सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा से चालकोन सिंथेस की क्लोनिंग, कार्यात्मक पहचान और अभिव्यक्ति विश्लेषण

सार: उद्देश्य

के कार्य का अध्ययन करने के लिएसिस्टान्चे ट्यूबुलोसा से चाल्कोन सिंथेसऔर सफेद, लाल और बैंगनी फूलों में CtCHS जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न।

तरीकोंसीटीसीएचएस जीन को आरटी-पीसीआर द्वारा क्लोन किया गया और बायोइनफॉरमैटिक्स विश्लेषण किया गया। आईपीटीजी द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए पीईटी-28ए-सीटीसीएचएस प्लास्मिड को एस्चेरिचिया कोली में स्थानांतरित किया गया था। सीटीसीएचएस पुनः संयोजक प्रोटीन को सब्सट्रेट पी-कौमारोइल सीओए और मैलोनिल सीओए के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और उत्पादों को एचपीएलसी और एमएस द्वारा पता लगाया गया था। पीसीएम्बिया1300-35एस-जीएफपी-सीटीसीएचएस प्लास्मिड को अरेबिडोप्सिस थालियाना के प्रोटोप्लास्ट में स्थानांतरित किया गया था ताकि सीटीसीएचएस प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का निरीक्षण किया जा सके। तीन रंगों वाले सी. ट्यूबुलोसा के फूलों में सीटीसीएचएस जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का पता qRT-PCR द्वारा लगाया गया था।

परिणामएक CtCHS जीन क्लोन किया गया। ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF) की लंबाई 1173 bp थी, जो 390 अमीनो एसिड को एनकोड करती थी, और प्रोटीन का आणविक भार 42 8000 था।

30% इचिनाकोसाइड और 12% एक्टिओसाइड के साथ ऑर्गेनिक सिस्टान्चे एक्सट्रैक्ट

CtCHS में उत्प्रेरक अवशेष Cys164, His303, Asn336 थे, जो चाल्कोन सिंथेस में संरक्षित थे। CtCHS प्रोटीन को ई. कोली में व्यक्त किया गया और पुनः संयोजक प्रोटीन प्राप्त करने के लिए शुद्ध किया गया। CtCHS प्रोटीन पी-कौमारोइल CoA और मैलोनिल CoA को उत्प्रेरित कर सकता है ताकि नैरिंगिन चाल्कोन का उत्पादन किया जा सके। CtCHS प्रोटीन मुख्य रूप से कोशिका द्रव्य में स्थानीयकृत था। बैंगनी और लाल फूलों में CtCHS जीन अत्यधिक व्यक्त किया गया था, और सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर क्रमशः सफेद फूलों की तुलना में 8.44 और 3.21 गुना अधिक थे।

निष्कर्ष सी. ट्यूबुलोसा के फूल से एक CtCHS जीन क्लोन किया गया और प्रोटीन व्यक्त किया गया। CtCHS प्रोटीन में चाल्कोन सिंथेस फ़ंक्शन होता है, और CtCHS जीन की अभिव्यक्ति गहरे रंग के फूलों में अधिक होती है, जो दर्शाता है कि CtCHS जीन सी. ट्यूबुलोसा के फूल के रंग को नियंत्रित कर सकता है, जो सी. ट्यूबुलोसा के फूल के रंग के विनियमन तंत्र पर आगे के शोध के लिए आधार तैयार करता है।

मुख्य शब्द: सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा (शेंक) वाइट; चाल्कोन सिंथेस; एंजाइम गतिविधि विश्लेषण; उपकोशिकीय स्थानीयकरण; अभिव्यक्ति विश्लेषण

सिस्टान्चे टुबुलोसा(शेंक) वाइट पाइरियल प्रजाति का पौधा है, जो दक्षिणी झिंजियांग [1] में झिंजियांग के हेतियन क्षेत्र [2] में प्राकृतिक रूप से वितरित किया जाता है। पाइप के फूलों में औषधीय गुण अधिक होते हैं। इसके मांस के तने 2020 के संस्करण के स्रोतों में से एक हैं "चीनी फार्माकोपिया". [३] पाइप के फूलों कॉर्डोनस मांस के तने पर शोध में वृद्धि हुई है, लेकिन इसके फूलों पर अपेक्षाकृत कम जैविक शोध हैं। पाइप के फूलों की फूल अवधि अप्रैल से मई तक होती है [४], मुख्य रूप से सफेद, लाल और बैंगनी तीन रंग होते हैं। पाइप के फूल रंग में समृद्ध हैं, लेकिन उनके फूल के रंग विनियमन तंत्र की रिपोर्ट नहीं की गई है। कक्षाएं पंखुड़ी ऊतक संरचना, वर्णक और पर्यावरणीय कारकों और आनुवंशिक कारकों के विनियमन के प्रकार, सामग्री, सामग्री और वितरण से संबंधित हैं [५]। पौधे के फूलों में वर्णक में मुख्य रूप से तीन श्रेणियां शामिल हैं: फ्लेवोनोइड्स, कैरोटीन और बीटीन। रंग, सबसे व्यापक रूप से महान रंग रेंज [७]। फ्लेवोनोइड्स के प्रकार और सामग्री कई पौधों के रंग को प्रभावित करती है, जैसे कि पैयोनिया लैक्टिफ्लोरा पैल की तीन किस्में।

यह सफेद दिखाई देता है, और रंग का मुख्य रंग लाल रंग का होता है और सुंदर क्षमता फूलों को बैंगनी-लाल [8] के रूप में प्रस्तुत करती है। पुष्प रंग कई सजावटी पौधों की एक महत्वपूर्ण विशेषता है, और यह गुलाबी कीटों को आकर्षित करने वाला प्रमुख कारक भी है [9]। अध्ययनों से पता चला है कि यह नीचे पारित हो जाता है कीट के दौरे की सबसे अधिक आवृत्ति गहरे बैंगनी रंग के सिस्टेचे पौधे [10] की होती है। ट्यूब फूल सिस्टानोसॉरस फूलों में सिस्टेनोइड्स के सिंथेटिक आनुवंशिक शोध पर जैविक अनुसंधान के लिए, यह ट्यूब फूल कॉर्डन रंग नियंत्रण तंत्र को स्पष्ट करने, आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी के रंग में सुधार के लिए सैद्धांतिक आधार प्रदान करने, इसके समृद्ध रंगों को बढ़ावा देने, देखने में वृद्धि करने, अनुप्रयोगों के दायरे का विस्तार करने के लिए अनुकूल है।

जैवसंश्लेषण मार्गflavonoidsसे शुरू होता हैफेनिलप्रोपेनॉइड मार्गफेनिलएलनिन को सबसे पहले फेनिलएलनिन एमोनियालाइज़ (पीएएल) की क्रिया के तहत सिनामिक एसिड में परिवर्तित किया जाता है, और सिनामिक एसिड को सिनामिक एसिड द्वारा हाइड्रॉक्सिलेट किया जाता है। एंजाइम (सिनामिक एसिड हाइड्रॉक्सिलेस, C4H) और कूमारेट कोएंजाइम ए लिगेज (कूमारेट कोएंजाइम ए लिगेज, 4CL) प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करके कूमारोइल-सीओए [11] उत्पन्न करते हैं। कूमारोइल-सीओए के एक अणु और मैलोनिल-सीओए के तीन अणुओं को चाल्कोन सिंथेस (सीएचएस) द्वारा उत्प्रेरित करके नारिंजिनिन चाल्कोन उत्पन्न किया जाता हैफ्लेवोनोइड यौगिक.चालकोन आइसोमेरेज, फ्लेवनोन हाइड्रॉक्सिलेस, डायहाइड्रोफ्लेवोनॉल रिडक्टेस इत्यादि का मूल कंकाल विभिन्न प्रकार के फ्लेवोनोइड्स जैसे आइसोफ्लेवोन्स, फ्लेवोनोल्स, एंथोसायनिन इत्यादि उत्पन्न करता है [12]। फ्लेवोनोइड बायोसिंथेटिक मार्ग में एक प्रमुख एंजाइम के रूप में, सीएचएस पौधों में फ्लेवोनोइड्स की सामग्री को नियंत्रित करता है और पौधे के फूल के रंग को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [13]। उदाहरण के लिए, जेंटियाना स्कैबरा बंजी सीएचएस की पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन साइलेंसिंग एंथोसायनिन के बायोसिंथेसिस को बाधित कर सकती है और कोरोला लोब के विशिष्ट सफेदी का कारण बन सकती है [14]। एक्टिनिडिया एरिएंथा बेंथ का सीएचएस जीन साइलेंसिंग। सीएचएस पंखुड़ियों में एंथोसायनिन सामग्री को कम कर देता इसलिए, इस अध्ययन में, सिस्टान्चे डेजर्टीकोला फूलों से एक CtCHS जीन क्लोन किया गया था, और इस पर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण, प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण, एंजाइम गतिविधि विश्लेषण, उपकोशिकीय स्थानीयकरण विश्लेषण और फूलों के तीन रंगों में अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था ताकि CtCHS प्रोटीन के कार्य और CtCHS जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का उपयोग CtCHS और सिस्टान्चे डेजर्टीकोला फूल के रंग के बीच के रिश्ते का प्रारंभिक रूप से पता लगाने के लिए किया जा सके, जिसने सिस्टान्चे डेजर्टीकोला फूल के रंग के नियामक तंत्र के अध्ययन की नींव रखी।

1 सामग्री और उपकरण

1.1 सामग्री

मई 2018 में झिंजियांग के होतान प्रान्त के यूटियन काउंटी से सिस्टांच ट्यूबरोसा के फूल एकत्र किए गए थे। नमूने के दौरान यादृच्छिक सिद्धांत का पालन किया गया था, और अच्छी शारीरिक स्थिति और एक समान पौधे की ऊंचाई वाले सिस्टांच ट्यूबरोसा फूलों का चयन किया गया था। सफेद, लाल और बैंगनी तीन फूलों के रंगों के साथ सिस्टांच डेज़र्टिकोला के तीन उपभेदों को लिया गया और पेकिंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ फार्मेसी के प्रोफेसर टू पेंगफेई द्वारा सिस्टांच ट्यूबुलोसा (शेंक) वाइट के रूप में पहचाना गया। उन्हें जल्दी से तरल नाइट्रोजन में जमाया गया, सूखी बर्फ पर संग्रहीत किया गया, और बीजिंग ले जाया गया। ई. कोली डीएच5 रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं को नानजिंग नोवेजन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था, pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP वेक्टर को वुहान ट्रांसडक्शन बायोलॉजी लेबोरेटरी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था। मैलोनिल-सीओए को सिग्मा कंपनी से खरीदा गया था, 4-कौमारोइल-सीओए, नारिंजिनिन-चाल्कोन को शंघाई युआनये बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था, और नारिंजिनिन को शंघाई मैकलीन बायोकेमिकल टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था।

1.2 उपकरण

नैनोड्रॉप 2000सी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो फिशर कंपनी, यूएसए); ग्रेडिएंट पीसीआर उपकरण (एपेनडॉर्फ कंपनी, जर्मनी); सीएफएक्स 96 फ्लोरोसेंस क्वांटिटेटिव पीसीआर उपकरण, यूवीपी जेल इमेजर, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण, प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण (बायोराड कंपनी, यूएसए); एनस्पायर

माइक्रोप्लेट रीडर (पर्किनएल्मर कंपनी, यूएसए); निरंतर तापमान इनक्यूबेटर (शंघाई जिंगहोंग प्रायोगिक उपकरण कं, लिमिटेड); डीएचजेड-डी बड़ी क्षमता वाला पूर्ण तापमान ऑसिलेटर (ताइकांग प्रायोगिक उपकरण फैक्टरी); टीएचजेड-82एक जल स्नान निरंतर तापमान ऑसिलेटर (जियांग्सू केक्सी इंस्ट्रूमेंट कं, लिमिटेड); एयरटेक अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच (सूज़ौ एंटाई एयर टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड); उच्च दबाव वाला स्टीम स्टेरेलाइज़र (टॉमी कंपनी, जापान); मिलि क्यू शुद्ध जल उपकरण (मिलिपोर, संयुक्त राज्य अमेरिका); एलसी-20एक उच्च दक्षता वाला तरल चरण क्रोमैटोग्राफ (शिमादज़ु कंपनी, जापान); यूपीएलसी-क्यू-एक्सएक्टिव-ऑर्बिट्रैप उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (थर्मो फिशर कंपनी, यूएसए); एफवी1200 लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (ओलंपस कंपनी, जापान)।

2 प्रायोगिक विधियाँ

2.1 आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण। सिस्टांचे डेज़र्टिकोला फूलों को तरल नाइट्रोजन में पीसा गया और फिर आरएनए निष्कर्षण परख के अधीन किया गया।

किट (नॉर्गेन, कैट 17200) का उपयोग करके कुल आरएनए निकाला गया, आरएनए सांद्रता और गुणवत्ता का पता नैनोड्रॉप 2000सी द्वारा लगाया गया, और 1.8 और 2.1 के बीच ए260/ए280 अनुपात वाले आरएनए नमूनों को सीडीएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन संश्लेषण के लिए चुना गया। एम-एमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (प्रोमेगा, एम170बी) का उपयोग योग्य कुल आरएनए को सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब करने के लिए किया गया था। प्रयोगात्मक संचालन निर्देशों के अनुसार किया गया।

2.2 सी.टी.सी.एच.एस. जीन की क्लोनिंग

हमारे शोध समूह [16] के सिस्टान्चे डेज़र्टिकोला फूल ट्रांसक्रिप्टोम डेटा के आधार पर, एक पूर्ण ओपन रीडिंग फ़्रेम के साथ एक CtCHS की स्क्रीनिंग की गई, और जीन अनुक्रम (तालिका 1) के आधार पर विशिष्ट प्राइमरों को डिज़ाइन करने के लिए स्नैपजीन सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया। सिस्टान्चे डेज़र्टिकोला फूल cDNA को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके PCR प्रवर्धन किया गया। प्रवर्धन प्रणाली 2×फैंटा मैक्स बफर 25 μL, dNTP मिक्स (10 mmol/L) 1 μL, अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर (10 μmol/L) 2 μL प्रत्येक, cDNA 2 μL, फैंटा मैक्स सुपर-फिडेलिटी थी।

डीएनए पोलीमरेज़ 1 μL, ddH2O 17 μL. प्रतिक्रिया की स्थितियाँ इस प्रकार थीं: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री पर पूर्व-विकृतीकरण; 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण के 25 चक्र, 15 सेकंड के लिए 55 डिग्री पर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री पर विस्तार; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री पर प्रतिक्रिया विस्तार। पीसीआर उत्पाद का पता 1% एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा लगाया गया था, और डीएनए शुद्धिकरण किट (नोविज़ान, कैट डीसी301-01) का उपयोग जेल रिकवरी के लिए किया गया था, और फिर पुनर्प्राप्त डीएनए को एक तेज़ क्लोनिंग किट (नोविज़ान, कैट सी601-01) द्वारा शुद्ध किया गया था। डीएनए खंड को pCE2 TA/ब्लंट-ज़ीरो वेक्टर के साथ जोड़ा गया, एस्चेरिचिया कोली DH5 सक्षम कोशिकाओं में बदल दिया गया, और 37 डिग्री पर रात भर संवर्धन करने के बाद, एकल क्लोन उपभेदों का चयन किया गया और अनुक्रमण के लिए कंपनी को भेजा गया।

तालिका 1 प्राइमर अनुक्रम

2.3 जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

प्रोटीन के भौतिक और रासायनिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए ProtParam ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; प्रोटीन हाइड्रोफिलिसिटी/हाइड्रोफोबिसिटी का विश्लेषण करने के लिए Prot Scale ऑनलाइन टूल का उपयोग करें; प्रोटीन की द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन टूल SOPMA का उपयोग करें; प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन विश्लेषण सॉफ्टवेयर SWISS-MODEL का उपयोग करें; प्रोटीन की ट्रांसमेम्ब्रेन संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन सॉफ्टवेयर TMHMM का उपयोग करें; CtCHS की होमोलॉजी की तुलना अन्य प्रजातियों के CHS एमिनो एसिड अनुक्रमों के साथ करने के लिए DNAMAN सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; पड़ोसी-ज्वाइनिंग (NJ) और पॉइसन सुधार का उपयोग करके फ़ायलोजेनेटिक पेड़ का निर्माण करने के लिए MEGA-X सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। विकासवादी दूरी की गणना बूटस्ट्रैप विधि का उपयोग करके की जाती है, और बूटस्ट्रैप पुनरावृत्तियों की संख्या 1000 गुना है।

आगे की जांच के लिए यूपीएलसी-क्यू-एक्सएक्टिव-ऑर्बिट्रैप एमएस का इस्तेमाल किया गया। तरल चरण की स्थितियां थीं वाटर्स एक्विटी यूपीएलसी बीईएच शील्ड आरपी18 कॉलम (100 मिमी × 3.0 मिमी, 1.7 माइक्रोन), कॉलम तापमान 40 डिग्री, नारिंजिन, चालकोन और नारिंजिन। नियंत्रण पदार्थ की लोडिंग मात्रा 4 μL है, और एंजाइम प्रतिक्रिया उत्पाद की लोडिंग मात्रा 7 μL है। पानी (ए)-एसिटोनिट्राइल (बी) का उपयोग मोबाइल चरण के रूप में किया जाता है। रेफरेंस ग्रेडिएंट है: 0 से 5 मिनट, 30% बी; 5 से 15 मिनट, 30%~60% बी; 25~31 मिनट, 100%~30% बी. वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर 0.3 एमएल/मिनट है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री की स्थिति इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोत, वाहक गैस के रूप में नाइट्रोजन, म्यान गैस दबाव 3.5 एमपीए, सहायक गैस दबाव 1.0 एमपीए, स्प्रे दबाव 3500 वी, केशिका तापमान 350 डिग्री, सहायक गैस हीटिंग तापमान 200 डिग्री, सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड, स्कैनिंग आयन रेंज एम/जेड 100-1500 है, पूर्ण एमएस रिज़ॉल्यूशन 35 000 है, डीडी-एमएस2 रिज़ॉल्यूशन 17 500 है, (एन)

सीई/स्टेप्ड एनसीई 35, 60 पर सेट।

2.6 सी.टी.सी.एच.एस. प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण

सीटीसीएचएस अनुक्रम और निर्बाध क्लोनिंग के सिद्धांत के आधार पर, एंजाइम कटिंग साइट्स केपीएन Ⅰ और बामएच Ⅰ वाले प्राइमर्स डिजाइन किए गए थे, और इसी लक्ष्य टुकड़ों को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया था। pCAMBIA1300-35S-GFP प्लास्मिड को प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिअस Kpn Ⅰ और बामएच Ⅰ के साथ पचाया गया था, और लक्ष्य टुकड़ा और वेक्टर को निर्बाध क्लोनिंग किट (नोविज़ान, कैट सी115-01) के माध्यम से जोड़ा गया था, और फिर ई. कोली डीएच5 सक्षम कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। अनुक्रमण के लिए एकल क्लोन उपभेदों का चयन करें, और सही उपभेदों से प्लास्मिड निकालें। pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS और pCAMBIA 1300-35S-GFP प्लास्मिड को PEG4000 का उपयोग करके अरेबिडोप्सिस थालियाना प्रोटोप्लास्ट में बदल दिया गया, और 8 से 10 घंटे के लिए कम रोशनी में संवर्धित किया गया। सी.टी.सी.एच.एस. प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया।

2.7 सी.टी.सी.एच.एस. अभिव्यक्ति पैटर्न विश्लेषण

CtCHS अनुक्रम के आधार पर, DNAMAN का उपयोग वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए किया गया था, जिसमें आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में F-बॉक्स था। प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं। विभिन्न रंगों के सिस्टांच डेज़र्टिकोला फूलों में CtCHS की सापेक्ष अभिव्यक्ति का पता वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर द्वारा लगाया गया था। SYBR ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई विधि, प्रतिक्रिया प्रणाली: 2×ट्रांसस्टार्ट ग्रीन qPCR सुपरमिक्स 5 μL, अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर (10) के साथ मापने के लिए ट्रांसस्टार्ट ग्रीन qPCR सुपरमिक्स (पूर्ण स्वर्ण, AQ101-02) का उपयोग करें।

μmol/L) {{0}}.2 μL प्रत्येक, cDNA टेम्पलेट 0.5 μL, न्यूक्लियोटिडेज़-मुक्त पानी 4.1 μL, प्रतिक्रिया के लिए दो-चरण विधि का उपयोग किया गया था, और प्रतिक्रिया प्रक्रिया डोंग जियानजुआन एट अल [18] की विधि पर आधारित थी। प्रत्येक नमूने में 3 जैविक प्रतिकृतियां थीं, और प्रयोग तीन बार दोहराया गया था। प्रायोगिक डेटा का विश्लेषण एक्सेल का उपयोग करके 2

CtCHS की सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना -ΔΔCt विधि का उपयोग करके की गई, और महत्व विश्लेषण करने और हिस्टोग्राम बनाने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म 8 का उपयोग किया गया।