तंत्रिका भेदभाव के लिए उच्च-क्रम विनियामक संयोजन और इंजीनियरिंग जेनेटिक ड्राइवर्स की खोज के लिए संयोजन जेनेटिक्स तरीके

प्रभावी सेल विभेदन कारकों की खोज में गोता लगाना

पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग और हंटिंगटन रोग जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों की प्रगति को वापस लाने या धीमा करने के लिए शोधकर्ता अभी भी बेहतर उपचार खोजने का प्रयास कर रहे हैं। ये विकार मस्तिष्क के विभिन्न भागों में न्यूरोनल कोशिका मृत्यु का परिणाम हैं। रोगियों में लक्षणों से छुटकारा पाने के लिए उपयोग की जाने वाली दवाएं या उपचार अच्छी तरह से स्थापित नहीं हुए हैं।

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वे क्षतिग्रस्त तंत्रिका ऊतकों को ठीक नहीं करते हैं और इसके परिणामस्वरूप अवांछित दुष्प्रभाव हो सकते हैं। इसलिए, अध्ययन की बढ़ती संख्या स्टेम कोशिकाओं को एक आशाजनक चिकित्सीय के रूप में देखती है, क्योंकि उनकी आत्म-नवीनीकरण क्षमताओं और रोगी में खोए हुए तंत्रिका ऊतकों को ठीक करने के लिए वांछित सेल वंशावली में भेदभाव के लचीलेपन के कारण।

हालांकि, इससे पहले कि तंत्रिका संबंधी विकारों के इलाज में स्टेम सेल का नैदानिक ​​रूप से उपयोग किया जा सके, अभी भी ऐसे क्षेत्र हैं जिन्हें अपनी पूरी क्षमता को अनलॉक करने के लिए बेहतर समझ की आवश्यकता है। स्टेम सेल पुनर्योजी और निंदनीय हैं, किसी भी सेल प्रकार बनने की प्रवृत्ति के साथ भेदभाव को चलाने के लिए कारकों का सही संयोजन दिया गया है। हालांकि, कारकों के बड़े नेटवर्क में जटिलता की गहराई है।

ट्रांसक्रिप्शन कारकों (टीएफ), छोटे अणुओं और/या वृद्धि कारकों के संयोजन को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है ताकि भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल सहित स्टेम सेल में अंतर करने के लिए सबसे तेज गति से अनुकूलतम तालमेल प्राप्त किया जा सके, जिसके परिणामस्वरूप एक न्यूरोनल वंश की शुद्धतम आबादी में। हालांकि, अधिक लागत-कुशल और समय-प्रभावी तरीके से इन कारकों की जांच करने का एक रणनीतिक तरीका हो सकता है।

यह पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में मदद करेगा जो अभी भी श्रमसाध्य हैं या न्यूरोनल उपप्रकार जैसे कि मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स, संवेदी न्यूरॉन्स और सेरोटोनर्जिक न्यूरॉन्स के आगे लक्षण वर्णन के लिए। न्यूरोनल भाग्य के ड्राइवरों को व्यापक रूप से प्रोफाइल करना और यह परिभाषित करना एक चुनौती बनी हुई है कि ये तत्व नियामक नेटवर्क में एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं।

कुछ समूहों ने सेल भाग्य के नियामक नेटवर्क को स्पष्ट करने के लिए नए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया है और न्यूरोनल रूपांतरण और उत्तरजीविता को चलाने वाले कारकों पर सूचनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान की है। लियू एट अल। (2018) ईएससी के न्यूरोनल भाग्य को बढ़ावा देने वाले टीएफ या डीएनए-बाध्यकारी कारकों की खोज के लिए सीआरआईएसपीआर सक्रियण (सीआरआईएसपीआरए) का इस्तेमाल किया। हालांकि, काम एकल कारकों या जोड़ीदार संयोजनों का अध्ययन करने तक ही सीमित था।

Tsunemoto et al द्वारा एक और व्यवस्थित स्क्रीनिंग की गई। (2018), जिसने TFs के बीच संबंधों की जांच की। उनके अधिकांश चयनित एकल TF ने अध्ययन में कोई प्रभाव नहीं दिखाया, हालांकि, उन्होंने प्रेरित न्यूरॉन्स के लिए माउस फाइब्रोब्लास्ट के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए 76 जोड़ीदार TF संयोजनों की पहचान की।

विशेष रूप से, उनके परिणामों में पिछले अध्ययनों के साथ कुछ निरंतरता का अभाव था, जैसे कि प्रेरित न्यूरॉन्स में डोपामाइन सक्रिय ट्रांसपोर्टर Slc6a3 का पता नहीं लगाना, संभवतः अतिरिक्त कारकों पर लापता होने के कारण। एक अन्य अध्ययन ने CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi)-आधारित स्क्रीनिंग (तियान एट अल।, 2019) आयोजित करके न्यूरॉन्स के अस्तित्व को बनाए रखने या सुधारने के लिए आवश्यक जीन निर्धारित किया। और फिर, वे एकल एसजीआरएनए की स्क्रीनिंग तक ही सीमित थे।

अन्य आनुवंशिक कारकों के लिए एक निष्पक्ष जांच के लिए और कारक संयोजनों की संख्या बढ़ाने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि अलग-अलग संदर्भों में दो से अधिक कारकों के कॉकटेल की आवश्यकता हो सकती है ताकि भेदभाव और पुनर्संरचना को कुशलतापूर्वक चलाया जा सके।

एक अच्छा उदाहरण Oct4, Sox2, Klf4, और c-Myc का संयोजन है जो ESCs (ताकाहाशी और यामानाका, 2006) की बहुलता के लिए विकासात्मक सिग्नलिंग नेटवर्क को विनियमित करने के लिए आवश्यक है। इस तरह की जटिल प्रणालियों में, उच्च थ्रूपुट फैशन में उच्च-क्रम के आनुवंशिक संयोजनों के कार्यों को व्यापक रूप से चिह्नित करने की आवश्यकता होती है, और कॉम्बिनेटोरियल जेनेटिक्स एन मस्से (कॉम्बीजीईएम) विधि बस ऐसा करने में सक्षम हो सकती है।

एक उच्च-थ्रूपुट, उच्च-क्रम, और कारक संयोजनों की व्यवस्थित स्क्रीन के लिए CombiGEM विधि

CombiGEM न केवल बड़े पैमाने पर पूल की गई स्क्रीन के संचालन का एक व्यवस्थित तरीका प्रदान करता है, बल्कि इसमें उच्च-क्रम के कॉम्बीनेटरियल जेनेटिक लाइब्रेरी (वोंग एट अल।, 2015, 2016; झोउ एट अल।, 2020) की स्केलेबल असेंबली की क्षमता भी है। वन-पॉट प्रक्रिया उपयोगकर्ता को कई आनुवंशिक संयोजनों के लिए स्क्रीन करने की अनुमति देती है; 1-तरीका, 2-रास्ता, 3-रास्ता, और सिद्धांत रूप में, एन-वे लाइब्रेरी।

यह रुचि के व्यक्तिगत उम्मीदवार संयोजनों के निर्माण और परीक्षण की पारंपरिक प्रक्रिया का एक त्वरित विकल्प प्रदान करता है। जबकि कई अन्य कॉम्बिनेटरियल CRISPR स्क्रीनिंग रणनीतियाँ भी जोड़ीदार आनुवंशिक संयोजनों (हान एट अल।, 2017; शेन एट अल।, 2017; नज्म एट अल।, 2018; ट्रूंग एट अल।, 2019; डेवेर्ड एट अल।, 2020) के अध्ययन के लिए विकसित की गईं। ), CombiGEM तीन या अधिक अनुवांशिक संयोजनों के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है।

उदाहरण के लिए, यदि उपयोगकर्ता CRISPRa या CRISPRi का उपयोग क्रमशः ओवरएक्सप्रेसिंग या रिप्रेसिंग के लिए करना चाहता है, तो उम्मीदवार TF संयोजनों की एक सूची, CombiGEM-CRISPR v2.0 ( वोंग एट अल।, 2016; झोउ एट अल।, 2020) जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।

वन-पॉट लिगेशन चरणों का उपयोग करके, sgRNAs की लाइब्रेरी और उनके संबंधित बारकोड को एक लेंटिवायरल-डेस्टिनेशन वेक्टर में शामिल किया जाता है जो एक न्यूरॉन सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटर, जैसे कि ट्यूबुलिन 1 के सक्रियण पर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की रिपोर्ट करता है। पुस्तकालय sgRNAs और एक अलग लेंटिवायरल वेक्टर जो एंजाइम की कमी वाले Cas9 को या तो एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टीवेटर या रिप्रेसर के साथ जोड़ा जाता है, को वांछित शुरुआती कोशिकाओं में पहुंचाया जा सकता है।

समय के साथ, जैसे-जैसे कोशिकाएं अलग-अलग होने लगती हैं, केवल प्रेरित न्यूरॉन जैसी कोशिकाएं प्रतिदीप्ति व्यक्त करेंगी, और इन कोशिकाओं को बारकोड अनुक्रमण के माध्यम से उनके हार्बरिंग TF संयोजनों को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके अलग किया जा सकता है।

विशिष्ट सेल वंशों को चलाने वाले संयोजनों की बेहतर समझ हासिल करने के लिए, इन कोशिकाओं को ज्ञात सेल-वंश रिपोर्टरों या मार्करों के लिए भी जांचा जा सकता है, जो उपयोगकर्ता द्वारा अध्ययन करने के लिए चुने गए भेदभाव चरणों की वरीयता के आधार पर होता है। चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग सेल की सतह मार्कर अभिव्यक्तियों के आधार पर ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है।

सिंगल-सेल आरएनए सीक्वेंसिंग को कॉम्बीनेटरियल सीआरआईएसपीआर स्क्रीनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है, जो कि जीन अप या डाउनरेगुलेशन के प्रकार और स्तरों को प्रोफाइल करने के लिए एक रीडआउट के रूप में होता है और लक्षित टीएफ के संयोजन को बारकोड रीड्स (रिप्लॉग एट अल।, 2020) के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। न्यूरॉन विकास के प्रारंभिक से बाद के चरणों में सेल आकृति विज्ञान परिवर्तनों की निगरानी के लिए उच्च-सामग्री इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है।

प्रेरित न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं की शारीरिक प्रासंगिकता या कार्यक्षमता न्यूरॉन परिपक्वता के लिए विशिष्ट इम्यूनोसाइटोकेमिकल लेबलिंग द्वारा निर्धारित की जा सकती है, जैसे कि न्यूरॉन, टीयूजे1, और एमएपी2, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उपाय। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, अध्ययनों ने सेल भाग्य में हेरफेर करने के लिए TF और छोटे अणुओं को संयोजित किया है।

CombiGEM का उपयोग छोटे अणु संयोजनों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है जो स्टेम सेल के स्व-नवीनीकरण को बनाए रख सकते हैं, सेल-वंश भेदभाव को प्रेरित कर सकते हैं, या दक्षता बढ़ाकर और आनुवंशिक कारकों को संभावित रूप से बदलकर रीप्रोग्रामिंग की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। CombiGEM को पहले सिग्नलिंग पाथवे, एपिजेनेटिक, या सेलुलर प्रक्रिया कारकों के छोटे अणु लक्ष्यों को निर्धारित करके भी लागू किया जा सकता है।

फिर ड्रगेबल लक्ष्यों को सक्रिय या निष्क्रिय करने के लिए sgRNA के एक पुस्तकालय को डिजाइन करके, तब विभेदन या पुनर्संरचना को बढ़ाने के लिए छोटे अणुओं के प्रभावी संयोजनों की पहचान की जा सकती है। यह अवधारणा उन अध्ययनों से अच्छी तरह से परिलक्षित होती है जो हमने पहले कैंसर और पार्किंसंस रोग (झोउ एट अल।, 2020) के खिलाफ दवा लक्ष्य संयोजनों की खोज के लिए किए थे।

CombiGEM का उपयोग केवल CRISPR-आधारित गड़बड़ी तक ही सीमित नहीं है, बल्कि अन्य डीएनए या आरएनए विनियामक कारकों पर भी लागू किया जा सकता है ताकि आरएनए हस्तक्षेप के साथ हानि-की-फ़ंक्शन स्क्रीन का अध्ययन किया जा सके, साथ ही अभिव्यक्ति के साथ-साथ फ़ंक्शन का लाभ भी हो सके। माइक्रोआरएनए (वोंग एट अल।, 2015) और अनुक्रम-सत्यापित मानव ओपन रीडिंग फ्रेम जैसे कि मानव टीएफओएम लाइब्रेरी (एनजी एट अल।, 2020) में रिपोर्ट किए गए।

ट्रांसक्रिप्शन कारकों की उच्च-थ्रूपुट इंजीनियरिंग के लिए कॉम्बीसील विधि

स्वाभाविक रूप से होने वाले आनुवंशिक कारकों के आदर्श संयोजन को खोजना अभी भी चुनौतियों का सामना कर सकता है, जैसे कि जीनोम के विशिष्ट TFs तक सीमित होना, उनकी अभिव्यक्ति और भेदभाव में भूमिकाओं के बारे में पूर्व ज्ञान के साथ। अध्ययनों से पता चला है कि इंजीनियरिंग टीएफ या कृत्रिम ट्रांसक्रिप्शन कारकों को उत्पन्न करने से वैकल्पिक मार्गों के माध्यम से भेदभाव की दर को तेज करने के लिए विकल्पों का एक नया अवसर खुल जाता है, जो जीन नियामक नेटवर्क के भीतर अन्य अंतर्जात सह-कारकों की पूर्वापेक्षित अभिव्यक्ति की निर्भरता को पार कर जाता है, या पूरी तरह से बदल देता है। अधिक कुशल वाले प्राकृतिक TFs (Jach, 2018)।

यह शोधकर्ताओं को उनकी प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुसार आवश्यक कारकों को तैयार करने में सक्षम बनाता है। हमारा प्रस्ताव है कि यदि कोई TF के लिए कई साइटों पर उच्च थ्रूपुट म्यूटाजेनेसिस का संचालन करना चाहता है जिसमें विभिन्न डोमेन शामिल हैं, तो CombiSEAL एक उपयोगी प्लेटफॉर्म साबित हो सकता है (चोई एट अल।, 2019)। CombiSEAL विधि अमीनो एसिड-कोडिंग डीएनए अंशों को जोड़ती है जो कि बारकोड के साथ संयुक्त रूप से टैग किए जाते हैं (चित्र 1)।

चित्र 1 ｜ CombiGEM और CombiSEAL विधियाँ विभेदीकरण के प्रभावी आनुवंशिक चालकों की जांच करने के लिए। CombiGEM पद्धति का एक उदाहरण एक ही निर्माण से व्यक्त किए गए कई sgRNAs का संयोजन है, और sgRNA संयोजनों को उनके संघटित बारकोड द्वारा दर्शाया जाता है। CombiSEAL विधि में प्रोटीन के विभिन्न भागों में पेश किए गए म्यूटेशन शामिल हैं, जैसे ट्रांसक्रिप्शन कारक, जिन्हें P1, P2, P(n), और P(n प्लस 1) के रूप में दर्शाया गया है। और म्यूटेशन के संयोजन उनके संगत बारकोड द्वारा परिलक्षित होते हैं। उपयोगकर्ता अन्य डीएनए वितरण प्रणालियों के लिए सेटअप लागू कर सकता है, और इस प्रतिनिधित्व में लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग किया जाता है। स्क्रीनिंग रणनीतियों को पूल किए गए प्रारूप द्वारा आयोजित किया जा सकता है, और इस उदाहरण में, सेल आबादी की पहचान करना जो एक विशिष्ट न्यूरॉन वंश में अंतर करता है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रमोटर की सक्रियता से पता चला है, जिसे आरेख में एक्स-प्रतिदीप्ति के रूप में लेबल किया गया है। सेल पूल से बारकोड की अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (एनजीएस) डीएनए लक्ष्य या ट्रांसक्रिप्शनल वेरिएंट (एस) को समझेगा। विभिन्न न्यूरॉन प्रकारों के भेदभाव को चलाने वाले कारकों का कठोर विश्लेषण सरणी-आधारित विधियों का उपयोग कर सकता है जैसे सेल वंशावली मार्करों के साथ कोशिकाओं की जांच के बाद चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) बहु-अच्छी तरह से प्लेटों में, जिसके साथ पालन किया जा सकता है उच्च सामग्री इमेजिंग। वैकल्पिक रूप से, एकल-कोशिका RNA अनुक्रमण (RNA-Seq) उपयोगकर्ता को वांछित फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं के जीन भावों को प्रोफाइल करने की अनुमति देता है और sgRNA संयोजनों या प्रमुख प्रकारों के उत्परिवर्तन संयोजनों की पहचान करने के लिए बारकोड को पुनः प्राप्त करने में सक्षम होगा। FACS: प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई।

कॉम्बीसील प्रोटीन के पहले सेक्शनिंग भागों से शुरू होता है जहां उत्परिवर्तन वांछित होता है। उपयोगकर्ता प्रत्येक अनुभाग के लिए किसी भी संख्या में वेरिएंट उत्पन्न कर सकता है, फिर म्यूटेशन की स्थिति और संयोजन की पहचान करने के लिए उन्हें बारकोड के साथ टैग कर सकता है। वर्गों के प्रत्येक पूल को तब अनुक्रमिक रूप से एक गंतव्य वेक्टर में सम्मिलित करके इकट्ठा किया जाता है, जो इच्छित उत्परिवर्तन के क्षेत्र में फ़्लैंकिंग-प्रकार IIS एंजाइमों के साथ संशोधित जंगली प्रकार के प्रोटीन अनुक्रम को प्राप्त करता है।

प्रोटीन में अवांछित अमीनो एसिड जोड़ने से बचने के लिए प्रोटीन के कई हिस्सों को जोड़ने की यह स्कारलेस फ्यूजन योजना महत्वपूर्ण है। CombiSEAL विधि ब्याज के वेरिएंट के चयनित पूल के अमीनो एसिड अनुक्रमों को अधिक कुशलतापूर्वक और लागत प्रभावी ढंग से निर्धारित करने की अनुमति देती है, म्यूटेशन के प्रकारों की पहचान करने के लिए पूरे प्रोटीन पर लंबे समय से पढ़े जाने वाले अनुक्रमण की आवश्यकता से बचती है और जहां वे स्थित हैं। प्रोटीन।

यह पद्धतिगत सेटअप लघु संघटित बारकोड के पूल के एक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का संचालन करके आसान विश्लेषण की अनुमति देता है जो अमीनो एसिड म्यूटेशन के प्रकार और स्थिति के संयोजन का अनुमान लगाता है, या अन्य वांछित संशोधन जैसे कि डोमेन स्वैपिंग, सम्मिलन और विलोपन, जो किया गया था शुरू में TF पर डिजाइन और स्थापित किया गया

निष्कर्ष

परीक्षण-और-त्रुटि विधियों की तुलना में, एक कोशिका प्रकार को न्यूरोनल वंश में बदलने के लिए आवश्यक आवश्यक कारकों या संयोजनों को निर्धारित करने के लिए अधिक व्यवस्थित दृष्टिकोणों को नियोजित करने में प्रगति की गई है। हालाँकि, उच्च-क्रम के संयोजनों की पहचान करने की क्षमता की कमी रही है, और यहाँ हम प्रस्ताव करते हैं कि CombiGEM पद्धति ऐसी सीमाओं को दूर करने में सक्षम हो सकती है।

CombiGEM एक बार में डीएनए को लक्षित करने के लिए डीएनए बाध्यकारी कारकों के उच्च-क्रम संयोजनों को एक साथ जोड़ने के लिए एक बारकोडेड, एक-पॉट बंधाव प्रणाली का उपयोग करता है, डाउनस्ट्रीम सत्यापन के लिए प्रबंधनीय आकार में हिट की संख्या को कम करने के लिए स्क्रीनिंग के कई दौरों की प्रक्रिया को बाधित करता है। . इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति को बेहतर ढंग से विनियमित करने के लिए कम कुशल प्राकृतिक TFs को कृत्रिम या इंजीनियर TFs के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हम एक प्रोटीन म्यूटाजेनेसिस विधि, कॉम्बीसील का वर्णन करते हैं, जो उपयोगकर्ताओं को प्रोटीन और उनके विभिन्न डोमेन के भीतर बारकोड के साथ टैग किए गए कई साइट म्यूटेशनों को सीधा जोड़कर ट्रांसक्रिप्शन कारक वेरिएंट के बड़े पूल बनाने में सक्षम बनाती है।

यह ब्याज के वेरिएंट के म्यूटेशन के प्रकारों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं की लागत को गति देगा और कम करेगा। हम आशा करते हैं कि प्रस्तावित विधियाँ तंत्रिका पुनर्जनन को बढ़ावा देने की संभावनाओं को और अधिक समझने और व्यापक बनाने में सहायता कर सकती हैं और अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों में व्यापक रूप से लागू हो सकती हैं।

सिस्टैंच न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का तंत्र

Cistanche को कई तंत्रों के माध्यम से न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया गया है:

1. जलनरोधी प्रभाव: सिस्टैंच में यौगिक होते हैं जो मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों में सूजन को रोकते हैं, जो न्यूरॉन्स को नुकसान से बचाने में मदद कर सकते हैं।

2. एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव: Cistanche में ऐसे यौगिक होते हैं जिनमें मजबूत एंटीऑक्सीडेंट गुण होते हैं। एंटीऑक्सिडेंट न्यूरॉन्स को मुक्त कणों और ऑक्सीडेटिव तनाव से होने वाले नुकसान से बचाने में मदद करते हैं।

3. न्यूरोट्रांसमीटर का विनियमन: Cistanche कुछ न्यूरोट्रांसमीटर, जैसे सेरोटोनिन और डोपामाइन को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है, जो न्यूरॉन्स की रक्षा करने और संज्ञानात्मक कार्य में सुधार करने में मदद कर सकता है।

4. न्यूरोट्रॉफिक कारक उत्तेजना: सिस्टैंच को मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ) जैसे न्यूरोट्रॉफिक कारकों के उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है, जो न्यूरॉन्स के विकास और अस्तित्व को बढ़ावा दे सकता है।

कुल मिलाकर, ये तंत्र न्यूरॉन्स को नुकसान से बचाने, उनके विकास और उत्तरजीविता को बढ़ावा देने और संज्ञानात्मक कार्य में सुधार करने के लिए मिलकर काम करते हैं।

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डॉन जीएल थीन, एलन एसएल वोंग*