1 परिचय

इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों के साथ खाद्य सामग्री की उनके संबंधित आणविक लक्ष्यों के साथ पहचान ने हाल के वर्षों में बढ़ी हुई रुचि को आकर्षित किया है। उनकी उच्च लिगैंड विविधता के कारण, आयन चैनलों (टीआरपी चैनल) का क्षणिक रिसेप्टर संभावित सुपरफैमिली संभावित लक्ष्य संरचनाओं के एक बहुत ही दिलचस्प वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है।

स्तनधारी टीआरपी चैनल सुपरफैमिली में छह संबंधित प्रोटीन परिवार शामिल हैं, अर्थात् एकिरिन (टीआरपीए), कैनोनिकल (टीआरपीसी), मेलास्टैटिन (टीआरपीएम), म्यूकोलिपिन (टीआरपीएमएल), पॉलीसिस्टिन (टीआरपीपी), और वैनिलॉइड (टीआरपीवी) परिवार, जिनमें से सभी आम तौर पर छह ट्रांसमेम्ब्रेन खंड साझा करते हैं जो अलग-अलग कटियन चयनात्मकता के साथ कटियन-पारगम्य छिद्र बनाने के लिए टेट्रामर्स के रूप में इकट्ठे होते हैं। टीआरपीवी1 चैनल, अब तक, टीआरपी सुपरफैमिली का सबसे गहन जांच वाला सदस्य हो सकता है। TRPV1 को शुरू में मिर्च के तीखे घटक कैप्साइसिन के रिसेप्टर के रूप में पहचाना गया था।[2] बाद में, अदरक के तीखे तत्व, जिंजरोल्स को भी टीआरपीवी1 को सक्रिय करते हुए दिखाया गया।[3]

गैर-न्यूरोनल कोशिका प्रकारों में टीआरपीवी1 की जैविक भूमिका अभी भी व्यापक जांच के अधीन है, फिर भी उपलब्ध परिणाम संवेदी और थर्मल धारणा से कहीं अधिक कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, टीआरपीवी1 एगोनिस्ट नॉनिवैमाइड, एक संरचनात्मक कैप्साइसिन एनालॉग की 0.15 मिलीग्राम की दैनिक खुराक के साथ 12 सप्ताह के हस्तक्षेप ने शरीर में वसा द्रव्यमान में आहार-प्रेरित वृद्धि को रोक दिया, और स्वस्थ अधिक वजन वाले विषयों में प्लाज्मा सेरोटोनिन के स्तर में वृद्धि की।[4]

3T3-L1 एडिपोसाइट्स में नॉनिवैमाइड द्वारा TRPV1 के सक्रियण ने PPAR𝛾 अभिव्यक्ति को दबाकर विभेदन और परिपक्वता के दौरान लिपिड संचय को कम कर दिया।[5] मैक्रोफेज में, कैप्साइसिन और नॉनिवैमाइड ने टीआरपीवी1-निर्भर तरीके से आईएल6, सीएक्ससीएल8 और टीएनएफ-अल्फा जैसे प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के एलपीएस-प्रेरित रिलीज को कम कर दिया।[6] फिर भी, मानव रक्त ल्यूकोसाइट्स में टीआरपीवी1 के विशेष कार्य अस्पष्ट बने हुए हैं। मानव एनके कोशिकाओं में, 10 और 50 μM कैप्साइसिन ने इंट्रासेल्युलर Ca2+ सांद्रता में वृद्धि को प्रेरित किया, जो एक कार्यात्मक TRPV1 चैनल का संकेत देता है।[7]

हालाँकि, 10-100 μM की सांद्रता सीमा में 1 घंटे के लिए कैप्साइसिन के साथ कोशिकाओं के पूर्व-उपचार से प्रेरित साइटोटॉक्सिक डीग्रेनुलेशन और साइटोकिन स्राव जैसे एनके सेल प्रभावकारक कार्य काफी हद तक TRPV1 स्वतंत्र थे। टी कोशिकाओं में, टीआरपीवी1 को टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग, टी सेल प्रसार और विभेदन, साथ ही साइटोकिन उत्पादन की प्रक्रियाओं में शामिल होने के लिए प्रलेखित किया गया था। [8] हमारे समूह के पिछले कार्य ने मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में टीआरपीवी1 की कार्यात्मक अभिव्यक्ति का भी प्रदर्शन किया था।[9] इसके अलावा, 0.03 से 300 μmol L−1 तक की सांद्रता में खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण से पता चला कि [6]-जिंजरोल 82.2 μmol L−1 के IC50 मान के साथ प्राथमिक मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा साइटोकिन स्राव को रोकता है।

हालाँकि, स्वस्थ लोगों के प्लाज्मा नमूनों में [6]-जिंजरॉल की मात्रा का पता चला कि 1 लीटर अदरक की चाय के सेवन के बाद औसत अधिकतम प्लाज्मा सांद्रता केवल 42.0 ± 16.3 एनएमओएल एल−1 थी। चूंकि पिछले अध्ययनों में इन [6] - जिंजरॉल सांद्रता का साइटोकिन स्राव पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा था, [9] यह स्पष्ट नहीं है कि 1 लीटर अदरक की चाय के सेवन के बाद रक्त प्लाज्मा में पहुंचने वाली 50 एनएमओएल एल-1 की आहार संबंधी प्रासंगिक एकाग्रता, अन्य मानव प्राथमिक ल्यूकोसाइट्स में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने के लिए पर्याप्त है या नहीं।

मानव न्यूट्रोफिल के लिए, TRPV1 की कार्यात्मक भूमिका के बारे में ज्ञान सीमित है। जबकि कोसे और नाज़िरोग्लू˘ [10] ने टीआरपीवी1 प्रतिपक्षी कैप्साज़ेपाइन द्वारा कम किए जाने वाले 10 μM कैप्साइसिन के जवाब में न्यूट्रोफिल में Ca2+-फ्लक्स दिखाया, एक पता लगाने योग्य TRPV1 RNA अभिव्यक्ति के बावजूद, 1-100 μM की एकाग्रता सीमा में परीक्षण करने पर अन्य परिणामों ने Ca2+ प्रवाह को प्रेरित करने के लिए कैप्साइसिन प्रदर्शित नहीं किया।[11]

न्यूट्रोफिल मानव रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले ल्यूकोसाइट्स हैं, जो सभी परिसंचारी श्वेत रक्त कोशिकाओं का 60-70% हिस्सा बनाते हैं। वे पहली प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो संक्रमण के स्थानों पर भर्ती होती हैं; इसलिए उन्हें अक्सर रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में जाना जाता है।[12] न्यूट्रोफिल की भर्ती, अन्य चीजों के अलावा, बैक्टीरिया या माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न पेप्टाइड एन-फॉर्मिलमेथिओनिन-ल्यूसील-फेनिलएलनिन (एफएमएलएफ) या केमोकाइन्स जैसे सीएक्ससीएल 8 ({{0%)) से शुरू होती है।[13]

न्यूट्रोफिल के रक्षा तंत्र में फागोसाइटोसिस, [14] डीग्रेनुलेशन के माध्यम से एंटी-माइक्रोबियल एंजाइम रिलीज, [15] प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी, [16] और न्यूट्रोफिल बाह्यकोशिकीय जाल का निर्माण शामिल है। [17] इन प्रत्यक्ष रक्षा तंत्रों के अलावा, न्यूट्रोफिल विभिन्न साइटोकिन्स और केमोकाइन्स की रिहाई के माध्यम से बाद की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में योगदान करते हैं। [18] इसके अलावा, न्यूट्रोफिल एक प्राइमिंग प्रक्रिया से गुजर सकते हैं जो उन्हें बाद के पूर्ण सक्रियण के लिए अधिक दृढ़ता से प्रतिक्रिया करने में सक्षम बनाता है। [16बी]

हाल के वर्षों में, इस बात के प्रमाण बढ़े हैं कि भोजन और औषधीय पौधों के तत्व मानव न्यूट्रोफिल की उल्लिखित रक्षा प्रतिक्रियाओं में से एक या अधिक को संशोधित कर सकते हैं। इन संशोधनों में बढ़ी हुई फागोसाइटोटिक गतिविधि [19] और आरओएस पीढ़ी, [20] एफएमएलएफ की ओर संवर्धित कीमोटैक्सिस, [21] और न्यूट्रोफिल बाह्यकोशिकीय जाल का निर्माण शामिल है। हालाँकि, सक्रिय यौगिक की पहचान नहीं की गई थी। फेरूला एकिट्सकेंसिस (𝛽-पिनीन, सबाइनीन, 𝛾-टेरपिनीन, गेरानिलैसिटोन और आइसोबोर्निलसेटेट) के घटकों ने न्यूट्रोफिल को एफएमएलएफ- और सीएक्ससीएल8- प्रेरित सीए 2+ प्रवाह और बाधित एफएमएलएफ प्रेरित केमोटैक्सिस के प्रति संवेदनशील बना दिया, जिसमें गेरानिलएसीटोन-प्रेरित प्रभावों की मध्यस्थता की गई टीआरपीवी1.[22]

उपलब्ध आंकड़ों के आधार पर, हमने अनुमान लगाया कि [6] -जिंजरोल द्वारा टीआरपीवी1 का लिगैंड प्रेरित सक्रियण सामान्य न्यूट्रोफिल कार्यों को सीधे या सक्रिय उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं को बढ़ाकर प्रभावित कर सकता है। इस परिकल्पना के दायरे में, हमने विशेष रूप से यह स्पष्ट करने का लक्ष्य रखा है कि क्या सत्यापित पोषण संबंधी प्रासंगिक एकाग्रता ल्यूकोसाइट आबादी के हिस्से के रूप में मानव प्राथमिक न्यूट्रोफिल में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए पर्याप्त है। '

इसके अलावा, हमने मानव ल्यूकोसाइट्स में टीआरपी चैनल अभिव्यक्ति का गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से व्यापक अवलोकन प्राप्त करने के लिए मानव रक्त में पांच सबसे प्रमुख सेल प्रकारों में स्तनधारी टीआरपी सुपरफैमिली के सभी सदस्यों के आरएनए अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना करने की मांग की।

2. परिणाम

2.1. मानव ल्यूकोसाइट्स में टीआरपी चैनलों की प्रचुरता और सापेक्ष प्रतिलेख स्तर

रक्त ल्यूकोसाइट्स में टीआरपी चैनल आरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, सबसे प्रमुख ल्यूकोसाइट सेल प्रकारों में से पांच को स्वस्थ दाताओं के रक्त से अलग किया गया था और टीआरपी चैनलों की आरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (चित्रा 1) के माध्यम से किया गया था।

विश्लेषण किए गए सभी प्रकार की कोशिकाओं में 75-100% की उच्च आवृत्तियों के साथ टीआरपीवी के साथ-साथ टीआरपीएम परिवार के विशिष्ट प्रतिलेखों का पता लगाया गया। सभी सेल प्रकारों पर विचार करने पर औसत समग्र आवृत्ति टीआरपीवी परिवार के लिए 96% और टीआरपीएम परिवार के लिए 98% थी। टीआरपीसी-विशिष्ट प्रतिलेख बहुत कम प्रचुर मात्रा में थे, मोनोसाइट्स, एनके कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं में 0% से लेकर एनके कोशिकाओं में 100% तक, और टी कोशिकाओं की कुल औसत आवृत्ति केवल 53% (चित्रा 1 ए) थी। TRPC5-विशिष्ट प्रतिलेख केवल 70% की आवृत्ति के साथ न्यूट्रोफिल में पाया गया था।

इसके अलावा, TRPA1-विशिष्ट प्रतिलेख में आम तौर पर न्युट्रोफिल में 100%, मोनोसाइट्स में 25%, एनके कोशिकाओं में 80%, टी कोशिकाओं में 100% और बी कोशिकाओं में 60% की आवृत्ति के साथ विश्लेषण किए गए सेल प्रकारों में कम प्रचुरता का पता चला। इसी तरह, टीआरपीएमएल3-विशिष्ट प्रतिलेख ने न्यूट्रोफिल (50%), मोनोसाइट्स (25%), एनके कोशिकाओं (40%), और बी कोशिकाओं (20%) में कम आवृत्ति दिखाई, लेकिन टी कोशिकाओं में 100% की आवृत्ति दिखाई। TRPV1- विशिष्ट प्रतिलेख सभी प्रकार की कोशिकाओं में पाया गया, जिसमें मोनोसाइट्स, एनके कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में 100% की आवृत्ति और न्यूट्रोफिल में 90% और बी कोशिकाओं में 80% की आवृत्ति दिखाई गई।

सापेक्ष आरएनए अभिव्यक्ति के संबंध में, संबंधित आवृत्तियों की तुलना में, टीआरपी चैनलों ने अधिक सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न का खुलासा किया, जैसा कि विश्लेषण किए गए विभिन्न सेल प्रकारों में संबंधित Δct मानों की तुलना से स्पष्ट है (चित्र 1बी)। उदाहरण के लिए, TRPP3 को सभी प्रकार की कोशिकाओं में 100% की आवृत्ति के साथ पाया गया, लेकिन स्पष्ट रूप से मोनोसाइट्स में उच्चतम अभिव्यक्ति स्तर का पता चला।

इसके विपरीत, तुलनात्मक रूप से उच्च आरएनए-अभिव्यक्ति स्तर के साथ-साथ उच्च आवृत्ति के साथ, जांच की गई सभी प्रकार की कोशिकाओं में टीआरपीवी2 चैनल पाया गया। इसी तरह, जांच की गई सभी प्रकार की कोशिकाओं में टीआरपीवी1 का प्रतिलेख स्तर समान था (चित्र 1बी)।

2.2. न्यूट्रोफिल पर TRPV1 सतही अभिव्यक्ति

मानव न्यूट्रोफिल में टीआरपीवी1 के कार्य के बारे में वर्तमान ज्ञान अभी भी अस्पष्ट है। मानव न्यूट्रोफिल में टीआरपीवी1 की भूमिकाओं का और पता लगाने के लिए, हमने अगली बार जांच की कि क्या टीआरपीवी1 चैनल जीवित कोशिका प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 2) का उपयोग करके प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल की सतह पर व्यक्त किया गया है।

पृथक न्यूट्रोफिल को सीडी15 के लिए न्यूट्रोफिल के लिए एक सतह मार्कर के रूप में दाग दिया गया था (चित्रा 2ए,बी) और साथ ही या तो टीआरपीवी1 प्रोटीन (चित्रा 2बी) के पहले बाह्य कोशिकीय लूप में एक एपिटोप के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था (चित्रा 2बी) या संबंधित आइसोटाइप नियंत्रण, बाद वाला अनिर्दिष्ट बंधन को मापने के लिए सरोगेट के रूप में कार्य कर रहा था (चित्रा 2ए)। सीडी15+ आबादी के भीतर, एफआईटीसी के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण किया गया था। टीआरपीवी1 एंटीबॉडी के साथ न्यूट्रोफिल के धुंधलापन से आइसोटाइप नियंत्रण की तुलना में स्पष्ट रूप से अलग-अलग प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त हुआ, जिससे प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल (चित्रा 2सी) में टीआरपीवी1 की सतह अभिव्यक्ति की पुष्टि हुई। चार व्यक्तिगत दाताओं से न्यूट्रोफिल का विश्लेषण करने से टीआरपीवी1 (चित्र 2डी) की तुलनीय सतह अभिव्यक्ति का पता चला।

2.3. [6]-जिंजरॉल प्रेरित इंट्रासेल्युलर सीए में वृद्धि2+

चूँकि TRPV1 के लिगैंड-प्रेरित सक्रियण के परिणामस्वरूप Ca2+ का प्रवाह होगा, [23] इंट्रासेल्युलर Ca2+ न्यूट्रोफिल की सांद्रता Ca2+-संवेदनशील डाई Fura-2 के माध्यम से निर्धारित की गई थी। हमारे पिछले निष्कर्षों के आधार पर, [9] प्रसिद्ध टीआरपीवी1 लिगैंड [6] -जिंजरॉल की 50 एनएम की सांद्रता और 2 घंटे का ऊष्मायन समय चुना गया था। विश्लेषणों से पता चला कि 50 एनएम [6]-जिंजरोल के साथ न्यूट्रोफिल के ऊष्मायन के परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर सीए 2+ सांद्रता में वृद्धि हुई, जो औसतन अधिकतम मूल्य का 18.4% ± 1.0% थी, जैसा कि आयनोफोर आयनोमाइसिन के 1 μM लगाने से निर्धारित होता है। डीएमएसओ द्वारा प्रेरित वृद्धि 4.7% ± 1.2% थी (चित्र 3)।

2.4. [6]-जिंजरॉल का टीआरपीवी1 अभिव्यक्ति पर प्रभाव

इसके बाद, हमारा लक्ष्य क्यू-आरटीपीसीआर के माध्यम से प्रतिलेख स्तर पर और साथ ही जीवित कोशिका धुंधलापन के माध्यम से सतह प्रोटीन स्तर पर टीआरपीवी1 अभिव्यक्ति पर [6]-जिंजरोल द्वारा टीआरपीवी1 उत्तेजना के प्रभाव का विश्लेषण करना है। इस प्रयोजन के लिए, मानव न्यूट्रोफिल को 50 एनएम [6] - जिंजरोल के साथ 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया और संबंधित अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किया गया।

इस 2 घंटे के ऊष्मायन ने न तो TRPV1 प्रतिलेख और न ही प्रोटीन स्तर (चित्रा 4) को प्रभावित किया, और IL6, IL17A, IL24, C5 और GDF5 को छोड़कर, सामान्य साइटोकिन और केमोकाइन जीन की आरएनए अभिव्यक्ति की जांच नहीं की (चित्र S1, तालिका S2, सहायक जानकारी)।

2.5. न्यूट्रोफिल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति पर [6]-जिंजरॉल का प्रभाव

1 परिचय

इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों के साथ खाद्य सामग्री की उनके संबंधित आणविक लक्ष्यों के साथ पहचान ने हाल के वर्षों में बढ़ी हुई रुचि को आकर्षित किया है। उनकी उच्च लिगैंड विविधता के कारण, आयन चैनलों (टीआरपी चैनल) का क्षणिक रिसेप्टर संभावित सुपरफैमिली संभावित लक्ष्य संरचनाओं के एक बहुत ही दिलचस्प वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है।

स्तनधारी टीआरपी चैनल सुपरफैमिली में छह संबंधित प्रोटीन परिवार शामिल हैं, अर्थात् एकिरिन (टीआरपीए), कैनोनिकल (टीआरपीसी), मेलास्टैटिन (टीआरपीएम), म्यूकोलिपिन (टीआरपीएमएल), पॉलीसिस्टिन (टीआरपीपी), और वैनिलॉइड (टीआरपीवी) परिवार, जिनमें से सभी आम तौर पर छह ट्रांसमेम्ब्रेन खंड साझा करते हैं जो अलग-अलग कटियन चयनात्मकता के साथ कटियन-पारगम्य छिद्र बनाने के लिए टेट्रामर्स के रूप में इकट्ठे होते हैं। टीआरपीवी1 चैनल, अब तक, टीआरपी सुपरफैमिली का सबसे गहन जांच वाला सदस्य हो सकता है। TRPV1 को शुरू में मिर्च के तीखे घटक कैप्साइसिन के रिसेप्टर के रूप में पहचाना गया था।[2] बाद में, अदरक के तीखे तत्व, जिंजरोल्स को भी टीआरपीवी1 को सक्रिय करते हुए दिखाया गया।[3]

गैर-न्यूरोनल कोशिका प्रकारों में टीआरपीवी1 की जैविक भूमिका अभी भी व्यापक जांच के अधीन है, फिर भी उपलब्ध परिणाम संवेदी और थर्मल धारणा से कहीं अधिक कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, टीआरपीवी1 एगोनिस्ट नॉनिवैमाइड, एक संरचनात्मक कैप्साइसिन एनालॉग की 0.15 मिलीग्राम की दैनिक खुराक के साथ 12 सप्ताह के हस्तक्षेप ने शरीर में वसा द्रव्यमान में आहार-प्रेरित वृद्धि को रोक दिया, और स्वस्थ अधिक वजन वाले विषयों में प्लाज्मा सेरोटोनिन के स्तर में वृद्धि की।[4]

3T3-L1 एडिपोसाइट्स में नॉनिवैमाइड द्वारा TRPV1 के सक्रियण ने PPAR𝛾 अभिव्यक्ति को दबाकर विभेदन और परिपक्वता के दौरान लिपिड संचय को कम कर दिया।[5] मैक्रोफेज में, कैप्साइसिन और नॉनिवैमाइड ने टीआरपीवी1-निर्भर तरीके से आईएल6, सीएक्ससीएल8 और टीएनएफ-अल्फा जैसे प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के एलपीएस-प्रेरित रिलीज को कम कर दिया।[6] फिर भी, मानव रक्त ल्यूकोसाइट्स में टीआरपीवी1 के विशेष कार्य अस्पष्ट बने हुए हैं। मानव एनके कोशिकाओं में, 10 और 50 μM कैप्साइसिन ने इंट्रासेल्युलर Ca2+ सांद्रता में वृद्धि को प्रेरित किया, जो एक कार्यात्मक TRPV1 चैनल का संकेत देता है।[7]

हालाँकि, 10-100 μM की सांद्रता सीमा में 1 घंटे के लिए कैप्साइसिन के साथ कोशिकाओं के पूर्व-उपचार से प्रेरित साइटोटॉक्सिक डीग्रेनुलेशन और साइटोकिन स्राव जैसे एनके सेल प्रभावकारक कार्य काफी हद तक TRPV1 स्वतंत्र थे। टी कोशिकाओं में, टीआरपीवी1 को टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग, टी सेल प्रसार और विभेदन, साथ ही साइटोकिन उत्पादन की प्रक्रियाओं में शामिल होने के लिए प्रलेखित किया गया था। [8] हमारे समूह के पिछले कार्य ने मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में टीआरपीवी1 की कार्यात्मक अभिव्यक्ति का भी प्रदर्शन किया था।[9] इसके अलावा, 0.03 से 300 μmol L−1 तक की सांद्रता में खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण से पता चला कि [6]-जिंजरोल 82.2 μmol L−1 के IC50 मान के साथ प्राथमिक मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा साइटोकिन स्राव को रोकता है।

हालाँकि, स्वस्थ लोगों के प्लाज्मा नमूनों में [6]-जिंजरॉल की मात्रा का पता चला कि 1 लीटर अदरक की चाय के सेवन के बाद औसत अधिकतम प्लाज्मा सांद्रता केवल 42.0 ± 16.3 एनएमओएल एल−1 थी। चूंकि पिछले अध्ययनों में इन [6] - जिंजरॉल सांद्रता का साइटोकिन स्राव पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा था, [9] यह स्पष्ट नहीं है कि 1 लीटर अदरक की चाय के सेवन के बाद रक्त प्लाज्मा में पहुंचने वाली 50 एनएमओएल एल-1 की आहार संबंधी प्रासंगिक एकाग्रता, अन्य मानव प्राथमिक ल्यूकोसाइट्स में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने के लिए पर्याप्त है या नहीं।

मानव न्यूट्रोफिल के लिए, TRPV1 की कार्यात्मक भूमिका के बारे में ज्ञान सीमित है। जबकि कोसे और नाज़िरोग्लू˘ [10] ने टीआरपीवी1 प्रतिपक्षी कैप्साज़ेपाइन द्वारा कम किए जाने वाले 10 μM कैप्साइसिन के जवाब में न्यूट्रोफिल में Ca2+-फ्लक्स दिखाया, एक पता लगाने योग्य TRPV1 RNA अभिव्यक्ति के बावजूद, 1-100 μM की एकाग्रता सीमा में परीक्षण करने पर अन्य परिणामों ने Ca2+ प्रवाह को प्रेरित करने के लिए कैप्साइसिन प्रदर्शित नहीं किया।[11]

न्यूट्रोफिल मानव रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले ल्यूकोसाइट्स हैं, जो सभी परिसंचारी श्वेत रक्त कोशिकाओं का 60-70% हिस्सा बनाते हैं। वे पहली प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो संक्रमण के स्थानों पर भर्ती होती हैं; इसलिए उन्हें अक्सर रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में जाना जाता है।[12] न्यूट्रोफिल की भर्ती, अन्य चीजों के अलावा, बैक्टीरिया या माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न पेप्टाइड एन-फॉर्मिलमेथिओनिन-ल्यूसील-फेनिलएलनिन (एफएमएलएफ) या केमोकाइन्स जैसे सीएक्ससीएल 8 ({{0%)) से शुरू होती है।[13]

न्यूट्रोफिल के रक्षा तंत्र में फागोसाइटोसिस, [14] डीग्रेनुलेशन के माध्यम से एंटी-माइक्रोबियल एंजाइम रिलीज, [15] प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी, [16] और न्यूट्रोफिल बाह्यकोशिकीय जाल का निर्माण शामिल है। [17] इन प्रत्यक्ष रक्षा तंत्रों के अलावा, न्यूट्रोफिल विभिन्न साइटोकिन्स और केमोकाइन्स की रिहाई के माध्यम से बाद की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में योगदान करते हैं। [18] इसके अलावा, न्यूट्रोफिल एक प्राइमिंग प्रक्रिया से गुजर सकते हैं जो उन्हें बाद के पूर्ण सक्रियण के लिए अधिक दृढ़ता से प्रतिक्रिया करने में सक्षम बनाता है। [16बी]

हाल के वर्षों में, इस बात के प्रमाण बढ़े हैं कि भोजन और औषधीय पौधों के तत्व मानव न्यूट्रोफिल की उल्लिखित रक्षा प्रतिक्रियाओं में से एक या अधिक को संशोधित कर सकते हैं। इन संशोधनों में बढ़ी हुई फागोसाइटोटिक गतिविधि [19] और आरओएस पीढ़ी, [20] एफएमएलएफ की ओर संवर्धित कीमोटैक्सिस, [21] और न्यूट्रोफिल बाह्यकोशिकीय जाल का निर्माण शामिल है। हालाँकि, सक्रिय यौगिक की पहचान नहीं की गई थी। फेरूला एकिट्सकेंसिस (𝛽-पिनीन, सबाइनीन, 𝛾-टेरपिनीन, गेरानिलैसिटोन और आइसोबोर्निलसेटेट) के घटकों ने न्यूट्रोफिल को एफएमएलएफ- और सीएक्ससीएल8- प्रेरित सीए 2+ प्रवाह और बाधित एफएमएलएफ प्रेरित केमोटैक्सिस के प्रति संवेदनशील बना दिया, जिसमें गेरानिलएसीटोन-प्रेरित प्रभावों की मध्यस्थता की गई टीआरपीवी1.[22]

उपलब्ध आंकड़ों के आधार पर, हमने अनुमान लगाया कि [6] -जिंजरोल द्वारा टीआरपीवी1 का लिगैंड प्रेरित सक्रियण सामान्य न्यूट्रोफिल कार्यों को सीधे या सक्रिय उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं को बढ़ाकर प्रभावित कर सकता है। इस परिकल्पना के दायरे में, हमने विशेष रूप से यह स्पष्ट करने का लक्ष्य रखा है कि क्या सत्यापित पोषण संबंधी प्रासंगिक एकाग्रता ल्यूकोसाइट आबादी के हिस्से के रूप में मानव प्राथमिक न्यूट्रोफिल में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए पर्याप्त है। '

इसके अलावा, हमने मानव ल्यूकोसाइट्स में टीआरपी चैनल अभिव्यक्ति का गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से व्यापक अवलोकन प्राप्त करने के लिए मानव रक्त में पांच सबसे प्रमुख सेल प्रकारों में स्तनधारी टीआरपी सुपरफैमिली के सभी सदस्यों के आरएनए अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना करने की मांग की।

2. परिणाम

2.1. मानव ल्यूकोसाइट्स में टीआरपी चैनलों की प्रचुरता और सापेक्ष प्रतिलेख स्तर

रक्त ल्यूकोसाइट्स में टीआरपी चैनल आरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, सबसे प्रमुख ल्यूकोसाइट सेल प्रकारों में से पांच को स्वस्थ दाताओं के रक्त से अलग किया गया था और टीआरपी चैनलों की आरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (चित्रा 1) के माध्यम से किया गया था।

विश्लेषण किए गए सभी प्रकार की कोशिकाओं में 75-100% की उच्च आवृत्तियों के साथ टीआरपीवी के साथ-साथ टीआरपीएम परिवार के विशिष्ट प्रतिलेखों का पता लगाया गया। सभी सेल प्रकारों पर विचार करने पर औसत समग्र आवृत्ति टीआरपीवी परिवार के लिए 96% और टीआरपीएम परिवार के लिए 98% थी। टीआरपीसी-विशिष्ट प्रतिलेख बहुत कम प्रचुर मात्रा में थे, मोनोसाइट्स, एनके कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं में 0% से लेकर एनके कोशिकाओं में 100% तक, और टी कोशिकाओं की कुल औसत आवृत्ति केवल 53% (चित्रा 1 ए) थी। TRPC5-विशिष्ट प्रतिलेख केवल 70% की आवृत्ति के साथ न्यूट्रोफिल में पाया गया था।

इसके अलावा, TRPA1-विशिष्ट प्रतिलेख में आम तौर पर न्युट्रोफिल में 100%, मोनोसाइट्स में 25%, एनके कोशिकाओं में 80%, टी कोशिकाओं में 100% और बी कोशिकाओं में 60% की आवृत्ति के साथ विश्लेषण किए गए सेल प्रकारों में कम प्रचुरता का पता चला। इसी तरह, टीआरपीएमएल3-विशिष्ट प्रतिलेख ने न्यूट्रोफिल (50%), मोनोसाइट्स (25%), एनके कोशिकाओं (40%), और बी कोशिकाओं (20%) में कम आवृत्ति दिखाई, लेकिन टी कोशिकाओं में 100% की आवृत्ति दिखाई। TRPV1- विशिष्ट प्रतिलेख सभी प्रकार की कोशिकाओं में पाया गया, जिसमें मोनोसाइट्स, एनके कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में 100% की आवृत्ति और न्यूट्रोफिल में 90% और बी कोशिकाओं में 80% की आवृत्ति दिखाई गई।

सापेक्ष आरएनए अभिव्यक्ति के संबंध में, संबंधित आवृत्तियों की तुलना में, टीआरपी चैनलों ने अधिक सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न का खुलासा किया, जैसा कि विश्लेषण किए गए विभिन्न सेल प्रकारों में संबंधित Δct मानों की तुलना से स्पष्ट है (चित्र 1बी)। उदाहरण के लिए, TRPP3 को सभी प्रकार की कोशिकाओं में 100% की आवृत्ति के साथ पाया गया, लेकिन स्पष्ट रूप से मोनोसाइट्स में उच्चतम अभिव्यक्ति स्तर का पता चला।

इसके विपरीत, तुलनात्मक रूप से उच्च आरएनए-अभिव्यक्ति स्तर के साथ-साथ उच्च आवृत्ति के साथ, जांच की गई सभी प्रकार की कोशिकाओं में टीआरपीवी2 चैनल पाया गया। इसी तरह, जांच की गई सभी प्रकार की कोशिकाओं में टीआरपीवी1 का प्रतिलेख स्तर समान था (चित्र 1बी)।

2.2. न्यूट्रोफिल पर TRPV1 सतही अभिव्यक्ति

मानव न्यूट्रोफिल में टीआरपीवी1 के कार्य के बारे में वर्तमान ज्ञान अभी भी अस्पष्ट है। मानव न्यूट्रोफिल में टीआरपीवी1 की भूमिकाओं का और पता लगाने के लिए, हमने अगली बार जांच की कि क्या टीआरपीवी1 चैनल जीवित कोशिका प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 2) का उपयोग करके प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल की सतह पर व्यक्त किया गया है।

पृथक न्यूट्रोफिल को सीडी15 के लिए न्यूट्रोफिल के लिए एक सतह मार्कर के रूप में दाग दिया गया था (चित्रा 2ए,बी) और साथ ही या तो टीआरपीवी1 प्रोटीन (चित्रा 2बी) के पहले बाह्य कोशिकीय लूप में एक एपिटोप के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था (चित्रा 2बी) या संबंधित आइसोटाइप नियंत्रण, बाद वाला अनिर्दिष्ट बंधन को मापने के लिए सरोगेट के रूप में कार्य कर रहा था (चित्रा 2ए)। सीडी15+ आबादी के भीतर, एफआईटीसी के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण किया गया था। टीआरपीवी1 एंटीबॉडी के साथ न्यूट्रोफिल के धुंधलापन से आइसोटाइप नियंत्रण की तुलना में स्पष्ट रूप से अलग-अलग प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त हुआ, जिससे प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल (चित्रा 2सी) में टीआरपीवी1 की सतह अभिव्यक्ति की पुष्टि हुई। चार व्यक्तिगत दाताओं से न्यूट्रोफिल का विश्लेषण करने से टीआरपीवी1 (चित्र 2डी) की तुलनीय सतह अभिव्यक्ति का पता चला।

2.3. [6]-जिंजरॉल प्रेरित इंट्रासेल्युलर सीए में वृद्धि2+

चूँकि TRPV1 के लिगैंड-प्रेरित सक्रियण के परिणामस्वरूप Ca2+ का प्रवाह होगा, [23] इंट्रासेल्युलर Ca2+ न्यूट्रोफिल की सांद्रता Ca2+-संवेदनशील डाई Fura-2 के माध्यम से निर्धारित की गई थी। हमारे पिछले निष्कर्षों के आधार पर, [9] प्रसिद्ध टीआरपीवी1 लिगैंड [6] -जिंजरॉल की 50 एनएम की सांद्रता और 2 घंटे का ऊष्मायन समय चुना गया था। विश्लेषणों से पता चला कि 50 एनएम [6]-जिंजरोल के साथ न्यूट्रोफिल के ऊष्मायन के परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर सीए 2+ सांद्रता में वृद्धि हुई, जो औसतन अधिकतम मूल्य का 18.4% ± 1.0% थी, जैसा कि आयनोफोर आयनोमाइसिन के 1 μM लगाने से निर्धारित होता है। डीएमएसओ द्वारा प्रेरित वृद्धि 4.7% ± 1.2% थी (चित्र 3)।

2.4. [6]-जिंजरॉल का टीआरपीवी1 अभिव्यक्ति पर प्रभाव

इसके बाद, हमारा लक्ष्य क्यू-आरटीपीसीआर के माध्यम से प्रतिलेख स्तर पर और साथ ही जीवित कोशिका धुंधलापन के माध्यम से सतह प्रोटीन स्तर पर टीआरपीवी1 अभिव्यक्ति पर [6]-जिंजरोल द्वारा टीआरपीवी1 उत्तेजना के प्रभाव का विश्लेषण करना है। इस प्रयोजन के लिए, मानव न्यूट्रोफिल को 50 एनएम [6] - जिंजरोल के साथ 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया और संबंधित अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किया गया।

इस 2 घंटे के ऊष्मायन ने न तो TRPV1 प्रतिलेख और न ही प्रोटीन स्तर (चित्रा 4) को प्रभावित किया, और IL6, IL17A, IL24, C5 और GDF5 को छोड़कर, सामान्य साइटोकिन और केमोकाइन जीन की आरएनए अभिव्यक्ति की जांच नहीं की (चित्र S1, तालिका S2, सहायक जानकारी)।

2.5. न्यूट्रोफिल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति पर [6]-जिंजरॉल का प्रभाव

जिंकुई शेन्की गोलियों को टुकड़ों में काटें, नमूने का लगभग 2.0 ग्राम सटीक रूप से तौलें और इसे एक बंद शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित करें। 70% मेथनॉल का 25 एमएल जोड़ें, कुल द्रव्यमान का वजन करें, और 35 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण (300 डब्ल्यू, 40 किलोहर्ट्ज़) करें। कमरे के तापमान तक ठंडा होने के बाद, 70% मेथनॉल के साथ खोए हुए वजन की भरपाई करें और अच्छी तरह से हिलाएं। परीक्षण समाधान प्राप्त करने के लिए 0.45 μm माइक्रोपोरस झिल्ली के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।

 

पता लगाने की तरंग दैर्ध्य का चयन करने के लिए पूर्ण-तरंग दैर्ध्य स्कैनिंग (190-400 एनएम) आयोजित की गई थी। हालाँकि मॉरोनिसाइड और लोगानिन का अधिकतम अवशोषण 230-240 एनएम पर होता है, यह तरंग दैर्ध्य उच्च बेसलाइन शोर से ग्रस्त है। 254 एनएम तरंग दैर्ध्य स्थिर प्रतिक्रिया और कम पृष्ठभूमि हस्तक्षेप सुनिश्चित करता है। पियोनोल, सिनामिक एसिड, एक्टियोसाइड और 7-हाइड्रॉक्सीकौमरिन सभी 254 एनएम पर स्थिर पराबैंगनी अवशोषण उत्पन्न करते हैं। इसलिए, 254 एनएम को बहु-घटक तुल्यकालिक विश्लेषण के लिए एकीकृत पहचान तरंग दैर्ध्य के रूप में चुना गया था।

 

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