रिया की गई। प्रतिक्रिया को स्टॉप सॉल्यूशन के साथ समाप्त कर दिया गया, और अवशोषण 450 एनएम पर मापा गया।

 

2.9 एनएलआरपी3, कैस्पेज़-1 और एएससी के लिए वेस्टर्न ब्लॉट

लगभग 30 मिलीग्राम इलियल ऊतक को तरल नाइट्रोजन में पीसा गया था। प्रोटीज़/फॉस्फेट अवरोधक युक्त RIPA लिसीस बफ़र जोड़ा गया; लाइसेट्स को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए 15 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम, 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। प्रोटीन सांद्रता बीसीए परख द्वारा निर्धारित की गई और 2 ug/μL पर समायोजित की गई। प्रोटीन की समान मात्रा (20-40 ग्राम) को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। झिल्लियों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% नॉनफैट दूध के साथ अवरुद्ध किया गया, प्राथमिक एंटीबॉडी (एनएलआरपी 3 1: 1000, कैस्पेज़ -1 1: 500, एएससी 1: 1000) के साथ रात भर 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया, फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 5000) के साथ। टीबीएसटी धुलाई के बाद, सिग्नल विकसित किए गए। बैंड की तीव्रता को GAPDH के लिए सामान्यीकृत किया गया।

 

2.10 सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण और रेखांकन क्रमशः एसपीएसएस 26.0 और ग्राफपैड प्रिज्म 8.0.2 का उपयोग करके किया गया था। समूहों के बीच मतभेदों का आकलन करने के लिए एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया, इसके बाद तुकी का पोस्ट हॉक परीक्षण किया गया। सांख्यिकीय महत्व P <0.05 पर निर्धारित किया गया था।

 

आंत्र गतिशीलता और पूरक विकास में रुचि रखने वाले पाठकों के लिए व्यावहारिक नोट्स

 

सिस्टैंच डेजर्टिकोला का कार्यात्मक फोकस: पारंपरिक रूप से आंतों को नम करने और कब्ज से राहत देने के लिए उपयोग किया जाता है; आधुनिक डेटा समर्थन बाधा समर्थन, सूजन मॉड्यूलेशन (TLR4/NF-κB), और AMPK/SIRT1 के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन।

यहां संभावित एंटी-एजिंग आंत तंत्र का पता लगाया गया: एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण का दमन; एलपीएस-संचालित निम्न-श्रेणी की सूजन में कमी; तंग जंक्शनों का संरक्षण (जैसे, ZO-1); उपकला प्रसार/स्टेमनेस मार्करों का रखरखाव (Ki67, Lgr5)।

चूहों में विशिष्ट प्रायोगिक मौखिक खुराक: 2 महीने के लिए 2.5-5.0 ग्राम·किलो-1 सीडीपी; सकारात्मक नियंत्रण के रूप में NMN 200 mg·kg−1।

अनुवादात्मक सावधानी: माउस खुराक प्रत्यक्ष मानवीय अनुशंसाएँ नहीं हैं। अध्ययन शरीर की सतह क्षेत्र स्केलिंग का उपयोग करता है; उत्पाद विकास से पहले मानव-समतुल्य सूत्रीकरण और सुरक्षा, पहचान परीक्षण और जीएमपी विनिर्माण आवश्यक हैं।