सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा से चालकोन सिंथेस की क्लोनिंग, कार्यात्मक पहचान और अभिव्यक्ति विश्लेषण

सार: उद्देश्य गुआनहुआरोकोन्ग्रोंग (सिस्टान्चे टुबुलोसा) और सफेद, लाल और बैंगनी फूलों में CtCHS जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न।

विधियाँ CtCHS जीन को RT-PCR द्वारा क्लोन किया गया तथा जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण किया गया। PET-28a-CtCHS प्लास्मिड को IPTG द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए एस्चेरिचिया कोली में स्थानांतरित किया गया। CtCHS पुनः संयोजक प्रोटीन को सब्सट्रेट p-कौमारोइल CoA तथा मैलोनिल CoA के साथ इनक्यूबेट किया गया, तथा उत्पादों का HPLC तथा MS द्वारा पता लगाया गया। pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS प्लास्मिड को अरेबिडोप्सिस थालियाना के प्रोटोप्लास्ट में स्थानांतरित किया गया ताकि CtCHS प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का निरीक्षण किया जा सके। फूलों में CtCHS जीन का अभिव्यक्ति पैटर्नसी. ट्यूबुलोसातीन रंगों वाले इस वायरस का पता qRT-PCR द्वारा लगाया गया।

परिणाम एक CtCHS जीन क्लोन किया गया था। ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF) की लंबाई 1173 bp थी, जो 390 अमीनो एसिड को एनकोड करती थी, और प्रोटीन का आणविक भार 42 8000 था। CtCHS में उत्प्रेरक अवशेष Cys164, His303, Asn336 थे, जो चाल्कोन सिंथेस में संरक्षित थे। CtCHS प्रोटीन को E. कोलाई में व्यक्त किया गया और पुनः संयोजक प्रोटीन प्राप्त करने के लिए शुद्ध किया गया। CtCHS प्रोटीन p-कौमारोइल CoA और मैलोनिल CoA को उत्प्रेरित कर सकता है ताकि नैरिंगिन चाल्कोन का उत्पादन किया जा सके। CtCHS प्रोटीन मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत था। CtCHS जीन बैंगनी और लाल फूलों में अत्यधिक व्यक्त किया गया था, और सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर क्रमशः सफेद फूलों की तुलना में 8.44 और 3.21 गुना अधिक थे।

निष्कर्ष एक CtCHS जीन को फूल से क्लोन किया गया थासी. ट्यूबुलोसाऔर प्रोटीन व्यक्त किया गया। सीटीसीएचएस प्रोटीन में चाल्कोन सिंथेस फ़ंक्शन होता है, और सीटीसीएचएस जीन की अभिव्यक्ति गहरे रंग के फूलों में अधिक होती है, जो दर्शाता है कि सीटीसीएचएस जीन सी. ट्यूबुलोसा के फूल के रंग को नियंत्रित कर सकता है, जो इस पर आगे के शोध के लिए आधार तैयार करता हैसी. ट्यूबुलोसा के फूल के रंग का विनियमन तंत्र.

कीवर्ड:सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा (शेंक) वाइट; चाल्कोन सिंथेस; एंजाइम गतिविधि विश्लेषण; उपकोशिकीय स्थानीयकरण; अभिव्यक्ति विश्लेषण

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जैवसंश्लेषणफ्लेवोनोइड्स का मार्गफेनिलप्रोपेनॉयड मार्ग से शुरू होता है।फेनिलएलनिनसबसे पहले सिनामिक एसिड में परिवर्तित किया जाता हैफेनिलएलनिन अमोनियालाइज़ की क्रिया(पीएएल), और सिनामिक एसिड को सिनामिक एसिड द्वारा हाइड्रॉक्सिलेट किया जाता है। एंजाइम (सिनामिक एसिड हाइड्रॉक्सिलेस, C4H) और कौमारेटेकोएंजाइम ए लिगेज (कौमारेटेकोएंजाइम ए लिगेज, 4CL) प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करके कौमारोइल-सीओए [11] उत्पन्न करते हैं। 4-कौमारॉयल-सीओए के एक अणु और मैलोनिल-सीओए के तीन अणुओं को नारिंजिनिन चालकोन उत्पन्न करने के लिए चाकोन सिंथेस (सीएचएस) द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, जिसमें फ्लेवोनोइड यौगिक होते हैं चाकोन आइसोमेरेज़, फ्लेवनोन-3-हाइड्रॉक्सिलेस, डायहाइड्रोफ्लेवोनॉल 4-रिडक्टेस, आदि का मूल कंकाल विभिन्न प्रकार के फ्लेवोनोइड्स जैसे आइसोफ्लेवोन्स, फ्लेवोनोल्स, एंथोसायनिन आदि उत्पन्न करता है [12]। फ्लेवोनोइड बायोसिंथेटिक मार्ग में एक प्रमुख एंजाइम के रूप में, सीएचएस पौधों में फ्लेवोनोइड्स की सामग्री को नियंत्रित करता है और पौधे के फूलों के रंग को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [13]। उदाहरण के लिए, जेंटियाना स्कैबरा एक्टिनिडिया एरिएंथाबेन्थ का सीएचएस जीन साइलेंसिंग। सीएचएस पंखुड़ियों में एंथोसायनिन की मात्रा को कम करता है और पंखुड़ियों को लाल बनाता है। पंखुड़ियों का रंग हल्का हो जाता है[15]। इसलिए, इस अध्ययन में, सिस्टांच ट्यूबुलोसा फूलों से एक सीटीसीएचएस जीन क्लोन किया गया था, और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण, प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण, एंजाइम गतिविधि विश्लेषण, उपकोशिकीय स्थानीयकरण विश्लेषण और फूलों के तीन रंगों में अभिव्यक्ति विश्लेषण इस पर किया गया था ताकि सीटीसीएचएस प्रोटीन के कार्य और सीटीसीएचएस जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का उपयोग सीटीसीएचएस और सिस्टांच ट्यूबुलोसा फूल के रंग के बीच संबंधों का प्रारंभिक रूप से पता लगाने के लिए किया गया था, जिसने नियामक तंत्र के अध्ययन की नींव रखीसिस्टान्चे टुबुलोसा फूल का रंग.

1 सामग्री और उपकरण

1.1 सामग्री

मई 2018 में झिंजियांग के होतान प्रान्त के यूटियन काउंटी से सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा फूल एकत्र किए गए थे। नमूना लेने के दौरान यादृच्छिक सिद्धांत का पालन किया गया था, और अच्छी शारीरिक स्थिति और एक समान पौधे की ऊंचाई वाले सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा फूलों का चयन किया गया था। सफेद, लाल और बैंगनी तीन फूलों के रंगों के साथ सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा के तीन उपभेदों को लिया गया और पेकिंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ फार्मेसी के प्रोफेसर टू पेंगफेई द्वारा सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा (शेंक) वाइट के रूप में पहचाना गया। उन्हें जल्दी से तरल नाइट्रोजन में जमाया गया और फिर सूखी बर्फ के भंडारण में बीजिंग ले जाया गया। ई. कोली डीएच5 रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं को नानजिंग नोवेजन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था, pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP वेक्टर को वुहान ट्रांसडक्शन बायोलॉजी लेबोरेटरी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था। मैलोनिल-सीओए को सिग्मा कंपनी से खरीदा गया था, 4-कौमारोइल-सीओए, नारिंजिनिन-चाल्कोन को शंघाई युआनये बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था, और नारिंजिनिन को शंघाई मैकलीन बायोकेमिकल टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था।

1.2 उपकरण

नैनोड्रॉप 2000सी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो फिशर कंपनी, यूएसए); ग्रेडिएंट पीसीआर उपकरण (एपेनडॉर्फ कंपनी, जर्मनी); सीएफएक्स 96 फ्लोरोसेंस क्वांटिटेटिव पीसीआर उपकरण, यूवीपी जेल इमेजर, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण, प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण (बायोराड कंपनी, यूएसए); एनस्पायर

माइक्रोप्लेट रीडर (पर्किनएल्मर कंपनी, यूएसए); निरंतर तापमान इनक्यूबेटर (शंघाई जिंगहोंग प्रायोगिक उपकरण कं, लिमिटेड); डीएचजेड-डी बड़ी क्षमता वाला पूर्ण तापमान ऑसिलेटर (ताइकांग प्रायोगिक उपकरण फैक्टरी); टीएचजेड-82एक जल स्नान निरंतर तापमान ऑसिलेटर (जियांग्सू केक्सी इंस्ट्रूमेंट कं, लिमिटेड); एयरटेक अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच (सूज़ौ एंटाई एयर टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड); उच्च दबाव वाला स्टीम स्टेरेलाइज़र (टॉमी कंपनी, जापान); मिलि क्यू शुद्ध जल उपकरण (मिलिपोर, संयुक्त राज्य अमेरिका); एलसी-20एक उच्च दक्षता वाला तरल चरण क्रोमैटोग्राफ (शिमादज़ु कंपनी, जापान); यूपीएलसी-क्यू-एक्सएक्टिव-ऑर्बिट्रैप उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (थर्मो फिशर कंपनी, यूएसए); एफवी1200 लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (ओलंपस कंपनी, जापान)।

2 प्रायोगिक विधियाँ

2.1 आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण।

सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा के फूलों को तरल नाइट्रोजन में पीसा गया और फिर आरएनए निष्कर्षण परीक्षण किया गया।

किट (नॉर्गेन, कैट 17200) का उपयोग करके कुल आरएनए निकाला गया, आरएनए सांद्रता और गुणवत्ता का पता नैनोड्रॉप 2000सी द्वारा लगाया गया, और 1.8 और 2.1 के बीच ए260/ए280 अनुपात वाले आरएनए नमूनों को सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए चुना गया। एम-एमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (प्रोमेगा, एम170बी) का उपयोग योग्य कुल आरएनए को सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब करने के लिए किया गया था। प्रयोगात्मक संचालन निर्देशों के अनुसार किया गया।

2.2 सी.टी.सी.एच.एस. जीन की क्लोनिंग

हमारे शोध समूह [16] के सिस्टांच ट्यूबुलोसा फूल ट्रांसक्रिप्टोम डेटा के आधार पर, एक पूर्ण ओपन रीडिंग फ्रेम के साथ एक CtCHS की जांच की गई, और जीन अनुक्रम (तालिका 1) के आधार पर विशिष्ट प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए स्नैपजीन सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया। सिस्टांच ट्यूबुलोसा फूल सीडीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन किया गया। प्रवर्धन प्रणाली 2×फैंटा मैक्स बफर 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर (10 μmol/L) 2 μL प्रत्येक, cDNA 2 μL, फैंटा मैक्स सुपर-फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ 1 μL, ddH2O 17 μL थी। प्रतिक्रिया की स्थित 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण के 25 चक्र, 15 सेकंड के लिए 55 डिग्री पर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री पर विस्तार; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री पर प्रतिक्रिया विस्तार। पीसीआर उत्पाद को 1% एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पता लगाया गया था, और डीएनए शुद्धिकरण किट (नोविज़ान, कैट डीसी301-01) का उपयोग जेल रिकवरी के लिए किया गया था, और फिर पुनर्प्राप्त डीएनए को एक तेज़ क्लोनिंग किट (नोविज़ान, कैट सी601-01) द्वारा शुद्ध किया गया था। डीएनए खंड को pCE2TA/ब्लंट-ज़ीरो वेक्टर के साथ जोड़ा गया, एस्चेरिचिया कोली DH5 सक्षम कोशिकाओं में बदल दिया गया, और 37 डिग्री पर रात भर संवर्धन के बाद, एकल क्लोन उपभेदों का चयन किया गया और अनुक्रमण के लिए कंपनी को भेजा गया।

तालिका 1 प्राइमर अनुक्रम

2.3 जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

प्रोटीन के भौतिक और रासायनिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए ProtParam ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; प्रोटीन हाइड्रोफिलिसिटी/हाइड्रोफोबिसिटी का विश्लेषण करने के लिए Prot Scale ऑनलाइन टूल का उपयोग करें; प्रोटीन की द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन टूल SOPMA का उपयोग करें; प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन विश्लेषण सॉफ्टवेयर SWISS-MODEL का उपयोग करें; प्रोटीन की ट्रांसमेम्ब्रेन संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन सॉफ्टवेयर TMHMM का उपयोग करें; CtCHS की होमोलॉजी की तुलना अन्य प्रजातियों के CHS एमिनो एसिड अनुक्रमों के साथ करने के लिए DNAMAN सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; पड़ोसी-ज्वाइनिंग (NJ) और पॉइसन सुधार का उपयोग करके फ़ायलोजेनेटिक पेड़ का निर्माण करने के लिए MEGA-X सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। विकासवादी दूरी की गणना बूटस्ट्रैप विधि का उपयोग करके की जाती है, और बूटस्ट्रैप पुनरावृत्तियों की संख्या 1000 गुना है।

2.4 सीटीसीएचएस प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

CtCHS अनुक्रम के आधार पर प्रतिबंध साइटों BamHⅠ और XhoⅠ के साथ प्राइमर डिज़ाइन करें, और PCR संबंधित लक्ष्य टुकड़ों को बढ़ाता है। pET-28a वेक्टर और लक्ष्य टुकड़े को एंडोन्यूक्लिअस BamHI का उपयोग करके पचाया गया और क्लोन किए गए स्ट्रेन को अनुक्रमित किया गया, और सही अनुक्रमण के बाद प्लास्मिड निकाला गया। अनुक्रमण द्वारा सत्यापित pET-28a-CtCHS प्लास्मिड को एस्चेरिचिया कोली BL21 (DE3) सक्षम कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। आइसोप्रोपाइल के साथ डिंग निंग एट अल। [17] की विधि देखें

-डी-थियोगैलेक्टोपायरनोसाइड (आईपीटीजी) का उपयोग कम तापमान पर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया गया था और इसे Ni2+ एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम (साइटिवा, कैट 17531901) के माध्यम से शुद्ध किया गया था। प्रोटीन को एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब (मिलिपोर, 30 000) में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित किया गया और डीसॉल्ट किया गया। 20 mmol/L KPB बफर (pH 8.0, जिसमें 1 mmol/LEDTA होता है) में स्टोर करें और लंबे समय तक स्टोरेज के लिए -80 डिग्री रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।

2.5 सी.टी.सी.एच.एस. एंजाइम गतिविधि विश्लेषण

CtCHS एंजाइम प्रतिक्रिया प्रणाली: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS पुनः संयोजक प्रोटीन 20 μL, 37 डिग्री पर पानी के स्नान में 12 घंटे तक प्रतिक्रिया करने के बाद, मिश्रण को 800 μL एथिल एसीटेट के साथ तीन बार निकाला गया, नाइट्रोजन प्रवाह से सुखाया गया, और फिर 100 μL मेथनॉल में भंग कर दिया गया। उत्पाद का पता लगाने के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें। स्थितियाँ अंतिम LP-C18 कॉलम (250 मिमी × 4.6 मिमी, 5 μm), कॉलम तापमान 30 डिग्री, नमूना मात्रा 10 μL, और पानी (A) और एसिटोनिट्राइल (B) प्रवाह के रूप में हैं। चरण, निक्षालन प्रवणता: 0~10

न्यूनतम, 30% बी; 10~20 मिनट, 30%~60% बी; 20~25 मिनट, 60%~70% बी; 25~30 मिनट, 70%~80% बी; 30~35 मिनट, 80%~100 % बी; 35-40 मिनट, 100% बी; 40-46 मिनट, 100%-30% बी। वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर 1 एमएल/मिनट है और पता लगाना 290 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर है।

आगे की जांच के लिए यूपीएलसी-क्यू-एक्सएक्टिव-ऑर्बिट्रैप एमएस का इस्तेमाल किया गया। तरल चरण की स्थितियां थीं वाटर्स एक्विटी यूपीएलसी बीईएच शील्डआरपी18 कॉलम (100 मिमी × 3.0 मिमी, 1.7 माइक्रोन), कॉलम तापमान 40 डिग्री, नारिंजिन-चाल्कोन और नारिंजिन नियंत्रण। उत्पाद की लोडिंग मात्रा 4 μL है, और एंजाइम प्रतिक्रिया उत्पाद की लोडिंग मात्रा 7 μL है। पानी (ए)-एसिटोनिट्राइल (बी) का उपयोग मोबाइल चरण के रूप में किया जाता है। निक्षालन प्रवणता है: 0 से 5 मिनट, 30% बी; 5 से 15 मिनट, 30 %-60% बी; {{ 25-31 मिनट, 100%-30% बी. वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर 0.3 एमएल/मिनट है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री की स्थिति इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोत, वाहक गैस के रूप में नाइट्रोजन, म्यान गैस दबाव 3.5 एमपीए, सहायक गैस दबाव 1.0 एमपीए, स्प्रे दबाव 3500 वी, केशिका तापमान 350 डिग्री, सहायक गैस हीटिंग तापमान 200 डिग्री, सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड, स्कैनिंग आयन रेंज एम/जेड 100-1500 है, पूर्ण एमएस रिज़ॉल्यूशन 35 000 है, डीडी-एमएस2 रिज़ॉल्यूशन 17 500 है, (एन)

सीई/स्टेप्ड एनसीई 35, 60 पर सेट।

2.3 जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

प्रोटीन के भौतिक और रासायनिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए ProtParam ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; प्रोटीन हाइड्रोफिलिसिटी/हाइड्रोफोबिसिटी का विश्लेषण करने के लिए Prot Scale ऑनलाइन टूल का उपयोग करें; प्रोटीन की द्वितीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन टूल SOPMA का उपयोग करें; प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन विश्लेषण सॉफ्टवेयर SWISS-MODEL का उपयोग करें; प्रोटीन की ट्रांसमेम्ब्रेन संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन सॉफ्टवेयर TMHMM का उपयोग करें; CtCHS की होमोलॉजी की तुलना अन्य प्रजातियों के CHS एमिनो एसिड अनुक्रमों के साथ करने के लिए DNAMAN सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; पड़ोसी-ज्वाइनिंग (NJ) और पॉइसन सुधार का उपयोग करके फ़ायलोजेनेटिक पेड़ का निर्माण करने के लिए MEGA-X सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। विकासवादी दूरी की गणना बूटस्ट्रैप विधि का उपयोग करके की जाती है, और बूटस्ट्रैप पुनरावृत्तियों की संख्या 1000 गुना है।

2.4 सीटीसीएचएस प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

CtCHS अनुक्रम के आधार पर प्रतिबंध साइटों BamHⅠ और XhoⅠ के साथ प्राइमर डिज़ाइन करें, और PCR संबंधित लक्ष्य टुकड़ों को बढ़ाता है। pET-28a वेक्टर और लक्ष्य टुकड़े को एंडोन्यूक्लिअस BamHI का उपयोग करके पचाया गया और क्लोन किए गए स्ट्रेन को अनुक्रमित किया गया, और सही अनुक्रमण के बाद प्लास्मिड निकाला गया। अनुक्रमण द्वारा सत्यापित pET-28a-CtCHS प्लास्मिड को एस्चेरिचिया कोली BL21 (DE3) सक्षम कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। आइसोप्रोपाइल के साथ डिंग निंग एट अल। [17] की विधि देखें

-डी-थियोगैलेक्टोपायरनोसाइड (आईपीटीजी) का उपयोग कम तापमान पर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया गया था और इसे Ni2+ एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम (साइटिवा, कैट 17531901) के माध्यम से शुद्ध किया गया था। प्रोटीन को एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब (मिलिपोर, 30 000) में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित किया गया और डीसॉल्ट किया गया। 20 mmol/L KPB बफर (pH 8.0, जिसमें 1 mmol/LEDTA होता है) में स्टोर करें और लंबे समय तक स्टोरेज के लिए -80 डिग्री रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।

2.5 सी.टी.सी.एच.एस. एंजाइम गतिविधि विश्लेषण

CtCHS एंजाइम प्रतिक्रिया प्रणाली: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS पुनः संयोजक प्रोटीन 20 μL, 37 डिग्री पर पानी के स्नान में 12 घंटे तक प्रतिक्रिया करने के बाद, मिश्रण को 800 μL एथिल एसीटेट के साथ तीन बार निकाला गया, नाइट्रोजन प्रवाह से सुखाया गया, और फिर 100 μL मेथनॉल में भंग कर दिया गया। उत्पाद का पता लगाने के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें। स्थितियाँ अंतिम LP-C18 कॉलम (250 मिमी × 4.6 मिमी, 5 μm), कॉलम तापमान 30 डिग्री, नमूना मात्रा 10 μL, और पानी (A) और एसिटोनिट्राइल (B) प्रवाह के रूप में हैं। चरण, निक्षालन प्रवणता: 0~10

न्यूनतम, 30% बी; 10~20 मिनट, 30%~60% बी; 20~25 मिनट, 60%~70% बी; 25~30 मिनट, 70%~80% बी; 30~35 मिनट, 80%~100 % बी; 35-40 मिनट, 100% बी; 40-46 मिनट, 100%-30% बी। वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर 1 एमएल/मिनट है और पता लगाना 290 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर है।

आगे की जांच के लिए यूपीएलसी-क्यू-एक्सएक्टिव-ऑर्बिट्रैप एमएस का इस्तेमाल किया गया। तरल चरण की स्थितियां थीं वाटर्स एक्विटी यूपीएलसी बीईएच शील्डआरपी18 कॉलम (100 मिमी × 3.0 मिमी, 1.7 माइक्रोन), कॉलम तापमान 40 डिग्री, नारिंजिन-चाल्कोन और नारिंजिन नियंत्रण। उत्पाद की लोडिंग मात्रा 4 μL है, और एंजाइम प्रतिक्रिया उत्पाद की लोडिंग मात्रा 7 μL है। पानी (ए)-एसिटोनिट्राइल (बी) का उपयोग मोबाइल चरण के रूप में किया जाता है। निक्षालन प्रवणता है: 0 से 5 मिनट, 30% बी; 5 से 15 मिनट, 30 %-60% बी; {{ 25-31 मिनट, 100%-30% बी. वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर 0.3 एमएल/मिनट है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री की स्थिति इलेक्ट्रोस्प्रे आयन स्रोत, वाहक गैस के रूप में नाइट्रोजन, म्यान गैस दबाव 3.5 एमपीए, सहायक गैस दबाव 1.0 एमपीए, स्प्रे दबाव 3500 वी, केशिका तापमान 350 डिग्री, सहायक गैस हीटिंग तापमान 200 डिग्री, सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड, स्कैनिंग आयन रेंज एम/जेड 100-1500 है, पूर्ण एमएस रिज़ॉल्यूशन 35 000 है, डीडी-एमएस2 रिज़ॉल्यूशन 17 500 है, (एन)

सीई/स्टेप्ड एनसीई 35, 60 पर सेट।

2.6 सी.टी.सी.एच.एस. प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण

सीटीसीएचएस अनुक्रम और निर्बाध क्लोनिंग के सिद्धांत के आधार पर, एंजाइम कटिंग साइट्स केपीएन Ⅰ और बामएच Ⅰ वाले प्राइमर्स डिजाइन किए गए थे, और इसी लक्ष्य टुकड़ों को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया था। pCAMBIA1300-35S-GFP प्लास्मिड को प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिअस Kpn Ⅰ और बामएच Ⅰ के साथ पचाया गया था, और लक्ष्य टुकड़ा और वेक्टर को निर्बाध क्लोनिंग किट (नोविज़ान, कैट सी115-01) के माध्यम से जोड़ा गया था, और फिर ई. कोली डीएच5 सक्षम कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। अनुक्रमण के लिए एकल क्लोन उपभेदों का चयन करें, और सही उपभेदों से प्लास्मिड निकालें। pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS और pCAMBIA 1300-35S-GFP प्लास्मिड को PEG4000 का उपयोग करके अरेबिडोप्सिस थालियाना प्रोटोप्लास्ट में बदल दिया गया, और 8 से 10 घंटे के लिए कम रोशनी में संवर्धित किया गया। सी.टी.सी.एच.एस. प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया।

2.7 सी.टी.सी.एच.एस. अभिव्यक्ति पैटर्न विश्लेषण

वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक प्राइमरों को CtCHS अनुक्रम के आधार पर DNAMAN का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया था, जिसमें आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में F-बॉक्स था। प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं। विभिन्न रंगों के सिस्टांच ट्यूबलोसा फूलों में CtCHS की सापेक्ष अभिव्यक्ति का पता वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर द्वारा लगाया गया था। SYBRGreen फ्लोरोसेंट डाई विधि से मापने के लिए ट्रांसस्टार्ट ग्रीन qPCR सुपरमिक्स (फुल गोल्ड, AQ101-02) का उपयोग करें। प्रतिक्रिया प्रणाली: 2×ट्रांसस्टार्टग्रीन qPCR सुपरमिक्स 5 μL, अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर (10 μmol/L) 0.2 μL प्रत्येक, cDNA टेम्प्लेट 0.5 μL, 4.1 μL न्यूक्लियोटाइड्स मुक्त पानी का उपयोग दो-चरण विधि का उपयोग करके प्रतिक्रिया के लिए किया गया था। प्रत्येक नमूने में 3 जैविक प्रतिकृतियां थीं, और प्रयोग तीन बार दोहराया गया था। प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण एक्सेल का उपयोग करके किया गया था, CtCHS की सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना 2−ΔΔCt विधि का उपयोग करके की गई थी, और महत्व विश्लेषण करने और हिस्टोग्राम बनाने के लिए ग्राफपैडप्रिज्म 8 का उपयोग किया गया था।