Codonopsis Pilosula Extract मेलानोसाइट्स को H2O से बचाता है2-ऑटोफैगी को सक्रिय करके ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है

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सार:हाल ही में, त्वचा में मेलेनिन की एंटी-एजिंग भूमिका और मेलेनिन उत्पादन के निषेध की पहचान की गई है, त्वचा के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में सक्षम सामग्रियों का विकास ध्यान आकर्षित कर रहा है। इस अध्ययन में, हमने आगे कोडोनोप्सिस पाइलोसुला अर्क (सीपीई) के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव की जांच की और, ऑक्सीडेटिव तनाव के तहत, मेलान में साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव-एच 2 ओ 2 के संपर्क में आने वाले मेलानोसाइट्स। सबसे पहले, सीपीई उपचार ने मेलानोजेनेसिस से जुड़े प्रोटीन को रोककर मेलेनिन उत्पादन को काफी कम कर दिया, जिसमें मेलान में एमएपीके / जेएनके के फॉस्फोराइलेशन के परिणामस्वरूप माइक्रोफथाल्मिया-जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (एमआईटीएफ), टायरोसिनेस और टायरोसिनेज-संबंधित प्रोटीन 2 (टीआरपी 2) शामिल हैं। -ए सेल। अगला, ऑक्सीडेटिव-तनाव-प्रेरित त्वचा की चोट और इसके आणविक तंत्र पर सीपीई के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करने के लिए, हमने मेलानोसाइट्स को एच 2 ओ 2 में उजागर करके ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करने के बाद सीपीई के प्रभाव को निर्धारित किया। सीपीई ने एच2ओ से कोशिकाओं को संरक्षित किया 2- ने बैक्स प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन के जीन एन्कोडिंग की अभिव्यक्ति को कम करके साइटोटोक्सिसिटी को प्रेरित किया, जबकि इसने बी-सेल लिंफोमा (बीसीएल 2) परिवार और एमआईटीएफ को एन्कोडिंग करने वाले जीन को प्रेरित किया, जो एक ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटर है। जो मेलानोसाइट भेदभाव को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, हमारे परिणाम बताते हैं कि सीपीई ने ऑटोफैगी-संबंधित प्रोटीन जैसे बीक्लिन -1 और लाइट चेन 3 (एलसी 3) के उत्पादन को बढ़ाया; इसे 3-मिथाइल एडेनिन (एमए, एक ऑटोफैगी इनहिबिटर) प्रीट्रीटमेंट द्वारा काफी हद तक उलट दिया गया था। सामूहिक रूप से, हमारे निष्कर्षों से पता चलता है कि सीपीई उपचार न केवल सामान्य मेलानोसाइट्स में एक एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव प्रदर्शित करता है, बल्कि ऑटोफैगी और एमआईटीएफ अभिव्यक्ति को प्रेरित करके ऑक्सीडेटिव तनाव के अधीन मेलानोसाइट्स में एक साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव भी प्रदर्शित करता है।लिंग का आकार,इसलिए, हम मानते हैं कि सीपीई मेलानोसाइट्स में कोशिका रखरखाव के लिए एक प्रबल उम्मीदवार है।

कीवर्ड:कोडोनोप्सिस पाइलोसुला; मेलेन-एक कोशिकाएं; मेलेनोजेनेसिस; स्वरभंग; ऑक्सीडेटिव तनाव

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1 परिचय

मानव त्वचा मानव शरीर का सबसे बड़ा अंग है और शरीर को पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों, एलर्जी और ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है। मेलेनिन, जो मुख्य रूप से मेलानोसाइट्स द्वारा निर्मित होता है, त्वचा रोगों को रोकने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है और मानव शरीर के विभिन्न ऊतकों में मौजूद होता है [1,2]। हालांकि, तनाव, पराबैंगनी (यूवी) विकिरण, और उम्र बढ़ने के कारण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के अत्यधिक उत्पादन और संचय के परिणामस्वरूप कई त्वचा विकार होते हैं, जैसे कि हाइपरपिग्मेंटेशन, मेलास्मा और अंततः मेलानोसाइट्स का क्षरण। मेलानोजेनेसिस के उपचार पर कई अध्ययनों ने माइक्रोफथाल्मिया से जुड़े प्रतिलेखन कारक (एमआईटीएफ) और टायरोसिनेस गतिविधि [3-5] की अभिव्यक्ति को विनियमित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। इसके अतिरिक्त, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि त्वचा मेलेनोजेनेसिस को कई मेलेनोजेनिक सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से मध्यस्थ किया जाता है, जिसमें माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) सिग्नलिंग, प्रोटीन किनेज ए (पीकेए), और चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) -मध्यस्थता मार्ग [6] शामिल हैं।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

कोशिकीय स्वरभंग प्रणाली को एक कोशिकीय स्व-पाचन प्रक्रिया के रूप में जाना जाता है जो क्षतिग्रस्त प्रोटीन को नीचा दिखाती है या एक कोशिका में निष्क्रिय अंगों को अलग करती है और फिर सेल होमियोस्टेसिस [7,8] को बनाए रखने के लिए उन्हें लाइसोसोम में विघटित करती है। हाल के अध्ययनों ने ऑटोफैगी की पहचान मेलानोसाइट्स के सामान्य कार्य में शामिल होने और मेलेनिन बनाने वाले प्रतिलेखन कारक MITF की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के रूप में की है। इसलिए, ऑटोफैगी-उत्प्रेरण एजेंटों में यूवी किरणों और लिपिड ऑक्सीकरण से होने वाली क्षति को सीमित करने और मेलानोसाइट्स और केराटिनोसाइट्स [9-11] में होमोस्टैसिस को बनाए रखने की क्षमता होती है।सिस्टैंच पाउडर,हालांकि, प्राकृतिक ऑटोफैगी-उत्प्रेरण तैयारी के आवेदन पर बहुत कम जानकारी है जो ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ मेलानोसाइट्स की रक्षा करती है।

कोडोनोप्सिस पाइलोसुला कोडोनोप्सिस पाइलोसुला (Fr.) नानी की जड़ है, जो कैंपानुला परिवार से संबंधित है। यह कोरिया के गैंगवोन-डो के पहाड़ों में उगाया या उगाया जाता है, और चीन के उत्तरी और पश्चिमी क्षेत्रों में भी वितरित किया जाता है, जैसे कि गुआनक्सी और शांक्सी क्षेत्र [12]। लोक चिकित्सा में, इसका उपयोग सैकड़ों वर्षों से जिनसेंग के विकल्प के रूप में किया जाता रहा है, क्योंकि इसमें समान औषधीय गतिविधियाँ होती हैं, जैसे कि ऊर्जा को फिर से भरना, प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करना, जठरांत्र संबंधी रोगों को कम करना और रक्तचाप को नियंत्रित करना, लेकिन कम कीमत पर। फाइटोकेमिकल अनुसंधान से पता चलता है कि सी। पाइलोसुला में बड़ी मात्रा में सुक्रोज, पॉलीसेकेराइड, ट्राइटरपेन, सैपोनिन, फाइटोस्टेरॉल, फेनोलिक ग्लाइकोसाइड, अल्कलॉइड और पॉलीएसेटिलीन [13] होते हैं। उनमें से, लोबेटिओलिन, सी. पाइलोसुला का प्रमुख एसिटिलीन, एनएफ-केबी को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है और इसका प्रतिरक्षा-उत्तेजक प्रभाव होता है [14] इसके अलावा, सी। पाइलोसुला अर्क के प्रभाव पर हाल के अध्ययनों के अनुसार, एक इथेनॉल अर्क सी। पाइलोसुला ओवलब्यूमिन के कारण होने वाली एलर्जी प्रतिक्रियाओं को महत्वपूर्ण रूप से रोकता है, जबकि एक पानी का अर्क प्लाज्मा ग्लूकोज स्तर को कम करता है, और एक ब्यूटेनॉल अर्क मुक्त-कट्टरपंथी-स्कैवेंजिंग गतिविधि और चूहे के मस्तिष्क के समरूप में लिपिड पेरोक्सीडेशन पर एक निरोधात्मक प्रभाव दिखाता है [15-17] .

पहले, सी.पिल्डसुला की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि इस्तेमाल किए गए निष्कर्षण विलायक के आधार पर पॉलीफेनोल सामग्री में अंतर के कारण भिन्न होती थी [18]। इस प्रकार, हमने सामान्य परिस्थितियों में सी. पाइलोसुला अर्क (सीपीई) के मेलेनोजेनिक निरोधात्मक प्रभाव की जांच यांत्रिकी संकेतन पथों के माध्यम से की, साथ ही मेलान-एक मेलानोसाइट्स में H2O 2- प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव की जांच की।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1.अभिकर्मक

RPMI 1640 और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) वेल्जीन (डेगू, कोरिया) से खरीदे गए थे।सिस्टैंच साल्सा अर्कपेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन को गिब्कोबीआरएल (एगेनस्टीन, जर्मनी) से खरीदा गया था। फोर्बोल 12-मिरिस्टेट 13-एसीटेट (टीपीए) TOCRIS (ब्रिस्टल, यूके) से खरीदा गया था। हाइड्रोजन पेरोक्साइड (HaO2),3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 4',{11}}diamidino-2-फेनिलइंडोल (DAPI), और 3-MA को सिग्मा से खरीदा गया था। -एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए)। अन्य सभी रसायन और अभिकर्मक विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे।

2.2. Codonopsis Pilosula निकालने की तैयारी

सी.पिलोसुला रूट (सीपी) को केवल काट दिया गया था, और 100 ग्राम सीपी को 1 लोफ 50 प्रतिशत इथेनॉल (w/v) में डुबोया गया था; फिर, इसे 30 डिग्री पर अल्ट्रासोनिक तरंगों का उपयोग करके तीन बार निकाला गया। सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक अर्क को सेंट्रीफ्यूज किए जाने के बाद, सतह पर तैरनेवाला केंद्रित था और सी.पिलोसुला अर्क (सीपीई) तैयार करने के लिए फ्रीज-सूख गया।

2.3. सेल संस्कृति और सीपीई की स्टॉक तैयारी

मेलानोसाइट मेलान-ए कोशिकाओं को RPMI 1640 में विकसित और अनुरक्षित किया गया था, जो 10 प्रतिशत FBS, पेनिसिलिन (100 U/mL), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 U/mL), और 200 nM phorbol 12-myristate 13- के पूरक थे। एसीटेट (टीपीए) और 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर बनाए रखा। छह-अच्छी तरह से प्लेट में प्रति कुएं में 3 × 105 कोशिकाओं की खेती करने के बाद, मेलान-ए कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में रखा गया था जब तक कि माध्यम का रंग काला नहीं हो जाता। सीपीई के स्टॉक समाधान (100 मिलीग्राम/एमएल) बाँझ पानी में भंग कर दिए गए थे और -20 डिग्री पर संग्रहीत किए गए थे।

2.4. सेल व्यवहार्यता का मापन

मेलान-ए कोशिकाओं में सीपीई की सेल व्यवहार्यता एक एमटी वर्णमिति परख और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। कोशिकाओं को तब तक बनाए रखा गया जब तक कि वे 96-वेल प्लेट्स में 80 प्रतिशत संगम तक नहीं पहुंच गए और फिर 24 घंटे के लिए सीपीई और/या 0.5 एमएमएच2ओ2 के साथ इलाज किया गया। एमटीटी समाधान 5 मिलीग्राम / एमएल） के 10 μL के साथ एक सेल माध्यम जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को अतिरिक्त 4 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद, अघुलनशील फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड के 100 यूएल में भंग कर दिया गया था। 540 एनएम पर अवशोषण को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मृत कोशिकाओं को पीआई / एनेक्सिन वी सेल डेथ डिटेक्शन किट (ईएमडी मिलिपोर कॉर्पोरेशन, बिलरिका, एमए, यूएसए) के साथ निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, कोशिकाओं को एफआईटीसी-एनेक्सिन वी और पीआई युक्त अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए धोया और ऊष्मायन किया गया था। बाद में, MuselM सेल विश्लेषक द्वारा मृत कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया।

2.5.इन विट्रो मेलेनिन अनुमान

लगभग 2 × 1 0 5 कोशिकाओं/कुओं को छः कुएँ की थाली में उगाया गया था। पहले वर्णित [19] के रूप में सीपीई और/या 0.5 एमएम एच-ऑप के साथ उपचार के बाद, पीबीएस-धोए गए कोशिकाओं को काटा गया, 1 × पीबीएस में 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 युक्त, और 13 पर 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। 000 आरपीएम 15 मिनट के लिए। सेलुलर मेलेनिन सामग्री को 1 एन NaOH का उपयोग करके घुलनशील किया गया था। एक एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग 405 एनएम पर अवशोषण को मापकर मेलेनिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। डेटा तीन प्रयोगों से प्राप्त किया गया था, और मेलेनिन सामग्री की गणना और नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में गुना परिवर्तन के रूप में की गई थी। 2.6.प्रोटीन अलगाव और पश्चिमी धब्बा परख

हमारे पिछले काम [2 0] में बताए अनुसार प्रोटीन के नमूने निकाले गए। फिर, सेल लाइसेट की प्रोटीन सांद्रता को बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया। विकृत सेल lysate (प्रति नमूना सेल lysate के 30 ugs) की समतुल्य मात्रा को 10 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा अलग किया गया और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। पीबीएस में 5 प्रतिशत स्किम मिल्क पाउडर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को रातोंरात 4 डिग्री पर 0.05 प्रतिशत ट्वीन 20 (पीबीएसटी) से युक्त किया गया था।

प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, झिल्ली को धोया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएसटी में 5 प्रतिशत स्किम दूध में पतला एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी में ऊष्मायन किया गया। एन्हांस्ड केमिलुमिनेसिसेंस (ईसीएल) डिटेक्शन सिस्टम (एआई680, जीई हेल्थकेयर, उप्साला, स्वीडन) का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था।

2.7. डीसीएफएच-डीए स्टेनिंग द्वारा इंट्रासेल्युलर आरओएस का आकलन

हू-उपचारित मेलान-ए कोशिकाओं में सेलुलर आरओएस स्तर का अनुमान डीसीएफएच-डीए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि [21] द्वारा लगाया गया था। इंट्रासेल्युलर डीसीएफ प्रतिदीप्ति के स्तर उत्पादित इंट्रासेल्युलर आरओएस के समानुपाती होते हैं। पहले, 2 × 105 कोशिकाओं / कुओं को 24 घंटे के लिए सीपीई और / या एच-ओ 2 की व्यक्तिगत सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, फिर डीसीएफएच 2- डीए को प्रतिक्रिया के अंत से 2 घंटे पहले जोड़ा गया था। डेटा तीन या अधिक स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए थे। 2.8.सांख्यिकीय प्रसंस्करण

सभी प्रयोगात्मक परिणामों को तीन जैविक प्रतिकृति के माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।सिस्टैंच स्टेमबहु माध्य मानों के बीच सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन विचरण (ANOVA) के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया, इसके बाद SPSS 18 का उपयोग करते हुए डंकन का बहु-तुलना परीक्षण किया गया। 0 (SPSS Inc., शिकागो, IL, USA), जैसा कि किंवदंतियों में संकेत दिया गया है। एक पी-मान<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

3। परिणाम

3.1. सीपीई द्वारा मेलानोसाइट्स में मेलानोजेनेसिस का डाउनरेगुलेशन

मेलानोसाइट्स बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में मेलेनिन को संश्लेषित करते हैं, जैसे यूवी विकिरण। मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-MSH), स्टेम सेल फैक्टर (SCF), और एंडोटिलिन -1 (ET -1) जैसे प्रमुख कारक मेलानोसाइट्स से स्रावित होते हैं और MITF की अभिव्यक्ति को बढ़ाते हैं जिससे मेलानोजेनेसिस को बढ़ावा मिलता है। [22,23]। सबसे पहले, हमने जांच की कि क्या सीपीई उपचार मेलेनिन उत्पादन और मेलानोजेनेसिस-संबंधित प्रोटीन को रोकता है।

100,200 पर सीपीई उपचार, और 300 ug/mL नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में मेलेनिन उत्पादन को काफी कम कर देता है। विशेष रूप से, सीपीई के 300 कुरूप/एमएल के साथ उपचार के परिणामस्वरूप आर्बुटिन उपचार (चित्रा 1ए, बी) से प्रेरित कमी के समान कमी आई। इसके अलावा, हमने मेलानोजेनेसिस प्रोटीन टायरोसिनेज, टीआरपी-1, टीआरपी{{6 की जांच की। }}, और MITF वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे और साइड इफेक्ट300 ug/mL की सांद्रता पर CPE के साथ उपचार से MITF, TRP-2, और tyrosinase प्रोटीन (चित्र 1C) के स्तर में काफी कमी आई है। जैसा कि यह पुष्टि की गई थी कि सीपीई एमआईटीएफ-संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को रोकता है, मेलेनिन गठन को रोकता है, हमने आगे जांच की कि क्या सीपीई ने एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग को प्रभावित किया है। सीपीई ने एमएपीके फास्फारिलीकरण को खुराक पर निर्भर तरीके से बढ़ाया, विशेष रूप से जेएनके फास्फारिलीकरण (चित्रा 1डी) को प्रेरित किया। इन परिणामों से पता चलता है कि सीपीई द्वारा मेलानोजेनेसिस निषेध जेएनके / एमएपीके फॉस्फोराइलेशन के शामिल होने से एमआईटीएफ और टायरोसिनेस अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन के परिणामस्वरूप होता है।

3.2. H2O पर सीपीई का प्रभाव2-मेलानोसाइट्स में प्रेरित कोशिका मृत्यु

त्वचा कोशिकाएं, जैसे कि केराटिनोसाइट्स और मेलानोसाइट्स, सामान्य स्थिति बनाए रखने के लिए, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (HzOz) और सुपरऑक्साइड ऑयन जैसे ROS के प्रति संवेदनशील रूप से प्रतिक्रिया करती हैं। हालांकि, अत्यधिक सेलुलर आरओएस के कारण ऑक्सीडेंट-एंटीऑक्सिडेंट स्थिति में असंतुलन से क्षतिग्रस्त प्रोटीन या ऑर्गेनेल का संचय हो सकता है, जिससे अंततः एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु हो सकती है [24,25]। हाल ही में, यह बताया गया है कि मेलेनिन त्वचा के बाहरी वातावरण के आधार पर मेलेनिन गठन को उत्तेजित करके त्वचा की उम्र बढ़ने को बढ़ावा देता है, साथ ही इंट्रासेल्युलर मेलेनिन सामग्री को बनाए रखने के द्वारा त्वचा के स्वास्थ्य को बनाए रखा जाता है [26]। इस प्रकार, हमने H2O2 उपचार के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव के अधीन कोशिकाओं पर सीपीई निकालने के प्रभाव की जांच की। HzO2-उपचारित कोशिकाओं ने अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में सेल व्यवहार्यता में 32.8 प्रतिशत की कमी दिखाई। हालांकि, सीपीई उपचार ने एच-ओ2 उपचार के तहत एकाग्रता-निर्भर तरीके से सेल व्यवहार्यता के निषेध को कम कर दिया। विशेष रूप से, 300 ug/mL पर सीपीई ने 91.9 प्रतिशत (चित्रा 2ए) के लिए सेल व्यवहार्यता बहाल कर दी। इसके अलावा, सीपीई-और/या एच2ओ2-इलाज कोशिकाओं की एपोप्टोटिक मौत का पता एनेक्सिन वी- के साथ डबल धुंधला द्वारा लगाया गया था। FITC / PI, इसके बाद फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। H2O2 उपचार के बाद, एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़कर 34.5 प्रतिशत हो गया, जबकि अनुपचारित कोशिकाओं में यह 14.8 प्रतिशत था। हालांकि, सीपीई उपचार ने स्पष्ट रूप से H2O 2- प्रेरित एपोप्टोटिक मृत्यु को रोक दिया, जिसमें एनेक्सिन वी-दाग वाली कोशिकाओं का प्रतिशत 22.2 प्रतिशत (चित्र 2बी) था। जैसा कि यह आरओएस सामग्री के समान पैटर्न दिखाता है, इन परिणामों से पता चलता है कि सीपीई एच 2 ओ 2- प्रेरित आरओएस (चित्रा 2 सी) के खिलाफ सुरक्षा के माध्यम से कोशिका मृत्यु को रोककर सेल व्यवहार्यता बनाए रखता है।

3.3.HZO पर सीपीई का प्रभाव2-मेलानोसाइट्स में प्रेरित कोशिका मृत्यु

जैसा कि पहले पुष्टि की गई थी, CPE HzO2 उपचार के बाद एपोप्टोसिस में वृद्धि को रोककर सेल व्यवहार्यता बनाए रखता है। इस प्रकार, हमने अगली बार कोशिका मृत्यु और MITF प्रोटीन में शामिल प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर CPE के प्रभाव की जांच की, जो H2O2 की उपस्थिति में मेलेनिन उत्पादन को नियंत्रित करता है। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, H2O2 से उपचारित कोशिकाओं में, MITF की अभिव्यक्ति थोड़ी कम हो गई थी, दूसरी ओर, CPE से उपचारित कोशिकाओं में, और MITF की अभिव्यक्ति लगभग अनुपचारित कोशिकाओं की तरह ही थी। इसके अलावा, H2O2 ने एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण बैक्स प्रोटीन [27,28] की अभिव्यक्ति में वृद्धि की, लेकिन सीपीई-उपचारित कोशिकाओं में एकाग्रता-निर्भर तरीके से बैक्स की अभिव्यक्ति में कमी आई। इसके विपरीत, H202 ने Bcl2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, जो कोशिका अस्तित्व को बढ़ावा देता है [28,29], लेकिन Bel2 की अभिव्यक्ति को CPE उपचार द्वारा एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से बढ़ाया गया था। जब हमने Bax/Bcl2 अनुपात निर्धारित करने के लिए इन दो प्रोटीनों की अभिव्यक्ति की गणना की, तो वही प्रवृत्ति देखी गई। इसलिए, H2O 2- प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के तहत, कोशिका मृत्यु के शामिल होने से MITF की अभिव्यक्ति कम हो गई, जबकि CPE ने H2Oz- प्रेरित कोशिका मृत्यु को रोकने और MITF की अभिव्यक्ति को बनाए रखते हुए एक शक्तिशाली सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदर्शित किया।

3.4. ऑक्सीडेटिव-तनाव-प्रेरित मेलानोसाइट्स में ऑटोफैगी सक्रियण पर सीपीई का प्रभाव

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ऑटोफैगी और इसके नियामक मानव कोशिकाओं में आरओएस-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [26,30]। फेंग एट अल। [31] ने दिखाया कि एपोकाइमम वेनेटम लीफ एक्सट्रेक्ट ऑटोफैगी के आरओएस-प्रेरित सक्रियण को कम करके एच2ओ 2- प्रेरित एपोप्टोसिस के खिलाफ घायल न्यूरॉन्स की रक्षा करता है। चूंकि ऑटोफैगी और एंटी-मेलानोजेनेसिस के मॉड्यूलेशन के बीच संबंध स्थापित किया गया है, मेलान-ए कोशिकाओं में एच-ओज़-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ सीपीई के सुरक्षात्मक प्रभाव में ऑटोफैगी की भूमिका की जांच की गई थी। LC3, एक ऑटोफैगोसोम प्रोटीन के स्तर का उपयोग ऑटोफैगी के संकेतक के रूप में किया गया था। पश्चिमी धब्बा डेटा ने संकेत दिया कि सीपीई ने प्रो-ऑटोफैजिक एलसी 3- Ⅱ और बीक्लिन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को काफी हद तक बढ़ा दिया, जिनकी अभिव्यक्ति एच 2 ओ 2 उपचार से कम हो गई थी। इससे पता चलता है कि ऑटोफैगी सक्रियण आदेश इंट्रासेल्युलर ऑक्सीडेटिव तनाव (चित्रा 4 ए) के माध्यम से सीपीई का साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव होता है। इसके बाद, एचओजेड-उपचारित मेलान-ए कोशिकाओं में साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव और सीपीई के ऑटोफैगी के बीच अंतर-संबंध का एक शक्तिशाली ऑटोफैजिक अवरोधक, 3-एमए का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया गया था। पिछले डेटा की तुलना में, कोशिकाओं ने 3-एमए और सीपीई के साथ ढोंग किया और एच2ओ2 से प्रेरित होकर एलसी 3-द्वितीय अभिव्यक्ति स्तर (चित्रा 4बी) में कमी देखी गई। कुल मिलाकर, इन आंकड़ों का अर्थ है कि ऑटोफैगी को रोकना एचसीओ 2- उपचारित कोशिकाओं में सीपीई की साइटोप्रोटेक्टिव प्रभावकारिता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है, यह दर्शाता है कि सीपीई के साइटोप्रोटेक्टिव प्रभावों के लिए ऑटोफैगी आवश्यक है।

4। चर्चा

हमने पहले इष्टतम निष्कर्षण विधि की स्थापना की जिसके परिणामस्वरूप उच्चतम एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि के साथ-साथ पॉलीफेनॉल सामग्री [18] हुई। इस अध्ययन में, हमने उच्च-उपज वाले अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण विधि को लागू किया और पाया कि अर्क ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत ऑटोफैगी को सक्रिय करके और साथ ही मेलान-ए कोशिकाओं में मेलेनोजेनेसिस को रोककर एक साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रदर्शित करता है।

सबसे पहले, हमने आगे CPE.CPE के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव की जांच की। मेलानोजेनेसिस से संबंधित जीनों की अभिव्यक्ति को कम करके सीपीई ने मेलानोजेनेसिस को कम कर दिया, जैसे कि MITF, tyrosinase, और TRP-2। कई अध्ययनों से पता चला है कि एंजाइम अभिव्यक्ति से संबंधित मेलानोजेनेसिस के जैवसंश्लेषण तंत्र को विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, जिसमें माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके), प्रोटीन किनेज ए (पीकेए), और पीआई 3 के / एक्ट [32] शामिल हैं। उनमें से, MAPK सिग्नलिंग पाथवे की सक्रियता ने MITF को प्रोटीन स्थिरता स्तर पर, साथ ही ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर, मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स [33,34] में दबा दिया। एमएपीके के फास्फोराइलेशन और बाह्य कोशिकीय उत्तरदायी किनेज (ईआरके), सी-जून एन-टर्मिनल किनेज (जेएनके), और पी 38 के सिग्नलिंग कैस्केड भी मेलेनिन उत्पादन को नियंत्रित करते हैं। उनमें से, जेएनके कार्यकर्ता CREB-विनियमित ट्रांसक्रिप्शन कोएक्टीवेटर 3 (CRTC3) -निर्भर MITF अभिव्यक्ति [35,36] के फॉस्फो-निषेध के माध्यम से मेलेनोजेनेसिस को दबा देता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि एमएपीके का फॉस्फोराइलेशन, विशेष रूप से जेएनके, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में सीपीई उपचार के बाद प्रभावी रूप से बढ़ता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि मेलान-ए मेलानोसाइट्स में सीपीई-प्रेरित अपचयन एमआईटीएफ / जेएनके-विनियमित सिग्नलिंग मार्ग द्वारा हो सकता है।

मेलानोसाइट्स मेलेनिन वर्णक का उत्पादन करते हैं और इसे केराटिनोसाइट्स में स्थानांतरित करते हैं, जहां वर्णक वायु प्रदूषकों, रासायनिक उत्पादों और यूवी क्षति [37-39] जैसे ऑक्सीडेटिव पर्यावरणीय तनाव से त्वचा की रक्षा करने में मदद करते हैं। MITF प्रमुख जीनों के लिए जिम्मेदार प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों में से एक है जो मेलानोसाइट विकास और भेदभाव को बढ़ावा देता है, साथ ही साथ मेलानोजेनेसिस को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, MITF कुछ जीनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है जो सेल होमियोस्टेसिस को बनाए रखते हैं, जिसमें प्रसार में शामिल प्रोटीन (जैसे, CDK2) और एपोप्टोसिस (जैसे, Bcl2) [40-42] शामिल हैं। स्टीन-ग्रिमसन एट अल। [43] मेलानोसाइट्स के नुकसान के साथ-साथ दोषपूर्ण ऑस्टियोक्लास्ट और मस्तूल कोशिकाओं के परिणामस्वरूप सुनवाई हानि और वर्णक गड़बड़ी से प्रभावित एमआईटीएफ उत्परिवर्ती चूहों की पहचान की। इससे पता चलता है कि MITF इन प्रकार की कोशिकाओं के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

सीपीई अपने एंटी-एजिंग और एंटी-एलर्जी प्रभावों के कारण गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल और एलर्जी रोगों के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली हर्बल दवाओं का एक व्युत्पन्न है [15,44]। हालांकि, क्या सीपीई मेलानोसाइट्स को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचा सकता है, यह अज्ञात है। ऑक्सीडेटिव तनाव के जवाब में मेलानोसाइट अस्तित्व पर सीपीई के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए, हमने पहली बार एच-ओ 2 के संपर्क में आने वाले मेलानोसाइट्स में कोशिका मृत्यु को देखा। 24 घंटे के लिए 0.5 मिमी एच-ओ2 के साथ उपचार के बाद, अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में सेल व्यवहार्यता कम हो गई थी। हालांकि, सीपीई-उपचारित कोशिकाओं की व्यवहार्यता को आरओएस सामग्री को कम करके बहाल किया गया था; तब H2O 2- उपचारित कोशिकाओं के विपरीत, Bax/Bcl2 अनुपात और MITF अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी।

ऑटोफैगी प्रमुख इंट्रासेल्युलर गिरावट प्रणाली है जिसके द्वारा लाइसोसोम की क्षति के परिणामस्वरूप उनका क्षरण होता है। मिजुशिमा एट अल। [45] ने प्रदर्शित किया कि, भुखमरी, सूजन, या ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थितियों में, ऑटोफैजिक प्रक्रिया कोशिकाओं में क्षतिग्रस्त प्रोटीन और ऑर्गेनेल के क्षरण को नियंत्रित कर सकती है, ताकि सेलुलर नवीकरण और होमोस्टैसिस प्राप्त किया जा सके। सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 प्रकाश श्रृंखला 3 (LC3) और बीक्लिन -1 स्तनधारी स्वरभंग में प्रमुख भूमिका निभाते हैं। LC3 दो रूपों में मौजूद है, अर्थात् एक साइटोसोलिक रूप (LC3 I) और एक लिपिड फॉस्फेटाइडेथेनॉलमाइन-संयुग्मित रूप (LC3 III) जो बढ़ते हुए ऑटोफैगोसोम [46,47] झांग एट अल के आंतरिक और बाहरी दोनों झिल्लियों में डाला जाता है। 48] मेलानोसाइट्स में ऑटोफैगी की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए एक जैव रासायनिक मार्कर के रूप में LC3Ito LC3II के रूपांतरण का उपयोग किया। आगे के शोध ने संकेत दिया कि एलसी 3 अंतिम ऑटोफैगोसोम गठन का एक मार्कर है, जबकि बीक्लिन-एल ऑटोफैगोसोम गठन के प्रारंभिक चरण में शामिल है, ऑटोफैगी को सक्रिय करता है [49]। संवैधानिक ऑटोफैजिक गतिविधि मेलानोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव क्षति को रोकने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, लेकिन ऑक्सीडेटिव तनाव तहत मेलानोसाइट्स में ऑटोफैगी को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र पर कुछ अध्ययन हुए हैं।

नतीजतन, हमने ऑक्सीडेटिव तनाव के अधीन मेलानोसाइट्स में कोशिका अस्तित्व के लिए सीपीई-मध्यस्थता स्वरभंग के निहितार्थ की जांच की। हमारे परिणामों से पता चलता है कि, सीपीई उपचार के बाद, बीक्लिन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति -1 और LC3Ito LC3 II के प्रेरित रूपांतरण के माध्यम से ऑटोफैगी को सक्रिय किया गया था। इससे पता चलता है कि सीपीई ऑक्सीडेटिव तनाव के अधीन मेलानोसाइट्स में ऑटोफैगी सक्रियण के माध्यम से एक साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव डालता है।

निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन ने प्रदर्शित किया कि सीपीई उपचार में न केवल सामान्य मेलानोसाइट्स में MITF / JNK मार्ग के माध्यम से एक एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव होता है, बल्कि HzOg- प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के तहत, MITF के माध्यम से सेल अस्तित्व को बनाए रखता है और साइटोप्रोटेक्शन को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप निरंतर सक्रियता होती है। मेलान-ए कोशिकाओं में स्वरभंग का।

यह लेख कॉस्मेटिक्स 2021, 8, 67 से निकाला गया है। https://doi.org/10.3390/cosmetics8030067 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics