डोपामिन-विमोचन पेप्टाइड के साथ दत्तक एनके सेल इन्फ्यूजन का संयोजन वृद्ध चूहों में सेन्सेंट कोशिकाओं को कम करता है

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परिचय

बुढ़ापा कई बीमारियों के लिए प्रमुख जोखिम कारकों में से एक है [1], और उम्र बढ़ने में हस्तक्षेप करने के तरीकों के विकास से हृदय और मस्तिष्कवाहिकीय रोगों [2, 3], कैंसर जैसी उम्र से संबंधित बीमारियों की एक श्रृंखला के जोखिम में काफी कमी आएगी। [4], और अल्जाइमर रोग [5]। वृद्धावस्था की प्रक्रिया के दौरान सेन्सेंट कोशिकाएं (एसएनसी) धीरे-धीरे ऊतकों में जमा हो जाती हैं और उन्हें उम्र से संबंधित बीमारियों का मुख्य कारण माना जाता है [6-8]। माउस मॉडल में एसएनसी को हटाने से ऊतक की शिथिलता को रोकने या देरी करने और स्वस्थ जीवन काल का विस्तार करने के लिए दिखाया गया है [9, 10]। इसके विपरीत, एसएनसी की छोटी मात्रा का प्रत्यारोपण युवा चूहों में शारीरिक शिथिलता का कारण बनता है [1]। इन अध्ययनों ने उन तरीकों के विकास के द्वार खोल दिए हैं जो उम्र से संबंधित पुरानी बीमारियों को दूर करने के लिए एसएनसी को हटाने का लक्ष्य रखते हैं।

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एसएनसी की लक्षित निकासी, जिसे "सेनोलिटिक्स" कहा जाता है, विवो मॉडल में प्रीक्लिनिकल में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया पहला कीमोथेरेपी था, और वर्तमान में कई सेनोलिटिक एजेंट मौजूद हैं [12]। इनमें से कई दवाएं एसएनसी में कुछ प्रकार के एसएनसी को चुनिंदा रूप से साफ करने के लिए अप-विनियमित एंटी-एपोप्टोटिक मार्गों को लक्षित करती हैं और जीवन काल को बढ़ाने और शरीर के कार्यों में सुधार करने की क्षमता दिखाती हैं [13, 14]।सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट एंटी रेडिएशनपशु मॉडल में उम्र से संबंधित विकृति के सफल उलट होने के बावजूद, एसएनसी की विविधता और विषाक्तता के उच्च जोखिम [15] के कारण मनुष्यों में सेनोलिटिक दवाओं के उपयोग में कुछ बाधाएं हो सकती हैं। इसलिए, एक वैकल्पिक विधि जो मनुष्यों में एसएनसी की एक विस्तृत श्रृंखला को सुरक्षित रूप से समाप्त कर सकती है, की खोज की जानी चाहिए।

एसएनपी को प्रतिरक्षा प्रणाली [16] द्वारा पहचाना और हटाया जा सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एसएनसी प्राकृतिक हत्यारे (एनके) कोशिकाओं को प्रमुख हिस्टोकोम्पैटिबिलिटी वर्ग I श्रृंखला-संबंधित प्रोटीन ए और बी सक्रिय करने वाले लिगैंड [17] को विनियमित करके सक्रिय करते हैं। हालांकि, बढ़ती उम्र के साथ, प्रतिरक्षा प्रणाली की दक्षता कम हो जाती है, जिससे एसएनसी [18] से प्रतिरक्षा बच सकती है। कैंसर चिकित्सा [19] में कम प्रतिरक्षा समारोह के कारण प्रतिरक्षा से बचने के तरीकों का पता लगाया गया है। ट्यूमर को खत्म करने के लिए एनके कोशिकाओं को अपनाने में हाल ही में प्रगति हुई है, जिसने कुछ प्रभावकारिता दिखाई है [20]; इस प्रकार, यह मान लेना उचित था कि एनके कोशिकाओं के दत्तक जलसेक एसएनसी में साइटोटोक्सिसिटी पैदा कर सकते हैं।

तंत्रिका और प्रतिरक्षा प्रणाली शरीर के दो सबसे महत्वपूर्ण अनुकूली तंत्र हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि एक प्रतिरक्षा नियामक के रूप में डोपामाइन (डीए) न्यूरोइम्यून संचार [21] की कुंजी है। DA अपने जैविक कार्यों को डोपामाइन रिसेप्टर्स (DR) के साथ बातचीत और सक्रियण द्वारा करता है, जो 2 उपसमूहों में विभाजित हैं, D1-जैसे (D1 और D5), और D2-जैसे (D2, D3, और D4)। उनके विभिन्न कार्यों के संदर्भ में, DR की तरह D1- की सहभागिता cAMP उत्पादन को उत्तेजित करती है, जबकि DR की तरह D2- की सहभागिता cAMP उत्पादन को रोकती है [22]। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डी 1- जैसे डीआर उत्तेजना इन विट्रो [23] और विवो [24] दोनों में एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी को बढ़ाती है। हालाँकि, मानव आयु बढ़ने के साथ DA का स्तर गिरता है [25]। इस प्रकार, हमने अनुमान लगाया कि डोपामिनर्जिक दवाएं एनके कोशिकाओं के दत्तक जलसेक की साइटोटोक्सिसिटी को बढ़ा सकती हैं।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

यहां, हम एसएनसी को खत्म करने के लिए प्रणालीगत एनके सेल थेरेपी के संयोजन में, डीए स्राव [26] को प्रेरित करने के लिए एक एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम (एसीई I) के साथ बातचीत करने वाले नॉनपेप्टाइड एसिन के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं। इन विट्रो परिणामों से पता चला है कि एनके कोशिकाओं ने एसएनसी को स्वतंत्र रूप से सेनेसेंस इंड्यूसर और सेल प्रकारों से हटा दिया।सिस्टैंच हर्बाएक उम्र बढ़ने वाले माउस मॉडल में, एनके सेल थेरेपी ने एसिन के साथ संयोजन में कई ऊतकों में सेनेसेंस-जुड़े-गैलेक्टोसिडेज़ (एसए - - गैल) -पोजिटिव कोशिकाओं की संख्या को काफी कम कर दिया, प्रमुख अंगों में सेनेसेंस से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में कमी आई। और कम उम्र से जुड़े स्रावी फेनोटाइप (एसएसपी) को कम किया। इस अध्ययन के परिणाम ऐस के साथ संयोजन में एनके सेल थेरेपी का उपयोग करते हुए पुरानी एसएनसी की प्रतिरक्षा निगरानी की संभावित बहाली में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

परिणाम

एनके कोशिकाओं का दत्तक आसव परिधीय रक्त में सेन्सेंट सीडी3 प्लस टी कोशिकाओं को कम करता है

अध्ययन के लिए एनके सेल इन्फ्यूजन प्राप्त करने वाले छब्बीस स्वयंसेवकों को भर्ती किया गया था। स्वयंसेवकों की विशेषताएं और एनके सेल गुण तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। एनके सेल आधान के बाद रक्त स्मरण के लिए समय अंतराल लगभग 37 ({3}}) दिन था। परिधीय रक्त में एनके कोशिकाओं का अनुपात (छवि 1 ए) और पूर्ण संख्या (छवि 1 बी) स्वयंसेवकों की उम्र से विपरीत रूप से संबंधित था। हैरानी की बात है कि प्रत्येक व्यक्ति में पुन: स्थापित एनके सेल उत्पाद की शुद्धता भी स्वयंसेवकों की उम्र (छवि 1 सी) के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध थी।लिंग वृद्धियह बढ़ती उम्र के साथ धीरे-धीरे एनके कोशिकाओं की संख्या में कमी के कारण हो सकता है। एनके सेल प्रशासन के एंटी-एजिंग प्रभाव को प्रतिबिंबित करने के लिए, परिधीय रक्त सीडी 3 प्लस टी कोशिकाओं में कई सेन्सेंट मार्कर, जो बड़े पैमाने पर शरीर के उम्र से संबंधित फेनोटाइप को दर्शाते हैं [27], एनके सेल जलसेक से पहले और बाद में पाए गए थे। ऑटोलॉगस एनके सेल इन्फ्यूजन से पहले और बाद में परिधीय रक्त में सीडी 3 प्लस टी कोशिकाओं के सेनेसेंस मार्करों और एसएएसपी कारक की तुलना में, एसए - - गैल-पॉजिटिव टी कोशिकाओं का अनुपात जलसेक (छवि 1 डी) के बाद काफी कम हो गया था। P16, P21, और प्लास्मिनोजेन एक्टीवेटर इनहिबिटर 1 (Pai1) का mRNA स्तर काफी कम हो गया था, जबकि मोनोसाइट कीमोअट्रेक्टेंट प्रोटीन -1 (MCP-1) और IL-6 के mRNA स्तर में परिवर्तन महत्वपूर्ण नहीं थे (चित्र 1ई)। परिधीय रक्त में जैव रासायनिक सूचकांक (पूरक तालिका 1) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

मानव एनके कोशिकाएं वसा ऊतक सेनेसेंस मार्करों को कम करती हैं और प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का स्राव करती हैं

तीन मोटे व्यक्तियों से वसा ऊतक एकत्र किया गया था, क्योंकि मोटापा एसएनसी [28] के संचय का कारण बनता है। इसके अलावा, वसा ऊतक को एसएनसी से एक वातानुकूलित माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था ताकि वसा ऊतक की कमी को और अधिक प्रेरित किया जा सके। गैर-एसएनसी से वातानुकूलित माध्यम में सुसंस्कृत वसा ऊतक को नियंत्रण माना जाता था। NK कोशिकाओं में Perforin (Fig.2A) और CD69 (Fig.2B) अभिव्यक्ति को नियंत्रण वसा ऊतक के साथ सह-ऊष्मायन की तुलना में सीनेसेंट वसा ऊतक के साथ सह-ऊष्मायन के बाद काफी विनियमित किया गया था। सीनेसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति p16 और p21 in

एनके सेल उपचार (छवि 2 सी, अनुपूरक चित्र 1 ए, बी) के बाद सीनेसेंट वसा ऊतक में काफी कमी आई थी। हमने यह भी पाया कि सीनेसेंट समूह में एनके कोशिकाओं के साथ सह-ऊष्मायन के बाद वातानुकूलित माध्यम में एसएएसपी का प्रमुख घटक काफी कम हो गया था (चित्र 2डी)। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि एनके कोशिकाएं वसा ऊतक से एसएनसी को खत्म कर सकती हैं और एसएएसपी फेनोटाइप को कम कर सकती हैं।

माउस एनके कोशिकाओं को एसएनसी के खिलाफ सक्रिय किया जा सकता है और साइटोटोक्सिसिटी को बढ़ा सकता है

जैसा कि पहले वर्णित [29] हमने पहले विकिरण या एड्रियामाइसिन द्वारा माउस वसा पूर्वज कोशिकाओं के जीर्णता को प्रेरित किया। यह निर्धारित करने के लिए कि एनके कोशिकाओं को विशेष रूप से एसएनसी द्वारा सक्रिय किया गया था, गैर-विकिरणित नियंत्रण कोशिकाओं या विकिरणित एसएनसी को 24 घंटे के लिए एनके कोशिकाओं के साथ सह-ऊष्मायन किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री ने दिखाया कि एनके कोशिकाओं में सीडी 69 (छवि 3 ए) और आईएफएन-वाई (छवि 3 बी) के अभिव्यक्ति स्तर को लक्ष्य कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में एसएनसी लक्ष्य कोशिकाओं में काफी विनियमित किया गया था। इस बीच, एनके कोशिकाओं के साथ सह-ऊष्मायन के बाद, एसएनसी का एपोप्टोटिक स्तर नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 3 सी) की तुलना में काफी अधिक था। इसके बाद, हमने एसएनसी में एनके सेल-एक्टिवेटिंग और इनहिबिटरी लिगैंड्स की अभिव्यक्ति का पता लगाया। QPCR परिणामों से पता चला है कि NK कोशिकाओं में सक्रिय लिगैंड्स का अभिव्यक्ति स्तर नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में काफी ऊपर-विनियमित था, और कुछ निरोधात्मक लिगैंड्स, जैसे कि बीटा 2 माइक्रोग्लोबुलिन (2m) के अभिव्यक्ति स्तर को नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में डाउनग्रेड किया गया था (अंजीर। .3डी)। हमने विवो में एसएनसी को खत्म करने के लिए एनके कोशिकाओं की क्षमता की भी जांच की है।सिस्टैंच साल्सा लाभडीआईआर-लेबल नियंत्रण कोशिकाओं और डीआईआर-लेबल वाले एसएनसी को चूहों के उदर गुहा में प्रत्यारोपित किया गया था, और एनके कोशिकाओं को पूंछ की नस के माध्यम से प्रशासित किया गया था। विवो इमेजिंग परिणामों में पता चला है कि एनके सेल उपचार के बाद एसएनसी के साथ प्रत्यारोपित चूहों में प्रतिदीप्ति तीव्रता नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 3 ई) के साथ प्रत्यारोपित चूहों की तुलना में काफी कमजोर थी। इसने संकेत दिया कि एसएनसी को मारने के लिए एनके कोशिकाओं की क्षमता विवो में एसएनसी की तुलना में काफी अधिक थी। अगला, हमने निर्धारित किया कि क्या एसएनसी के खिलाफ एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी खुराक पर निर्भर और सेल-विशिष्ट थी। उसी समय, हमने यह निर्धारित करने के लिए डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित सेनेकेंस का भी उपयोग किया कि क्या एसएनसी के खिलाफ एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी विकिरण प्रेरण तक सीमित थी। परिणामों से पता चला कि एनके कोशिकाओं में खुराक पर निर्भर तरीके से एसएनसी के खिलाफ महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिक गतिविधि थी, लेकिन नियंत्रण कोशिकाओं के खिलाफ थोड़ा साइटोटोक्सिसिटी थी। एसएनसी (छवि 3 एफ) को मारने के लिए एनके कोशिकाओं की क्षमता पर विभिन्न सेनेकेंस उत्तेजना विधियों का कोई प्रभाव नहीं पड़ा। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि एनके कोशिकाओं को विशेष रूप से एसएनसी द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और इन विट्रो और विवो में एसएनसी के खिलाफ महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिसिटी पैदा कर सकता है।

डीए एसएनसी के खिलाफ माउस एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी को डी1-जैसे रिसेप्टर्स . के माध्यम से बढ़ाता है

डीए [30] के महत्वपूर्ण न्यूरोइम्यून संचार कार्य के मद्देनजर, हमने मूल्यांकन किया कि क्या डीए एसएनसी के खिलाफ माउस एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी को बढ़ा सकता है। एनके कोशिकाओं को विकिरण-प्रेरित एसएनसी के साथ सह-ऊष्मायन किया गया था, और डीए के विभिन्न सांद्रता को माध्यम में जोड़ा गया था। परिणामों से पता चला कि डीए एसएनसी (छवि 4 ए, बी) के खिलाफ एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी को बढ़ा सकता है। सिग्नलिंग मार्ग को चिह्नित करने के लिए जिसके द्वारा डीए ने एसएनसी पर एनके कोशिकाओं के हत्या प्रभाव को बढ़ाया, एनके कोशिकाओं में डीआर अभिव्यक्ति, सीएमपी सामग्री और सीएमपी प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी प्रोटीन (सीआरईबी) फॉस्फोराइलेशन में परिवर्तन का मूल्यांकन किया गया। एनके कोशिकाओं और एसएनसी सह-ऊष्मायन की तुलना में एनके कोशिकाओं में डीए के साथ एसएनसी के साथ सह-ऊष्मायन, सीएमपी (छवि 4 सी) की सामग्री और सीआरईबी (छवि 4 डी, अनुपूरक चित्र 2 ए) के फॉस्फोराइलेशन स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। डीए के बिना यह स्पष्ट करने के लिए कि डीए एसएनसी के खिलाफ एनके कोशिकाओं की हत्या गतिविधि को क्यों बढ़ाता है, हमने एनके कोशिकाओं पर डीआर के परिवर्तनों की तुलना एसएनसी या नियंत्रण कोशिकाओं के साथ एनके कोशिकाओं के सह-ऊष्मायन के बाद की। परिणामों से पता चला कि नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 4 ई) की तुलना में एनके कोशिकाओं को एसएनसी के साथ सह-ऊष्मायन के बाद डी 1 और डी 5 डीआर अभिव्यक्ति स्तर को काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। अगला, DA और D1-जैसे रिसेप्टर विरोधी या D2-पसंद

एनके कोशिकाओं और एसएनसी के सह-ऊष्मायन प्रणाली में रिसेप्टर विरोधी को एक साथ जोड़ा गया था। अकेले डीए के जोड़ की तुलना में, डीए प्लस एससीएच -23300 (डी 1- रिसेप्टर विरोधी की तरह) (छवि 4 एफ, जी) के अलावा एसएनसी के एपोप्टोसिस स्तर में कमी आई थी। इस बीच, एनके कोशिकाओं में सीएमपी सामग्री (छवि 4 एच) और सीआरईबी (छवि 4 एल, अनुपूरक चित्र 2 बी) के फॉस्फोराइलेशन स्तर को डाउनग्रेड किया गया था। इसके विपरीत, DA प्लस हेलोपरिडोल (D2 रिसेप्टर प्रतिपक्षी) के अलावा ने अकेले DA की तुलना में NK कोशिकाओं में SNCs, cAMP सामग्री और CREB फॉस्फोराइलेशन के एपोप्टोसिस स्तर को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला। इन परिणामों ने प्रदर्शित किया कि DA ने एसएनसी के खिलाफ माउस एनके कोशिकाओं की हत्या गतिविधि को डी 1- जैसे डीआरएस के माध्यम से बढ़ाया।

माउस एनके कोशिकाओं के साथ संयुक्त ऐस विवो में एसएनसी की निकासी को काफी बढ़ाता है

एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि मनुष्यों में उम्र के साथ डोपामाइन कम हो जाता है [22]। हमने पहले युवा और बूढ़े चूहों में परिधीय डोपामाइन स्तर को मापा। परिणामों ने संकेत दिया कि पुराने चूहों के प्लाज्मा डोपामाइन का स्तर युवा चूहों (छवि 5 ए) की तुलना में कम था। इसके बाद, पुराने चूहों में एसिन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद परिधीय डोपामाइन रिलीज का पता लगाया गया। हमने पाया कि प्लाज्मा डोपामाइन का स्तर 10 मिलीग्राम / किग्रा एसिन इंजेक्शन (छवि 5 बी, अनुपूरक चित्र 3) के बाद काफी बढ़ गया। इसे देखते हुए, हमने वृद्ध चूहों के इलाज के लिए एसिन के साथ संयुक्त माउस एनके कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। हमने उपचार के बाद चूहों के परिधीय रक्त में एनके कोशिकाओं की स्थिति का पता लगाया और पाया कि अकेले एनके कोशिकाओं या एसिन के साथ संयुक्त एनके कोशिकाओं के परिधीय रक्त में एनके कोशिकाओं की संख्या ऐस उपचारित समूह की तुलना में काफी अधिक थी और पीबीएस समूह, जबकि एनके कोशिकाओं की संख्या एनके कोशिकाओं के इलाज समूह और एनके कोशिकाओं के बीच एसिन इलाज समूह (छवि 5 सी, डी) के साथ संयुक्त रूप से भिन्न नहीं थी।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा खुराक redditएनके कोशिकाओं के सक्रियण स्तर का और पता लगाने से पता चला है कि संयुक्त उपचारित समूह में परिधीय रक्त एनके कोशिकाओं में सीडी69 का अभिव्यक्ति स्तर एनके कोशिकाओं के इलाज समूह (छवि 5 ई) की तुलना में काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। इसके बाद, हमने ऊतक में एसएनसी का मूल्यांकन किया। हमने पाया कि अकेले एनके कोशिकाओं के जलसेक ने पीबीएस समूह और एसिन उपचारित समूह की तुलना में कुछ सेन्सेंट मार्करों की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, जबकि एसिन के साथ संयुक्त एनके कोशिकाओं के जलसेक ने एसए - - गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं (छवि 5 एफ) को काफी कम कर दिया। ) और साथ ही अकेले एनके कोशिकाओं के उपचार की तुलना में वसा ऊतक में P16 और P21 (छवि 5G, अनुपूरक चित्र। 4A, B) के अभिव्यक्ति स्तर। वसा ऊतक में Ki67BrdUcells की संख्या में भी काफी वृद्धि हुई थी (चित्र 5H) यह साबित करता है कि संयुक्त उपचारित समूह में वसा ऊतक में एसएनसी की सामग्री कम थी। एसए - -यकृत, फेफड़े, गुर्दे और वसा वर्गों के गैल स्टेनिंग ने संयुक्त उपचारित समूह (सप्लीमेंट्री अंजीर.5ए-डी) में एसएनसी का निम्नतम स्तर दिखाया। इन परिणामों से पता चला कि एनके कोशिकाओं ने एसिन थेरेपी के साथ मिलकर चूहों में एनके कोशिकाओं के सक्रियण स्तर को बढ़ाया, और विवो में एसएनसी के महत्वपूर्ण उन्मूलन का कारण बना।

एनके कोशिकाओं के साथ संयुक्त ऐस वृद्ध चूहों में उम्र से संबंधित फेनोटाइप को कम करता है

P16, P21 और SASP कारकों सहित विभिन्न प्रकार के सेन्सेंट मार्करों का पता लगाने के लिए चूहों, यकृत, फेफड़े, गुर्दे, वसा और आंखों के ऊतकों में उम्र से संबंधित फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए एकत्र किया गया था। इन नमूनों को इसलिए चुना गया क्योंकि इन ऊतकों में उम्र [31] के साथ बुढ़ापा आने की संभावना अधिक होती है। प्रत्येक ऊतक में, अकेले NK सेल इन्फ्यूजन के बाद, P16, P21 और SASP कारकों का mRNA स्तर नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम था, जबकि संयुक्त उपचार में लीवर, वसा और ईव टिश्यू में सेनेसेंस मार्करों का स्तर अकेले एनके सेल इन्फ्यूजन (छवि 6 ए) के साथ इलाज किए गए समूह की तुलना में समूह को और कम कर दिया गया था। इसी तरह, हमने चूहों के सीरम में मुख्य एसएएसपी कारक का भी पता लगाया है, और परिणाम ऊतकों (छवि 6 बी) के परिणामों के अनुरूप थे। इसके अलावा, हमने जिगर और वसा ऊतक में एनएडी स्तरों की भी जांच की है, जो उम्र बढ़ने से जुड़े हैं [32]। हमने पाया कि अकेले एनके कोशिकाओं के जलसेक या संयोजन चिकित्सा में यकृत और वसा ऊतक में एनएडी की सामग्री में काफी वृद्धि हुई है, संयुक्त चिकित्सा समूह (छवि 6 सी) में सुधार का स्तर काफी अधिक है। ALT, AST, CREA, UA, CHOL, और BUN सहित कुछ सीरम जैव रासायनिक सूचकांक उम्र बढ़ने के स्तर [33] से जुड़े हैं। हमने पाया है कि संयोजन-उपचार समूह में चूहों के सीरम में केवल यूए काफी कम हो गया था, जबकि अन्य प्रमुख जैव रासायनिक सूचकांक नहीं थे।

सामग्री और तरीके मानव एनके कोशिकाओं का आसव

ऑटोलॉगस एनके सेल इन्फ्यूजन शंघाई मेंगचाओ कैंसर अस्पताल (शंघाई, चीन) द्वारा किया गया था, और सभी प्रोटोकॉल को उनकी आचार समिति (नंबर 05,2020, शंघाई मेंगचाओ कैंसर अस्पताल की मेडिकल एथिक्स कमेटी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी स्वयंसेवकों ने परिधीय रक्त प्राप्त करने के लिए हस्ताक्षरित सूचित सहमति प्रदान की। संक्षेप में, प्रत्येक व्यक्ति से 50 एमएल परिधीय रक्त निकाला गया, जिसके बाद परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) को अलग कर दिया गया और ExCellerate "ह्यूमन एनके सेल एक्सपेंशन मीडिया (आर एंड डी सिस्टम्स, यूएसए) के साथ एक T75 फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया गया जिसमें 1 × Cloudz CD2 / NKp46 था। , रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन आईएल-2(27ng/mL), रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन एल-12 (10 एनजी/एमएल), रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन आईएल-18 (10 एनजी/एमएल, और रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन एल{{ 13}}(10 एनजी/एमएल)(आर एंड डी सिस्टम्स, यूएसए) 48 घंटे के लिए, और फिर सक्रिय माध्यम (270 एनजी/एमएल पुनः संयोजक मानव आईएल-2, 20 एनजी/एमएल पुनः संयोजक मानव आईएल-12 के साथ प्रतिस्थापित किया गया। , 20 एनजी/एमएल पुनः संयोजक मानव आईएल -18, और 20 एनजी/एमएल पुनः संयोजक मानव आईएल -21) आगे की संस्कृति के लिए। सेल घनत्व 1 × 10 डिग्री कोशिकाओं / एमएल पर बनाए रखा गया था। संस्कृति के 28 दिन पर , गुणवत्ता नियंत्रण के लिए ऑटोलॉगस एनके कोशिकाओं की एक छोटी संख्या एकत्र की गई थी और 4.15 × 10 डिग्री (3. 76-5 .87 × 10) कोशिकाओं के घनत्व पर ऑटोलॉगस एनके कोशिकाओं के साथ अंतःक्रियात्मक रूप से पुन: इंजेक्ट किया गया था, जिसमें 30 मिनट का जलसेक समय था। प्रयोगात्मक प्रक्रिया के अनुसार किया गया था गुड क्लिनिकल प्रैक्टिस के साथ। दूसरे रक्त संग्रह के लिए समय अंतराल लगभग 37 ({36}}) दिन था।

मानव परिधीय रक्त टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं का अलगाव सूचित सहमति प्रदान किए जाने के बाद स्वस्थ स्वयंसेवकों से ताजा रक्त प्राप्त किया गया था, और प्रोटोकॉल को चाइना फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (परमिट संख्या: SYXK 2016-0011) द्वारा अनुमोदित किया गया था। लिम्फोप्रेप (STEMCELL Technologies, Canada) का उपयोग मानव PBMCs को अलग करने के लिए किया गया था। मानव सीडी 3 प्लस टी कोशिकाओं को पीबीएमसी से मानव सीडी 3 टी-सेल छँटाई चुंबकीय मोतियों (मिल्टनी बायोटेक, जर्मनी) का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किया गया था। एनके कोशिकाओं को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रोसेटसेप "ह्यूमन एनके सेल एनरिचमेंट कॉकटेल (STEMCELL टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके परिधीय रक्त से अलग किया गया था।

इन विट्रो में माउस एनके कोशिकाओं का पृथक्करण और विस्तार

माउस स्प्लेनिक एनके कोशिकाओं को निर्माता के निर्देशों के अनुसार एनके सेल आइसोलेशन किट (मिल्टनी बायोटेक) का उपयोग करके अलग किया गया था। संक्षेप में, माउस स्प्लेन्स प्राप्त किए गए थे, प्लीहा कोशिकाओं को 70μm सेल फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था, और प्लीहा लिम्फोसाइट्स को माउस प्लीहा लिम्फोसाइट सेपरेशन किट (सोलरबियो, चीन) का उपयोग करके घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त किया गया था। स्प्लेनिक लिम्फोसाइट्स को माउस एनके कोशिकाओं को अलग करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके उच्च शुद्धता वाली एनके कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एकत्र किया गया था। पृथक स्प्लेनिक एनके कोशिकाओं को एक रखरखाव आरपीएमआई -1640 माध्यम में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1 प्रतिशत एल-ग्लूटामाइन, 1 प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 प्रतिशत न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) गैर- आवश्यक अमीनो एसिड, 1 प्रतिशत सोडियम पाइरूवेट एसिड, और 50 यूएम मर्कैप्टोएथेनॉल (सभी लाइफ टेक्नोलॉजीज, यूएसए से)। इसके अलावा, 200 IU/mL पुनः संयोजक इंटरल्यूकिन 2 (RL-2)(PeproTech, USA) और 10 ng/mL माउस I-15(ml-15)(PeproTech) को इसमें जोड़ा गया। मध्यम। फिर 10 डिग्री एनके कोशिकाओं और 10 डिग्री विकिरणित प्लीहा लिम्फोसाइटों को एकत्र किया गया, और 5 एमएल प्रवर्धन माध्यम (1000 आईयू / एमएल आरएलएल -2, 10एनजी / एमएल एमएल -15, और 30एनजी / एमएल के साथ पूरक रखरखाव माध्यम) -NKp46 एंटीबॉडी (PA5-46986,Invitrogen,USA)) था

Fig.3 एसएनसी एनके कोशिकाओं को सक्रिय करते हैं और एनके कोशिकाओं द्वारा मारे गए थे। (ए) सीडी69 और (बी) की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री माउस एनके कोशिकाओं और पेरीडिपोसाइट्स या विकिरण-प्रेरित पेरीडिपोसाइट्स के साथ 24 घंटे के सह-ऊष्मायन के बाद किया गया था। एन =3। डेटा को ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। दो-पूंछ वाले अयुग्मित गैर-पैरामीट्रिक टी-परीक्षण द्वारा अंतर का मूल्यांकन किया गया था। **पी<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

पेरीडिपोसाइट्स और मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं का निष्कर्षण

पेरीडिपोसाइट्स को पहले वर्णित [11] के रूप में निकाला गया था। संक्षेप में, मानव या माउस वसा को बाँझ परिस्थितियों में हटा दिया गया था और 1-2 मिमी टुकड़ों में काट दिया गया था, दो बार पीबीएस के साथ धोया गया था, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर कोलेजनैस ll Solarbio） के साथ पच गया। फिर कोशिकाओं को 100 माइक्रोन सेल फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया, 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और एकत्र किया गया। अनुयाई कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए 20 प्रतिशत एफबीएस के साथ पूरक ए-एमईएम में सुसंस्कृत किया गया और अनुयाई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया। पहले वर्णित [34] के रूप में मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं को पृथक किया गया था। क्वाड्रिसेप्स पेशी को 1-2 मिमी टुकड़ों में काट दिया गया था, और 5 एमएल कोलेजेनेज ll को 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए पाचन के लिए जोड़ा गया था। मिश्रण को एक पिपेट के साथ मिलाया गया था, और 12 मिनट के लिए अतिरिक्त पाचन के बाद 5 मिलीलीटर पूरा माध्यम जोड़ा गया था। कोशिकाओं को 70 माइक्रोन सेल फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया और 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। तब कोशिकाएं थीं

5 एमएल माध्यम के साथ सुसंस्कृत दैनिक 4 दिनों के लिए जोड़ा गया। आसन्न कोशिकाओं को एक पिपेट के साथ उड़ा दिया गया और 5 मिनट के लिए 2000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री पर ट्रिप्सिन पाचन के बाद, कोशिकाओं को 2000 × g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और एकत्र किया गया। फिर 5 एमएल एफ-10 हैम का माध्यम 20 प्रतिशत एफबीएस और 4 एनजी/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (पेप्रोटेक) के साथ जोड़ा गया।

एसएनसी को माउस स्प्लेनिक एनके कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी का पता लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज परख द्वारा लगाया गया था

एसएनसी को 0.2 माइक्रोन एड्रियामाइसिन (मेडकेमएक्सप्रेस, यूएसए) द्वारा 24 घंटे के लिए या 10 Gy एक्स-रे विकिरण के बाद 20 दिनों तक निरंतर संस्कृति द्वारा प्रेरित किया गया था। तब 5000 एसएनसी को एक प्लेट में रखा गया था, और प्लीहा एनके कोशिकाओं (सेल व्यवहार्यता: 93.5-97.1 प्रतिशत) को 50:1,25:1,12.5:1, 6.25 के अनुपात को लक्षित करने के लिए प्रभावकारक में जोड़ा गया था: 1,3.125:1, और 1.563: 1। सतह पर तैरनेवाला 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सह-संवर्धन के बाद एकत्र किया गया था, और एक लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) साइटोटोक्सिसिटी डिटेक्शन किट (केमैन केमिकल, यूएसए) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। साइटोटोक्सिसिटी की गणना निम्न सूत्र द्वारा की गई: साइटोटोक्सिसिटी (प्रतिशत)=(मिश्रण सेल प्रयोग-लक्ष्य सेल सहज-प्रभावक सेल सहज) / (लक्ष्य सेल अधिकतम- लक्ष्य सेल सहज) × 100।

लाइव इमेजिंग

बारह 10-सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों को Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, China) से खरीदा गया था। फिर 1×10 डिग्री 1,1'-ऑक्टाडेसिल-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine आयोडाइड (DiR) (Invitrogen)-लेबल नियंत्रण

पेरीडिपोसाइट्स या विकिरण-प्रेरित सीनेसेंट पेरीडिपोसाइट्स को 200 यूएल फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में फिर से जोड़ा गया और 22 गेज सुई के साथ चूहों के उदर गुहा में इंजेक्ट किया गया। तीन दिनों के बाद, 100uL पीबीएस में 5 × 10 डिग्री एलोजेनिक एनके कोशिकाओं (सेल व्यवहार्यता: 93। 6-96 .2 प्रतिशत) को पूंछ की नस के माध्यम से इंजेक्ट किया गया। 10 वें दिन, चूहों को आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था। विवो इमेजिंग सिस्टम (PerkinElmer, MA, USA) में MS 100 सीरीज का उपयोग करके प्रतिदीप्ति का पता लगाया गया था।

फ़्लो साइटॉमेट्री

एसएनसी के एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए डीआईआर-लेबल स्प्लेनिक एनके कोशिकाओं (सेल व्यवहार्यता: 91.{3}}.2 प्रतिशत) के साथ सह-ऊष्मायन का पता लगाने के लिए, 1 × 10 डिग्री एसएनसी को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पर सटीकता के साथ पचाया गया और फिर दाग दिया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एनेक्सिन वी और प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) एपोप्टोसिस स्टेनिंग किट (मल्टीसाइंसेस बायोटेक कं, लिमिटेड, चीन) के साथ। एसएनसी को डीआईआर-नकारात्मक स्थिति में रखा गया था। एनके कोशिकाओं की सक्रियता का परीक्षण करने के लिए, माउस एनके कोशिकाओं को एकत्र किया गया और एमएनके1 के साथ दाग दिया गया। 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) 30 मिनट के लिए 4 डिग्री पर। तब कोशिकाओं को CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, USA) के साथ संसाधित किया गया और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री पर माउस इंटरफेरॉन गामा-ब्रिलियंट वायलेट 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) के साथ दाग दिया गया। मानव एनके कोशिकाओं के पेर्फोरिन-एपीसी (एस1609ए) धुंधला उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था, जो बाह्य कोशिकीय धुंधला (सीडी 56- फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट [एफआईटीसी] (5.1 एच 11), सीडी 69- पीई (एफएन 50) के लिए उपयोग किया जाता था। ) और इंट्रासेल्युलर धुंधला (पेर्फोरिन-एपीसी) (बायोलेगेंड)।

परिधीय रक्त एनके कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, 100uL थक्कारोधी रक्त एकत्र किया गया था। माउस परिधीय रक्त के लिए, CD3-FITC, NK1.1-APC, और CD69-PE-Cy7 जोड़े गए। मानव परिधीय रक्त के लिए, सीडी 3-बीवी421 (ओकेटी3) और सीडी56-एफआईटीसी को जोड़ा गया और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया।

फिर 400 μL 1 × एरिथ्रोसाइट लाइसेट (बीडी बायोसाइंसेस) जोड़ा गया और 3 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया, इसके बाद पीबीएस के साथ तीन वॉश किए गए। वसा ऊतक में कोशिका प्रसार का पता लगाने के लिए, चूहों को इच्छामृत्यु से पहले 10 मिलीग्राम / एमएल ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन （BrdU） 24 और 72 घंटे के 200 μL के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था। इच्छामृत्यु के बाद, वंक्षण वसा डिपो को हटा दिया गया और टुकड़ों में काट दिया गया, कोलेजनेज़ ll और DNase के साथ 30 मिनट के लिए 37 सी पर पचाया गया, और 100 उम सेल फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया। कोशिकाओं को Cytofix/Cytoperm Plus Kit के साथ संसाधित किया गया और BrdU-FITC (3D4) और Ki 67- PE (16A8) के साथ दाग दिया गया। फ्लो साइटोमेट्री एक साइटोफ्लेक्स फ्लो साइटोमीटर पर किया गया था। सभी प्रयोगों में मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए LIVE / DEAD फिक्सेबल वायलेट डेड सेल स्टेन किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए) का उपयोग किया गया था। फ्लोजो सॉफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशलैंड, ओआर, यूएसए) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर

ट्राईजोल अभिकर्मक का उपयोग करके आरएनए को निकाला गया और हेयर 1 स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट (येपसेन बायोटेक्नोलॉजी, चीन) का उपयोग करके उलटा और सीडीएनए में स्थानांतरित किया गया। एबीसी क्वांटस्टूडियो 3 रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, यूएसए) पर एसवाईबीआर ग्रीन (येपसेन बायोटेक्नोलॉजी) के प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का प्रदर्शन किया गया था, जिसमें जीएपीडीएच एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य कर रहा था। 2-△ACT पद्धति का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। पूरक सामग्री (तालिका 2-3) में प्राइमर अनुक्रम सूची की सूचना दी गई है।

बुढ़ापा-संबंधी -गैलेक्टोसिडेज़ धुंधला हो जाना

सेल धुंधला होने के लिए, कोशिकाओं को एक बार पीबीएस के साथ धोया गया था, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेनेसेंस से जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ (एसए - - गैल) समाधान (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, यूएसए) में तय किया गया था, पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था, और ऊष्मायन किया गया था। एसए - - में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर गैल धुंधला समाधान। धुंधला माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट को पैराफिल्म के साथ सील कर दिया गया था। प्रकोष्ठों

पीबीएस से धोए गए और माइक्रोस्कोप से देखे गए। जमे हुए खंड धुंधला होने के लिए, वर्गों को 3 0 मिनट के लिए 37 डिग्री पर सुखाया गया और 15 मिनट के लिए एसए - - गैल फिक्सेशन समाधान में कमरे के तापमान पर तय किया गया। वर्गों को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और 37 डिग्री सेल्सियस पर एसए - - गैल धुंधला समाधान में रातोंरात ऊष्मायन किया गया। फिर उन्हें 1 मिनट के लिए ईओसिन से दाग दिया गया और 2 मिनट के लिए पानी से धोया गया। इमेज-प्रो प्लस 6.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एसए - -गैल स्टेनिंग डेटा का विश्लेषण किया गया।

मानव वसा ऊतक का पता चलता है

तीन व्यक्तियों से वसा ऊतक लिपोसक्शन द्वारा प्राप्त किया गया था। विषयों में से एक पुरुष था, और दो महिलाएं थीं। विषयों की औसत आयु 57.0±7.6 वर्ष (मतलब ±SD: सीमा, 50-65) थी। औसत बीएमआई 40.5 ± 5.1 किग्रा/एम²（मीन ± एसडी था; रेंज, 36.7-46.2）. शंघाई मेंगचाओ कैंसर अस्पताल की आचार समिति (नंबर 05, 2020, शंघाई मेंगचाओ कैंसर अस्पताल की मेडिकल एथिक्स कमेटी) ने प्रायोगिक योजना को मंजूरी दी। सभी स्वयंसेवकों के लिए सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। लगभग 2 मिमी के व्यास के साथ वसा ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट दिया गया था। ऊतक के पांच टुकड़े एक 96- कुओं की प्लेट के प्रत्येक कुएं में रखे गए थे, और 200 यूएल या तो पेरीडिपोसाइट्स या विकिरण-प्रेरित सेन्सेंट पेरीडिपोसाइट्स से वातानुकूलित माध्यम, 10 प्रतिशत मानव एबी सीरम, 1 प्रतिशत एल-ग्लूटामाइन, 1 के साथ पूरक। 24 घंटे के लिए सह-संस्कृति में प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 प्रतिशत एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और 1 प्रतिशत सोडियम पाइरूवेट एसिड मिलाया गया। फिर माध्यम को एक नए माध्यम से बदल दिया गया जिसमें 5 × 10 डिग्री ऑटोलॉगस एनके सेल (सेल व्यवहार्यता: 92। 3-95 .7 प्रतिशत 6) थे और एक और 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे, जिसके बाद एनके कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एकत्र किया गया था। वसा ऊतक को पीबीएस के साथ पांच बार धोया गया था, और उसी माध्यम को आगे की संस्कृति के लिए 48 घंटे के लिए जोड़ा गया था; सतह पर तैरनेवाला (100 uL) का उपयोग बहु-कारक पहचान के लिए किया गया था। पेरीडिपोसाइट्स या विकिरण-प्रेरित सीनेसेंट पेरीडिपोसाइट्स एक ही व्यक्ति के वसा ऊतक से प्राप्त किए गए थे।

यह लेख सेल डेथ एंड डिजीज (2022) 13:305 . से निकाला गया है