सीएलआर-एफ एक्सप्रेशन किडनी की प्रतिरक्षा और मेटाबोलिक होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है

माउस एनके जीन कॉम्प्लेक्स (एनकेसी) में क्लेक2एच द्वारा एन्कोड किया गया सी-टाइप लेक्टिन-संबंधित प्रोटीन, सीएलआर-एफ, प्रतिरक्षा नियामक लेक्टिन के एक परिवार का सदस्य है जो शरीर के विभिन्न ऊतकों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मार्गदर्शन करता है। सीएलआर-एफ गुर्दे में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है; हालाँकि, इस अंग में इसकी गतिविधि अज्ञात है। गुर्दे के स्वास्थ्य और कार्य में सीएलआर-एफ की आवश्यकता का आकलन करने के लिए, हमने सीएलईसी2एच जीन में लक्षित विलोपन द्वारा सीएलआर-एफ-कमी वाला माउस (सीएलआर-एफ -/-) उत्पन्न किया। सीएलआर-एफ की कमी वाले चूहों में ग्लोमेरुलर और ट्यूबलर घाव, इम्युनोग्लोबुलिन और सी 3 पूरक प्रोटीन रीनल जमा, और महत्वपूर्ण पेट और एक्टोपिक लिपिड संचय प्रदर्शित हुए। 7, 13 और 24 सप्ताह की उम्र में सीएलआर-एफ -/- चूहों के संपूर्ण किडनी ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल विश्लेषण से लिपिड चयापचय प्रक्रियाओं, तनाव प्रतिक्रियाओं और सूजन मध्यस्थों में एक गतिशील विकृति का पता चला। सीएलआर-एफ -/- माउस किडनी की विकृति में प्रतिरक्षा योगदान की जांच से ट्यूबलोइंटरस्टिटियम की कोशिकाओं में ऊंचे आईएल -12 और आईएफएन और न्यूट्रोफिल और टी और बी लिम्फोसाइटों की घुसपैठ की आबादी की पहचान की गई। Rag1−/−Clr-f−/− पृष्ठभूमि में इन अपमानों की उपस्थिति से पता चलता है कि Clr-f−/− चूहे T और B लिम्फोसाइट-स्वतंत्र वृक्क रोगजनन के प्रति संवेदनशील हैं। हमारा डेटा रखरखाव में सीएलआर-एफ की भूमिका को प्रकट करता हैगुर्दे की प्रतिरक्षा और चयापचय होमियोस्टैसिस.

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हानिरहित के प्रति सहनशीलता बनाए रखनाआत्म एंटीजनके लिए एक कठिन कार्य हो सकता हैवृक्क प्रतिरक्षा कोशिकाएं, जो लगातार परिसंचरण से फ़िल्टर किए गए आम तौर पर हानिरहित कम-आणविक-द्रव्यमान प्रोटीन के संपर्क में रहते हैं। इस प्रतिरक्षा नियमन में किडनी की सुरक्षा की कई परतों को नियंत्रण में रखना चाहिए। ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाएं, जो ग्लोमेरुलर फिल्ट्रेट और परिसंचारी रक्त के बीच आयनों, पानी और छोटे अणुओं के आदान-प्रदान को नियंत्रित करती हैं, पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (पीआरआर)1 के परिष्कृत प्रदर्शनों की सूची का उपयोग करके रोगजनक या ऑटो-एंटीजन को पहचानने की क्षमता भी रखती हैं। गुर्दे की निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं, मुख्य रूप से डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी), और मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों की एक छोटी आबादी नेफ्रॉन के आसपास के ट्यूबलोइंटरस्टीशियल स्थान पर कब्जा कर लेती है और विभिन्न प्रकार के पीआरआर2-4 को भी व्यक्त करती है। गुर्दे की बीमारी के संदर्भ में, गुर्दे की क्षति अक्सर ग्लोमेरुलस से शुरू होती है और इंटरस्टिटियम की प्रतिरक्षा कोशिकाओं तक फैल जाती है। ग्लोमेरुलर चोटों के कारण प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की प्रचुरता हो सकती है और ग्लोमेरुलर फिल्ट्रेट और ऑटोएंटीजन का ट्यूबलोइंटरस्टिटियम में रिसाव हो सकता है। इस व्यवधान के परिणामस्वरूप सक्रियण होता हैडीसी द्वारा लिम्फोसाइटों में घुसपैठ करना, जो सूजन संबंधी साइटोकिन्स के अतिरिक्त उत्पादन को प्रेरित करता है जिससे ऊतक को और अधिक क्षति होती है। जबकि वृक्क लिम्फ नोड्स में ऑटोरिएक्टिव टी कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए तंत्र को इंट्रा-रीनल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच स्व-लिगैंड के प्रति सहिष्णुता बनाए रखने के साधन के रूप में प्रस्तावित किया गया है, होमोस्टैसिस को बनाए रखने में किडनी एपिथेलियम की भूमिका के बारे में हमारी समझ कम स्पष्ट है5।

माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग, डलहौजी विश्वविद्यालय, हैलिफ़ैक्स, एनएस, कनाडा। 2 किंग अब्दुल्ला इंटरनेशनल मेडिकल रिसर्च सेंटर, इम्यूनोलॉजी रिसर्च प्रोग्राम, रियाद, सऊदी अरब। 3 बायोकैमिस्ट्री, माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग, ओटावा विश्वविद्यालय, ओटावा, ओएन, कनाडा। 4 नेफ्रोलॉजी प्रभाग, मेडिसिन विभाग, किडनी अनुसंधान केंद्र, ओटावा अस्पताल अनुसंधान संस्थान, ओटावा विश्वविद्यालय, ओटावा, ओएन, कनाडा। 5 पैथोलॉजी और आणविक चिकित्सा विभाग, मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी प्रभाग, मैकमास्टर यूनिवर्सिटी, हैमिल्टन, ओएन, कनाडा। 6 आणविक आनुवंशिकी और हृदय पुनर्जनन प्रयोगशाला, जैव रसायन, सूक्ष्म जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी विभाग, ओटावा विश्वविद्यालय, ओटावा, ओएन, कनाडा। कार्डियक सर्जरी के 7 प्रभाग, ओटावा विश्वविद्यालय हार्ट इंस्टीट्यूट, ओटावा, ओएन, कनाडा। 8 वैक्सीन और इम्यूनोथेरेपी यूनिट, किंग फहद मेडिकल रिसर्च सेंटर, किंग अब्दुलअजीज यूनिवर्सिटी, जेद्दा, सऊदी अरब। 9 चिकित्सा प्रयोगशाला प्रौद्योगिकी विभाग, अनुप्रयुक्त चिकित्सा विज्ञान संकाय, किंग अब्दुलअज़ीज़ विश्वविद्यालय, जेद्दा, सऊदी अरब। 10बीट्राइस हंटर कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट, हैलिफ़ैक्स, एनएस, कनाडा। 11 बायोमेडिकल साइंसेज विभाग, विंडसर विश्वविद्यालय, विंडसर, ओएन, कनाडा। 12 इंस्टीट्यूट फॉर मॉलिक्यूलर मेडिसिन, गोएथे यूनिवर्सिटी फ्रैंकफर्ट, फ्रैंकफर्ट एम मेन, जर्मनी। 13 फ्रैंकफर्ट कैंसर इंस्टीट्यूट, गोएथे यूनिवर्सिटी फ्रैंकफर्ट, फ्रैंकफर्ट एम मेन, जर्मनी। 14माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग, डलहौजी विश्वविद्यालय, सर चार्ल्स टुपर मेडिकल बिल्डिंग, आरएम। 7‑F2, 5850 कॉलेज स्ट्रीट, हैलिफ़ैक्स, NS B3H 4R2, कनाडा। 15माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग, डलहौजी विश्वविद्यालय, सर चार्ल्स टुपर मेडिकल बिल्डिंग, आरएम। 7‑बी2, 5850 कॉलेज स्ट्रीट, हैलिफ़ैक्स, एनएस बी3एच 4आर2, कनाडा। 16इन लेखकों ने समान रूप से योगदान दिया: हग्गाग एस. ज़ीन और एलियास अबू-सामरा। *ईमेल: brendonp@dal.ca; andrew.makrigiannis@dal.ca

का एक सदस्यसतह प्रोटीन का सी-प्रकार लेक्टिन-संबंधित (सीएलआर) परिवार, सीएलआर-एफ (सीएलईसी2एच द्वारा एन्कोडेड), माउस समीपस्थ ट्यूबलर एपिथेलियम और आंत 6,7 में दृढ़ता से व्यक्त किया जाता है। सीएलआर-एफ चूहों में सीएलआर प्रोटीन परिवार के सात सदस्यों में से एक है (सीएलआर-ए/क्लीसी2ई, सीएलआर-बी/क्लीसी2डी, सीएलआर-सी/क्लीसी2एफ, सीएलआर-डी/क्लीसी2जी, सीएलआर-एफ/क्लीसी2एच, सीएलआर-जी/ क्लेक2आई, और सीएलआर-एच/क्लेक2जे), जिनमें अभिव्यक्ति के विशिष्ट और अतिव्यापी ऊतक-विशिष्ट पैटर्न हैं6। सीएलआर प्रोटीन प्रतिरक्षा नियामक अणुओं की विशिष्ट विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि सीएलआर प्रोटीन को आमतौर पर कार्यात्मक प्रतिमान में एनकेआर-पी1 परिवार [एनकेआर-पी1ए (केएलआरबी1ए द्वारा एन्कोडेड) से संबंधित एफवी सी-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स के ऊतक-विशिष्ट लिगैंड के रूप में वर्णित किया जाता है। ), NKR-P1C/Klrb1c, NKR-P1F/Klrb1f, NKR-P1D/Klrb1d, और NKR-P1G/Klrb1g] जो आत्म बनाम गैर-आत्म-पहचान में मध्यस्थता करते हैं और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करते हैं। इस रिसेप्टर प्रणाली प्रतिमान में, सीएलआर-एफ निरोधात्मक एनकेआर-पी1जी रिसेप्टर7 का सूचित स्व-लिगैंड है। मनुष्यों में, CLEC2D द्वारा एन्कोड किया गया लेक्टिन जैसा ट्रांसक्रिप्ट 1 (LLT1), माउस सीएलआर प्रोटीन का कार्यात्मक और संरचनात्मक ऑर्थोलॉग है। एलएलटी1 को लिम्फोसाइट्स, डीसी, ऑस्टियोब्लास्ट्स14-16, और पित्ताशय, पाचन तंत्र, फेफड़े के न्यूमोसाइट्स और वृक्क ट्यूबलर एपिथेलियम17 सहित कोशिकाओं और ऊतकों की एक विस्तृत विविधता में व्यक्त किया जाता है। चूहों में रिसेप्टर-लिगैंड सिस्टम के समान, एलएलटी1 को एनकेआर-पी1ए लेक्टिन-जैसे रिसेप्टर द्वारा पहचाना जाता है, जो माउस एनकेआर-पी1 प्रोटीन18 का एक ऑर्थोलॉग है।

गुर्दे और आंतों के उपकला में सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण स्तर के बावजूद, इन ऊतकों में इसका कार्य अस्पष्ट है। आंत में, लीबेल्ट और सहकर्मियों ने दिखाया कि सीएलआर-एफ को पॉली (आई: सी)-प्रेरित सूजन के बाद आंतों के उपकला कोशिकाओं में अपग्रेड किया जाता है, संभवतः इंट्रापीथेलियल लिम्फोसाइटों द्वारा आंतों के उपकला को प्रतिरक्षा क्षति को सीमित करने के लिए जो निरोधात्मक एनकेआर-पी 1 जी को व्यक्त करते हैं। रिसेप्टर. सीएलआर-एफ की ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति से पता चलता है कि एनकेआर-पी1जी: सीएलआर-एफ पहचान ऊतक-विशिष्ट तरीके से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को विनियमित करती प्रतीत होती है। हालाँकि, वृक्क उपकला कोशिकाओं में सीएलआर-एफ की भूमिका, और जन्मजात के नियमन में इसकी भूमिकाप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँकिडनी में पूरी तरह से अज्ञात है।

यहां हम सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों का उपयोग करके गुर्दे में सीएलआर-एफ की भूमिका का पता लगाते हैं। हम दिखाते हैं कि सीएलआर-एफ की कमी वाले चूहों में ग्लोमेरुली और नलिकाओं से जुड़े रोग संबंधी घाव विकसित होते हैं। इसके अतिरिक्त, हम सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों के ग्लोमेरुली में प्रतिरक्षा परिसरों के आयु-संबंधित जमाव और गुर्दे में घुसपैठ करने वाले न्यूट्रोफिल और टी और बी कोशिकाओं की उपस्थिति को उजागर करते हैं। सीएलआर-एफ-कमी वाले गुर्दे के वैश्विक प्रतिलेख विश्लेषण से लिपिड चयापचय मार्गों और सूजन मार्गों के अनियमित होने का पता चला, जो वृद्धावस्था में सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों की पैथोलॉजिकल प्रगति में प्रतिबिंबित हुआ था, चूहों में पेट में वसा ऊतक और लिपिड का महत्वपूर्ण संचय प्रदर्शित हुआ था। वृक्क कॉर्टिकल इंटरस्टिटियम में। हमारे निष्कर्ष सीएलआर-एफ के लिए किडनी-सुरक्षात्मक भूमिका प्रदान करते हैं, जो प्रतिरक्षा उपसमुच्चय पर इम्यूनोरेगुलेटरी गतिविधि प्रदर्शित करता है और किडनी में चयापचय होमियोस्टैसिस में भूमिका निभा सकता है।

परिणाम

सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों की पीढ़ी।

माउस सीएलआर परिवार के सदस्यों के ऊतक-विशिष्ट वितरण की पिछली रिपोर्ट में यकृत में सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति का निम्न स्तर और गुर्दे और ग्यूटिपिथेलियल ऊतकों 6,7,19 में बहुत उच्च अभिव्यक्ति पाई गई। डब्ल्यूटी माउस किडनी में सीएलआर-एफ के सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न को हल करने के लिए, हमने सीटू संकरण द्वारा डीआइजी-लेबल वाले सीएलआर-एफ-विशिष्ट आरएनए जांच के साथ किडनी के ऊतकों की जांच की। हमने समीपस्थ घुमावदार नलिकाओं की उपकला कोशिकाओं में सीएलआर-एफ ट्रांस्क्रिप्ट विशिष्ट धुंधलापन और डिस्टल वृक्क नलिकाओं के कम स्पष्ट धुंधलापन का पता लगाया (चित्र 1ए)। पोडोसाइट्स में भी सिग्नल पाए गए, लेकिन ग्लोमेरुलर मेसेंजियल और एंडोथेलियल कोशिकाओं में नहीं, न ही किडनी के इंटरस्टिटियम या लिम्फोइड और संवहनी संरचनाओं में, पूरे किडनी एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण20 में रिपोर्ट की गई सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति के साथ संरेखित।

किडनी के स्वास्थ्य और कार्य में सीएलआर-एफ की भूमिका का पता लगाने के लिए, हमने सीएलआर-एफ एक्सॉन 3, 4 और एक्सॉन 5 के भाग के समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता विलोपन द्वारा सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों (सीएलआर-एफ -/-) को उत्पन्न किया। (चित्र 1बी और चित्र एस1)। सीएलआर-एफ -/- चूहों की किडनी, आंत और यकृत कोशिकाओं में सीएलआर-एफ जीन अभिव्यक्ति की आरटीपीसीआर ने पता लगाने योग्य सीएलआर-एफ प्रतिलेख के पूर्ण नुकसान की पुष्टि की। हमने यह भी पुष्टि की कि सबसे निकट से संबंधित सीएलआर प्रतिलेख, सीएलआर-बी और सीएलआर-ए प्रतिलेख, अभी भी पता लगाने योग्य थे (चित्र 1सी)। सीएलआर-एफ -/- चूहों की किडनी और छोटी आंत की इम्यूनोफ्लोरेसेंट (आईएफ) लेबलिंग ने सीएलआर-एफ प्रोटीन अभिव्यक्ति (छवि 1 डी और छवि एस 2 ए) की अनुपस्थिति की पुष्टि की।

चित्र 2. सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों में गुर्दे की विकृति और परिवर्तन प्रदर्शित होते हैंगुर्दा कार्य. (ए) सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों (एन {{3%) से गुर्दे के ऊतक खंड पीएएस से सना हुआ। ऊपरी पैनल सीएलआर-एफ -/- चूहों के समीपस्थ और डिस्टल नलिकाओं में घावों की उपस्थिति दिखाते हैं, जिनकी गंभीरता न्यूनतम उपकला गड़बड़ी (दिखाई नहीं गई है), (आई) कई साइटोप्लास्मिक रिक्तिकाएं (तीर), परमाणु एपिकल विस्थापन के साथ ट्यूबलर एपिथेलियम, और (II) मध्यम और गंभीर घावट्यूबलर एपिथेलियम का गायब होना. सबसे दाहिने पैनल (II) में हरा तीर का सिरा कोशिका हानि के एक क्षेत्र को इंगित करता है जहां ट्यूबलर बेसमेंट झिल्ली साइटोप्लाज्म की एक पतली परत से ढकी होती है। तीर ट्यूबलर ल्यूमिना में अलग कोशिकाओं को इंगित करते हैं और तारांकन संचित नेक्रोटिक मलबे के एक क्षेत्र और उपकला कोशिका ब्रश सीमा के नुकसान को चिह्नित करते हैं। निचले पैनल सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ−/− चूहों (एन=4) से पीएएस से सना हुआ ग्लोमेरुलर अनुभाग दिखाते हैं। सीएलआर-एफ -/- चूहे (I) प्राथमिक चरण और (II) विखंडन और ग्लोमेरुली के स्पष्ट व्यवधान के साथ ग्लोमेरुलर मेसेंजियोलिसिस की एक अलग सीमा प्रदर्शित करते हैं। तीर केशिका धमनीविस्फार (तीर) का संकेत देते हैं। एक तारांकन बोमन के स्थानों में सेलुलर मलबे और प्लाज्मा को नेक्रोटाइज़ करने का संकेत देता है। (बी) देखे गए ग्लोमेरुलर घावों की पैथोलॉजी स्कोरिंग। स्कोर ग्लोमेरुलस के गायब होने के स्तर पर आधारित हैं: 0:<10%, 1: 10–30%, 2: 30–60%, 3:>60%। बुलबुला क्षेत्र कुल गिनती के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है (****पी 0.0001 से कम या उसके बराबर)। (सी) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ सीएलआर-एफ -/- चूहों (लाल तीर) में गंभीर पोडोसाइट विनाश और पोडोसाइट पैर प्रक्रिया के विनाश को प्रदर्शित करते हैं। ऊपरी पैनल में इनसेट बॉक्स निचले पैनल में दिखाए गए हैं। पीला एरोहेड जीबीएम गाढ़ा होने का संकेत देता है, हरा एरोहेड सबेंडोथेलियल इलेक्ट्रॉन-सघन जमाव का संकेत देता है, और नीला एरोहेड माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टोलिसिस का संकेत देता है। ऊपरी पैनल स्केल बार 2 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। निचला बायां और मध्य पैनल स्केल बार 800 एनएम का प्रतिनिधित्व करता है और निचला दायां पैनल स्केल बार 500 एनएम का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) डब्ल्यूटी (एन =2) ​​चूहों और सीएलआर-एफ -/- (एन =3) चूहों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइक्रोग्राफ से जीबीएम मोटाई का माप। प्रत्येक बिंदु एक विशिष्ट जीबीएम माप का प्रतिनिधित्व करता है। (****पी 0.0001 से कम या उसके बराबर)। (ई) यदि आईजीए, आईजीएम, आईजीजी जमाव के लिए डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- ग्लोमेरुलर अनुभागों का धुंधलापन, और (एफ) सी3 सप्ताह पुराने माउस किडनी में प्रोटीन का पूरक है। स्केल बार 40 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। (जी) मूत्र और सीरम नमूनों में प्रोटीन और क्रिएटिनिन माप और 12-सप्ताह के पुरुष सीएलआर-एफ -/- और डब्ल्यूटी चूहों से सोडियम (एफईएनए) मूल्यों का मूत्र आंशिक उत्सर्जन। (एच) संकेतित उम्र में उनके डब्ल्यूटी लिटरमेट्स की तुलना में सीएलआर-एफ -/- चूहों में रक्तचाप माप। माध्य और मानक विचलन दिखाया गया है।

सीएलआर-एफ जीन, सीएलआरबी1जी जीन के साथ जुड़ा हुआ है, जो सीएलआर-एफ के लिए रिपोर्ट किए गए रिसेप्टर एनकेआर-पी1जी को एनकोड करता है। यह आकलन करने के लिए कि क्या सीएलआर-एफ में विलोपन एनकेआरपी1जी की अभिव्यक्ति को बदल देता है, हमने आईएफ (छवि एस2बी, सी) द्वारा डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों के एनकेआर-पी1जी-लेबल वाले आंतों और स्प्लेनिक ऊतकों की छवि बनाई और एनकेआर-पी1जी को मापा। डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों से सीडी 3+ और एनकेपी 46+ स्प्लेनोसाइट्स पर (चित्र। एस2डी, ई)। एनकेआर-पी1जी-आंत और स्प्लेनिक ऊतकों का धुंधलापन और सीएलआर-एफ -/- चूहों के अलग-अलग स्प्लेनोसाइट्स डब्ल्यूटी चूहों से अप्रभेद्य थे, यह पुष्टि करते हुए कि सीएलआर-एफ जीन विलोपन एनकेआर-पी 1 जी प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं करता है।

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