ट्रांसडर्मल ड्रग डिलीवरी पार्ट 1 के लिए स्पंदित-लेजर विकिरण के साथ माइक्रोबबल कंट्रास्ट एजेंट का संयोजन

अमूर्त: विभिन्न चिकित्सा अनुप्रयोगों में तरल पदार्थ में लेजर-प्रेरित माइक्रोबबल (एमबी) गुहिकायन की ऑप्टोडायनामिक प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है। हालांकि, अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के रूप में लेजर विकिरण एमबी के साथ कैसे संपर्क करता है, इसका अनुमान शायद ही कभी लगाया जाता है जब तरल में पहले से ही स्थिर एमबी होते हैं। वर्तमान अध्ययन ने ट्रांसडर्मल दवा वितरण को बढ़ाने में एल्ब्यूमिन-शेल्ड एमबी के लेजर-मध्यस्थ गुहिकायन की दक्षता की जांच की। एमबी के लेजर-मध्यस्थ जड़त्वीय गुहिकायन के विभिन्न प्रकार और स्थितियों का पहले मूल्यांकन किया गया था। इन विट्रो और इन विवो प्रयोगों में एमबी के साथ संयोजन के लिए एक सीओ2 भिन्नात्मक स्पंदित लेजर का चयन किया गया था। 2 घंटे के बाद -आरब्यूटिन द्वारा इन विट्रो स्किन पैठ नियंत्रण समूह की तुलना में एमबी के साथ लेजर संयोजन करने वाले समूह में 2 गुना अधिक था। छोटे-जानवरों के प्रयोगों में, समूह में C57BL/6J चूहों की त्वचा पर सफेदी का प्रभाव MBs के साथ त्वचा पर मर्मज्ञ -अर्बुटिन के संयोजन से (महत्वपूर्ण रूप से) 48 तक बढ़ गया। 0 प्रतिशत दिन 11 और 5 पर 0.0 प्रतिशत दिन 14 पर, और फिर शेष 20-दिन प्रायोगिक अवधि के लिए स्थिर होने की प्रवृत्ति थी। वर्तमान परिणामों से संकेत मिलता है कि एल्ब्यूमिन-शेल्ड एमबी के साथ CO2 लेजर के संयोजन से त्वचा की पारगम्यता बढ़ सकती है ताकि त्वचा को नुकसान पहुंचाए बिना चूहों में मेलानोजेनेसिस को रोकने के लिए -आरब्यूटिन की डिलीवरी बढ़ाई जा सके।

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार,धनियाएक आम जड़ी बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइडजिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसेएंटीऑक्सिडेंट, सूजनरोधी, औरप्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना. सिस्टंच और के बीच का तंत्रत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाके एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित हैधनिया ग्लाइकोसाइड्स. मानव त्वचा में मेलेनिन द्वारा उत्प्रेरित टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता हैटायरोसिनेस. ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। Cistanche में cistanoside होता है, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना।

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1 परिचय

गुहिकायन एक तरल में गुहाओं के गठन को संदर्भित करता है और आमतौर पर तब होता है जब तरल तेजी से दबाव परिवर्तन के अधीन होता है। इस तरह के दबाव परिवर्तन को कई अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके प्रेरित किया जा सकता है, ध्वनिक गुहिकायन तब शुरू किया जाता है जब एक लागू ध्वनिक दबाव का आयाम एक निश्चित सीमा [1] से अधिक हो जाता है। ध्वनिक गुहिकायन में उच्च-तीव्रता वाले अल्ट्रासाउंड (यूएस) तरंगों द्वारा sonication के दौरान तरल पदार्थों में माइक्रोबबल्स (एमबी) का निर्माण, विकास, स्पंदन और पतन शामिल है। इन घटनाओं को मिश्रण, विखंडन, कटाव, गीलापन, सोनोकेपिलरी और अन्य प्रभावों के लिए जिम्मेदार माना जाता है जिनके विभिन्न व्यावहारिक औद्योगिक अनुप्रयोग हैं [1]।

एमबी कंट्रास्ट एजेंटों के यूएस-प्रेरित गुहिकायन भी नैदानिक ​​​​और चिकित्सीय चिकित्सा अनुप्रयोगों दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यूएस कंट्रास्ट एजेंट स्थिर और लेपित एमबी हैं जिन्हें डायग्नोस्टिक यूएस इमेजिंग [2] के रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए अंतःशिरा में इंजेक्ट किया जाता है। कई अध्ययनों से सबूत हैं कि रक्त में एमबी कंट्रास्ट एजेंटों की उपस्थिति इन विट्रो और विवो दोनों में विभिन्न यूएस-प्रेरित जैविक प्रभावों के लिए दहलीज को कम कर सकती है, जैसे हेमोलिसिस, केशिका टूटना, और सोनोपोरेशन [3]। कुछ अध्ययनों ने संकेत दिया है कि रक्त में एमबी कंट्रास्ट एजेंटों की उपस्थिति यूएस-प्रेरित समयपूर्व हृदय संकुचन [4,5] के लिए दहलीज को काफी कम कर देती है। एमबी (स्थिर गुहिकायन) की अनुनाद के परिणामस्वरूप नॉनलाइनियर हार्मोनिक उत्सर्जन होता है जिसका उपयोग एमबी-विशिष्ट कंट्रास्ट इमेजिंग में किया जा सकता है। एमबी की जड़त्वीय गुहिकायन और विनाश मजबूत यांत्रिक तनाव को प्रेरित कर सकता है जो चिकित्सीय एजेंटों के वितरण में सुधार के लिए कोशिका झिल्ली की पारगम्यता और रक्त-मस्तिष्क बाधा को बढ़ाता है। अपने पिछले अध्ययनों में, हमने ट्रांसडर्मल ड्रग डिलीवरी (टीडीडी) को बढ़ाने के लिए यूएस द्वारा प्रेरित एमबी के जड़त्वीय गुहिकायन को लागू किया है, क्योंकि स्थिर गुहिकायन की तुलना में जड़त्वीय गुहिकायन स्ट्रेटम कॉर्नियम की कहीं अधिक पारगम्यता वृद्धि के परिणामस्वरूप पाया गया था [6-8] .

लेजर विकिरण दवा के पारगमन को बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है और इसलिए त्वचा में या उसके पार दवा वितरण की सुविधा प्रदान करता है। जब एक निश्चित दहलीज से ऊपर की तीव्रता वाली एक लेजर पल्स एक तरल पर केंद्रित होती है, तो तरल का विस्फोटक वाष्पीकरण भी एमबी पोकेशन [9,10] को प्रेरित कर सकता है। लेजर-प्रेरित पोकेशन की आक्रामक प्रकृति के परिणामस्वरूप इसका उपयोग सेल लसीस, सेल मेम्ब्रेन पोरेशन और ओकुलर सर्जरी [11] सहित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया जा रहा है। पोस्टऑपरेटिव, एट्रोफिक और मुँहासे के निशान की उपस्थिति को सुरक्षित रूप से सुधारने के लिए रणनीतियों को हाल ही में भिन्नात्मक एब्लेटिव और नॉनएबलेटिव लेजर [12] का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। एब्लेटिव लेजर स्किन रिसर्फेसिंग सबसे बड़ा नैदानिक ​​​​सुधार प्रदान करता है, लेकिन पोस्टऑपरेटिव रिकवरी में कई सप्ताह लगते हैं [13]। विस्तारित पोस्टऑपरेटिव हीलिंग को सहन करने में असमर्थ या अनिच्छुक रोगियों के लिए नॉनएब्लेटिव लेजर प्रक्रियाएं अधिक उपयुक्त हो सकती हैं। हालांकि, लेजर या अन्य प्रकाश स्रोत [13] द्वारा उत्पन्न तीव्र गर्मी के कारण पूर्व दाद सिंप्लेक्स संक्रमण गैर-विस्फोटक लेजर त्वचा रीमॉडेलिंग के बाद पुन: सक्रिय हो सकता है।

लेजर विकिरण द्वारा उत्पन्न गर्मी को कम करने के लिए कुछ तरीके विकसित किए गए हैं, जैसे कि संपर्क कूलिंग हैंडपीस या डायनेमिक क्रायोजेनिक उपकरणों का उपयोग जो अलग-अलग अवधि के कूलिंग स्प्रे के स्पर्ट देने में सक्षम हैं [14]। हालांकि, इस बात पर अभी भी कोई सहमति नहीं है कि उपचार के दौरान शीतलन की कौन सी विधि सबसे प्रभावी है। इसके अलावा, अमेरिका के विपरीत, तरल पदार्थ में स्थिर लेपित एमबी के साथ लेजर-प्रेरित गुहिकायन के प्रभावों को अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहता है।

2। सामग्री और विधि

2.1। एल्बुमिन-शेल्ड एमबी का उत्पादन

हमारे पिछले अध्ययनों [7,15] में प्रयुक्त प्रक्रिया के अनुसार एल्बुमिन-शेल्ड एमबी तैयार किए गए थे। संक्षेप में, 14 0 मिलीग्राम एल्ब्यूमिन (ऑक्टाफार्मा, विएना, ऑस्ट्रिया) और फिजियोलॉजिकल सलाइन (पीएच 7.4, {पीएच 7.4, {) में पेरफ्लूरोकार्बन गैस युक्त घोल के 1 0 एमएल में एल्ब्यूमिन-शेल्ड एमबी सोनिकेशन द्वारा उत्पन्न किए गए थे। {21}}.9 प्रतिशत सोडियम क्लोराइड) 2 मिनट के लिए एक सोनिकेटर (ब्रैनसन अल्ट्रासोनिक्स, डैनबरी, सीटी, यूएसए) का उपयोग करके। समाधान में परफ्लूरोकार्बन-फिफिल्ड एल्ब्यूमिन एमबी की संख्या को 30-माइक्रोन-अपर्चर जांच और 0.6–20 माइक्रोन की माप सीमाओं के साथ मल्टीसाइज़र III डिवाइस (बेकमैन कूल्टर, फुलरटन, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। निलंबन में आकार वितरण को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, UK) के आधार पर मापा गया था, जिससे पता चला कि एल्ब्यूमिन-शेल्ड MB का व्यास 1.02 ± 0.11 µm (मतलब ± SD) और 1.40 की सांद्रता थी। × 108 एमबी/एमएल।

2.2। लेजर-प्रेरित एमबी व्यवधान 

पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि प्रभावी टीडीडी [8,16,17] के लिए यूएस-मध्यस्थ एमबी व्यवधान (यानी, जड़त्वीय गुहिकायन) आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन ने विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न प्रकार के लेज़रों का उपयोग करते समय एमबी व्यवधान की दक्षता को मापा। MBs की सांद्रता 2.8 × 107 MBs/mL (पांच गुना कमजोर पड़ने) और 1.4 × 107 MBs/mL (दस गुना कमजोर पड़ने) को एक Eppendorf ट्यूब में समायोजित किया गया था, और विकिरण चार प्रकार के लेजर द्वारा प्रदान किया गया था: एयर-कूल्ड आर्गन-आयन लेजर (515 एनएम, निरंतर तरंग), सुपरकॉन्टिनम फाइबर लेजर (1064 एनएम, स्पंदित तरंग), एनडी: वाईएजी लेजर (532 एनएम, स्पंदित तरंग), और सीओ2 भिन्नात्मक लेजर (10,600 एनएम, स्पंदित तरंग)। विभिन्न प्रकार के लेज़रों के लिए विस्तृत शर्तें तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

ऑप्टिकल सेटअप का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है। लेजर विकिरण के दौरान तापमान में परिवर्तन को थर्मामीटर (ऑपट्रिस एलएस, ऑप्ट्रिस, बर्लिन, जर्मनी) का उपयोग करके मापा गया था। फिर, लेजर के संपर्क में आने के बाद, अवलोकन के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड में एमबी समाधान के 100 μL को जोड़ा गया। लेज़र विकिरण से पहले और बाद में प्रकाश-माइक्रोस्कोपी छवियों में MB की संख्या को MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) का उपयोग करके 8-बिट ग्रेस्केल छवियों में परिवर्तित किया गया था ताकि MB व्यवधान के प्रेक्षणों को सुविधाजनक बनाया जा सके। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के अनुसार एमबी की विनाश दर निर्धारित की गई थी:

2.3। पिगस्किन में प्रवेश गहराई

2.4। -आरबुटिन सॉल्यूशन द्वारा इन विट्रो स्किन पेनेट्रेशन

पिगस्किन के एक {{0}}मिमी-मोटे नमूने को हंबी चाकू का उपयोग करके काटा गया था, जिसे पीबीएस के साथ सावधानीपूर्वक साफ किया गया था, और चौकोर टुकड़ों (2 सेमी × 2 सेमी) में काटा गया था। 1.5 सेमी की त्रिज्या और 5 मिमी की ऊंचाई के साथ त्वचा के नमूनों पर परिपत्र क्षेत्रों को रिसाव को रोकने के लिए जेल के साथ घेर लिया गया था जब नमूना एमबी के 5 {{3 0}} 0 μL के साथ लोड किया गया था। CO2 भिन्नात्मक लेजर के साथ नमूना को सात बार विकिरणित करने के बाद (स्थितियों को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है), प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार 2.14 सेमी2 के क्षेत्र में स्थैतिक फ्रांज प्रसार कोशिकाओं का उपयोग करके त्वचा के प्रवेश का परीक्षण किया गया था जिसे हमने पहले वर्णित किया है [7]। प्रसार असेंबली का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। -अर्बुटिन (30 mg/mL, 500 µL, 4-हाइड्रॉक्सीफेनिल- -D-ग्लूकोपीरानोसाइड, आणविक द्रव्यमान=272.25 Da; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, USA) था त्वचा के एपिडर्मल पक्ष पर लागू होता है और पैराफिल्म (पेचिनी प्रयोगशाला सुरक्षा उत्पाद और परिधान, शिकागो, आईएल, यूएसए) के साथ बंद हो जाता है। त्वचीय पक्ष का सामना करने वाले रिसेप्टर प्रसार डिब्बे को पीबीएस (पीएच 7.4) के 12 एमएल से भर दिया गया था, जिसे 600 आरपीएम पर घूमने वाली चुंबकीय पट्टी से हिलाया गया था। जिन परीक्षण समाधानों में एमबी नहीं था, उन्हें 0.2-µm माइक्रोपोर फ़िल्टर (Nalgene, Rochester, NY, USA) या 0.22-µm माइक्रोपोर फ़िल्टर (Millex, Darmstadt, Germany) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। रिसेप्टर समाधान के एलिकोट्स (200 μL) को 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, और 24 घंटे में लिया गया था, और ताजा रिसेप्टर समाधान की समान मात्रा द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था।

2.5। -आरबुटिन का एचपीएलसी विश्लेषण

एक इंस्पायर ™ C18 कॉलम (25 0 मिमी × 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन कण आकार; डिक्मा टेक्नोलॉजीज, लेक फॉरेस्ट, सीए, यूएसए) का उपयोग -आरब्यूटिन सांद्रता को मापने के लिए किया गया था। एचपीएलसी प्रणाली एक बाइनरी पंप (पीयू -2089, जैस्को, टोक्यो, जापान) से लैस थी, और पराबैंगनी (यूवी) डिटेक्टर (यूवी -2075, जैस्को) की तरंग दैर्ध्य 280 एनएम पर सेट की गई थी। मोबाइल चरण में मेथनॉल शामिल है: आसुत जल (पीएच 5.5, 70:30 वी/वी) [18] 0.6 एमएल/मिनट की साथी दर पर। विश्लेषण किए जाने वाले सभी नमूनों को 20 µL की मात्रा में इंजेक्ट किया गया था। -अरबुटिन का प्रतिधारण समय लगभग 4.3 मिनट था।

2.6। पशु उपचार

C57BL/6J माउस मॉडल [19] में ऑर्गेनॉइड की मेलेनिन सामग्री की जांच की गई थी। बायो लास्को (ताइपेई, ताइवान) से 20-25 ग्राम वजन वाले पांच सप्ताह के चूहों को प्राप्त किया गया था। प्रायोगिक प्रोटोकॉल को राष्ट्रीय रक्षा चिकित्सा केंद्र, ताइपेई, ताइवान की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। जानवरों की देखभाल के लिए प्रक्रियाएँ संस्थागत दिशानिर्देशों और विनियमों (अनुमोदन संख्या IACUC-17-092) का अनुपालन करती हैं। प्रयोगों के दौरान, जानवरों को एक वातानुकूलित कमरे में स्टेनलेस स्टील के पिंजरों में रखा गया था, जिसमें तापमान 25-28 डिग्री सेल्सियस और प्रत्येक 12 घंटे के प्रकाश और अंधेरे चक्रों के साथ रखा गया था।

प्रयोग से पहले 7 दिनों के लिए जानवरों को अभ्यस्त कर दिया गया था। उनके बालों को 2 सेमी × 2 सेमी के क्षेत्र से हटा दिए जाने के बाद, त्वचा का रंग क्रोमा मीटर (सीआर -400, कोनिका मिनोल्टा सेंसिंग, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके मापा गया था। जानवरों को तब पराबैंगनी बी (यूवीबी) विकिरण (G8T5E, Sankyo, Tokyo, Japan) के संपर्क में लाया गया ताकि हाइपरपिग्मेंटेशन (कुल ऊर्जा खुराक प्रति एक्सपोज़र=1 J/cm2, वेवलेंथ=306 एनएम, तीन बार प्रति सप्ताह 2 सप्ताह के लिए), और फिर त्वचा का रंग फिर से मापा गया।

जानवरों को निम्नलिखित पांच समूहों में विभाजित किया गया था (n {{0}} प्रति समूह, उपचार 2 0 दिनों के लिए हर 3 दिनों में एक बार लागू किया गया): (1) कोई इलाज नहीं (समूह सी); (2) मर्मज्ञ -अर्बुटिन अकेले (300 μg/mL, 0.2 mL/cm2 ) (समूह A); (3) भेदन -अर्बुटिन (300 µg/mL, 0.2 mL/cm2 ) (समूह L प्लस A) के अनुप्रयोग के साथ सीधे त्वचा को विकिरणित करने वाला लेज़र; (4) खारा द्वारा कवर की गई त्वचा को विकिरणित करने वाला लेजर और मर्मज्ञ -अरबुटिन (300 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.2 एमएल / सेमी 2) (समूह एल प्लस एस प्लस ए) के आवेदन के साथ; और (5) त्वचा पर एमबी के साथ संयुक्त त्वचा को विकिरणित करने वाला लेज़र और पेनेट्रेटिंग -आरब्यूटिन (300 µg/mL, 0.2 mL/cm2 ) (समूह L प्लस MBs प्लस A) के अनुप्रयोग के साथ। प्रत्येक उपचार से प्रेरित त्वचा के रंग में परिवर्तन का मूल्यांकन क्रोमा मीटर का उपयोग करके पूर्व निर्धारित समय पर किया गया था। ल्यूमिनोसिटी इंडेक्स, एल [20] की गणना उपचार से पहले और बाद में प्रत्येक माप के दिन की गई थी।

2.7। हिस्टोलॉजिकल अध्ययन

त्वचा के ऊतकों के नमूने (लगभग 8 मिमी × 8 मिमी) प्रयोगों के तुरंत बाद उपचार क्षेत्र से लिए गए और 10 प्रतिशत फॉर्मेलिन घोल में संग्रहित किए गए। हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एचई; सिग्मा-एल्ड्रिच) धुंधला लागू किया गया था, और नमूनों का विश्लेषण एक विशेषज्ञ त्वचाविज्ञान विशेषज्ञ (एचडब्ल्यूजी) द्वारा किया गया था। कुछ अन्य नमूनों को 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए फोंटाना-मैसन सिल्वर नाइट्रेट (कोजिमा केमिकल, काशीवाबारा, जापान) के साथ दाग दिया गया था, और फिर आसुत जल से धोया गया और 2 के लिए 5 प्रतिशत सोडियम थायोसल्फेट घोल (डुकसन, सियोल, कोरिया) में तय किया गया। न्यूनतम, आसुत जल से फिर से धोने से पहले। नमूनों को 5 मिनट के लिए परमाणु तेज लाल घोल (फ्लुका, बुक्स, स्विट्जरलैंड) से दाग दिया गया और आसुत जल से दो बार धोया गया। अंत में, नमूनों को 95 प्रतिशत में निर्जलित किया गया और उसके बाद 100 प्रतिशत इथेनॉल और फिर xylene (Duksan) [21] से दो बार धोया गया।

2.8। सांख्यिकीय विश्लेषण

प्राप्त आंकड़ों का छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया गया था। p <0.05 के प्रायिकता मान को महत्वपूर्ण अंतर का संकेत माना गया।

3। परिणाम

3.1। लेजर-प्रेरित एमबी व्यवधान

10.8 मेगावाट निरंतर (एयर-कूल्ड आर्गन-आयन) लेजर और 60, 120, और 180 एस के लिए 10.8 मेगावाट स्पंदित (सुपरकॉन्टिनम फाइबर) लेजर द्वारा विकिरण के बिना और साथ में पांच गुना पतला एमबी की माइक्रोस्कोपी छवियां चित्रा 2 में दिखायी गयी हैं। स्पंदित लेजर के लिए विनाश दर क्रमशः 60, 120 और 180 एस पर निरंतर लेजर की तुलना में 17.66 प्रतिशत, 20.52 प्रतिशत और 39.05 प्रतिशत की वृद्धि हुई। चित्र 3 में Nd: YAG स्पंदित लेजर का 60, 120, और 180 s पर उपयोग करते समय पांच और दस गुना पतला एमबी की विनाश क्षमता को दिखाया गया है। पांच और दस गुना पतला एमबी की विनाश दर क्रमशः 72.46 प्रतिशत और 78.59 प्रतिशत थी, 60 एस पर, 88.06 प्रतिशत, 120 एस पर 96.10 प्रतिशत, 85.22 प्रतिशत और 180 एस पर 98.80 प्रतिशत। चित्र 4 क्लिनिकल CO2 भिन्नात्मक स्पंदित लेजर द्वारा एक, तीन और सात बार विकिरणित होने के लिए दस गुना-पतला एमबी की विनाश प्रभावकारिता को दर्शाता है। विकिरण समय के साथ विनाश दर में वृद्धि हुई, सात गुना विकिरण के लिए 100 प्रतिशत के करीब होने के कारण, और इसलिए इस स्थिति का उपयोग बाद के इन विट्रो और विवो प्रयोगों में किया गया था।

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