जीन क्लोनिंग, कार्यात्मक पहचान, सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से सुक्रोज सिंथेज़ का संरचनात्मक और अभिव्यक्ति विश्लेषण Ⅲ

4 सूखे के तनाव के तहत सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के विभिन्न हिस्सों और सेल कल्चर सिस्टम में सीटीसस का अभिव्यक्ति विश्लेषण

4.1 सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के विभिन्न भागों में सीटीसस का अभिव्यक्ति विश्लेषण

इन विट्रो संपूर्ण कोशिका परिवर्तन प्रयोगों और एंजाइमेटिक उत्प्रेरक प्रतिक्रिया प्रयोगों ने पुष्टि की कि सीटीसस जीन द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन में यूडीपी-ग्लूकोज के संश्लेषण को उत्प्रेरित करने की क्षमता है। इस जीन और सिस्टैंच ट्यूबुलोसा में ग्लाइकोसाइड यौगिकों के जैवसंश्लेषण के बीच सहसंबंध का और अधिक पता लगाने के लिए, विभिन्न भागों में इस जीन की अभिव्यक्ति का स्तरसिस्टैंच ट्यूबुलोसाविश्लेषण किया गया.

बिक्री के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सिस्टांचे कच्चे माल

वेसिस्टैंच की सहायक सेवा-छूट की जानकारी पाने के लिए हमसे संपर्क करें:

ईमेल:wallence.suen@wecistanche.com

व्हाट्सएप/टेलीभाष:+86 15292862950

इचिनाकोसाइडसिस्टैंच ट्यूबुलोसा में सबसे अधिक प्रतिनिधि ग्लाइकोसाइड यौगिक है, और इसकी सामग्री सिस्टैंच ट्यूबुलोसा पौधों के सूखे वजन के 30% से अधिक तक पहुंच सकती है [23]। अनुसंधान समूह ने पहले सिस्टैंच ट्यूबुलोसा पौधों के विभिन्न हिस्सों में इचिनाकोसाइड की सामग्री को मापा था, और विशिष्ट प्रदर्शन था: की सामग्रीechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>हवाई भाग; उनमें से, हौस्टोरियम में इचिनाकोसाइड की मात्रा सबसे अधिक थी। टेम्प्लेट के रूप में सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के विभिन्न हिस्सों से सीडीएनए का उपयोग करके वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था, और परिणामों का विश्लेषण 2 द्वारा किया गया था-ΔΔCT विधि, और विभेदक विश्लेषण किया गया। परिणाम चित्र 4ए में दिखाए गए हैं। हौस्टोरियम में CtSus जीन की अभिव्यक्ति का स्तर उच्चतम था, जमीन के ऊपर के हिस्से की तुलना में 1.5 गुना, और भूमिगत हिस्से में अभिव्यक्ति का स्तर जमीन के ऊपर के हिस्से की तुलना में काफी अधिक था, जो कि फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स के संचय पैटर्न के अनुरूप है। के विभिन्न भागों में इचिनाकोसाइड द्वारा दर्शाया गया हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसा.

चित्र 4 सी. ट्यूबुलोसा के विभिन्न हिस्सों में और पीईजी6{4}}00 द्वारा उपचारित सस्पेंशन कोशिकाओं में सीटीसस की सापेक्ष अभिव्यक्ति का स्तर। ए: सी. ट्यूबुलोसा के विभिन्न भागों में सीटीएसयूएस की सापेक्ष अभिव्यक्ति का स्तर; बी: सी. ट्यूबुलोसा निलंबन कोशिकाओं में सीटीएसयूएस का सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर पीईजी 6000 द्वारा अलग-अलग समय बिंदुओं पर इलाज किया गया एन =3, 𝑥̅± एस। * पी ＜ 0.05, *** पी ＜ 0.001

उच्च गुणवत्ता वाले सिस्टांचे कच्चे माल

4.2 सूखे की तनाव स्थितियों के तहत सिस्टैंच डेजर्टिकोला सस्पेंशन कोशिकाओं में सीटीसस का अभिव्यक्ति विश्लेषण

परियोजना पर प्रारंभिक शोध से पता चला हैPEG6000 से प्रेरित सूखा तनावकर सकनाउल्लेखनीय वृद्धिफेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड का संचयसिस्टैंच निलंबन कोशिकाओं में। शामिल होने के 3 से 9 दिनों के बाद, इचिनेसीसाइड सामग्री में काफी वृद्धि हुई। 12वें से 15वें दिन तकइचिनेसीसाइड की वृद्धि दरसामग्री धीमी हो गई और 15वें दिन अधिकतम मूल्य पर पहुंच गई। फिर, जैसे-जैसे संस्कृति का समय बढ़ता गया, इचिनेसीसाइड सामग्री में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। फ्रुक्टोसाइड की मात्रा धीरे-धीरे कम हो गई [24]। इस शोध के आधार पर, इस पेपर ने सिस्टैंच डेजर्टिकोला सस्पेंशन में सीटीसस जीन की जांच करने के लिए वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर का पता लगाने के लिए अनुपचारित सिस्टैंच डेजर्टिकोला सस्पेंशन कोशिकाओं और पीईजी 6000- प्रेरित सिस्टैंच डेजर्टिकोला सस्पेंशन कोशिकाओं के सीडीएनए का उपयोग टेम्पलेट के रूप में किया। सूखे की तनाव की स्थिति में कोशिकाएँ। अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन. परिणाम चित्र 4बी में दिखाए गए हैं। PEG6000 द्वारा प्रेरित सिस्टैंच डेजर्टिकोला सस्पेंशन कोशिकाओं में, CtSus की अभिव्यक्ति प्रेरण के 6 वें दिन काफी बढ़ गई, और 9 वें दिन उच्चतम मूल्य पर पहुंच गई, और फिर नियंत्रण के समान स्तर पर वापस आ गई। समान स्तर के समूह. उपरोक्त परिणामों से पता चलता है कि सूखे का तनाव सिस्टैंच डेजर्टिकोला सस्पेंशन सेल लाइन में सीटीसस जीन की अभिव्यक्ति को काफी हद तक बढ़ा सकता है, जो सूखे के तनाव के तहत इचिनेसाइड के संचय पैटर्न के अनुरूप है। हालाँकि, CtSus जीन की चरम अभिव्यक्ति इचिनेसीसाइड सामग्री के शिखर से पहले दिखाई देती है, क्योंकि CtSus कटैलिसीस द्वारा संश्लेषित सक्रिय ग्लाइकोसिल दाता इचिनेसीसाइड के बाद के बायोसिंथेटिक मार्ग में बहु-चरण ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण अग्रदूत है। , इसलिए यह अनुमान लगाया जाता है कि सूखे के तनाव के अधीन होने के बाद, जीव सक्रिय दाताओं के संचय को प्राप्त करने के लिए प्राथमिक चयापचय से संबंधित जीन को प्राथमिकता से जुटाएंगे, और फिर महत्वपूर्ण माध्यमिक चयापचयों के संचय को प्राप्त करेंगे।

उच्च गुणवत्ता वाले सिस्टांचे कच्चे माल

5 सीटीसस प्रोटीन का त्रि-आयामी संरचना अध्ययन और प्रमुख सक्रिय साइटों का विश्लेषण

ग्लाइकोसिल डोनर यूडीपी-ग्लूकोज के उत्पादन को उत्प्रेरित करने में सीटीसस के कार्य के आधार पर, सीटीसस उत्प्रेरक गतिविधि के संरचनात्मक आधार का आगे अध्ययन किया गया। प्रोटीन की द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन टूल SOPMA का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि CtSus की द्वितीयक संरचना में 55.28% -हेलिस, 25.47% यादृच्छिक कॉइल, 12.80% विस्तारित स्ट्रैंड और 6.46% -टर्न (चित्र 5A) शामिल हैं, जो दर्शाता है कि -CtSus प्रोटीन में -हेलिस सबसे महत्वपूर्ण माध्यमिक संरचनात्मक इकाइयाँ हैं। इसके बाद यादृच्छिक कुंडलियाँ आती हैं, जो प्रोटीन के एक बड़े हिस्से के लिए भी जिम्मेदार होती हैं। विस्तारित स्ट्रैंड और -टर्न पूरे प्रोटीन में वितरित होते हैं। मौजूदा अध्ययनों के अनुसार, सुक्रोज सिंथेज़ आमतौर पर टेट्रामर के रूप में मौजूद होता है, जिसे इसका सक्रिय रूप माना जाता है। इसलिए, इस पेपर ने सीटीसस प्रोटीन की संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए अल्फाफोल्ड2 का उपयोग किया और प्रोटीन टेट्रामर्स की त्रि-आयामी संरचना प्राप्त की। पीडीबी (प्रोटीन डेटा बैंक) डेटाबेस तुलना में पाया गया कि एराबिडोप्सिस थालियाना सुक्रोज सिंथेज़ AtSus1 (PDBID 3S28) और CtSus के बीच अनुक्रम समानता 77.93% तक पहुंच सकती है। अनुमानित CtSus संरचना की तुलना AtSus1 त्रि-आयामी संरचना के साथ की गई थी, और प्रोटीन सुपरपोजिशन के बाद मूल माध्य वर्ग विचलन (RMSD) मान 1.11 Å था, जो दर्शाता है कि दोनों की स्थानिक संरचनाएं अत्यधिक सुसंगत हैं (चित्र 5B)।

यूडीपी और फ्रुक्टोज (पीडीबीआईडी3एस29) के साथ एराबिडोप्सिस एटसस1 की रिपोर्ट की गई प्रोटीन-लिगैंड क्रिस्टल जटिल संरचना का उपयोग यूडीपी और फ्रुक्टोज के साथ सीटीसस के बाइंडिंग मोड का विश्लेषण करने के लिए एक टेम्पलेट [16] के रूप में किया गया था। आणविक डॉकिंग परिणाम चित्र 5सी में दिखाए गए हैं। यह देखा जा सकता है कि AtSus1 और CtSus के सब्सट्रेट बाइंडिंग पॉकेट अमीनो एसिड प्रकार, स्थानिक वितरण और विन्यास के मामले में बहुत समान हैं, और ओवरलैप अधिक है, जिससे साबित होता है कि पौधों में सुक्रोज सिंथेज़ का अनुक्रम अत्यधिक संरक्षित है। प्रोटीन सब्सट्रेट बाइंडिंग पॉकेट में दो लिगेंड, यूडीपी और फ्रुक्टोज की संरचना चित्र 5D में दिखाई गई है। UDP और CtSus की आणविक डॉकिंग सबसे लाभप्रद संरचना, AtSus{8}}UDP क्रिस्टल कॉम्प्लेक्स में UDP की संरचना के साथ एक अच्छा ओवरलैप है, जो आणविक डॉकिंग परिणामों की सटीकता को साबित करती है। यूडीपी और प्रोटीन सब्सट्रेट बाइंडिंग पॉकेट में प्रमुख अमीनो एसिड अवशेषों के बीच बातचीत को चित्र 5ई में दिखाया गया है। यूडीपी और सीटीएसयूएस मुख्य रूप से हाइड्रोजन बांड और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन द्वारा एक साथ बंधे हैं। सब्सट्रेट बाइंडिंग पॉकेट में प्रमुख अमीनो एसिड अवशेषों में शामिल हैं: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Th678, और ग्लू681।

संदर्भ

[1] सॉन्ग जेडएच, लेई एल, टीयू पीएफ। सिस्टैंचहॉफ़िंग के पौधों में औषधीय गतिविधि के अनुसंधान में प्रगति। एट लिंक [जे]। चिन ट्रेडिट हर्ब ड्रग्स (中草药), 2003, 34: 113-115।

[2] लियू डब्ल्यूजे, लियू वाई, सॉन्ग क्यूक्यू, एट अल। ¹H-NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी [J] का उपयोग करके खेती और जंगली सिस्टानचेटुबुलोसा के बीच कीमोम तुलना। चाइना जे चिन मेटर मेड (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512।

[3] सोंग वाई, ज़ेंग के, जियांग वाई, और अन्य। सिस्टैंचेस हर्बा, एक लुप्तप्राय प्रजाति से चीनी दवा के एक बड़े ब्रांड तक [जे]। मेड रेस रेव, 2021, 41: 1539-1577।

[4] लियू वाई, वांग एच, यांग एम, एट अल। सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड पीसी12 कोशिकाओं को ओजीडी/आरपी-प्रेरित चोट [जे] से बचाता है। बायोमेड फार्माकोथेर, 2018, 99: 671-680।

[5] यिन वाई, हुआंग जे, गु एक्स, एट अल। पादप न्यूक्लियोटाइड-चीनी अंतररूपांतरण एंजाइमों का विकास [जे]। पीएलओएस वन, 2011, 6: ई27995।

[6] बार-पेलेड एम, ओ'नील एमए। प्लांट न्यूक्लियोटाइड चीनी का निर्माण, अंतररूपांतरण, और चीनी पुनर्चक्रण द्वारा बचाव [जे]। अन्नू रेव प्लांट बायोल, 2011, 62: 127-155।

[7] गुओ एच, ली एल, वांग पीजी। एस्चेरिचिया कोली O86:B7 [J] से UDP-GlcNAc/Glc4-एपिमेरेज़ का जैव रासायनिक लक्षण वर्णन। जैव रसायन, 2006, 45: 13760-13768।

[8] डोंग एस, चेसनोकोवा ओएन, टर्नबॉफ सीएल जूनियर, एट अल। बैसिलस एन्थ्रेसीस [जे] में एक्सोस्पोरियम प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन में शामिल यूडीपी-एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन 4-एपिमेरेज़ की पहचान। जे बैक्टीरियोल, 2009, 191: 7094-7101।

[9] ली एलएन, कोंग जेक्यू। ऑर्निथोगलुमकौडेटम [जे] में सुक्रोज सिंथेज़ जीन की ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड पहचान। आरएससी विज्ञापन, 2016, 6: 18778-18792।

[10] श्मोल्ज़र के, गुटमैन ए, डिरिक्स एम, एट अल। सुक्रोज सिंथेज़: बायोकैटलिटिक ग्लाइकोसिलेशन प्रक्रिया विकास के लिए एक अद्वितीय ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ [जे]। बायोटेक्नॉल विज्ञापन, 2016, 34: 88-111।

[11] कार्डिनी सीई, लेलोइर एलएफ, चिरीबोगा जे। सुक्रोज का जैवसंश्लेषण [जे]। जे बायोल केम, 1955,214: 149-155।[12]स्टीन ओ, ग्रैनोट