पूरक गतिविधि सी3 ग्लोमेरुलोपैथी में आईजीजी-कारक एच फ्यूजन प्रोटीन के साथ और उचित लक्ष्यीकरण डोमेन के बिना विनियमित है

संपर्क करना:joanna.jia@wecistanche.com/ व्हाट्सएप: 008618081934791

एलिसा सी. गिलमोर, युचुन झांग, एच. टेरेंस कुक', डेबोरा पी. लविन, सुरेश कट्टी, यीवांग2, क्रिस्टा के. जॉनसन, सुंगक्वोन किमो, और मैथ्यू सी. पिकरिंग

'सेंटर फॉर इंफ्लेमेटरी डिजीज, इंपीरियल कॉलेज लंदन, यूके; और²एलेक्सियन फार्मास्यूटिकल्स, न्यू हेवन, कनेक्टिकट, यूएसए

C3 ग्लोमेरुलोपैथीग्लोमेरुली के भीतर पूरक C3 के संचय की विशेषता है। कारणों में शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं, कारक एच में असामान्यताएं, पूरक वैकल्पिक मार्ग के प्रमुख नकारात्मक नियामक। फैक्टर एच-डिफिशिएंट (सीएफएच-/-) चूहों में सी3 विकसित होता हैग्लोमेरुलोपैथीप्लाज्मा C3 के स्तर में कमी के साथ। इस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने कारक एच वैकल्पिक मार्ग नियामक डोमेन (एफएच 1-5) वाले दो संलयन प्रोटीन की प्रभावशीलता का आकलन किया।

या तो एक गैर-लक्षित माउस इम्युनोग्लोबुलिन (IgG-FH1-5) या एक एंटी-माउस प्रोपरडिन एंटीबॉडी (एंटी-पी-FH1-5) से जुड़ा हुआ है। दोनों प्रोटीनों ने प्लाज्मा C3 को बढ़ाया और ग्लोमेरुलर C3 के जमाव को एक समान सीमा तक कम कर दिया, यह सुझाव देते हुए कि FH 1-5 के लिए प्लाज्मा या ग्लोमेरुली में C3 सक्रियण को बदलने के लिए उचित-लक्ष्यीकरण की आवश्यकता नहीं थी। IgG-FH 1-5 प्रशासन के बाद, प्लाज्मा C3 स्तर अस्थायी रूप से कारक B स्तरों में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध होते हैं जबकि प्लाज्मा C5 स्तर प्लाज्मा उचित स्तर में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध होते हैं। विशेष रूप से, प्लाज्मा में वृद्धि

C5 और प्रोपरडिन का स्तर C3 और कारक B में वृद्धि से अधिक समय तक बना रहा। Cfh -/- चूहों में IgG-FH 1-5 त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस के दौरान गुर्दे की चोट को कम करता है। इस प्रकार, हमारा डेटा प्रदर्शित करता है कि IgG-FH 1-5 ने परिसंचारी वैकल्पिक मार्ग गतिविधि को बहाल कर दिया और Cfh - / - चूहों में ग्लोमेरुलर C3 जमाव को कम कर दिया और यह कि प्लाज्मा उचित स्तर कारक H कमी में C5 कन्वर्टेज गतिविधि का एक संवेदनशील मार्कर है। इम्युनोग्लोबुलिन संयुग्मित एफएच 1-5 प्रोटीन, अपने तुलनात्मक रूप से लंबे प्लाज्मा आधा जीवन के माध्यम से, सी 3 के लिए एक संभावित चिकित्सा हो सकती हैग्लोमेरुलोपैथी.

Cistanche ग्लोमेरुलोपैथी में मदद कर सकता है

अनुवाद संबंधी वक्तव्य

C3 ग्लोमेरुलोपैथी(C3G) गुर्दे की एक बीमारी है जो ग्लोमेरुली और ग्लोमेरुलर क्षति के भीतर पूरक C3 के असामान्य संचय की विशेषता है। यह पूरक वैकल्पिक मार्ग के अनियंत्रित सक्रियण के कारण है। फ्यूजन प्रोटीन, वैकल्पिक मार्ग नियामक के कार्यात्मक डोमेन से युक्त, कारक एच (एफएच), एक एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ है, पूरक विनियमन को बहाल करता है, और एक C3G माउस मॉडल में ग्लोमेरुलर C3 को कम करता है। गैर-लक्षित एंटीबॉडी संयुग्मन के परिणामस्वरूप तुलनात्मक रूप से लंबे समय तक संलयन प्रोटीन प्लाज्मा आधा जीवन होता है, और यह, या इसी तरह की संयुग्मन विधियों का उपयोग C3G की चिकित्सा में FH फ़ंक्शन को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

C3 ग्लोमेरुलोपैथी(C3G) ग्लोमेरुली के भीतर C3 की असामान्य मात्रा द्वारा विशेषता एक पूरक-मध्यस्थता वृक्क विकार है। यह गुर्दे की विफलता में प्रगति कर सकता है और इसका कोई निर्णायक उपचार नहीं है। C3G पूरक वैकल्पिक मार्ग (AP) के असामान्य सक्रियण से जुड़ा है। AP सक्रियण के परिणामस्वरूप C3bBb (C3 कन्वर्टेज़) का उत्पादन होता है, एक एंजाइम जो C3 को साफ़ करता है। एक और C3b अणु के जुड़ने के बाद, परिणामी C3bBbC3b कॉम्प्लेक्स (C5 कन्वर्टेज़) पूरक C5 को क्लीव कर सकता है। अनियंत्रित

C3G में AP सक्रियण C3, C5, फ़ैक्टर B (FB), और प्रॉपरडिन के परिसंचारी में कमी के साथ जुड़ा हो सकता है। अनियंत्रित एपी सक्रियण के कारणों में पूरक नियामकों में कार्य परिवर्तनों का नुकसान और पूरक सक्रियकर्ताओं में कार्य परिवर्तनों का लाभ शामिल है। 2 प्रमुख नकारात्मक एपी नियामक कारक एच (एफएच) है, और मनुष्यों, सूअरों और चूहों में एफएच की कमी सी 3 जी से जुड़ी है। 3 C3 नेफ्रिटिक कारक, एक एंटीबॉडी जो AP C3 कन्वर्टेज को स्थिर करता है, C3G में अक्सर होता है। C3 नेफ्रिटिक कारक अकेले C3 में कमी (उचित-स्वतंत्र C3 नेफ्रिटिक कारक) या C3 और C5 दोनों में कमी (उचित- आश्रित C3 नेफ्रिटिक कारक)।5,6

हालांकि उचित मात्रा में कमी ने प्लाज्मा C3 के स्तर में सुधार नहीं किया, C5 के स्तर में वृद्धि हुई, यह सुझाव देते हुए कि C5 की गतिविधि के लिए प्रॉपरडिन आवश्यक था, लेकिन C3 कन्वर्टेज़ नहीं। 8,9

माउस 10 या मानव FH11,12 से Cfh - / - चूहों का प्रशासन ग्लोमेरुलर C3 धुंधलापन को कम करता है और C3 के स्तर को बढ़ाता है। निर्माण जिसमें केवल एफएच (मिनी-एफएच अणु) के नियामक और लक्ष्यीकरण डोमेन शामिल हैं, इस मॉडल में भी प्रभावशाली हैं। 13 अन्य दृष्टिकोणों में प्रोटीन शामिल हैं जो पूरक सक्रियण की साइटों को लक्षित करते हैं। इनमें टीटी 30,14 एक प्रोटीन शामिल है जिसमें एफएच (एफएच 1-5) के पूरक नियामक डोमेन होते हैं जो पूरक रिसेप्टर 2 के पूरक-बाध्यकारी डोमेन से जुड़े होते हैं, और होमोडिमेरिक एफएच अणु, 15 मिनी-एफएच अणु जिनमें पूरक-बाध्यकारी डोमेन होते हैं। कारक एच-संबंधित प्रोटीन 1.

चूंकि C3G में पूरक C3 सक्रियण को रोकने की चिकित्सीय उपयोगिता की जांच की जा रही है, इसलिए ग्लोमेरुलर C3 जमाव के कैनेटीक्स और ग्लोमेरुली और परिसंचरण दोनों के भीतर AP सक्रियण के साथ इसके संबंध को समझना महत्वपूर्ण है। प्रतिरक्षा जटिल-मध्यस्थ ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के मॉडल में, ग्लोमेरुलर C3c पूरक सक्रियण को रोकने के 24 घंटों के भीतर साफ हो जाता है, जबकि ग्लोमेरुलर C3d हफ्तों तक बना रहता है। इसी तरह, Cfh-/- चूहों में, बहिर्जात FH के परिणामस्वरूप 24 घंटे में ग्लोमेरुलर C3c धुंधला हो जाता है। , जबकि ग्लोमेरुलर C3d अपरिवर्तित रहता है।11

इस अध्ययन में, हमने C3G के Cfh-/- माउस मॉडल में पूरक नियामक गतिविधि के साथ 2 उपन्यास संलयन प्रोटीन की प्रभावशीलता की जांच की। प्रोटीन में माउस FH (FH1-5) के नियामक डोमेन शामिल थे, जो जैविक अर्ध-जीवन को लम्बा करने के लिए माउस Ig से संयुग्मित था। फ्यूजन प्रोटीन में से एक, जिसे IgG-FH 1-5 कहा जाता है, एक गैर-लक्षित माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित था। दूसरा, जिसे एंटी-पी-एफएच 1-5 कहा जाता है, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से माउस प्रोपरडिन में संयुग्मित था। यह परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए किया गया था कि इस संलयन प्रोटीन को पूरक सक्रियण की साइटों पर लक्षित करना, उचित बयान के साथ बातचीत करके, ऊतक पूरक विनियमन को बढ़ाएगा। हमारा डेटा प्रदर्शित करता है कि दोनों गैर-लक्षित (IgG-FH 1-5) और प्रॉपरडिन-टारगेटिंग (एंटी-P-FH 1-5) प्रोटीन ने Cfh-/- चूहों में प्लाज्मा और ग्लोमेरुलर C3 विनियमन को बहाल किया। टाइमकोर्स अध्ययनों से पता चला है कि C3 और FB स्तरों की बहाली परिसंचरण में संलयन प्रोटीन के स्तर को दर्शाती है। इसके विपरीत, प्लाज्मा C5 में वृद्धि तब बनी रही जब संलयन प्रोटीन संचलन से साफ हो गया था। हम दिखाते हैं कि Cfh-/- चूहों में त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस के दौरान IgG-FH 1-5 ने ग्लोमेरुलर चोट को ठीक कर दिया।

गुर्दे की बीमारी का इलाज कर सकता है सिस्टैन्च गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार

परिणाम

फ्यूजन प्रोटीन का निर्माण और इन विट्रो में और गतिविधि के विवो मूल्यांकन में फ्यूजन प्रोटीन को माउस एफएच (एफएच 1-5) के पहले 5 शॉर्ट सर्वसम्मति रिपीट (एससीआर) डोमेन को या तो एक एंटी-माउस प्रोपरडिन एंटीबॉडी (एंटी) से जोड़कर बनाया गया था। -पी-एफएच 1-5) या एक गैर-लक्षित आईजी डोमेन (आईजीजी-एफएच 1- 5, पूरक चित्रा एस 1) के साथ एक एंटीबॉडी। एपी-विशिष्ट हेमोलिटिक परख (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके प्रोटीन की गतिविधि का आकलन किया गया था। एंटी-पी-एफएच 1-5 और आईजीजी-एफएच 1-5 एंटी-पी-एफएच 1-5 के लिए अधिक शक्ति के साथ खुराक पर निर्भर तरीके से हेमोलिसिस को रोकते हैं। एंटी-प्रोपेर्डिन (एंटी-पी) ने खुराक पर निर्भर तरीके से हेमोलिसिस को भी कम कर दिया, लेकिन आईजीजी-नियंत्रण का कोई प्रभाव नहीं पड़ा। Cfh - / - चूहों में प्रोटीन के विषुवतीय इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन के 11 दिन बाद तक IgG-FH 1-5 प्रोटीन का पता लगाया जा सकता था, जबकि एंटी-P-FH 1-5 4 दिनों के बाद पता लगाने योग्य था। इंजेक्शन (पूरक चित्रा S2)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या IgG-FH1-5 और एंटी-P-FH1-5 Cfh-/- चूहों में प्लाज्मा AP विनियमन को बहाल कर सकते हैं, हमने संलयन प्रोटीन (चित्र 1b) के इंजेक्शन के बाद प्लाज्मा C3 के स्तर को मापा। . या तो IgG-FH1-5 या एंटी-P-FH1-5 का प्रशासन 24 घंटे में प्लाज्मा C3 में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि करता है, और कुछ हद तक, इंजेक्शन के बाद 96 घंटे में (चित्र 1b)। इन आंकड़ों ने प्रदर्शित किया कि IgG-FH 1-5 और एंटी-P-FH 1-5 दोनों अस्थायी रूप से Cfh-/- चूहों में प्लाज्मा AP विनियमन को बहाल कर सकते हैं। हमने अगली बार न केवल प्लाज्मा C3 बल्कि प्लाज्मा C5 और वैकल्पिक मार्ग प्रोटीन FB और प्रॉपडिन में परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम को चिह्नित करके इन परिवर्तनों का विस्तृत विश्लेषण किया। C5 के परिसंचारी में वृद्धि और Cfh-/- चूहों में IgG-FH 1-5 और एंटी-P-FH 1-5 के प्रशासन के बाद C3 और FB में वृद्धि की तुलना में उचित स्तर अधिक समय तक बना रहता है।

हमने आईजीजी-एफएच 1-5 या एंटी-पी-एफएच 1-5 के एकल इंजेक्शन के बाद 27 दिनों तक के अंतराल पर प्रोटीन को मापकर सी3, सी5, एफबी, और प्रॉपरडिन में परिवर्तन के कैनेटीक्स की तुलना की। चित्र 2)। IgG-FH 1-5 के प्रशासन के बाद, C3, C5, FB, और प्रॉपडिन में चरम वृद्धि इंजेक्शन के 1 दिन बाद हुई। इन परिवर्तनों के पूर्व-उपचार स्तरों तक गिरने का समय अलग-अलग था। प्रीट्रीटमेंट के स्तर पर वापसी एफबी के लिए 1 और 4 दिनों के बीच, सी 3 के लिए 7 और 11 दिनों के बीच, और 14 और 21 दिनों के बीच प्रॉपडिन और सी 5 (चित्रा 2 ए, सी, ई, और जी) दोनों के लिए हुई। एंटी-पी-एफएच 1-5 के प्रशासन के बाद, पीक सी 3 का स्तर 1 दिन पर हुआ, लेकिन दिन 4 और 7 (चित्रा 2 बी) के बीच प्रीट्रीटमेंट स्तर तक गिर गया। पीक C5 का स्तर 4 दिन पर हुआ और 7 और 11 दिनों (चित्र 2d) के बीच प्रीट्रीटमेंट स्तर पर लौट आया। एफबी में चरम वृद्धि 1 दिन हुई और दिन 1 और 4 (चित्रा 2 एफ) के बीच प्रीट्रीटमेंट स्तर तक गिर गई। जैसा कि अपेक्षित था, एंटी-पी-एफएच 1-5 या एंटी-पी (चित्रा 2एच) के इंजेक्शन के बाद फ्री प्लाज्मा प्रॉपडिन समाप्त हो गया था। एंटी-पी-एफएच 1-5 के बाद 7 दिनों तक और एंटी-पी (चित्रा 2एच) के बाद 14 दिनों तक फ्री प्लाज्मा प्रॉपडिन का स्तर कम रहा। हालांकि दोनों संलयन प्रोटीन ने अस्थायी रूप से प्लाज्मा एपी विनियमन को बहाल कर दिया, सी 3, एफबी और सी 5 स्तरों में सुधार की अवधि ने प्लाज्मा में उनके पता लगाने की अवधि को दर्शाया, जो कि पी-एफएच के लिए कम था 1-5 (पूरक चित्रा एस 2) . संक्षेप में, प्रोटीन के इंजेक्शन के बाद C3 और FB के स्तर में परिवर्तन C5 और प्रॉपरडिन की तुलना में कम थे। इन आंकड़ों से पता चलता है कि प्लाज्मा एफबी इस सेटिंग में C3 कन्वर्टेज गतिविधि का एक संवेदनशील मार्कर है, जबकि प्रॉपरडिन C5 कन्वर्टेज गतिविधि का एक मार्कर है। विशेष रूप से, एंटी-पी इंजेक्शन के बाद, C5 में 24 और 96 घंटे और दिन 7 में वृद्धि हुई थी

चित्र 1| (ए) वैकल्पिक मार्ग-निर्भर हेमोलिसिस परख को लागू करें। एंटीबॉडी को 2-गुना dilutions 60 nM से 0.5 nM तक शीर्षक दिया गया था। आईजीजी-एफएच 1-5, एंटी-पी-एफएच 1-5, और एंटी-पी अभिकर्मकों ने खुराक पर निर्भर तरीके से खरगोश एरिथ्रोसाइट हेमोलिसिस को कम कर दिया। आईजीजी-नियंत्रण प्रोटीन का उपयोग नहीं किया गया था। क्षैतिज पट्टियाँ माध्य मानों को दर्शाती हैं, और त्रुटि पट्टियाँ SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) संलयन प्रोटीन के इंजेक्शन के बाद सीएफएच-/- चूहों में प्लाज्मा पूरक सी3। प्लाज्मा C3 को IgG-FH 1-5 (लाल त्रिकोण, n 5) के प्रशासन से पहले और 24 घंटे और 96 घंटे बाद मापा गया था, एंटी-पी-एफएच 1-5 (बैंगनी त्रिकोण, n 6), एंटी -P (हरा बिंदु, n 5), और IgG- नियंत्रण (नीला बिंदु, n 5)। क्षैतिज पट्टियाँ माध्य मानों को दर्शाती हैं, और मूंछें SD को दर्शाती हैं। ***पी # 0.001 बनाम प्रीट्रीटमेंट वैल्यू और 2-वे एनोवा विद बोनफेरोनी मल्टीपल कंपेरिजन टेस्ट। एफएच, कारक एच; पी, प्रोपरडिन।

(चित्र 2d)। जैसा कि रिपोर्ट किया गया है, 8,9 इंगित करता है कि C5 कन्वर्टेज़ Cfh-/- चूहों में प्रॉपरडिन पर निर्भर है।

IgG-FH1-5 और एंटी-P-FH1-5 ने ग्लोमेरुलर C3c को कम किया लेकिन Cfh-/- चूहों में C3d धुंधला को नहीं बदला

हमने अगली बार ग्लोमेरुलर C3b/iC3b/C3c, C3d, प्रॉपडिन और FH- संबंधित (FHR) प्रोटीन पर IgG-FH1-5 और एंटी-P-FH1-5 के प्रभाव का आकलन किया। IgG-FH 1-5 के इंजेक्शन के 96 घंटों के बाद, ग्लोमेरुलर C3b/iC3b/C3c धुंधलापन कम हो गया था, लेकिन ग्लोमेरुलर C3d (चित्र 3a) और FHR धुंधला (चित्र 3b) नहीं था। Glomerular C3b/iC3b/C3c या तो IgG- नियंत्रण या एंटी-P के साथ अपरिवर्तित रहा। अनुपचारित Cfh-/- चूहों में ग्लोमेरुलर प्रोपरडिन धुंधला का असामान्य रैखिक पैटर्न IgG नियंत्रण के 96 घंटे बाद भी बना रहा। Cfh में - / - चूहों को या तो एंटी-पी या IgG-FH 1-5 के साथ इंजेक्ट किया जाता है, ग्लोमेरुलर प्रॉपडिन का स्तर 96 घंटे (चित्र 3 बी) में लगभग अवांछनीय था। अप्रत्याशित रूप से, एंटी-पी-एफएच 1-5 इंजेक्शन के परिणामस्वरूप एंटी-प्रोपेर्डिन, एंटी-एफएच / एफएचआर, और एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके एक दानेदार ग्लोमेरुलर धुंधला पैटर्न बन गया। इस खोज ने सुझाव दिया कि ग्लोमेरुली में एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन जमा किया जा रहा था। जंगली प्रकार के चूहों में एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप 96 घंटों में एंटी-प्रोपेर्डिन, एंटी-एफएच/एफएचआर, और एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी के साथ ग्लोमेरुलर धुंधला हो गया (सप्लीमेंट्री फिगर एस3), यह दर्शाता है कि यह अभिकर्मक सामान्य ग्लोमेरुली के साथ बातचीत करता है। हालांकि, हमने अनुमान लगाया कि एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन भी Cfh - / - चूहों में पहले से मौजूद ग्लोमेरुलर प्रॉपडिन के साथ बातचीत कर सकता है। जब हमने अभिकर्मक को Cfh-/- चूहों में इंजेक्ट किया, जिन्हें ग्लोमेरुलर प्रोपरडिन को हटाने के लिए एंटी-पी के साथ दिखाया गया था, तो एंटी-प्रोपेर्डिन, एंटी-एफएच / एफएचआर, और एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी का उपयोग करके दानेदार धुंधला पैटर्न में कमी आई थी। पूरक चित्रा S4)। इन अवलोकनों से संकेत मिलता है कि Cfh-/- चूहों में एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन का ग्लोमेरुलर इंटरेक्शन आंशिक रूप से ग्लोमेरुलर प्रॉपरडिन पर निर्भर है।

Cfh-/- चूहों में त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस के दौरान IgG-FH1-5 गुर्दे की चोट को ठीक करता है

C3G के रोगियों में, तीव्र गुर्दे की चोट इंटरकरंट संक्रमण के संदर्भ में विकसित हो सकती है। उदाहरण के लिए, FHR5 नेफ्रोपैथी में वृक्क समारोह का नुकसान सिन्फेरींजिटिक मैक्रोस्कोपिक हेमट्यूरिया के एपिसोड के साथ जुड़ा हुआ है। 17 C3G रोगियों में अंतर्निहित C3 डिसरेग्यूलेशन के परिणामस्वरूप एक ट्रिगर के बाद पूरक-मध्यस्थता गुर्दे की चोट में वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप गुर्दे की सूजन होती है। इसे मॉडल करने के लिए, हमने त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस, एक प्रतिरक्षा-जटिल . को प्रेरित किया

चित्र 2| प्लाज्मा Cfh-/- चूहों में IgG-FH1-5 और एंटी-P-FH1-5 इंजेक्ट किए गए प्रो-ले टाइम कोर्स को पूरक करता है। प्लाज्मा C3 (ए, बी), सी 5 (सी, डी), एफबी (ई, एफ), और प्रॉपरडिन (पी; जी, एच) आईजीजी-एफएच के एकल इंजेक्शन के 27 दिन बाद तक प्रायोगिक शुरुआत से {{1 {{21 }}}} (ए, सी, ई, जी; लाल त्रिकोण, एन ¼ 5) या विरोधी पी- एफएच 1-5 (बी, डी, एफ, एच; बैंगनी त्रिकोण, एन ¼ 6)। नियंत्रणों में एंटी-पी (ग्रीन डॉट्स, एन 5) और एक आइसोटाइप-मिलान मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (आईजीजी-कंट्रोल; ब्लू डॉट्स, एन 5) शामिल थे। क्षैतिज पट्टियाँ माध्य मानों को दर्शाती हैं, और मूंछें SD को दर्शाती हैं। *P # 0.05, **P # 0.01, ***P#0.001 बनाम प्रीट्रीटमेंट वैल्यू और 2-बोनफेरोनी मल्टीपल कम्पेरिजन टेस्ट के साथ विचरण के विश्लेषण से व्युत्पन्न। एफबी, कारक बी; एफएच, फैक्टर एच।

ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस मॉडल जिसमें पूरक और एफसी रिसेप्टर-मध्यस्थ मार्ग शामिल हैं, सीएफएच-/- चूहों में 18,19। हमने पहले दिखाया था कि Cfh - / - चूहे इस सेटिंग में गुर्दे की चोट के प्रति अतिसंवेदनशील होते हैं और यह अनुमान लगाते हैं कि FH 1-5 प्रोटीन, AP विनियमन को बढ़ाकर, इस मॉडल में पूरक-मध्यस्थता गुर्दे की चोट को ठीक कर सकता है। क्योंकि हमारे डेटा ने संकेत दिया था कि सामान्य ग्लोमेरुली में एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन जमा किया गया था, हमने त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस के दौरान आईजीजी-एफएच 1-5 का इस्तेमाल किया। भेड़ नेफ्रोटॉक्सिक सीरम के इंजेक्शन से चौबीस घंटे पहले, चूहों को आईजीजी-कंट्रोल (एन 7) या आईजीजी-एफएच 1-5 (एन ¼ 8) का आईपी इंजेक्शन मिला। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल चित्र 4कमें दर्शाया गया है। भेड़ नेफ्रोटॉक्सिक सीरम के प्रशासन के 6 दिन बाद चूहे मारे गए। ग्लोमेरुलर पैथोलॉजी (गंभीरता स्कोर, कुल सेल संख्या और मैक्रोफेज संख्या) के सभी 3 हिस्टोलॉजिक उपाय आईजीजी-एफएच 1-5 समूह (चित्रा 4 बी) में काफी कम थे। IgG-FH 1-5 समूह (चित्र 4b) में ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल चोट भी कम थी। सीरम यूरिया में काफी वृद्धि हुई थी

चित्र 3| आईजीजी-एफएच 1-5 या एंटी-पी-एफएच 1-5 के इंजेक्शन के 96 घंटे बाद सीएफएच-/- चूहों में ग्लोमेरुलर पूरक इम्यूनोस्टेनिंग। (ए) 4 प्रायोगिक समूहों में ग्लोमेरुलर सी3बी/आईसी3बी/सी3सी और सी3डी की मात्रा के साथ प्रतिनिधि छवियां: आईजीजी-एफएच 1-5 (लाल त्रिकोण, एन ¼ 5), एंटी-पी-एफएच 1-5 (बैंगनी त्रिकोण, एन 6), एंटी-पी (हरा बिंदु, एन ¼ 5), और आईजीजी-नियंत्रण (नीला बिंदु, एन ¼ 5)। प्लाज्मा सी 3 स्तर चित्र 1 में दिखाए गए समय के साथ। (बी) डेटा बिंदु औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और व्हिस्कर एक इंटरक्वेर्टाइल रेंज को दर्शाते हैं। डन एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण से प्राप्त पी मान। (बी) ग्लोमेरुलर आईजीजी, एफएचआर, और, 4 प्रायोगिक समूहों में धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। बार 100 मिमी। एएफयू, मनमाना-यूरोसेंट इकाइयां; एफएच, कारक एच; पी, प्रोपरडिन। इस छवि को देखने का अनुकूलन करने के लिए, कृपया इस लेख का ऑनलाइन संस्करण देखेंwww.kidney-international.org।

आईजीजी-नियंत्रण समूह, लेकिन सीरम एल्ब्यूमिन और मूत्र एल्ब्यूमिन-से-क्रिएटिनिन अनुपात में परिवर्तन भिन्न नहीं था (चित्र 4 बी)। जैसा कि अपेक्षित था, ग्लोमेरुलर C3b/iC3b/C3c को IgG-FH 1-5 समूह (चित्र 4b) में उल्लेखनीय रूप से कम किया गया था, लेकिन ग्लोमेरुलर माउस IgG (चित्र 4b) और भेड़ IgG (डेटा नहीं दिखाया गया) समूहों के बीच भिन्न नहीं थे। .

चित्र 4| Cfh-/- चूहों में त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस के दौरान IgG-FH 1-5 के साथ गुर्दे की चोट में सुधार। (ए) त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध। भेड़ के साथ पूर्व-प्रतिरक्षित चूहे IgG को भेड़ नेफ्रोटॉक्सिक सीरम के प्रशासन से 24 घंटे पहले IgG-FH 1-5 (उपचार समूह, n 8) या IgG- नियंत्रण (नियंत्रण समूह, n 7) प्राप्त हुआ। (बी) आईजीजी-एफएच 1-5 (उपचार; लाल त्रिकोण, एन ¼ 8) या आईजीजी-नियंत्रण (नियंत्रण; नीले घेरे, एन) के साथ इलाज किए गए चूहों में त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस के शामिल होने के 6 दिन बाद गुर्दे का कार्य और ऊतक विज्ञान 7). क्षैतिज पट्टियाँ माध्यिका मानों को दर्शाती हैं, और मूंछें एक अंतःचतुर्थक श्रेणी को दर्शाती हैं। *P# 0.05, **P# 0.01, ***P#0.001 बनाम नियंत्रण और मान-व्हिटनी परीक्षण से व्युत्पन्न। एफएच, कारक एच; पी, प्रोपरडिन।

बहस

IgG-FH1-5 और एंटी-P-FH1-5 दोनों ने Cfh-/- चूहों में C3, FB, और C5 स्तरों को सामान्य किया। यह निष्कर्ष इस तथ्य के अनुरूप है कि माउस FH के पूरक नियामक डोमेन SCR डोमेन 1 से 5 (एक C3b-बाइंडिंग साइट और C3b के कारक I-मध्यस्थ दरार के लिए कोफ़ेक्टर गतिविधि) के भीतर स्थित हैं। 20 भूतल पहचान डोमेन, जो हेपरिन और एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए बाध्यकारी प्रभाव और एक दूसरी सी 3 बी-बाध्यकारी साइट शामिल है, एससीआर डोमेन 18 के माध्यम से मौजूद हैं

20 (FH18-20) और इसलिए फ्यूजन प्रोटीन में मौजूद नहीं हैं। 20 फिर भी, दोनों प्रोटीनों ने ग्लोमेरुलर iC3b/C3b/C3c को कम कर दिया, यह दर्शाता है कि इस सेटिंग में FH 18-20 की आवश्यकता नहीं थी। यह खोज पिछले डेटा के अनुरूप है जिसमें दिखाया गया है कि Cfh-/- चूहों ने SCR डोमेन 1 से 15 (Cfh-/- .FHD16-20) से युक्त एक उत्परिवर्ती FH प्रोटीन को व्यक्त करते हुए असामान्य ग्लोमेरुलर C3 बयान विकसित नहीं किया।21,22 हालांकि, Cfh–/–.FH D 16-20 जानवर वृक्क एंडोथेलियम के साथ C3 सक्रियण को विनियमित करने में असमर्थ थे और थ्रोम्बोटिक माइक्रोएंगियोपैथी विकसित की। यह संभव है कि एफएच 18-20 डोमेन को लक्षित करने वाले सतह की कमी के कारण, एफएच की कमी में एफएच 1-5 युक्त फ्यूजन प्रोटीन के प्रशासन के परिणामस्वरूप थ्रोम्बोटिक माइक्रोएंगियोपैथी की संवेदनशीलता हो सकती है। यह भी संभव है कि फ्यूजन प्रोटीन की डिमेरिक संरचना के तहत C3b बाइंडिंग के लिए बढ़ी हुई अम्लता, FH 18-20 डोमेन को लक्षित करने वाली सतह की अनुपस्थिति की भरपाई के लिए पर्याप्त है। हालाँकि, C3b की सतह की पहचान FH.23 में गठनात्मक परिवर्तनों से भी प्रभावित होती है। एक स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया FH- बाइंडिंग प्रोटीन (PspCN, जो SCR डोमेन 9 को बांधता है), एक FH रूपात्मक परिवर्तन को ट्रिगर करता है, और FH-PspCN कॉम्प्लेक्स ने C3b बाइंडिंग को बढ़ा दिया था और बढ़ी हुई क्षय-त्वरण गतिविधि। FH20 C3d-बाइंडिंग साइट FH में उजागर नहीं होती है, लेकिन FH- PspCN कॉम्प्लेक्स में उजागर हो जाती है। यह समझा सकता है कि क्यों FH 19-20 सतह C3d के साथ इंटरैक्ट करता है लेकिन FH नहीं करता है। 24,25 हम अनुमान लगाते हैं कि हमारे एजेंट, संरचनात्मक परिवर्तनों के माध्यम से, तरल-चरण और सतह C3b दोनों के साथ प्रभावी ढंग से बातचीत कर सकते हैं। विशेष रूप से, आईजीजी-एफएच 1-5 और एंटी-पी-एफएच 1-5 दोनों ने एपी-निर्भर हेमोलिसिस परख में एरिथ्रोसाइट्स को लसीका से बचाया।

न तो संलयन प्रोटीन ने ग्लोमेरुलर C3d धुंधलापन को कम किया, शायद ग्लोमेरुलर C3d की लगातार प्रकृति के कारण। प्रायोगिक प्रतिरक्षा-जटिल नेफ्रैटिस में, ग्लोमेरुलर C3c पूरक सक्रियण की समाप्ति के 24 घंटों के भीतर हल हो जाता है लेकिन C3d हफ्तों तक बना रहता है। इसके अलावा, ग्लोमेरुलर C3d ल्यूपस नेफ्रैटिस में लगातार बना रहता है। 26 यह संभवतः ग्लोमेरुलर सतहों के साथ इसकी सहसंयोजक बातचीत को दर्शाता है। Cfh-/- चूहों में मानव FH के बार-बार इंजेक्शन ने 10 दिनों में ग्लोमेरुलर C3d में कमी दिखाई। 11 यह संभावना है कि IgG-FH 1-5 की बार-बार खुराक इस मॉडल में ग्लोमेरुलर C3d को कम कर सकती है। ग्लोमेरुलर एफएचआर धुंधला में भी कोई बदलाव नहीं हुआ। माउस FHR प्रोटीन के कार्यों के बारे में बहुत कम जानकारी है, लेकिन वे C3b27,28 और C3d.27 दोनों के साथ बातचीत कर सकते हैं। वास्तव में, C3d के लिए FHR-A और FHR-B दोनों की स्पष्ट आत्मीयता FH.27 की तुलना में अधिक मजबूत है। हम अनुमान लगाते हैं कि ग्लोमेरुलर एफएचआर प्रोटीन ग्लोमेरुली से तभी साफ होने की संभावना है जब C3d को हटा दिया गया हो। इस संदर्भ में, यह उल्लेखनीय है कि मानव C3G में, कारक H-संबंधित प्रोटीन 5 ग्लोमेरुलर C3d.29 के साथ जुड़ता है।

एंटी-पी-एफएच1-5 प्रोटीन ने उम्मीद के मुताबिक मुक्त प्लाज्मा प्रोपरडिन स्तर को कम कर दिया क्योंकि इस फ्यूजन प्रोटीन का एंटी-प्रोपेर्डिन हिस्सा एक इंजेक्शन के बाद 8 दिनों के लिए एपी गतिविधि (उचित मात्रा में कमी के कारण) को अवरुद्ध कर सकता है। 30 हालांकि, हमारे डेटा से पता चला है कि प्लाज्मा C3 के स्तर को बढ़ाने और ग्लोमेरुलर C3b / iC3b / C3c धुंधला को कम करने में FH 1-5 की प्रभावशीलता 2 संलयन प्रोटीन (यानी, उचित लक्ष्यीकरण से स्वतंत्र थी) के बीच तुलनीय थी। इसके अलावा, एंटी-पी या आईजीजी-एफएच 1-5 के प्रशासन के बाद असामान्य ग्लोमेरुलर प्रॉपरडिन धुंधला काफी कम हो गया था। जाहिर है, C3d और FHR प्रोटीन के विपरीत, C3 विनियमन की बहाली के बाद ग्लोमेरुलर प्रॉपडिन आसानी से साफ हो जाता है। एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन के प्रशासन के बाद ग्लोमेरुलर प्रॉपडिन पैटर्न में बदल गया, लेकिन यह इस अवलोकन से जटिल था कि हमने सीएफएच - / - और जंगली-प्रकार के ग्लोमेरुली दोनों में इस संलयन प्रोटीन के जमाव का पता लगाया। यह आंशिक रूप से ग्लोमेरुलर प्रॉपडिन के साथ बातचीत के कारण था, लेकिन जंगली प्रकार के ग्लोमेरुली में बयान ने संकेत दिया कि यह पूरी तरह से ग्लोमेरुलर पूरक पर निर्भर था और संभवतः संलयन प्रोटीन के भौतिक रासायनिक गुणों से संबंधित था।

हमारे काइनेटिक डेटा ने एफबी, सी5, और प्रोपरडिन में अस्थायी परिवर्तनों से संबंधित उपन्यास निष्कर्षों का प्रदर्शन किया, जो फ्यूजन प्रोटीन के इंजेक्शन के बाद सीएफएच-/- चूहों में सी3 में वृद्धि के साथ होते हैं। इंजेक्शन के बाद एफबी का स्तर तेजी से बढ़ा

और ऐसे समय में आधारभूत स्तर पर लौट आए जब C5 और प्रॉपरडिन दोनों का स्तर ऊंचा बना रहा। Cfh-/- चूहों में प्रॉपरडिन का स्तर बेसलाइन पर कम हो गया और IgG-FH 1-5 के इंजेक्शन के बाद सामान्य स्तर (20 mg/ml30) तक बढ़ गया और कम से कम 14 दिनों तक इन स्तरों पर बना रहा। प्लाज्मा C5 के स्तर में वृद्धि के लिए एक समान समय पाठ्यक्रम देखा गया था। आश्चर्यजनक रूप से, IgG-FH 1-5 ज्यादातर 11 दिनों में प्रचलन से अनुपस्थित था, यह दर्शाता है कि Cfh-/- चूहों में C5 कन्वर्टेज़ का गठन C3 कन्वर्टेज़ की तुलना में धीमा है (क्योंकि C3 का स्तर बेसलाइन पर वापस आ गया है) 7 और 11 दिन)। प्लाज्मा C5 एंटी-पी उपचार के बाद बढ़ा और एंटी-पी-एफएच 1-5 प्रोटीन के साथ और बढ़ गया। इसलिए, उचित लक्ष्यीकरण और FH 1-5 के प्रभाव दोनों ही बढ़े हुए C5 स्तरों में योगदान दे रहे थे और यह संकेत देते हैं कि C5 कन्वर्टेज़ आंशिक रूप से Cfh-/- चूहों पर निर्भर है। यह निष्कर्ष एफएच और प्रॉपरडिन की संयुक्त कमी के साथ चूहों में सी5 डिसरेगुलेशन के सुधार के अनुरूप है। सी3जी में सर्कुलेटिंग प्रॉपरडिन का स्तर कम किया जा सकता है और प्लाज्मा सी5 या घुलनशील सी5बी के विपरीत सतह सी5 कन्वर्टेज गतिविधि के साथ सहसंबद्ध प्रतीत होता है। {30}}.31,32 हमारा डेटा प्रॉपरडिन स्तरों और C5 कन्वर्टेज़ गतिविधि के बीच एक अंतरंग लिंक का समर्थन करता है और चल रहे ग्लोमेरुलर C5 सक्रियण के बायोमार्कर के रूप में प्रॉपरडिन स्तरों के उपयोग का समर्थन करता है।

विशेष रूप से, आईजीजी-एफएच 1-5 प्रोटीन एक इंजेक्शन के 11 दिनों के बाद भी संचलन में पता लगाने योग्य था। यह असंयुग्मित माउस एफएच 1-5 प्रोटीन के लिए पहले की रिपोर्ट की तुलना में काफी लंबा है, जिसे 24 घंटों के भीतर संचलन से हटा दिया गया था। 14 यह खोज इंगित करती है कि आईजीजी-एफएच का लंबा प्लाज्मा आधा जीवन { {9}} प्रोटीन प्रतिरक्षी संयुग्मन से प्राप्त होता है। IgG-FH1-5 प्रोटीन का प्लाज़्मा अर्ध-आयु भी उससे अधिक लंबा था जो हमने पहले पूर्ण-लंबाई वाले FH के लिए देखा था। उदाहरण के लिए, मानव FH को एक इंजेक्शन के 96 घंटे बाद संचलन से हटा दिया गया था Cfh-/- चूहों में।11 पूरक नियमन में IgG-FH1-5 प्रोटीन की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करने वाले हमारे डेटा के साथ, हम मानते हैं कि FH1-5 प्रोटीन के अपने फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल को लम्बा करने के लिए संयुग्मन संभावित चिकित्सीय है C3G में उपयोगिता।

सारांश में, हम दिखाते हैं कि सतह पहचान डोमेन की कमी के बावजूद, FH1-5 संलयन प्रोटीन ग्लोमेरुलर C3 सक्रियण को कम करने और FH की कमी में प्लाज्मा पूरक विनियमन को बहाल करने में प्रभावी थे। एफएच 1-5 डोमेन को एंटी-प्रोपेर्डिन से संयुग्मित करने में कोई स्पष्ट लाभ नहीं था, और आईजीजी-एफएच 1-5 प्रोटीन ने प्रायोगिक नेफ्रैटिस में गुर्दे की चोट को कम कर दिया। चिकित्सीय उपयोग के लिए एफएच की बड़े पैमाने पर तैयारियों के उत्पादन में चुनौतियों के विपरीत, एंटीबॉडी-आधारित उपचारों का बड़े पैमाने पर उत्पादन अच्छी तरह से स्थापित है, जो आईजीजी-एफएच 1-5 को सी 3 जी के लिए एक आकर्षक संभावित चिकित्सीय बनाता है।

विधि

फ्यूजन प्रोटीन

आईजीजी-एफएच1-5. पहले 5 माउस FH SCR डोमेन (mFH1-5) जुड़े हुए हैं

एक गैर-लक्षित IgG1 माउस Ig (एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ उठाया गया एक एंटी-इडियोटाइपिक एंटीबॉडी)।

एंटी-पी-एफएच1-5. मुराइन एफएच 1-5 माउस एंटी-प्रोपेर्डिन एंटीबॉडी (एंटी-पी) से जुड़ा हुआ है, 30 डब्ल्यू सॉन्ग, यूनिवर्सिटी ऑफ पेनसिल्वेनिया द्वारा एलेक्सियन को प्रदान किया गया है)।

नियंत्रण। नियंत्रण आइसोटाइप-मिलान गैर-लक्षित माउस आईजी (आईजीजी-कंट्रोल) और माउस एंटी-प्रोपेर्डिन (एंटी-पी) (सप्लीमेंट्री फिगर एस 1) थे। प्रोटीन A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA) का उपयोग करके शुद्ध किए गए pVEK वैक्टर और Expi293 कोशिकाओं (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, MA) का उपयोग करके प्रोटीन उत्पन्न किए गए थे।

एपी-विशिष्ट-सी हेमोलिटिक परख

6 0 एनएम से 0.5 एनएम तक बीस प्रतिशत सामान्य माउस सीरम को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए खरगोश एरिथ्रोसाइट्स (1.5 106 कोशिकाओं/एमएल) के साथ ऊष्मायन किया गया था। हेम रिलीज को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से परिमाणित किया गया था (ऑप्टिकल घनत्व 415 एनएम); 100 प्रतिशत लसीस सीरम था जिसमें कोई अवरोधक नहीं था।

प्लाज्मा एफबी और एफएच

एथिलीनडायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (सरस्टेड, नॉर्डरहेन-वेस्टफेलन, जर्मनी) युक्त ट्यूबों में एकत्रित रक्त के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्लाज्मा प्राप्त किया गया था। प्रोटीन को केशिका वैद्युतकणसंचलन इम्युनोसे (WES, प्रोटीनसिंपल, सैन जोस, सीए) द्वारा मापा गया था। इस्तेमाल किए गए एंटी-बॉडी पॉलीक्लोनल एंटी-माउस एफएच एंटीबॉडी (एलेक्सियन फार्मास्यूटिकल्स, बोस्टन, एमए) और एंटी-माउस एफबी एंटीबॉडी (एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके) थे; WES एंटी-रैबिट डिटेक्शन मॉड्यूल (ProteinSimple, San Jose, CA) का उपयोग किया गया था। एसडब्ल्यू सॉफ्टवेयर के लिए कम्पास के साथ केमिलुमिनसेंट संकेतों का विश्लेषण किया गया था (प्रोटीनसिम्पल, संस्करण 5.0.1), चोटी के क्षेत्रों के रूप में परिमाणित, और परख नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत।

चूहे

सभी चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था; प्रक्रियाओं को संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार निष्पादित किया गया और यूनाइटेड किंगडम होम ऑफिस द्वारा अनुमोदित किया गया। C57BL / 6 जंगली प्रकार के चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, एमई) से खरीदा गया था, और Cfh - / - चूहों को पहले वर्णित के रूप में उत्पन्न किया गया था। उम्र और लिंग के लिए चूहों का मिलान किया गया था; आईपी ​​इंजेक्शन (एंटी-प्रोपेर्डिन और आईजीजी-कंट्रोल के लिए 1 मिलीग्राम; आईजीजी-एफएच के लिए 1.4 मिलीग्राम 1-5 और एंटी-पी-एफएच 1-5) के माध्यम से प्रोटीन की समतुल्य खुराक प्रशासित की गई। त्वरित सीरम नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस भेड़ नेफ्रोटॉक्सिक सीरम के iv इंजेक्शन द्वारा भेड़ के साथ पूर्व-प्रतिरक्षित चूहों में प्रेरित किया गया था IgG.7 संलयन प्रोटीन का प्रशासन भेड़ नेफ्रोटॉक्सिक सीरम प्रेरण (चित्रा 4 ए) से 24 घंटे पहले किया गया था।

C3, C5, और फ्री प्रॉपरडिन प्लाज्मा C3 को एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख द्वारा मापा गया था। 14 प्लाज्मा "फ्री" प्रॉपरडिन और C5 स्तरों को इलेक्ट्रोकेमिलुमिनेसिसेंस इम्यूनोसे (मेसो स्केल डिस्कवरी [एमएसडी], मेसो स्केल डायग्नोस्टिक्स, रॉकविले, एमडी) का उपयोग करके मापा गया था। - प्रॉपरडिन या एक कस्टम एंटी-म्यूरिन C5 उच्च-बाध्यकारी MSD प्लेटों पर लेपित। बाउंड "फ्री" प्रॉपरडिन और सी5 को एंटी-प्रोपेर्डिन (डब्ल्यू सॉन्ग से) या बायोटिनाइलेटेड मोनोक्लोनल एंटी-सी5 (एलेक्सियन) के साथ स्ट्रेप्टाविडिन-सल्फो (एमएसडी, मेसो स्केल डायग्नोस्टिक्स) के साथ मिला कर पाया गया। रसायनयुक्त संकेत एक सेक्टर एस 6000 इमेजर (एमएसडी, मेसो स्केल डायग्नोस्टिक्स) का उपयोग करके हासिल किया गया था और एमएसडी डिस्कवरी वर्कबेंच सॉफ्टवेयर (मेसो स्केल) के साथ विश्लेषण किया गया था।

निदान, संस्करण 4.0.12.1)। मानक के रूप में रिकॉम्बिनेंट मुराइन प्रॉपडिन और सी5 का इस्तेमाल किया गया।

गुर्दे का कार्य और ऊतक विज्ञान

हेमा-कॉम्बिस्टिक्स (बायर, रीडिंग, यूके) का उपयोग करके हेमट्यूरिया और प्रोटीनुरिया का मूल्यांकन किया गया था; प्लाज्मा यूरिया को मापा गया और गुर्दे के ऊतकों को पहले वर्णित के रूप में संसाधित किया गया। 9 मूत्र संबंधी क्रिएटिनिन को क्रिएटिनिन कंपेनियन प्रोटोकॉल परख (# 1 0 12; एक्सेल, फिलाडेल्फिया, पीए) और स्पॉट मूत्र / का उपयोग करके स्पॉट मूत्र के नमूनों पर निर्धारित किया गया था। प्लाज्मा एल्ब्यूमिन को एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (#E 99-134; बेथिल लेबोरेटरीज, मोंटगोमरी, TX) द्वारा मापा गया था। आवधिक एसिड-शिफ-दाग वाले गुर्दे वर्गों का मूल्यांकन एक अंधा फैशन में किया गया था और ग्लोमेरुलर और ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल चोट (0 [कोई नहीं], 1 [हल्का], 2 [मध्यम]) की गंभीरता के अनुसार रैंक किया गया था। माध्य ग्लोमेरुलर सेल संख्या निर्धारित करने के लिए प्रति खंड दस ग्लोमेरुली का मूल्यांकन किया गया था। इम्यूनो-यूरेसेंस धुंधला 5- मिमी क्रायोसेक्शन पर डीएपीआई (वेक्टर लेबोरेटरीज, बर्लिंग, सीए) के साथ वेक्टाशील्ड माध्यम का उपयोग करके घुड़सवार किया गया था। इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी थे uorescein isothiocyanate (FITC)-संयुग्मित पॉलीक्लोनल बकरी विरोधी माउस C3b/C3c/ iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; अंजीर-श्रृंखला-विशेष- FITC-संयुग्मित पॉलीक्लोनल बकरी विरोधी माउस IgG (1:400; #F5387; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO); FITC-संयुग्मित मोनोक्लोनल माउस विरोधी बकरी/भेड़ IgG (1:100; #F5137; सिग्मा-एल्ड्रिच); या FITC-संयुग्मित बकरी मानव-विरोधी प्रोपरडिन (1:50; #GAHu/PPD/FITC, नॉर्डिक इम्मु- नो लॉजिक लैबोरेट्रीज़, कोपेनहेगन, डेनमार्क)।9 बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटी-माउस C3d (1:10; # BAF2655; R&D सिस्टम्स) , मिनियापोलिस, एमएन) का उपयोग बायोटिन-अवरुद्ध वर्गों (बायोटिन ब्लॉकिंग सिस्टम; एगिलेंट डको, सांता क्लारा, सीए) पर किया गया था, जिसमें स्ट्रेप्टाविडिन AF488 माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200; #S -32354; थर्मो फिशर साइंटिc) था। FH की कल्पना चूहे विरोधी माउस CD16/CD32-अवरुद्ध वर्गों (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) में बकरी विरोधी मानव FH (1:1000; #A312; Quidel, San Diego) का उपयोग करके की गई थी। , CA) और मोनोक्लोनल एंटी-बकरी IgG-FITC सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:100; क्लोन GT -34; F4891; सिग्मा-एल्ड्रिच)। ग्लोमेरुलर मैक्रोफेज की पहचान FITC-संयुग्मित चूहे विरोधी माउस CD68 (FA -11 क्लोन GTX43518; GeneTex, Irvine, CA) का उपयोग करके की गई। Leica DFC700T डिजिटल कैमरा (Leica माइक्रोसिस्टम्स, वेट्ज़लर, जर्मनी) और इमेज-प्रो प्लस सॉफ्टवेयर (मीडिया साइबरनेटिक्स, रॉकविले, एमडी, संस्करण 7) के साथ युग्मित Leica DM4B ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मात्रात्मक इम्यूनो-यूरेसेंस विश्लेषण किया गया था। प्रति खंड दस ग्लोमेरुली की जांच की गई, और माध्य तीव्रता को मनमाना uores- विज्ञान इकाइयों में व्यक्त किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म, संस्करण 8.0 (ग्राफपैड, सैन डिएगो, सीए) का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया गया था। बार-बार उपाय 2-बोनफेरोनी मल्टीपल कम्पेरिजन टेस्ट (कारक समय और उपचार थे) के साथ विचरण के विश्लेषण का उपयोग समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण के लिए किया गया था। क्रुस्कल-वालिस विद डन मल्टीपल कम्पेरिजन टेस्ट का उपयोग कई समूहों की तुलना करते समय किया गया था, और मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग 2 समूहों के लिए किया गया था।

खुलासा

MCP को Alexion, ChemoCentryx, Novaartis, Gyroscope, और Achillion Pharmaceuticals से परामर्श शुल्क प्राप्त हुआ है। एचटीसी को एलेक्सियन, नोवार्टिस, औरिनिया और एचिलियन फार्मास्युटिकल्स से परामर्श शुल्क प्राप्त हुआ है। YZ, YW, KKJ, और SK-K, Alexion Pharmaceuticals के कर्मचारी हैं। एसके एलेक्सियन फार्मास्युटिकल्स के पूर्व कर्मचारी हैं और वर्तमान में जेमिनी फार्मास्युटिकल्स द्वारा कार्यरत हैं। अन्य सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया।

आभार

एमसीपी क्लिनिकल साइंस में वेलकम ट्रस्ट सीनियर फेलो है (अनुदान संदर्भ 212252/जेड/18/जेड), और एसीजी और डीपीएल इस फेलोशिप द्वारा समर्थित हैं। YZ, SK, YW, KKJ और SK-K को एलेक्सियन फार्मास्युटिकल्स द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

पूरक सामग्री

अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ)

चित्रा S1। Fusionproteinsusedinthisstudy.IgG-FH1-5 में माउस फैक्टर H (FH1-5) के पहले 5 डोमेन शामिल हैं जो एक गैर-लक्षित माउस Ig से जुड़े हैं। एंटी-पी-एफएच 1-5 में एमएफएच 1-5 होता है जो एक न्यूट्रलाइजिंग माउस एंटी-माउस प्रोपरडिन एंटीबॉडी से जुड़ा होता है (एंटी-पी; मिवा एट अल देखें। 30)। नियंत्रण प्रोटीन में एक आइसोटाइप-मिलान गैर-लक्षित माउस आईजी (आईजीजी-कंट्रोल) और न्यूट्रलाइजिंग माउस एंटी-माउस प्रोपरडिन एंटीबॉडी (एंटी-पी) शामिल थे। चित्रा S2। या तो (ए) आईजीजी-एफएच 1-5 या (बी) एंटी-पी-एफएच 1-5 के साथ इंजेक्ट किए गए एफएच-कमी वाले चूहों से प्लाज्मा नमूनों में एफएच 1-5 का पता लगाने के लिए डब्ल्यूईएस धब्बा विश्लेषण। 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5)IgG-FH के इंजेक्शन के 11 दिन बाद तक 1-5 और एंटी-पी-एफएच इंजेक्शन लगाने के 4 दिन बाद तक 1-5 प्रोटीन (लाल बॉक्स) का पता लगाया जा सकता है। जंगली प्रकार के चूहों से शामिल प्लाज्मा को नियंत्रित किया जाता है जहां पूर्ण लंबाई कारक एच प्रोटीन का पता लगाया जाता है (एफएच, ब्लैक बॉक्स, लेन सी 1) और गैर-इंजेक्टेड एफएच-डिफिएंट चूहों, जहां कोई एफएच स्पष्ट नहीं है (ब्लैक बॉक्स, लेन सी 2)। जैसा कि अपेक्षित था, एंटी-पी या आईजीजी-कंट्रोल के इंजेक्शन वाले चूहों से प्लाज्मा नमूनों में न तो FHnorFH 1-5 का पता लगाया जा सकता है।

चित्रा S3। जंगली प्रकार के चूहों में आईजीजी-नियंत्रण या एंटी-पी-एफएच 1-5 के इंजेक्शन के 96 घंटे बाद ग्लोमेरुलर पूरक इम्यूनोस्टेनिंग। प्रतिनिधि ग्लोमेरुलर छवियां दिखाई जाती हैं (बार 100 मिमी)।

चित्रा S4। एफएच-कमी वाले चूहों के ग्लोमेरुली में एंटी-पी-एफएच 1-5 के जमाव पर उचित की भूमिका। Cfh - / - चूहों को IgG- नियंत्रण या एंटी-P (उपचार 1) के साथ इंजेक्ट किया गया था 24- घंटे बाद में IgG- नियंत्रण या एंटी-P-FH 1-5 (उपचार 2)। उपचार के 120 घंटे बाद जानवरों को मार दिया गया और आईजीजी, प्रोपरडिन और एफएच / एफएचआर के लिए ग्लोमेरुलर धुंधलापन का आकलन किया गया। प्रतिनिधि चित्र दिखाए गए हैं। एंटी-पी इंजेक्शन ने उचित रूप से कम कर दिया (पंक्ति 1, कॉलम 2) लेकिन एफएच / एफएचआर (अपरिवर्तित रहता है) या आईजीजी (अनुपस्थित रहता है) धुंधला नहीं। आईजीजी-नियंत्रण के कुछ घंटे बाद एंटी-पी-एफएच का प्रशासन 1-5 24-एंटी-आईजीजी, एंटी-एफएच/एफएचआर, और एंटी-पी एंटीबॉडी के साथ दानेदार धुंधलापन दिखाई देता है जैसा कि एंटी-पी-एफएच के इंजेक्शन के बाद देखा गया है। 1-5 अकेले (चित्र 3ख देखें)। यह दानेदार धुंधलापन कम हो गया था जब एंटी-पी-एफएच 1-5 इंजेक्शन एंटी-पी इंजेक्शन से पहले था, जो परिसंचारी (चित्रा 1 एच देखें) और ग्लोमेरुलर (चित्रा 3 बी देखें) दोनों को कम कर देता है। एंटी-आईजीजी के साथ ग्लोमेरुलर धुंधलापन केवल एंटी-पी-एफएच 1-5 (पंक्ति 3, कॉलम 3 और 4) के इंजेक्शन वाले चूहों में स्पष्ट था और चूहों में काफी कम था, जो कि पी-एफएच प्राप्त करते थे 1-5 विरोधी पी से पहले। हमने निष्कर्ष निकाला कि Cfh-/- चूहों के ग्लोमेरुली में एंटी-पी-एफएच 1-5 का जमाव आंशिक रूप से प्रॉपरडिन पर निर्भर था। क्षैतिज पट्टियाँ माध्यिका मानों को दर्शाती हैं, और मूंछें इंटरक्वेर्टाइल रेंज को दर्शाती हैं। P-मान मान-व्हिटनी परीक्षण से प्राप्त किया गया था। बार 100 मिमी।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

1.फखौरी एफ, फ्रैमेक्स-बाची वी, नूल एलएच, एट अल सी ग्लोमेरुलोपैथी, नए सिरे से दासीकरण। नेट रेव नेफ्रोल.20106:494-499।

2 SmithRH.AppeG8.BlomAmet aLC3gkomeripathy- दुर्लभ पूरक-संचालित वास्तविक बीमारी को समझना। नेट रे नेफ्रोल।201915129-143

3. पिकरिंग एमसी, कुक एचटी। पूरक कारक एच पर अनुवाद संबंधी मिनी-समीक्षा श्रृंखला: पूरक कारक एच से जुड़े गुर्दे की बीमारियां मनुष्यों और जानवरों से उपन्यास अंतर्दृष्टि। सिन Expक्स्प इम्यूनोल.2008;151:210-230.

4. दाहा एमआर फियरन डीटी ऑस्टेन केएफ, सी3नेक्रिटिक फैक्टर सी3एनईएफ-फ्लुइड फेज का स्थिरीकरण और सेल-बाउंड अल्टरनेटिव पाथवे कन्वर्टेज। जे इम्यूनोल 1976;116:1-7।

5. मोलनेस टीई, एनजी वाईसी, पीटर्स डीके, सी3 पर एक नेफ्रिटिक कारक का एट अल प्रभाव और विवो और इन विट्रो में पूरक के टर्मिनल मार्ग पर। ओइन Expक्स्प इम्यूनोल। 1986;65:73-79।

6. एनक्यू वाईसी, पीटर्स डीके। G3 नेफ्रिटिक फैक्टर (C3NeF): सेल-बाउंड का पृथक्करण और वैकल्पिक मार्ग C3 कन्वर्टेज़ का द्रव चरण स्थिरीकरण। सीएन Expक्स्प इम्यूनोल.19865:450-457।

7. पिकरिंग एमसी, कुक एचटी, वारेन जे, एट अल अनियंत्रित सी3 सक्रियण चूहों में मेम्ब्रानोप्रोलिफेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस का कारण बनता है जिसमें पूरक कारक एच. नेट जेनर्ट.2002:31;424-428 की कमी होती है।

8. लेशर एएम, झोउ एल, किमुरा वाई, एट अल। फैक्टर एच म्यूटेशन और प्रॉपरडिन की कमी के संयोजन से गंभीर सी 3 ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस होता है। जे एम सोक नेफ्रोल। 2013; 24: 53-65।

9. रुसेवा एमएम, वेरोन केए, लेशर एएम, एट अल। प्रोपरडिन की हानि कारक एच की कमी के परिणामस्वरूप सी3 ग्लोमेरुलोपैथी को बढ़ा देती है। जे एम सोक नेफ्रोल। 2013;24:43-52।

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al। फैक्टर एच द्रव चरण में C3 सक्रियण को नियंत्रित करके GBM बाध्य iC3b की निकासी की सुविधा प्रदान करता है। मोल इम्यूनोल.2009;46:1942-1950।

11फखौरी एफ, डी जॉर्ज ईजी। ब्रुने एफ, एट अल मानव पूरक कारक एच के साथ उपचार कारक एच-कमी वाले चूहों में गुर्दे के पूरक बयान को तेजी से उलट देता है। किडनी इंट.2010:78:279-286।

12. मिशेलफेल्डर एस, पार्सन्स जे, बोहलेंडर एलएल, एट अल मॉस-उत्पादित, ग्लाइकोसिलेशन-अनुकूलित मानव कारक एच पूरक विकारों में चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए। जैम सोक नेफ्रोल.201728:1462-1474।

13. निकोलस ईएम, बारबोर टीडी, पप्पवर्थ वाई, एट अल एक विस्तारित मिनी-पूरक कारक एच अणु प्रयोगात्मक सी 3 ग्लोमेरुलोपैथी को बेहतर बनाता है। किडनी इंट। 201588:1314-1322।

14. रुसेवा एमएम, पेंग टी, लेजर एमए, एट अल प्रयोगात्मक सी3 ग्लोमेरुलोपैथी में लक्षित पूरक निषेध की प्रभावशीलता। जे एम सोक नेफ्रोल। 2016;27:405-416।

15. यांग वाई, डेंटन एच, डेविस या, एट अल सी3 ग्लोमेरुलोपैथी के उपचार के लिए एक इंजीनियर पूरक कारक एच निर्माण। जे एम सोक नेफ्रोल। 2018;29:1649-1661।

16. शुल्ज़ एम, प्रुचनो सीजे, बर्न्स एम, एट अल ग्लोमेरुलर सी3क्लोकलाइज़ेशन, प्रायोगिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में चल रहे प्रतिरक्षा जमा गठन और पूरक सक्रियण को इंगित करता है। एम जे पैथोल एल। 1993:142179-187.

17. अथानासियौ वाई, वोस्कराइड्स के गेल डीपी, एट अल फैमिलियल सी3 ग्लोमेरुलोपैथी सीएफएचआरएस म्यूटेशन नैदानिक ​​​​विशेषताओं के साथ 16 वंशावली में 91 रोगियों के साथ जुड़ा हुआ है। CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. कानेको वाई, निम्मेरोहन एफ, मैडायो एमपी, एट अल नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रैटिस में पैथोलॉजी और सुरक्षा विशिष्ट एफसी रिसेप्टर्स के चयनात्मक जुड़ाव द्वारा निर्धारित की जाती है। जे Expक्स्प मेड.2003;203:789-797।

19. शीरिन एनएस, स्प्रिंगॉल टी, कैरोल एमसी, एट अल। एंटी-ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन (सी 3- और सी 4- में कमी वाले चूहों में जीबीएम-मध्यस्थता वाले नेफ्रैटिस के खिलाफ सुरक्षा। सी एक्सप इम्यूनोल। 1997; 110: 403-409।

20. चेंग जेडजेड हेलवे जे, सीबर्गर एच एट अल। सतह की पहचान और माउस और मानव पूरक कारक के C3b बाध्यकारी गुणों की तुलना H.Mol Immunol.2006;43.972-979।

21dp रो ईजी। Macor P.Paixao-Caakante D. et al विशिष्ट हेमोलिटिक यूरीमिक सिंड्रोम का विकास पूरक C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145 पर निर्भर करता है।

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry et al स्वतःस्फूर्त हेमोलिटिक यूरेमिक सिंड्रोम पूरक कारक H द्वारा ट्रिगर किया गया जिसमें सतह की पहचान डोमेन की कमी है। जे Expक्स्प मेड.2004;204:1249-1256।

23 हर्बर्ट एपी। माइक ई, चेन जेडएट एएल कैप्चर किए गए कारक एच की वृद्धि द्वारा मध्यस्थता की गई चोरी: पूरक से आत्म-सतहों की सुरक्षा के लिए निहितार्थ। जे इम्यूनोल। 2015;195:4986-4998।

24. गोइकोचिया डी जॉर्ज ई सीज़र जेजे, मलिक टीएच, एट अल पूरक कारक एच-संबंधित प्रोटीन का डिमराइजेशन के साथ पूरक सक्रियण को नियंत्रित करता है। Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690।

25. श्मिट सीक्यू, बाई एच लिन जेड, एट अल। अद्वितीय ट्रिपल-टारगेटिंग गुणों के साथ एक न्यूनतम प्रतिरक्षा अवरोधक की तर्कसंगत इंजीनियरिंग। जे इम्यूनोल। 2013;190:5712-5721।

26. विल्सन एचआर, मेडजेरा-थॉमस एनआर, गिलमोर एसी, एट अल। ग्लोमेरुलर मेम्ब्रेन अटैक कॉम्प्लेक्स ल्यूपस नेफ्रैटिस में चल रहे C5 सक्रियण का विश्वसनीय मार्कर नहीं है। किडनी इंट। 201995655-665।

27. एंटोनियोली एएच व्हाइट जे, क्रॉफर्ड एफ, एट अल एल म्यूरिन फैक्टर एच-संबंधित प्रोटीन द्वारा पूरक के वैकल्पिक मार्ग का मॉड्यूलेशन। जे इम्यूनोल। 2018;200:316-326।

28. सेरहल्मी एम, सिसिंसीएएलमेज़ी जेड, एट अल। murine कारक H-संबंधित प्रोटीन FHR-B पूरक सक्रियण को बढ़ावा देता है। फ्रंट इम्यूनोल.20178:1145.

29. मेडजेरल-थॉमस एनआर, मोफेट एच, लोमैक्स-ब्राउन एचजे एट अल ग्लोमेरुलर पूरक कारक एच-संबंधित प्रोटीन 5 (एफएचआर5) सी3 ग्लोमेरुलोपैथी में अत्यधिक प्रचलित है और गुर्दे की हानि के साथ जुड़ा हुआ है। 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. ब्लॉकिंग प्रॉपरडिन, अल्टरनेटिव पाथवे, और एनाफिलाटॉक्सिन रिसेप्टर्स रेनल इस्किमिया-रीपरफ्यूजन इंजरी को क्षय-त्वरक कारक और CD59 डबल-नॉकआउट चूहों में सुधारते हैं। जे इम्यूनोल। 2013;190:3552-3559।

31. कोरिलो एफ, ब्रावो गार्सिया-मोराटो एम, नोजल पी, एट अल सीरम प्रोपरडिन खपत सी3 ग्लोमेरुलोपैथी में सी5 कन्वर्टेज डिसरेग्यूलेशन के बायोमार्कर के रूप में। क्लिन क्स्प इम्यूनोल.2016;184:118-125.8. लेशर एएम, झोउ एल किमुरा वाई, एट अल। फैक्टर एच म्यूटेशन और प्रॉपरडिन की कमी के संयोजन से गंभीर सी3 ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस होता है। जेएएम सोक नेफ्रोल.2013;2453-65।

32. झांग वाई, नेस्टर ओएम मार्टिन बी.एट अल सी3 ग्लोमेरुलोपैथी के पूरक बायोमार्कर प्रोफाइल को परिभाषित करना। क्लिन जे एम सोक नेफ्वोल.20149:186-1882।