साइक्लोपेंटेनोन बी16एफ10 मेलानोमा में एंटी-मेलानोजेनेसिस और एंटी-रिंकल गतिविधियां करता है

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ही जिन जंग 1, ए क्यूंग ली 1,2, येओ जिन पार्क 1,2, सांगवोन ली 1,2, डोंगवान कांग 1,2, यंग सुक जंग 1,2, हे यंग चुंग 1,2 और ह्युंग रयोंग मून 1, 2,*

सार:अल्ट्रावाइलेट (यूवी) विकिरण एक्सपोजर बाहरी त्वचा उम्र बढ़ने का प्राथमिक कारण है, जिसके परिणामस्वरूप त्वचा हाइपरपीग्मेंटेशन और झुर्रियां होती है। इस अध्ययन में, हमने B16F10 मेलेनोमा पर (2E,5E)-2,5-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP) के श्वेत प्रभाव की जांच की और इसके एंटी- Hs27 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं पर शिकन गतिविधि। BHCP को संभावित रूप से टायरोसिनेस को बाधित करने के लिए पाया गया था, जिसमें 1.10 μM और 8.18 μM फॉर्माइकोफेनोलेट (L-tyrosine) और डिफेनोलेज़ (L-DOPA) के 50 प्रतिशत निषेध एकाग्रता (IC50) मान थे, और एंजाइम कैनेटीक्स अध्ययन से पता चला कि BHCP एक प्रतिस्पर्धी-प्रकार का टायरोसिनेस अवरोधक है। . इसके अलावा, BHCP ने मेलेनिन सामग्री और सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया और माइक्रोफथाल्मिया से जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF), cAMP प्रतिक्रिया तत्व-बाइंडिंग (CREB) प्रोटीन के फॉस्फोराइलेटेड स्तर और -मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-MSH) में टायरोसिनेस के स्तर को कम कर दिया। B16F10 मेलेनोमा कोशिकाएं। इसके अलावा, BHCP ने P65 के फॉस्फोराइलेशन और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (MMP -1, MMP -9, MMP -12, और MMP -13) की अभिव्यक्ति को Hs27 फाइब्रोब्लास्ट में रोक दिया। यूवी विकिरण से प्रेरित। इसलिए, हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि BHCP हाइपरपिग्मेंटेशन और झुर्रियों से जुड़ी बीमारियों के लिए चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए एक अच्छा उम्मीदवार हो सकता है।

कीवर्ड: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP); टायरोसिनेस अवरोधक; एंटी-मेलानोजेनेसिस; सिकुड़न प्रतिरोधी

सिस्टांचे isविरोधी शिकन।

1 परिचय

त्वचा की उम्र बढ़ना एक जटिल और प्रगतिशील प्रक्रिया है जो त्वचा में कार्यात्मक और सौंदर्य परिवर्तन की ओर ले जाती है, जिसमें आंतरिक और बाहरी दोनों कारक जिम्मेदार होते हैं [1]। बाहरी त्वचा की उम्र बढ़ने का कारण पर्यावरणीय हमलावरों, जैसे पराबैंगनी (यूवी) विकिरण, तनाव या धूम्रपान है। हालांकि, यह मुख्य रूप से सूर्य से यूवी के बार-बार संपर्क के कारण होता है, जिसे फोटोएजिंग कहा जाता है। त्वचा की फोटोएजिंग मोटे और गहरी झुर्रियों, मोटाई, खुरदरापन, अपच और ऊतकीय परिवर्तनों की विशेषता है [2-4]।

टायरोसिनेस (ईसी 1.14.18.1), जिसे पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज के रूप में भी जाना जाता है, मेलेनिन संश्लेषण में शामिल बहुक्रियाशील तांबा युक्त एंजाइमों में से एक है और प्रकृति में व्यापक रूप से पाया जाता है [5]। टायरोसिनेज आमतौर पर सूक्ष्मजीवों, पौधों के बहुमत में मौजूद होता है। और जानवर। पौधों में, टायरोसिनेस मोनोफेनोल्स को डिफेनोल (माइकोफेनोलेट गतिविधि) में ऑक्सीकरण करके कार्य करता है और ओ-डिफेनोल्स के ऑक्सीकरण में ओ-क्विनोन (डिफेनोलेस गतिविधि) में शामिल होता है, इसके बाद क्विनोन का ऑक्सीकरण गहरे भूरे रंग के रंग में होता है [6]।

मेलानोजेनेसिस एल-टायरोसिन का 3,4-डायहाइड्रोक्सीफेनिलएलनिन (एल-डीओपीए) में परिवर्तन है, जिससे एल-डीओपीए को डीओपीए कुनैन [7] में बदल दिया जाता है। इसलिए, मेलेनोसाइट्स में मेलेनिन उत्पादन में टाइरोसिनेज एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और टाइरोसिनेज का निषेध रंजकता संबंधी विकारों के सुधार और श्वेत एजेंटों के विकास के लिए एक आकर्षक लक्ष्य है [8,9]। मेलेनिन संश्लेषण कई उत्तेजनाओं से प्रेरित होता है, जैसे कि यूवी और रसायन जिसमें आइसोब्यूटाइलमिथाइलक्सैन्थिन (आईबीएमएक्स) और अल्फा-मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-एमएसएच) शामिल हैं। -MSH अपने रिसेप्टर मेलानोकोर्टिन 1 रिसेप्टर (MC1R) को बांधता है, बाद में साइटोप्लाज्मिक चक्रीय AMP (cAMP) स्तर को बढ़ाता है। बढ़ा हुआ सीएमपी स्तर प्रोटीन किनेज ए (पीकेए) को सक्रिय करता है, जो सीएमपी प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी प्रोटीन (सीआरईबी) के फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से माइक्रोफथाल्मिया-संबंधित प्रतिलेखन कारक (एमआईटीएफ) की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। MITF tyrosinase, tyrosinase-संबंधित प्रोटीन (TRP)-1, और TRP-2 की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः मेलेनिन संश्लेषण में वृद्धि होती है [10]। MITF को मेलानोजेनेसिस का मुख्य ट्रांसक्रिप्शन कारक माना जाता है; इसलिए, मेलानोजेनेसिस [11] को रोकने के लिए MITF की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए कई अध्ययन किए गए हैं।

शिकन गठन को त्वचा के बाह्य मैट्रिक्स के क्षरण के साथ निकटता से जुड़ा हुआ माना जाता है, और यूवी विकिरण परमाणु कारक-κB (NF-κB) को सक्रिय करता है, जिससे कोलेजन विखंडन और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (MMPs) [2] का उत्पादन बढ़ जाता है। एमएमपी जिंक-आश्रित एंडोपेप्टिडेस हैं जो त्वचा में बाह्य मैट्रिक्स संरचना के रीमॉडेलिंग में महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, यूवी-प्रेरित एमएमपी द्वारा कोलेजन और मैट्रिक्स का अत्यधिक क्षरण फोटोडैमेज्ड त्वचा की एक विशेषता है, और एमएमपी का उपयोग यूवी-प्रेरित फोटोएजिंग के साथ-साथ त्वचा की सूजन [12] के प्रमुख मार्कर के रूप में किया जाता है।

करक्यूमिन की तरह डायरिलहेप्टानॉइड कंकाल डेरिवेटिव में एंटीऑक्सिडेंट, रिपोर्ट किए गए एंटीकैंसर, गतिविधियां शामिल हैं। मचान, जिसमें (2E,5E)-2,5-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone शामिल हैं। (बीएचसीपी) (चित्र 1),विरोधी सूजन, विरोधी मेलेनोजेनेसिस की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन करने के लिए, विशेष रूप से, लियो एट अल। [19] बायोएक्टीविटीज़, और एंटी-टायरोसिनेस [13-18] डिबेंज़िलिडीन-साइक्लोपेंटेनोन 2014 में रिपोर्ट किया गया है जो Wnt/-कैटेनिनसिग्नलिंग पाथवे के नियमन के माध्यम से मानव ओस्टियोसारकोमा पर सुरक्षात्मक प्रभावों में योगदान कर सकता है। हालांकि, बीएचसीपी के मेलानोजेनेसिस और एंटी-रिंकल प्रभावों की खोज की जानी बाकी है, और इसकी गतिविधि में अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी तक स्पष्ट रूप से स्थापित नहीं हुए हैं।

चित्र 1. (2E,5E)-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP) की संरचना।

वर्तमान अध्ययन में, हमने बीएचसीपी के एंटी-मेलानोजेनेसिस और एंटी-रिंकल क्षमता की जांच की, और इसमें शामिल तंत्र की पहचान करने की मांग की, विशेष रूप से मेलेनिन सामग्री और सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि के संबंध में, जिसे टायरोसिनेस अवरोध परख और एंजाइम कैनेटीक्स के विश्लेषण का उपयोग करके खोजा गया था। इसके अलावा, हमने दिखाया कि BHCP मेलानोजेनेसिस और झुर्रियों पर एक निरोधात्मक प्रभाव डालता है जो कि CREB / MITF / tyrosinase के -MSH- प्रेरित B16F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं के डाउनरेगुलेशन से जुड़ा है और यूवी-प्रेरित Hs27 मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट में p65 और MMP अभिव्यक्ति के फॉस्फोराइलेशन को रोकता है।

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2. परिणाम और चर्चा

2.1. (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP) का संश्लेषण

{0}}हाइड्रॉक्सी-4-मेथॉक्सीबेंज़ल्डिहाइड (100 मिलीग्राम, 0.66 mmol, isovanillin) और साइक्लोपेंटेनोन (0.03 एमएल, 0.33) का घोल mmol) को 1 N HCl-एसिटिक एसिड घोल (0.02 mL) में 25 Cfor 2 h पर हिलाया गया। 1 दिन तक खड़े रहने के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को ठंडे पानी से मेथनॉल की एक छोटी मात्रा की उपस्थिति में उपचारित किया गया, फ़िल्टर किया गया, और 56.9 प्रतिशत उपज में BHCP (65.9 mg) का उत्पादन करने के लिए ठंडे पानी से धोया गया। BHCP को स्पेक्ट्रोस्कोपिक विधियों द्वारा पहचाना गया, जिसमें शामिल हैं 1H और 13C-NMR, साथ ही प्रकाशित स्पेक्ट्रल डेटा और थिन लेयर क्रोमैटोग्राफी (TLC) विश्लेषण [19] के साथ तुलना करके। संरचना चित्र 1 में दिखाई गई है।

BHCP: पीला अनाकार पाउडर (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.25 (s, 2H, 2 × OH),7.28(s,2H,2×vinylicH), 7.14 (d, 2H) , जे=2.0 हर्ट्ज, 2 × 2-एच), 7.11 (डीडी, 2एच, जे=8.5, 2.0 हर्ट्ज, 2×6- एच),7.01 (डी, 2एच, जे=8.5 हर्ट्ज, 2 × 5-एच), 3.81 (एस, 6एच, 2 × ओएमई), 3.01 (एस, 4एच, 2 × सीएच2) ; 13सी-एनएमआर (100 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) : 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26.6; ईएसआई-एमएस: एम/जेड 351 (एम - एच)-।

2.2. मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि पर BHCP का निरोधात्मक प्रभाव

जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, BHCP ने IC5 0 1.1 0 ± 0.12 μMand 8.18 ± 0.44 μM के मानों के साथ tyrosinase को बाधित किया, जबकि kojic एसिड (सकारात्मक नियंत्रण) में IC50 मान 18.68 ± 1.40 μMand 33.89 ± 1.16 था। क्रमशः मोनोफेनोलेस और डिफेनोलेस के लिए μM। टायरोसिनेस के सिंथेटिक संभावित अवरोधकों के हमारे पिछले अध्ययन में, हमने आणविक मॉडलिंग अध्ययनों के माध्यम से तंत्र पाया जिसके द्वारा 3-हाइड्रॉक्सी और 4-बेंजाइलिडीन के मेथॉक्सी समूहों में टाइरोसिनेस सक्रिय साइट [20] के प्रति महान बाध्यकारी प्रवृत्ति थी। इस अध्ययन के परिणाम से, यह दिखाया गया था कि इसके कार्यात्मक समूह (3-हाइड्रॉक्सी और 4-मेथॉक्सी समूह) टायरोसिनेसिनहिबिटरी गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ जुड़े थे।

तालिका 1. BHCP के टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि और एंजाइम गतिज विश्लेषण।

इसके अलावा, BHCP द्वारा टायरोसिनेस निषेध के लिए जिम्मेदार तंत्र की जांच वर्तमान अध्ययन (तालिका 1 और चित्र 2) में एंजाइम गतिज विश्लेषण द्वारा की गई थी। लाइनविवर-बर्क भूखंडों को गतिज अध्ययनों से प्राप्त आंकड़ों का उपयोग करके तैयार किया गया था, और अवरोध स्थिरांक (की) डिक्सन भूखंडों से प्राप्त किया गया था। लाइनविवर-बर्क डबल पारस्परिक भूखंड प्रतिस्पर्धी-प्रकार के निषेध का संकेत देते हैं। जैसा कि चित्र 2a-c में दिखाया गया है, BHCP ने L-tyrosine और L-DOPA दोनों के प्रतिस्पर्धी अवरोधक के रूप में कार्य किया। इसके अलावा, डिक्सन भूखंडों के x- अक्ष पर अवरोध आमतौर पर हैं एक एंजाइम-अवरोधक परिसर [21,22] के लिए एंजाइम निषेध स्थिरांक (की) के प्रकारों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, जहां थैक्स-अक्ष का मान −Ki के मान को इंगित करता है। जैसा कि चित्र 2b-d में दर्शाया गया है, BHCP के Ki मान क्रमशः 1.7 μMand 10.5 μM थे, जो क्रमशः L-tyrosine और L-DOPA के लिए सब्सट्रेट के रूप में थे। जैसा कि Ki मान एक एंजाइम-अवरोधक परिसर बनाने के लिए आवश्यक एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, एक कम Ki मान टायरोसिनेस के खिलाफ अधिक प्रभावी निषेध का सुझाव देता है।

चित्रा 2. लाइनविवर-बर्क (ए, सी) और डिक्सन (बी, डी) बीएचसीपी द्वारा टायरोसिनेज एंजाइम निषेध के लिए भूखंड।

2.3. B16F10 मेलानोमा और Hs27 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता पर BHCP के प्रभाव

यह निर्धारित करने से पहले कि क्या BHCP ने किसी भी एंटी-मेलानोजेनेसिस और एंटी-रिंकल गतिविधियों को अंजाम दिया है, हमने अलग-अलग समय अंतराल के लिए BHCP के विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार द्वारा BHCP से B16F10 कोशिकाओं और Hs27 कोशिकाओं की साइटोटोक्सिसिटी की जांच की, और सेल व्यवहार्यता को EZ-Cytox परख के साथ मापा गया। जैसा कि चित्र 3ए, बी में दिखाया गया है, 48 घंटे के लिए बीएचसीपी के 10 माइक्रोन तक बी16एफ10 कोशिकाओं या एचएस27 कोशिकाओं के अस्तित्व को कम नहीं करता है। इसके बाद, बीएचसीपी के एंटी-मेलानोजेनेसिस और एंटी-रिंकल गतिविधियों पर आगे इन विट्रो अध्ययन 1, 5, और 10 माइक्रोन के साथ आयोजित किए गए थे।

2.4. B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री और सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि के खिलाफ BHCP का निषेध

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या BHCP -MSH- प्रेरितB16F10 कोशिकाओं की मेलेनिन सामग्री पर निरोधात्मक क्षमता रखता है, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए BHCP या कोजिक एसिड (5 मिमी) के संकेतित विभिन्न सांद्रता (1, 5, और 10 μM) के साथ दर्शाया गया था और फिर उत्तेजित किया गया था। 48 घंटे के लिए -MSH के साथ। जैसा कि चित्र 4a में दिखाया गया है, -MSH की उपस्थिति में BHCP के साथ उपचारित कोशिकाओं में मेलेनिन की मात्रा एकाग्रता-निर्भर तरीके से घट गई, जो 1 μM पर 113 प्रतिशत, 5 μM पर 106 प्रतिशत और 10 μM पर 102 प्रतिशत दिखा रही है। नियंत्रण समूह केवल -MSH (186 प्रतिशत) के साथ इलाज किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि BHCP (1 μM) कोजिक एसिड (5 mM) की तुलना में मेलेनिन सामग्री को अधिक मजबूती से रोकता है। इसके अलावा, B16F10 कोशिकाओं पर BHCP के निरोधात्मक प्रभाव को मापने के लिए एक सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि परख की गई। जैसा कि चित्र 4b में दिखाया गया है, BHCP केवल -MSH के साथ इलाज किए गए नियंत्रण समूह की तुलना में tyrosinase गतिविधि के साथ 1 μM पर 120 प्रतिशत, 5 μM पर 116 प्रतिशत और 10 μM पर 105 प्रतिशत की कमी के साथ एकाग्रता-निर्भर तरीके से घट गया। प्रतिशत। BHCP का निरोधात्मक प्रभाव कोजिक एसिड की तुलना में बहुत अधिक शक्तिशाली था; 1 μM पर BHCP का निषेध 5 mM (131 प्रतिशत) पर kojic एसिड से बेहतर था। इन परिणामों से पता चलता है कि BHCP का B16F10 मेलानोसाइट्स में मेलेनिन जैवसंश्लेषण और इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस संश्लेषण को रोककर एक श्वेत प्रभाव है।

चित्रा 4. मेलेनिन सामग्री (ए) और सेलुलर टाइरोसिनेस गतिविधि (बी) का निषेध बी 16 एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं पर बीएचसीपी।

2.5. B16F10 कोशिकाओं में MITF/Tyrosinase और Phosphorylated CREB की अभिव्यक्ति पर BHCP का प्रभाव

MITF, एक विशिष्ट प्रतिलेखन कारक, मेलेनिन जैवसंश्लेषण में दर-सीमित कदम को उत्प्रेरित करते हुए, tyrosinase सहित मेलेनोजेनिक जीन को प्रभावी ढंग से सक्रिय करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: TRP-1, और TRP-2। MITF की अभिव्यक्ति हो सकती है CREB [23] के फॉस्फोराइलेशन द्वारा बढ़ाया जा सकता है। CREB एक महत्वपूर्ण MITF प्रमोटर [24,25] है, और मेलानोसाइट्स में CREB का फॉस्फोराइलेशन मेलानोसाइट्स [26] में CREB (c-AMP प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी प्रोटीन) से जुड़कर MITF अभिव्यक्ति को बढ़ाता है। B16F10 कोशिकाओं पर BHCP के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव के लिए जिम्मेदार आणविक मार्गों को स्पष्ट करने के लिए, हमने CREB और MITF सहित प्रमुख अणुओं के प्रोटीन स्तर की जांच की, जो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मेलानोजेनेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कोशिकाओं को BHCP या kojic एसिड के साथ इलाज किया गया और फिर 48 घंटे के लिए -MSH द्वारा उत्तेजित किया गया। माप के लिए समय अंतराल पिछले अध्ययनों में वर्णित पद्धति का पालन करता है [27]। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, टायरोसिनेस और MITF का स्तर -MSH के साथ बढ़ा, लेकिन BHCP ने इन प्रोटीन स्तरों को कम कर दिया। इसके अलावा, CREB के फॉस्फोराइलेशन को BHCP द्वारा काफी दबा दिया गया था। -एमएसएच-प्रेरित सीआरईबी फास्फारिलीकरण के विनियमन को रंजकता [28] को विनियमित करने में संभावित रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि BHCP के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव MITF के डाउनरेगुलेशन और फॉस्फोराइलेटेड CREB के डाउनरेगुलेशन के माध्यम से टायरोसिनेस के परिणामस्वरूप होते हैं। वर्तमान अध्ययन से पता चलता है कि टायरोसिनेस और मेलानोजेनेसिस पर बीएचसीपी के निषेध तंत्र की व्याख्या महत्वपूर्ण है और भविष्य में इसकी और जांच की जानी चाहिए। हालांकि B16F10 मेलेनोमा सेल लाइन आमतौर पर इन विट्रो में सिग्नलिंग तंत्र की जांच के लिए अधिक उपयुक्त है, B16F10 सेल लाइन एक कृंतक मेलेनोमा की है। इसलिए, निष्कर्षों की पुष्टि के लिए मानव मेलानोसाइट्स पर आगे के अध्ययन आवश्यक होंगे।

2.6. यूवी प्रेरित NF-κB p-p65 Hs27 कोशिकाओं में सक्रियण पर BHCP का प्रभाव

हमने अगली बार Hs27 फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करने वाले भड़काऊ मध्यस्थों की यूवी-प्रेरित अभिव्यक्ति पर BHCP के प्रभाव की जांच की। यह पहले बताया गया है कि p65 (Ser536) का फॉस्फोराइलेशन जीन को लेन-देन करने की क्षमता के लिए आवश्यक है [29]। इसलिए, पश्चिमी सोख्ता द्वारा नाभिक अंश में p-p65 (Ser536) andp65 के प्रोटीन स्तर की जांच की गई। जैसा कि चित्र 6a, b में दर्शाया गया है, Hs27 कोशिकाओं में, UV ने नाभिक में p-p65 (Ser536) के प्रोटीन स्तर में वृद्धि की, जबकि BHCP के उपचार से नाभिक p-p65 (Ser536) प्रोटीन स्तर में कमी आई। इसके अनुरूप, यूवी द्वारा साइटोप्लाज्म में p65 की कुल मात्रा में कमी की गई और BHCP (चित्र 6c, d) द्वारा बहाल किया गया। यद्यपि साइटोप्लाज्म में p65 की प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर कम हो गया था और यूवी प्रेरण के बाद नाभिक में वृद्धि हुई थी, BHCP के साथ दिखावा ने इन प्रवृत्तियों को खुराक पर निर्भर तरीके से उलट दिया। इस प्रकार, इन परिणामों से पता चलता है कि BHCP द्वारा p-p65 का निषेध त्वचा की रंजकता और यूवी के खिलाफ कोलेजन विनाश पर सुरक्षात्मक प्रभावों में योगदान कर सकता है।

चित्र 6. यूवी-प्रेरित Hs27 मानवफाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में p-p65 (Ser536) के अभिव्यक्ति स्तरों पर BHCP का प्रभाव।

2.7. Hs27 कोशिकाओं में MMP की अभिव्यक्ति पर BHCP का प्रभाव

एमएमपी त्वचा की उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यूवी विकिरण एमएमपी [30,31] की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर त्वचा के संयोजी ऊतकों को बदल देता है। एमएमपी-1 एक कोलेजन-डीकंपोज़िंग एंजाइम है जो टाइप I प्रोकोलेजन से संश्लेषित कोलेजन के टूटने को तेज करता है। एमएमपी -9 एक जिलेटिन-डीकंपोज़िंग एंजाइम है जो एमएमपी द्वारा काटे गए कोलेजन फाइबर को तोड़ता है -1, शिकन उत्पादन और लोच हानि को बढ़ाता है। यूवी इंडक्शन के खिलाफ बीएचसीपी के एंटी-रिंकल प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा एमएमपी -1 और एमएमपी -9 प्रोटीन के स्तर का निर्धारण किया। इसके अलावा, यूवी-प्रेरित कोशिकाओं ने एमएमपी -13 का काफी ऊंचा स्तर दिखाया, जो एमएमपी -1 [32] के बजाय टाइप I और III कोलेजन के क्षरण की शुरुआत करता है। हमने 1 और 10 μM पर BHCP के साथ UV-प्रेरित Hs27 कोशिकाओं के उपचार के बाद MMPs (MMP1, MMP9, MMP12, और MMP13) की वृद्धि की जांच की। जैसा कि चित्र 7 में दिखाया गया है, यूवी प्रेरण के बाद एमएमपी -1, एमएमपी -9, एमएमपी -12, और एमएमपी -13 के स्तर में वृद्धि हुई है; हालांकि, बीएचसीपी उपचार ने एक खुराक में अभिव्यक्ति में कमी की है। -निर्भर तरीके से। हमारे परिणाम बताते हैं कि बीएचसीपी यूवी जोखिम से प्रेरित एमएमपी के असामान्य उत्पादन को कम करके शिकन गठन की रोकथाम में योगदान दे सकता है। इन परिणामों का अर्थ है कि BHCP कोलेजन अपघटन को रोकने के लिए Hs27fibroblasts में MMP अभिव्यक्ति को रोकता है, और इस प्रकार शिकन उत्पादन करता है। इसलिए, बीएचसीपी त्वचा संबंधी रोग की एक निवारक और उपचार दवा के रूप में उपयोग करने की क्षमता प्रदर्शित करता है।

सिस्टैंच स्टेम लाभ

3. सामग्री और तरीके

3.1. रसायन और इंस्ट्रुमेंटेशन

मशरूम टाइरोसिनेज (ईसी 1.14.18.1), -एमएसएच, एल-टायरोसिन, 3, 4-डायहाइड्रॉक्सीफेनिलएलनिन (एल-डीओपीए), डाइमिथाइल सल्फोऑक्साइड (डीएमएसओ), और कोजिक एसिड सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस) से खरीदे गए थे। एमओ, यूएसए)। डल्बेको का संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम), भ्रूण गोजातीय सीरम, स्ट्रेप्टोमाइसिन और एम्फोटेरिसिन गिब्को लाइफ टेक्नोलॉजीज इंक। (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। MITF, CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tyrosinase, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB के खिलाफ एंटीबॉडी , और -एक्टिन को सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। पॉलीविनाइलिडीन डिफ़्लुओराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली मिलिपोर कॉर्पोरेशन (बेडफोर्ड, एमए, यूएसए) से प्राप्त की गई थी। टिशू कल्चर के लिए स्टेरिलप्लास्टिक वेयर एसपीएल लैबवेयर (सियोल, कोरिया) से खरीदा गया था। यूवी प्रकाश स्रोत क्रॉसलिंकर 800 श्रृंखला (यूवीपी, सीए, यूएसए) 6 दीपक इकाई (8 वाट/दीपक) द्वारा प्रदान किया गया था। सिलिका जेल पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी और सिलिका जेल 60 (मेष 230-400) का प्रदर्शन किया गया था {{27} }मर्क मिलिपोर (डार्मस्टाड, जर्मनी) से प्रीकोटेड प्लेट्स। एनएमआर स्पेक्ट्रा को वेरियन यूनिटी इनोवा 400 (1H के लिए 400 मेगाहर्ट्ज, 13C के लिए 100 मेगाहर्ट्ज) और वेरियन यूनिटी एएस 500 (1H के लिए 500 मेगाहर्ट्ज) उपकरणों का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। रासायनिक बदलाव मूल्यों (δ) को संबंधित अवशिष्ट विलायक या ड्यूटेरेटेड चोटियों (डीएमएसओ के लिए δH 2.50 और δC 39.51) के संदर्भ में सूचित किया जाता है। कम-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एक एक्सप्रेशन सीएमएस मास स्पेक्ट्रोमीटर (एडवियन, इथाका, एनवाई, यूएसए) के साथ प्राप्त किए गए थे।

3.2. मशरूम टायरोसिनेस निषेध परख

जंग एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया के आधार पर, मशरूम टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि एल-टायरोसिन और एल-डीओपीए सबस्ट्रेट्स का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। [23]। संक्षेप में, tyrosinase एंजाइम के 190 μL (मशरूम tyrosinase बफर के साथ पतला 1000 U, जिसमें 1 mM L-tyrosine और L-DOPA समाधान शामिल हैं) को यौगिकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में जोड़ा गया था (अंतिम एकाग्रता 1 से 20 μM तक, में भंग 100 प्रतिशत डीएमएसओ), एक 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में, 200 μL की अंतिम मात्रा प्रदान करने के लिए। प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। माइक्रोप्लेट रीडर (TECAN, साल्ज़बर्ग, ऑस्ट्रिया) का उपयोग करके 492 एनएम पर अवशोषण को मापकर टायरोसिनेस गतिविधि की मात्रा निर्धारित की गई थी और प्रतिशत निषेध (प्रतिशत) निम्नलिखित समीकरण से प्राप्त किया गया था:

प्रतिशत अवरोध=(एसी - अस)/एसी × 100 (1)

जहां एसी नियंत्रण का अवशोषण है और जैसा नमूना का अवशोषण है। IC50 मानों की गणना लॉग-रैखिक वक्रों और उनके समीकरणों से की गई थी। तीन निर्धारणों के लिए औसत परिणाम दिखाए गए हैं। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोजिक एसिड का उपयोग किया गया था।

3.3. टायरोसिनेस निषेध का काइनेटिक विश्लेषण

गतिज तंत्रों को निर्धारित करने के लिए, दो गतिज विधियों (लाइनविवर-बर्क और डिक्सन भूखंडों) का पूरक रूप से उपयोग किया गया [21,22,33]। लाइनविवर-बर्क डबल पारस्परिक भूखंडों के लिए (1/एंजाइम वेग (1/वी) बनाम 1/सब्सट्रेट एकाग्रता (1/[एस])) का एक प्लॉट, एल-टायरोसिन (1, 2,) के विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके अवरोध प्रकार निर्धारित किया गया था। और 4 मिमी) और एल-डोपा (0.5, 1, और 2 मिमी) सब्सट्रेट के रूप में BHCP के विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में। BHCP की सांद्रता इस प्रकार थी: 0, 0.5, 1.{{20}}, और 2.0L-tyrosine के लिए μM; और L-DOPA के लिए 0, 2.5, 5, और 10 μM। डिक्सन प्लॉट एंजाइम निषेध के प्रकार के निर्धारण के लिए एक ग्राफिकल विधि (1/एंजाइम वेग (1/वी) का अवरोधक एकाग्रता (I) के खिलाफ है) और एंजाइम-अवरोधक परिसर के लिए पृथक्करण स्थिरांक या Ki निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था। निषेध के डिक्सन भूखंड (एकल पारस्परिक भूखंड) 1, 2, और 4 मिमी और {{4 0}}, 0.5, 1.{ पर एल-टायरोसिन सब्सट्रेट की उपस्थिति में प्राप्त किए गए थे। {47}}, और 2.0 μM BHCP के लिए; और एल-डीओपीए बीएचसीपी के लिए {{50}}.5, 1.0, और 2.0 एमएम और 0, 2.5, 5.0, और 10.0 माइक्रोन पर सबस्ट्रेट करें।

सिस्टैंच प्लांटएक टायरोसिनेस अवरोधक है।

3.4. सेल लाइन्स और सेल कल्चर

मरीन B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को कोरियाई सेल लाइन बैंक से प्राप्त किया गया था। ह्यूमनस्किन फ़ाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन Hs27 को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC, मानस, VA, यूएसए) से खरीदा गया था। इन कोशिकाओं को डीएमईएम में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीयरम, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एक आर्द्र 5 प्रतिशत सीओ2 इन्क्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस में अनुरक्षित किया गया था। 100 मिमी डिश पर त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट का इलाज BHCP के साथ किया गया और सीरम-मुक्त DMEM (UV प्रकाश स्रोत, UVP) में 50 mJ/cm2UV के संपर्क में आया। Hs27 कोशिकाओं को 100 मिमी व्यास की प्लेट में 70-80 प्रतिशत संगम पर सुसंस्कृत किया गया था और मार्ग संख्या 5 और 15 के बीच उपयोग किया गया था।

3.5. सेल व्यवहार्यता परख

EZ-Cytox किट परख का उपयोग करके कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन किया गया था। संक्षेप में, B16F1 0 कोशिकाओं और Hs27fibroblasts को 1 × 104 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर एक 96-वेल प्लेट में डाला गया और 37 Cfor 24 h पर इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को ताजा, सीरम-मुक्त DMEM खिलाया गया जिसमें BHCP के विभिन्न सांद्रता (0, 1, 2, 5, और 10 μM) थे, और 24 और 48 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद, EZ-Cytox समाधान के 10 μL को प्रत्येक कुएं में लोड किया गया और कोशिकाओं को 2-4 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। किसी भी उपचार के अभाव में कोशिकाओं के अवशोषण माप को 100 प्रतिशत कोशिका अस्तित्व के रूप में माना जाता था। प्रत्येक उपचार को तीन प्रतियों में किया गया और प्रत्येक प्रयोग को तीन बार दोहराया गया।

3.6. मेलेनिन सामग्री परख का निर्धारण

B16F10 कोशिकाओं में -MSH- प्रेरित मेलानोजेनेसिस पर BHCP का प्रभाव मामूली संशोधनों के साथ पहले से उपयोग की जाने वाली विधि पर आधारित था [34]। संक्षेप में, 6-वेल प्लेट्स में B16F10 कोशिकाओं (5 × 104 सेल/वेल) को 70-80 प्रतिशत संगम तक बढ़ने दिया गया। कोशिकाओं को तब 24 घंटे के लिए BHCP (1, 5, और 10 μM) या कोजिक एसिड (5 मिमी) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, और फिर 48 घंटे के लिए -MSH (5 μM) से प्रेरित किया गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को दो बार बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोया गया, 90 μL 1 M NaOH समाधान में भंग कर दिया गया, जिसमें DMSO (5 प्रतिशत) शामिल है, 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर, और अवशोषण को 405 एनएम विथा माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (TECAN, साल्ज़बर्ग) में मापा गया था। , ऑस्ट्रिया)। प्रयोग में मेलेनिन की मात्रा को मापने के लिए, उपचार समूहों में निषेध की दर की गणना सिंथेटिक मेलेनिन के ज्ञात सांद्रता के अवशोषण से की गई थी, जिसे प्रोटीन की कुल मात्रा में ठीक किया गया था जो सेल lysates के सतह पर तैरनेवाला में मौजूद था। अनुपचारित कोशिकाओं के अवशोषण को तीन प्रतियों में मापा गया।

3.7. सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि परख

एल-डोपा [35] के ऑक्सीकरण की दर को मापकर सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि परख की गई। B16F1 0 5 × 104/कोशिकाओं के घनत्व वाली कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से व्यंजन में रखा गया और रात भर इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को तब 24 घंटे के लिए BHCP (1, 5, और 10 μM) या कोजिक एसिड (5 mM) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, और फिर 48 घंटे के लिए -MSH (5 μM) से प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और 50 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 6.5), 0.1 मिमीफेनिलमेथाइलसल्फोनीलफ्लोराइड (पीएमएसएफ), और 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 के 100 μL युक्त घोल में मिलाया गया। फिर, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए एक डीपफ्रीज़र मशीन (−80 C) में रखा गया। कोशिकाओं को डीफ्रॉस्ट करने के बाद, सेलुलर अर्क को 12, 000 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किया गया था। कुल 80 μL सतह पर तैरनेवाला और 20 μL ofL-DOPA (2 mg/mL) को एक अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ा गया था, और 492 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को 37 पर 1 घंटे के दौरान हर 10 मिनट में मापा गया था। सी एक एलिसा प्लेट रीडर (TECAN, साल्ज़बर्ग, ऑस्ट्रिया) के साथ।

3.8. Hs27 कोशिकाओं के साइटोसोलिक और परमाणु अर्क की तैयारी

Hs27 कोशिकाओं को बर्फ के ठंडे पीबीएस से धोया गया और काटा गया। 1 0 मिमी ट्रिस (पीएच 8. 0), 1.5 मिमी एमजीसीएल 2, 1 मिमी डीटीटी, 0.1 प्रतिशत एनपी -40, और प्रोटीज अवरोधक युक्त बफर का उपयोग साइटोसोलिक अंशों के निष्कर्षण के लिए किया गया था। 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12, 000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन 10 मिमी ट्रिस, 50 मिमी केसीएल, 100 मिमी NaCl, और प्रोटीजइनहिबिटर युक्त बफर का उपयोग करके छर्रों से परमाणु अंश निकाले गए। और फिर 13,000× g पर 30 मिनट के लिए 4 C पर परमाणु अंश प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया।

3.9. पश्चिमी सोख्ता

जेल-लोडिंग बफर (125 मिमी ट्रिस-एचसीएल, 4 प्रतिशत सोडियमडोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 1 0 प्रतिशत 2- मर्कैप्टोएथेनॉल, और 0.2 प्रतिशत ब्रोमोफेनॉल में 1 0 मिनट के लिए लाइसेट के नमूने उबाले गए थे। नीला; पीएच 6.8) 1:1 के आयतन के अनुपात में। प्रत्येक नमूने के लिए कुल प्रोटीन समकक्षों को एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेलइलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) द्वारा एक्रिलामाइड जैल का उपयोग करके अलग किया गया था, जैसा कि लैम्मली [36] द्वारा वर्णित प्रक्रिया के आधार पर किया गया था और वेट-ट्रांसफर सिस्टम का उपयोग करके 2 घंटे के लिए पीवीडीएफ झिल्ली को 80 वी पर स्थानांतरित किया गया था। झिल्लियों को तुरंत 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.5, 100 एमएमएनएसीएल, और 0.1 प्रतिशत ट्वीन -20 में एक अवरुद्ध बफर (5 प्रतिशत नॉनफैट दूध) में रखा गया था। 2 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर गैर-बाध्यकारी बंधन को रोकने के लिए धमाकों को अवरुद्ध कर दिया गया था। इसके बाद, झिल्ली को एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था, इसके बाद 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। . निर्माता के निर्देशों के अनुसार एन्हांस्ड केमिलुमिनेसिसेंस द्वारा एंटीबॉडी लेबलिंग का पता लगाया गया था। डेविंच-केमी टीएम। केमिलुमिनेसिसेंस इमेजिंग सिस्टम सीएएस -400 एसएम (कोर बायो, सियोल, कोरिया) का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा का प्रदर्शन किया गया। आणविक भार के निर्धारण के लिए प्रेस्टेड प्रोटीन मार्करों का उपयोग किया गया था।

3.10. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है डेटा का विश्लेषण बोनफेरोनी पोस्ट-हॉक टेस्ट के बाद उपचार के बीच अंतर के लिए विचरण (ANOVA) के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया था। p < 0.05="" का="" मान="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="">

4। निष्कर्ष

सारांश में, वर्तमान अध्ययन के निष्कर्षों से पता चला है कि BHCP में टायरोसिनेस के निषेध के माध्यम से त्वचा को गोरा करने वाला प्रभाव है, जो -MSH- प्रेरित B16F10 मेलानोसाइट्स में मेलेनिन जैवसंश्लेषण के लिए एक प्रमुख एंजाइम है। इसके अलावा, बीएचसीपी ने यूवी-प्रेरित फाइब्रोब्लास्ट में एमएमपी प्रोटीन के स्तर की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, जिससे एक विरोधी शिकन प्रभाव होने की उम्मीद है। पशु और नैदानिक ​​अध्ययनों के माध्यम से BHCP के श्वेत और शिकन-विरोधी प्रभावों की पुष्टि करने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है। अंत में, बीएचसीपी को श्वेत और शिकन विरोधी दोनों प्रभावों के लिए पहचाना गया, जो हाइपरपिग्मेंटेशन और झुर्रियों से जुड़े रोगों के लिए चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए इसकी क्षमता को दर्शाता है।

सिस्टैंच क्या है?

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