करक्यूमिन इन विट्रो विस्तार भाग 2 के दौरान कैनाइन बोन मैरो मेसेनकाइमल स्टेम सेल की बुढ़ापा को कम करता है

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2.5. cBMSC सेनेसेंस में वक्र के सुरक्षात्मक प्रभाव को लागू करने में ऑटोफैगी इनोवोलोज़

cBMSC सेनेसेंस पर वक्र-प्रेरित स्वरभंग के प्रभाव का पता लगाने के लिए, ऑटोफैगी स्तर को RAP (200 nM) या 3-MA(5 mM) के रोजगार के माध्यम से संशोधित किया गया था।3-MA एक महत्वपूर्ण निरोधात्मक कार्रवाई करता है। ऑटोफैगिक गतिविधि पर, सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 प्रकाश श्रृंखला 3 (एलसी 3), ऑटोफैगी-संबंधित जीन (एटीजी) 7, एटीजी 12, और अन 51- जैसे ऑटोफैगी-एक्टिवेटिंग किनेज की एमआरएनए अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण गिरावट से प्रकट होता है। {14}}(ULK1); घटी हुई सूक्ष्मनलिका-संबंधी प्रोटीन 1 प्रकाश श्रृंखला 3 प्रकार /I (LC3-I/I) व्यंजक अनुपात; और नियंत्रण समूह (चित्रा 5ए, बी) के साथ तुलना में p62 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति। तदनुसार, Cur समूह के साथ तुलना में, 3-एमए प्लस वक्र समूह (चित्र 5ए, बी) में ऑटोफैजिक गतिविधि में कमी देखी गई। इसके विपरीत, आरएपी समूह में ऑटोफैजिक गतिविधि में वृद्धि देखी गई, जैसा कि एलसी3, एटीजी12, और एटीजी7 की अपग्रेडित एमआरएनए अभिव्यक्ति से स्पष्ट है; एलसी का बढ़ा हुआ रूपांतरण 3-I से LC3-II; और p62 का ह्रास (चित्र 5ए, बी)।

सबसे पहले, ऑटोफैजिक गतिविधि की व्यवस्थित रूप से जांच की गई थी। ऑटोफैजिक रिक्तिका (जिसे ऑटोफैगोसोम भी कहा जाता है) के गठन का मूल्यांकन रूपात्मक अवलोकन द्वारा किया गया था, और परिणामों ने संकेत दिया कि नियंत्रण समूह की तुलना में क्यू समूह और आरएपी समूह में अधिक ऑटोफैजिक रिक्तिकाएं और एलसी 3 डॉट्स थे, जबकि ऑटोफैजिक रिक्तिका की कम संख्या और कम LC3 डॉट्स 3-MA और 3-MA प्लस कर्व ग्रुप्स (चित्र 5C, E) में देखे गए। इसके अलावा, LysoTracker स्टेनिंग ने संकेत दिया कि लाइसोसोमल अम्लीकरण को cBMSCs में RAP और Cur द्वारा बढ़ाया गया था और इसमें कमी आई थी 3-एमए और 3-एमए प्लस वक्र समूह(चित्रा 5डी)। परिणाम बताते हैं कि Cur और RAP ऑटोफैगी सक्रियण पर समान सकारात्मक प्रभाव डालते हैं और यह कि ऑटोफैजिक गतिविधि 3-MA द्वारा दबा दी जाती है।लिंग का आकार,हालांकि, ऑटोफैगी पर 3-एमए के निषेध प्रभाव को Cur के रोजगार से आंशिक रूप से बचाया जा सकता है।

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यह पुष्टि करने के लिए कि क्या ऑटोफैगी सीबी एमएससी सेनेसेंस के नियमन में भाग लेती है, हमने फार्माकोलॉजिकल उपचार के माध्यम से ऑटोफैगी को बढ़ावा देने या दबाने के बाद सेनेकेंस से जुड़े फेनोटाइप्स की जांच की। परिणामों से पता चला कि कर और आरएपी समूहों में एसए- -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं की कम संख्या मौजूद थी, जबकि एसए- -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं की बढ़ी हुई संख्या {{5} में देखी गई थी। }एमए समूह की तुलना नियंत्रण समूह से की जाती है। यह उल्लेखनीय है कि एसए - -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में काफी वृद्धि हुई थी 3-एमए प्लस कर्व ग्रुप में कर्व ग्रुप (चित्रा) की तुलना में। RT-qPCR विश्लेषण के परिणामों ने संकेत दिया कि RAP और Cur के साथ उपचार ने SOX -2 और नैनोग के अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि की और IL -6, TNF-a, p21, और p16 के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना में कमी आई। नियंत्रण समूह के साथ। हालाँकि, 3-MA द्वारा स्वरभंग के निषेध ने p16, p21, TNF- और IL-6(चित्र 6C-E) की अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया। इसके अलावा, नियंत्रण समूह के साथ तुलना में, cBMSCs की कॉलोनी बनाने की दक्षता को Cur और RAPgroups में बढ़ाया गया था, जबकि CFU-F की संख्या और आकार 3-MA समूह में काफी कम हो गए थे। इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया था कि cBMSCs की कॉलोनी बनाने वाली संख्या पर Cur के बढ़े हुए प्रभाव को 3-MA (चित्र 6B) के साथ पूर्व शर्त के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है।सिस्टैंच पाउडरयह साक्ष्य इंगित करता है कि RAP और Cur cBMSC सेनेसेंस को सुधार सकते हैं, जबकि 3-MA cBMSC सेनेसेंस को बढ़ाता है और Cur द्वारा लगाए गए लाभकारी प्रभावों को कम करता है।

एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि 3-MA के साथ ऑटोफैगी का निषेध cBMSCs सेनेसेंस को तेज करता है, जबकि Cur और RAP के साथ ऑटोफैगी की सक्रियता cBMSC सेनेसेंस (चित्र 6F) को कम करती है। विशेष रूप से, Cur द्वारा लगाए गए सुरक्षात्मक प्रभावों को 3- MA (चित्र 6F) के साथ दिखावा द्वारा देखा गया था, यह सुझाव देते हुए कि Cur- प्रेरित स्वरभंग cBMSC सेनेसेंस को संशोधित करने के लिए एक संभावित आणविक तंत्र है।

3. चर्चा

MSCs की विशिष्ट कार्यात्मक विशेषताओं के कारण जीव लगातार घायल ऊतकों और मंद बुढ़ापा संबंधी प्रक्रियाओं की मरम्मत करते हैं जो विभिन्न ऊतकों और अंगों [15] के भीतर बड़े पैमाने पर रहते हैं। दुर्भाग्य से, उम्र और बीमारी विवो में एमएससी सेनेसेंस के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं, और सेलुलर वातावरण में आंतरिक और बाहरी अंतर इन विट्रो संस्कृति में एमएससी सेनेसेंस को तेज करते हैं, जो दोनों ही इम्युनोसुप्रेशन, भेदभाव और प्रवास के लिए उनकी क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं, अंततः स्वयं की प्रभावकारिता को कम करते हैं। MSCs में मरम्मत और प्रत्यारोपण [7,14,49-51]।सिस्टैंच साल्सा अर्कओजा और उनके सहयोगियों ने संकेत दिया कि मानव बीएमएससी ने क्लिनिकल-ग्रेड संस्कृतियों के पांचवें से नौवें मार्ग पर प्रसार को बंद कर दिया और विशिष्ट सेनेसेंस फेनोटाइप्स का प्रदर्शन किया, जैसे कि हाइपरट्रॉफिक और फ्लैट आकारिकी, सेल चक्र किनसे अवरोधकों की सक्रियता p16 और p21, एक घटी हुई प्रसार दर , और एसए की बढ़ी हुई गतिविधि - -गैल [52]। जाहिर है, इन विट्रो विस्तार अनिवार्य रूप से MSCs में बुढ़ापा की समयपूर्व उपस्थिति को बढ़ाता है, जिसे इन विट्रो सेलुलर उम्र बढ़ने के अनुसंधान [42, A4, A5] के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली माना जाता है। हमारे वर्तमान अध्ययन में पाया गया है कि तीसरे मार्ग से पहले cBMSCs ने एक समान आकारिकी प्रदर्शित की थी, लेकिन 6 वें मार्ग (आंकड़े 2 और 7) के बाद सेलुलर आकारिकी, शरीर विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में परिवर्तनों की एक श्रृंखला से गुजरना देखा गया था, जो समय से पहले बुढ़ापा के अनुरूप था। .

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

साक्ष्य की बढ़ती मात्रा इंगित करती है कि एमएससी को बुढ़ापा से बचाने के लिए औषधीय उत्तेजना एक आशाजनक दृष्टिकोण है [53,54]। इसे ध्यान में रखते हुए, विवो और इन विट्रो [15,55] में उनके विरोधी भड़काऊ, एंटीऑक्सिडेंट और एंटी-सेनेसेंस क्षमता को निर्धारित करने के लिए कई प्राकृतिक और सिंथेटिक यौगिकों की बड़े पैमाने पर जांच की गई है। प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले फेनोलिक यौगिक के रूप में, Cur ने MSC जीव विज्ञान [36,37,56,57] पर इसके लाभकारी प्रभावों के कारण बहुत ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, विभिन्न जैव चिकित्सा अनुसंधान के कार्यान्वयन से पहले MSCs पर Cur जोखिम के जटिल प्रभावों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। यांग और उनके सहयोगियों ने बताया कि Cur (50 और 100 uM) की उच्च सांद्रता इन विट्रो में मानव BMSCs में तीव्र विषाक्त प्रभाव उत्पन्न कर सकती है, जबकि निरंतर संपर्क (7 d) से 10uM मानव BMSC प्रसार को रोकता है और सेल एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है [58]। दिलचस्प बात यह है कि एक अन्य अध्ययन ने संकेत दिया कि कर्व के साथ उपचार (<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

हाल ही में, Cur की जैविक गतिविधियों को विभिन्न इन विट्रो या विवो मॉडल में बड़े पैमाने पर रिपोर्ट किया गया है, विशेष रूप से MSCs की जैविक विशेषताओं के मॉड्यूलेशन के बारे में। Cur की एंटी-एजिंग गतिविधि पर अक्सर चर्चा की गई है, और Cur को जीवों और सेलुलर स्तरों पर उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों पर लाभकारी प्रभाव प्रदर्शित करने के लिए पाया गया है। हालांकि, इसके नियमन में अंतर्निहित तंत्र, Cur की विभिन्न खुराकों और रूपों के साथ-साथ उम्र बढ़ने के तंत्र [19] के कारण जटिल है। अणु क्षरण और ऑर्गेनेल टर्नओवर के एक प्रमुख इंट्रासेल्युलर तंत्र के रूप में, ऑटोफैगी MSCs को तनाव की स्थिति से बचाने और सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। ऑटोफैगी के मॉड्यूलेशन को एमएससी कार्यों में सुधार के लिए एक नई रणनीति माना जाता है [59]। पर्याप्त अध्ययनों से प्राप्त आंकड़ों के अनुसार, विभिन्न सेल मॉडल में कर्व द्वारा ऑटोफैगी को बढ़ावा या दमन संतोषजनक साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव डालता है [38-40]।सिस्टैंच स्टेमहमारे डेटा से पता चला है कि Cur के संपर्क में आने के बाद बढ़ी हुई ऑटोफैजिक गतिविधि देखी गई थी, जैसा कि ऑटोफैगी-संबंधित जीन (LC3, ULK1, Atg7, और Atg12) के अपग्रेडेशन द्वारा पहचाना गया था, LC की पीढ़ी 3- II, की संख्या में वृद्धि ऑटोफैजिक रिक्तिकाएं और अम्लीय वेसिकुलर ऑर्गेनेल, और p62 प्रोटीन स्तर में उल्लेखनीय कमी (चित्र 4)। इसके अतिरिक्त, लाइसोसोम को ऑटोफैगी के लिए एक अनिवार्य अंग के रूप में माना जाता है, जबकि लाइसोसोमल पीएच की विकृति और वेक्यूलर एच प्लस-एटीपीस (वी-एटीपीस) गतिविधि में परिवर्तन एमएससी सेनेसेंस की प्रक्रिया में देखा गया था, इस प्रकार लाइसोसोमल अम्लीकरण और ऑटोफैगी को बढ़ावा देता है और योगदान देता है। MSC के बुढ़ापा में देरी करने के लिए [60]। यान और उनके सहयोगियों ने संकेत दिया कि Cur माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (MEFs) के लाइसोसोम फ़ंक्शन को सक्रिय कर सकता है और ऑटोफैगी को प्रेरित कर सकता है, जो एक महत्वपूर्ण उत्तरजीविता संकेत [38] के रूप में कार्य करता है। इसी तरह, हमने देखा कि Cur उपचार cBMSCs (चित्र 4) में लाइसोसोमल अम्लीकरण को बढ़ाता है, यह सुझाव देता है कि Cur लाइसोसोम फ़ंक्शन को सक्रिय करने में शामिल हो सकता है, जो कि ऑटोफैजिक गतिविधि को बढ़ाने के लिए अपरिहार्य है।

ऑटोफैगी मुख्य रूप से एक साइटोप्रोटेक्टिव तंत्र है, और साक्ष्य की बढ़ती मात्रा ने संकेत दिया है कि प्राकृतिक और सिंथेटिक यौगिकों के एंटी-एजिंग गुण ऑटोफैगी मॉड्यूलेशन [29,54,61,62] के साथ सहसंबद्ध हैं। हालाँकि, MSC सेनेसेंस और संबंधित तंत्रों पर ऑटोफैगी मॉड्यूलेशन के प्रभावों का अभी तक पूरी तरह से मूल्यांकन और पता नहीं चला है। प्रारंभिक रिपोर्टों ने संकेत दिया है कि ऑटोफैगी एक मुख्य रूप से साइटोप्रोटेक्टिव तंत्र है और यह कि ऑटोफैगी का एक बढ़ा हुआ स्तर विषाक्त मेटाबोलाइट्स के संचय को कम करके और ऑर्गेनेल [63] के कार्य को बहाल करके सेलुलर सिनेसेंस में देरी कर सकता है। दिलचस्प बात यह है कि हाल की जांच से यह भी पता चला है कि ऑटोफैजिक रिक्तिका और ऑटोफैगी-संबंधित प्रोटीन (एलसी 3- II, एटीजी 7, और एटीजी 12) की संख्या में वृद्धि एमएससी सेनेसेंस के दौरान देखी गई थी, जबकि बाफिलोमाइसिन ए 1 और {{11 के साथ ऑटोफैगी का निषेध }}MA को SA- -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत और p16 और p21 [35] की अभिव्यक्ति को कम करने के लिए दिखाया गया था। क्यूआर-प्रेरित ऑटोफैगी और cBMSCsenescence पर इसके प्रभावों के बीच संबंधों को और स्पष्ट करने के लिए, ऑटोफैगी को रैपामाइसिन या 3-एमए के साथ दिखावा करके संशोधित किया गया था। जाहिर है, ऑटोफैगिक गतिविधि को 3-एमए द्वारा देखा गया था, जबकि आरएपी और क्यूआर (1 यूएम) को ऑटोफैगी (चित्रा 5) को काफी बढ़ाने के लिए दिखाया गया था। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप [5], हमारे निष्कर्ष यह भी प्रदर्शित करते हैं कि 3- द्वारा ऑटोफैगी का निषेध cBMSCs में एमए त्वरित सेलुलर सिनेसेंस। ऑटोफैगी की सक्रियता पर लगभग सुसंगत प्रभाव Cur (1uMand RAP जबकि अनुरूप साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव) द्वारा लगाए गए थे। cBMSCs प्रदर्शित किए गए थे। तदनुसार, जब ऑटोफैगी को 3-MA द्वारा बाधित किया गया था, Cur द्वारा लगाए गए सुरक्षात्मक प्रभावों को कम किया गया था (चित्र), यह सुझाव देता है कि cBMSC सेनेसेंस (चित्र 7) को संशोधित करने के लिए Cur- प्रेरित स्वरभंग एक संभावित आणविक तंत्र है।

शारीरिक स्थितियों के तहत, सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एक बेसल स्तर पर ऑटोफैगी होता है। हालांकि, विभिन्न तनाव स्थितियों से असामान्य स्वरभंग हो सकता है, जिसका कोशिका भाग्य पर प्रभाव पड़ता है जब तक कि ऑटोफैगी को एक इष्टतम स्तर [41,44,64] पर बहाल नहीं किया जाता है। हमारे साक्ष्यों ने पुष्टि की कि वक्र-प्रेरित स्वरभंग cBMSC सेनेसेंस के नियमन पर लाभकारी प्रभाव प्रदर्शित करता है। इस परिदृश्य में, विभिन्न तनाव-उत्पादक उत्तेजनाओं और बाह्य सेटिंग्स पर ध्यान से इलाज से पहले विचार किया जाना चाहिए, और यह जांचना दिलचस्प होगा कि क्या वक्र-प्रेरित ऑटोफैगी एक पूर्व निर्धारित खुराक और अवधि में MSCs के कार्य में सुधार कर सकती है। इसके अतिरिक्त, एक नैनो-प्रौद्योगिकी-आधारित करक्यूमिन वितरण प्रणाली ने बेहतर जलीय-चरण घुलनशीलता और जैवउपलब्धता स्तरों का प्रदर्शन किया है [65,66]; यह एक आशाजनक उपकरण हो सकता है जिसके द्वारा MSC के जीर्णता में देरी और प्रतिकार किया जा सकता है। इस सवाल का जवाब कि क्या ऑटोफैगी एमएससी सेनेसेंस में देरी करने में प्राथमिक अंतर्निहित तंत्र है, इसके लिए अभी भी अधिक विवरण की आवश्यकता है जो भविष्य के अनुसंधान द्वारा प्रदान किया जाएगा।

4. सामग्री और तरीके

4.1. पशु

6 स्वस्थ वयस्क मादा चीनी ग्रामीण कुत्तों (12-महीने पुराने) से अस्थि मज्जा के नमूने एकत्र किए गए थे। सभी अध्ययनों को सिचुआन कृषि विश्वविद्यालय के संकाय पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन संख्या 2020-0608) द्वारा अनुमोदित किया गया था और चीन के जनवादी गणराज्य के पशु संरक्षण कानूनों के नैतिक मानकों के अनुसार आयोजित किया गया था।

4.2. Curcumin समाधान की तैयारी

Cur(HPLC 98 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर, CAS संख्या:458-37-7; Solar Science & Technology Co., Ltd., बीजिंग, चीन) को DMSO में 20 mmol/ एल 0.22 सुक्ष्ममापी कार्बनिक सूक्ष्मदर्शी फिल्टर झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया और -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। इन विट्रो अध्ययन के लिए एक माध्यम में विभिन्न क्यू समाधान तैयार किए गए थे।

4.3. सेल संस्कृति और विस्तार

cBMSCs अस्थि मज्जा से प्राप्त किए गए थे। कोशिकाओं को निम्न-ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (एलजी-डीएमईएम, गिब्को ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए), 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, ट्रांसजेन बायोटेक कं, लिमिटेड, बीजिंग, चीन) से युक्त एक पूर्ण माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। ), और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन। 80-90 प्रतिशत संगम पर, अनुयाई कोशिकाओं को ट्रिप्सिन डाइजेस्टिव सॉल्यूशन (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, शंघाई, चीन) के साथ छोड़ा गया और 1:2-1:3 [67 के अनुपात में आगे बढ़ाया गया। ].

4.4. सेल ग्रोथ क्यूरी

मार्ग (पी) 3,6, और 9 में cBMSCs की प्रसार क्षमता का निर्धारण करने के लिए, कोशिकाओं को तीन 48-वेल प्लेट्स (2500 सेल/वेल) में वरीयता दी गई थी। 48 घंटे के ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन डाइजेस्टिव सॉल्यूशन के साथ छोड़ा गया और एक हेमोसाइटोमीटर के साथ गिना गया। सेल काउंटिंग प्रक्रिया को हर 48 घंटे में दोहराया गया और 14 डी के लिए जारी रखा गया।

4.5. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा cBMSCs के इम्यूनोफेनोटाइप का पता लगाना

तीसरे मार्ग में, cBMSCs को PBS से धोया गया और trypsinized किया गया। कोशिकाओं (3 × 105 कोशिकाओं / एमएल) को धुंधला बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था, और सेल निलंबन 100 μL-सतह एंटीजन सीडी 45, सीडी 34, और के खिलाफ एफआईटीसी, पीई, या एपीसी फ्लोरोसेंट-लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) और गैर-फ्लोरोसेंट-लेबल CD31, CD90, और CD105 (बायोसिंथेसिस बायोटेक्नोलॉजी Co.Ltd. बीजिंग, चीन) 15 मिनट के लिए 4 डिग्री पर। कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और एफआईटीसी-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ 15 मिनट के लिए 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। सतह प्रतिजनों का पता फ्लो साइटोमेट्री (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) द्वारा लगाया गया था। CytExpert सॉफ्टवेयर के साथ डेटा विश्लेषण किया गया था।

4.6. इन विट्रो विभेदन परख

cBMSCs को 6-वेल प्लेट्स में 5 × 104 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर चढ़ाया गया था। 70-80 प्रतिशत संगम पर, पूरे माध्यम को एक ओस्टोजेनिक या एडिपोजेनिक भेदभाव प्रेरण माध्यम से बदल दिया गया था और हर 3 दिनों में बदल दिया गया था (कैवेजन, सूज़ौ, चीन)। 3 सप्ताह के ओस्टोजेनिक इंडक्शन के बाद एलिज़रीन रेड एस स्टेनिंग (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) द्वारा कैल्शियम के जमाव का पता लगाया गया था और 2 सप्ताह के एडिपोजेनिक इंडक्शन के बाद ऑयल रेड ओ स्टेनिंग (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) का उपयोग करके लिपिड ड्रॉपलेट संचय देखा गया था।

4.7. सेलुलर व्यवहार्यता पर वक्र का प्रभाव

cBMSCs की सेलुलर व्यवहार्यता CCK-8किट (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे और साइड इफेक्टcBMSCs को एक 96-वेल प्लेट में 24 h.cBMSCs के लिए अलग-अलग सांद्रता (0.1, 0.5, 1, 5, और 1{ {14}} umol/L) 12 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे के लिए। डीएमएसओ के 0.1 प्रतिशत के साथ कोशिकाओं का इलाज किया गया था, जिसे नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, 2 घंटे के लिए प्रति कुएं के 10 μL CCK -8 समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद, ऑप्टिकल घनत्व 450 एनएम (थर्मो वैज्ञानिक) पर एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा मापा गया था। वाल्थम, एमए, यूएसए)। सापेक्ष सेल व्यवहार्यता की गणना निर्माता के निर्देशों के अनुसार की गई थी।

4.8. कॉलोनी गठन परख

cBMSCs की स्व-नवीकरण दक्षता का पता कॉलोनी बनाने वाली इकाई-फ़ाइब्रोब्लास्ट CFU-F） परख का उपयोग करके लगाया गया था। cBMSCs को 6-वेल प्लेट्स में 3×10² सेल्स/वेल） सीड किया गया। दो सप्ताह की संस्कृति के बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था और 10 मिनट के लिए 1 प्रतिशत क्रिस्टल वायलेट के साथ धुंधला होने के बाद एक उल्टे माइक्रोस्कोप (LX73, ओलिंप कॉर्पोरेशन, टोक्यो, जापान) के तहत देखा गया था। CFU-F के लिए, 50 से अधिक कोशिकाओं को गिना गया। CFU-F दक्षता की गणना निम्नानुसार की गई:

सीएफयू-एफ दक्षता=सीएफयू-एफ/बीज की संख्या (300 कोशिकाओं) की संख्या [68]।

4.9. बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ धुंधला परख

cBMSCs में सेनेसेंस से जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ (SA - - gal) की गतिविधि का अनुमान निर्माता के निर्देशों के अनुसार SA - - गैल स्टेनिंग किट (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, शंघाई, चीन) का उपयोग करके लगाया गया था। . धुंधला होने के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच की गई। सेल्युलर सेनेस का आकलन करने के लिए सकारात्मक रूप से सना हुआ कोशिकाओं को गिना गया।

4.10.रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रीयल-टाइम क्वांटिटेटिव पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर)

Trizol अभिकर्मक विधि का उपयोग करके सेल छर्रों से कुल RNA निकाला गया था। सीडीएनए को जीडीएनए इरेज़र (तकरा, शिगा, जापान) के साथ प्राइमस्क्रिप्ट टीएम आरटी अभिकर्मक किट का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। पिछले अध्ययनों के संदर्भ में जीएपीडीएच के अलावा पीसीआर प्राइमर (तालिका 2) [67] सीडीएनए अनुक्रमों के आधार पर प्राइमर एक्सप्रेस सॉफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) का उपयोग करके डिजाइन किए गए थे। CFX96 टच रियल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड, रिचमंड, सीए, यूएसए) पर टीबी ग्रीन पीसीआर मिक्स (तकरा, शिगा, जापान) का उपयोग करके क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया। प्रतिक्रिया की स्थिति इस प्रकार थी: 3 0 एस के लिए 95 डिग्री और फिर 5 एस के लिए 95 डिग्री के 39 चक्र और 30 एस के लिए 60 डिग्री। पिघलने की अवस्था का विश्लेषण 95 डिग्री से 10 के लिए शुरू किया गया था, फिर 65 से 95 डिग्री तक, हर चक्र में 0.5 डिग्री की वृद्धि हुई। GAPDH का उपयोग सभी डेटा को सामान्य करने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था और सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना तुलनात्मक साइकिल थ्रेशोल्ड (Ct) विधि के माध्यम से की गई थी।

4.11. लुसोसोमल UIsing LysoTracker की ट्रैकिंग

लाइसो-ट्रैकर रेड (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, शंघाई, चीन) का उपयोग लाइसोसोम को ट्रैक करने के लिए किया गया था, जो लाइसोसोमल अम्लीकरण पर एक बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित कर सकता है। हमने cBMSCs को 12-अच्छी तरह से प्लेटों में रखा और उन्हें 24 घंटे के लिए Cur के साथ इलाज किया, फिर कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए Lyso-Tracker (60 nM) और Hoechst 33,342 (2 ug/mL) के साथ इलाज किया गया। पीबीएस के साथ धोने के बाद एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिदीप्ति देखी गई।

4.12. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

cBMSCs (2 × 1 0 4 सेल / स्लाइड) को स्लाइड्स पर रखा गया और 30 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया। 5 मिनट (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) के लिए 0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 के साथ सह-ऊष्मायन के बाद, वर्गों को 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान में डुबोया गया। संलग्न तरल को हटा दिया गया था, और कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री पर एंटी-एलसी 3 बी एंटीबॉडी (1: 1000, एबकैम, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) के साथ ऊष्मायन किया गया था, फिर फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (एबकैम, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) के साथ ऊष्मायन किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए। अंत में, कोशिकाओं को डीएपीआई (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी, शंघाई, चीन) के साथ उलट दिया गया और एक मुखर माइक्रोस्कोप के तहत निगरानी की गई।

4.13.पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण

सेल के नमूनों को ऊतक और सेल लाइसेट (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) के साथ बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोने के बाद प्रोटीज अवरोधक से युक्त किया गया था। प्रति नमूना 15 कुग प्रोटीन युक्त सेल लाइसेट्स को सोडियम-डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड (एसडीएस-पीए) (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) जैल में लोड किया गया और वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया गया। पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर प्रोटीन को स्थानांतरित करने के बाद, बाद वाले को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) के साथ गैर-विशिष्ट रूप से अवरुद्ध कर दिया गया था। झिल्लियों को प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-एलसी3बी (1:2000, एबकैम, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए), एंटी-पी62/एसक्यूएसटीएम1(1:4000, नोवस बायोलॉजिकल्स, लिटलटन, एनएच, यूएसए) के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया था। ), और एंटी - -एक्टिन (1:1000, एबकैम, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) 4 डिग्री पर, और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करने से पहले धब्बों को टीबीएसटी (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) से धोया गया। :2000, Abcam, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए। इसके बाद, झिल्ली को रसायनयुक्त अभिकर्मकों (मिलिपोर, बिलरिका, एमए, यूएसए) के संपर्क में विकसित किया गया और चेमीडॉकटीएम इमेजिंग सिस्टम्स (टैनन -5200, शंघाई, चीन) के साथ कल्पना की गई। प्रत्येक समूह के लिए इमेज-प्रो प्लस 6.0 सॉफ्टवेयर (मीडिया साइबरनेटिक्स, सिल्वर स्प्रिंग, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके बैंड घनत्व की मात्रा निर्धारित की गई और -एक्टिन के साथ सामान्यीकृत किया गया।

4.14. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)

सेल गोली को पचाया गया और 1.5mL अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र किया गया, फिर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड (सोलरबियो, बीजिंग, चीन) के साथ तय किया गया। पीबीएस के साथ धोने के बाद नमूनों को 1 घंटे के लिए 1 प्रतिशत ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के साथ पोस्ट-फिक्स किया गया था, फिर हमने एसीटोन के समाधान में निर्जलीकरण को चरणबद्ध तरीके से बढ़ाया और उन्हें 812 एपॉक्सी राल (बीजिंग झोंगजिंगकी टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, बेजिंग) में एम्बेड किया। चीन)। इसके बाद, अल्ट्रा-माइक्रोटोम (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Germany) से 50 एनएम अनुभाग प्राप्त किए गए। वर्गों को यूरेनिल एसीटेट (झोंगजिंगकेवी, बेजिंग, चीन) के साथ 10-15 मिनट और लेड साइट्रेट (झोंगजिंगकेई, बीजिंग, चीन) के लिए 2 मिनट के लिए दाग दिया गया था। सभी नमूनों को एक TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Japan) पर देखा गया।

4.15. सांख्यिकीय विश्लेषण

परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे और सभी डेटा को ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में दिखाया गया था। आईबीएम एसपीएस सांख्यिकी 25 का उपयोग करके सांख्यिकीय मूल्यों का विश्लेषण किया गया और ग्राफपैड प्रिज्म 9 का उपयोग करके सचित्र किया गया। 0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, सीए, यूएसए)। विचरण (ANOVA) और छात्र के t -est के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित किए गए थे। पी मान<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5। निष्कर्ष

हमारे निष्कर्ष Cur, cBMSC सेनेसेंस और ऑटोफैगी के बीच संबंधों पर प्रकाश डालते हैं। हमारे अध्ययन के आंकड़ों से पता चलता है कि ऑटोफैगी को सक्रिय करते हुए और लाइसोसोमल अम्लीकरण को बढ़ावा देते हुए Cur cBMSCs की पुरानी अवस्था को कम कर सकता है। इसके अलावा, आगे के सबूतों से पता चला है कि सीबीएमएससी सेनेसेन्स को संशोधित करने के लिए कर्व-प्रेरित ऑटोफैगी एक संभावित तंत्र है। MSCs के कार्य में सुधार के लिए Cur एक आशाजनक उत्प्रेरक और संरक्षक हो सकता है। हमारी राय में, उम्र बढ़ने पर Cur के सकारात्मक प्रभावों की उपेक्षा नहीं की जा सकती है। भविष्य के अध्ययनों को विभिन्न रोगों, जैसे ऊतक क्षति और अपक्षयी और सूजन संबंधी बीमारियों में MSCs की चिकित्सीय क्षमता को बढ़ाने के लिए MSC भाग्य पर Cur के नियमन के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए।

यह लेख Int से निकाला गया है। जे. मोल. विज्ञान 2021, 22, 11356। https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms