किडनी ऑर्गेनॉइड के साथ रोग मॉडलिंग Ⅱ

4. किडनी ऑर्गेनॉइड प्लेटफ़ॉर्म को बेहतर बनाने की रणनीतियाँ

वर्तमान किडनी ऑर्गेनॉइड प्रदर्शित होते हैंगुर्दे से संबंधित संरचनाएँलेकिन मिलते-जुलते नहींकार्यात्मक वयस्क गुर्दे. इस प्रकार, अनुभाग में वर्णित प्रोटोकॉल2.2 किडनी ऑर्गेनॉइड को जन्म देते हैं जिनमें ऊतकों के माध्यम से द्रव प्रवाह सहित विवो-जैसे बायोफिजिकल वातावरण की कमी होती है। हाल के अध्ययनों ने उच्च-क्रम वाली किडनी संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए प्रत्यारोपण और विभिन्न ऑर्गेनॉइड प्रकारों के संयोजन जैसी तकनीकों का उपयोग करके वयस्क किडनी के साथ ऑर्गेनॉइड समानता में सुधार किया है। ऑर्गेनॉइड परिपक्वता का पता लगाने और उसमें सुधार करने के लिए इन तकनीकों को बायोइंजीनियरिंग दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है। नीचे, हम उन रणनीतियों पर प्रकाश डालेंगे और अगली पीढ़ी तैयार करने के लिए नए विचारों पर चर्चा करेंगेकिडनी ऑर्गेनॉइड सिस्टम. 

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4.1. स्नातकों का परिचय

हम जानते हैं कि सामान्य भ्रूणजनन के दौरान मेसोनेफ्रोस, मेटानेफ्रोस और यूबी विकासशील किडनी को पैटर्न देने के लिए एक दूसरे को संकेत भेजते हैं [6]। इसके अलावा, प्रारंभिक भ्रूण में स्थापित जैव रासायनिक ग्रेडिएंट्स उचित किडनी पैटर्निंग और विकास को निर्देशित करने के लिए आवश्यक हैं [47]। हमारे वर्तमान किडनी ऑर्गेनॉइड विकास प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण मुद्दा विकास के दौरान अन्य शारीरिक ऊतकों से उनका अलगाव है, और इस प्रकार भ्रूण के अन्य सह-विकासशील ऊतक प्रणालियों के साथ बातचीत के माध्यम से स्थापित जैव रासायनिक ग्रेडिएंट की कमी है। इसलिए, ऑर्गेनॉइड विकास में उन अंतःक्रियाओं को शामिल करना सार्थक है। तागुची और निशिनाकामुरा (2017) और त्सुजिमोटो एट अल। (2020) ने ऑर्गेनॉइड परिपक्वता को सुविधाजनक बनाने के लिए इनमें से कुछ इंटरैक्शन पर विचार किया है [17,24]। अपनी रणनीतियों में, उन्होंने पहले स्वतंत्र ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए पीआईएम और एआईएम-विशिष्ट कारकों का उपयोग किया, फिर सह-संवर्धित एमएम और यूबी ऑर्गेनॉइड को चूहों में प्रत्यारोपित किया [17,24]। इस तरीके से विकसित किडनी ऑर्गेनॉइड ने उच्च-क्रम संरचनाओं का प्रदर्शन किया, लेकिन विवो-जैसी यूबी शाखाओं में व्यापक पुनरावृत्ति नहीं कर सका। जबकि ये अध्ययन पड़ोसी ऊतकों के सह-संवर्धन के महत्व को रेखांकित करते हैं, वे ऑर्गेनॉइड विकास की शुरुआत से शामिल स्थापित ग्रेडिएंट्स के माध्यम से ऑर्गेनॉइड के सुधार का आह्वान करते हैं।

चूँकि विकासशील भ्रूण से प्रत्येक ऊतक को शामिल करना और उसकी स्थितियों को अनुकूलित करना लगभग असंभव है, हम एक ऐसे वातावरण के अनुकरण का प्रस्ताव करते हैं, जहाँ कोशिकाएँ पड़ोसी ऊतक के प्रभाव का अनुभव करती हैं। इसे कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक जैव रासायनिक ग्रेडिएंट इंजीनियरिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें ग्रेडिएंट पड़ोसी ऊतकों की उपस्थिति की नकल कर सकता है। ग्रेडिएंट तब कोशिकाओं के एक ही निलंबन के भीतर एआईएम और पीआईएम दोनों वंशों को निर्देशित कर सकता है, और इस प्रकार यूबी और एमएम गठन को एक साथ प्रेरित कर सकता है। उदाहरण के लिए, हम वयस्क गुर्दे की जटिल संग्रह वाहिनी प्रणाली के गठन को प्रेरित करने के लिए एमएम के भीतर एक जीडीएनएफ ग्रेडिएंट और अग्रिम यूबी शाखा स्थापित कर सकते हैं।

हालाँकि किडनी ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के लिए इन ग्रेडिएंट-आधारित दृष्टिकोणों की खोज नहीं की गई है, लेकिन इनका उपयोग अन्य ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता में सुधार करने के लिए किया गया है। उदाहरण के लिए, बेन-रूवेन और रेनर एट अल। (2020) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के पूर्वकाल-पश्च अक्ष को पैटर्न देने में मदद करने के लिए हाइड्रोजेल में मॉर्फोजेन-रिलीजिंग मोतियों को एम्बेड किया गया [48]। एक अन्य अध्ययन में, काम्परमैन एट अल। (2019) बायोटिनाइलेटेड मोर्फोजेंस [49] के साथ सेल सब्सट्रेटम की स्थापना की। इन स्थैतिक दृष्टिकोणों के अलावा, शोधकर्ताओं ने साथी-संचालित मॉर्फोजेन जोड़ के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स भी विकसित किए हैं। उदाहरण के लिए, कुई एट अल। (2020) ने मॉर्फोजेन वितरण के लिए केमोटैक्सिस कक्षों और कक्षों के साथ एक कक्ष का उपयोग किया जिसमें स्टेम कोशिकाओं को हाइड्रोजेल में संवर्धित किया जा सकता है [50]। इस प्रकार, शोधकर्ता विशिष्ट कारकों का उपयोग करके किडनी ऑर्गेनॉइड विकास को प्रोग्राम करने के लिए समान सिस्टम लागू कर सकते हैं जो उनके प्रभावों को मध्यस्थ करने के लिए स्थानिक रूप से नियंत्रित होते हैं। यह एक ग्रेडिएंट स्थापित करेगा और भ्रूण के गुर्दे के विकास के लिए प्रासंगिक प्राकृतिक रूप से होने वाले मॉर्फोजेन वितरण की नकल करेगा। उदाहरण के लिए, एआईएम और पीआईएम विभेदन के लिए विशिष्ट कारकों वाले मोतियों को प्राकृतिक एआईएम-पीआईएम ग्रेडिएंट की नकल करने के लिए हाइड्रोजेल के विपरीत किनारों पर रखा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, हाईपीएससी विभेदन को नियंत्रित करने के लिए, कोशिकाओं या ऑर्गेनॉइड को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में डाला जा सकता है, जैसे कि विभिन्न वंशों की कोशिकाएं/ऑर्गनॉइड विपरीत दिशा में हों (चित्र 5ए देखें)। हाइड्रोजेल में एम्बेडेड HiPSCs को इन दो संरचनाओं के बीच सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो मॉर्फोजेनिक कारकों के स्रोत के रूप में काम कर सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मेसोनेफ्रोस और मेटानेफ्रोस के बीच बातचीत की नकल करने के लिए किया जा सकता है, जो कि वर्तमान किडनी ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल में उनके सेटअप में कमी है (चित्रा 5 ए देखें)। इस प्रकार, भविष्य के काम का लक्ष्य कई प्रकार के ऊतक से जैव रासायनिक संकेतों की नकल करना होना चाहिए जो किडनी के विकास के लिए प्रासंगिक हैं, जिनमें यूबी और एमएम के बीच, साथ ही विकासशील किडनी और वास्कुलचर के बीच के संकेत भी शामिल हैं। संबंधित सिस्टम डिज़ाइन उन इंटरैक्शन की नकल करने के लिए ग्रेडिएंट स्थापित करने के विकल्पों का पता लगा सकता है।

4.2. माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ ऑर्गेनॉइड का छिड़काव

द्रव प्रवाह के लिए महत्वपूर्ण हैकिडनी फिजियोलॉजीचूंकि यह मैकेनोसेंसिंग के जवाब में इंट्रासेल्युलर घटनाओं का एक झरना शुरू करता है और ऊतकों में परिवहन की सुविधा प्रदान करता है [51]। इसलिए, यदि हम कार्यात्मक किडनी ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करना चाहते हैं और उन्हें विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखना चाहते हैं, तो हमें अपने ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम में स्थिर और सुगंधित संवहनी नेटवर्क को एकीकृत करना होगा। किडनी ऑर्गेनॉइड में द्रव का प्रवाह दो मुख्य तरीकों से शुरू किया गया है, माइक्रोफ्लुइडिक्स और प्रत्यारोपण। होमन एट अल. (2019) में 3डी बायो-प्रिंटेड चिप में बायोफिजिकल संकेत शामिल थे, जिसमें ऑर्गेनॉइड को गतिशील द्रव प्रवाह के साथ एक कक्ष में संवर्धित किया गया था [52]। इस सेटअप ने माइक्रोफ्लुइडिक फेलो का अनुकरण किया और संवहनी नेटवर्क गठन को बढ़ावा दिया, लेकिन इसने किडनी फिजियोलॉजी को दोहराने के लिए संवहनी और नलिका संरचनाओं के माध्यम से छिड़काव को पुन: व्यवस्थित नहीं किया। फिर भी, इस अध्ययन ने ऑर्गेनॉइड परिपक्वता में जैव-भौतिकीय वातावरण के महत्व पर प्रकाश डाला।

चित्र 5. किडनी ऑर्गेनॉइड प्लेटफार्मों में प्रस्तावित सुधार। (ए) ग्रेडिएंट उत्पन्न करने के लिए दृष्टिकोण जिसमें एचआईपीएससी को किडनी ऑर्गेनोइड में विकसित करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। बाएं से दाएं: मॉर्फोजेन-उत्सर्जक मोतियों से घिरे हाइड्रोजेल में आईपीएससी क्लस्टर, मॉर्फोजेन-उत्सर्जक ऑर्गेनोइड से घिरे हाइड्रोजेल में हाईपीएससी क्लस्टर, हाइड्रोजेल में संवर्धित हाईपीएससी क्लस्टर के साथ बहु-कक्षीय चिप प्रणाली और एनपी और यूबी वंश के मॉर्फोजेन के द्विपक्षीय संपर्क में शामिल एक तरल में. (बी) एक हाइड्रोजेल (उदाहरण के लिए, कोलेजन मैट्रिक्स) में फॉलो थ्रू के साथ, एक शाखायुक्त एंडोथेलियल चैनल के बगल में एक किडनी ऑर्गेनॉइड को संवर्धित करने के लिए प्रस्तावित चिप प्रणाली। (सी) प्रस्तावित मचान सेटअप, जिसमें किडनी ऑर्गेनॉइड उगाए जा सकते हैं और बाद में प्रत्यारोपित किए जा सकते हैं। बाएं से दाएं: शाखाओं वाले एंडोथेलियल चैनल (लाल), बीजयुक्त किडनी ऑर्गेनॉइड और बीजयुक्त मॉर्फोजेन मोती (लाल और नीले गोले) के साथ छिद्रपूर्ण मचान; यूबी ऑर्गेनॉइड के आसपास एनपी ऑर्गेनॉइड के साथ झरझरा मचान

हमारा मानना ​​है कि मानव किडनी को मॉडल करने के लिए एक चैनलयुक्त माइक्रोफ्लुइडिक ऑर्गन-ऑन-चिप प्लेटफॉर्म में ऑर्गेनॉइड विकसित किया जा सकता है, जैसा कि अन्य गोलाकार प्रणालियों में किया गया है। उदाहरण के लिए, होमन एट अल के विपरीत। (2019), जिन्होंने एक द्रव-साथी कक्ष में एक ऑर्गेनॉइड रखा, नाशिमोटो एट अल। (2017) दो एंडोथेलियल चैनलों के बीच एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में मानव फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट स्फेरोइड को संवर्धित किया गया [52,53]। चैनलों ने एंजियोजेनेसिस के माध्यम से गठित एक सुगंधित संवहनी नेटवर्क को जन्म दिया। नैशिमोटो एट अल के समान कुछ दृष्टिकोण का उपयोग करना। (2017), हम एक सुगंधित एंडोथेलियल पोत के बगल में एक हाईपीएससी क्लस्टर रखने का प्रस्ताव करते हैं जिसे एक चिप में बनाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 5बी [53] में दिखाया गया है। अंकुरण किडनी-ऑर्गनॉइड-विशिष्ट संकेतों के बाद के संयोजन के साथ, संवहनी चैनल को शाखा में निर्देशित किया जा सकता है और ऑर्गेनॉइड पर आक्रमण किया जा सकता है क्योंकि यह अंतर करना शुरू कर देता है। यह विन्यास किडनी के विकास के शुरुआती चरणों को दोहराएगा [54]। किडनी के विकास के लिए आवश्यक मॉर्फोजेनेटिक संकेतों के निरंतर छिड़काव के साथ, किडनी ऑर्गेनॉइड वास्तविक मानव किडनी निर्माण प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से दोहराने में सक्षम होना चाहिए। यह भी महत्वपूर्ण है कि सिस्टम पैरामीटर, जैसे द्रव साथी तनाव, ईसीएम संरचना और कॉन्फ़िगरेशन, और ऑर्गेनॉइड चरण पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाए और अनुकूलित किया जाए। इसके अलावा, शूमाकर एट अल के बाद से। (2021) से पता चला है कि हाइपोक्सिया से किडनी ऑर्गेनॉइड में एंजियोजेनेसिस बढ़ जाता है, ऐसे पूर्व विवो सिस्टम को अधिक कुशलता से संवहनीकरण को प्रेरित करने के लिए कम ऑक्सीजन की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जा सकता है [55]। अंततः, इन रणनीतियों को ऑर्गेनोइड परिपक्वता की सुविधा प्रदान करनी चाहिए, संवहनी और ट्यूबलर छिड़काव को पुन: व्यवस्थित करना चाहिए, और शारीरिक कार्यों को निष्पादित करना चाहिए जैसा कि वे विवो में होते हैं।

4.3. प्रत्यारोपण के माध्यम से ऑर्गनॉइड परिपक्वता को आगे बढ़ाना

अध्ययनों से पता चला है कि किडनी ऑर्गेनॉइड को एक मेजबान, जैसे कि चूहे, मुर्गी के अंडे, या चूहे में प्रत्यारोपित करना, संवहनीकरण के लिए एक व्यवहार्य मार्ग प्रदान कर सकता है [16,33,56]। हालाँकि, प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड कार्यात्मक संरचनाओं के रूप में सीमित सफलता प्रदर्शित करते हैं। इस रणनीति में एक बड़ी बाधा प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड के एमएम के भीतर व्यापक यूबी शाखाओं का पुनर्पूंजीकरण करना है। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनॉइड के भीतर नेफ्रॉन खंडों में संग्रह वाहिनी की ओर उचित अभिविन्यास का अभाव होता है। वयस्क मानव किडनी के कार्य करने के लिए प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड के लिए ये विशेषताएं आवश्यक हैं। इसके अलावा, प्रत्यारोपण के बाद ऑर्गेनॉइड मेजबान के साथ एकीकृत हो जाते हैं, जिससे ऑर्गेनॉइड बनाम मेजबान ऊतक सीमाओं को अलग करना मुश्किल हो जाता है, और इस प्रकार ऑर्गेनॉइड-विशिष्ट विश्लेषण सीमित हो जाता है।

ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियाँ उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करती हैंकिडनी ऑर्गेनॉइड विकास में सुधार करेंपरिपक्वता और कार्यात्मक एकीकरण के संदर्भ में। आमतौर पर, ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण कोशिकाओं की व्यवस्था का समर्थन करने और वांछित मुद्दों के विभिन्न जैवभौतिकीय संकेतों को दोहराने के लिए फिल्म, मैट, हाइड्रोजेल और स्पंज जैसे विभिन्न विन्यासों में मचान (उदाहरण के लिए, रेशम फ़ाइब्रोइन मचान) का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन में, गुप्ता एट अल। (2019) ऑर्गेनॉइड उगाने के लिए झरझरा रेशम मचानों का उपयोग किया गया, उसके बाद प्रत्यारोपण किया गया [31]। इस दृष्टिकोण में, मचान बायोमटेरियल और कॉन्फ़िगरेशन ने ऑर्गेनॉइड विकास का समर्थन करने और प्रत्यारोपण पर स्थिरता प्रदान करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान की। हालाँकि, इस प्रणाली में ऑर्गेनॉइड परिपक्वता का समर्थन करने के लिए कार्यात्मक संकेतों का अभाव था, जैसे कि अन्य विकासशील संरचनाओं के निकट साथी के साथ वास्कुलचर का सह-विकास।

भविष्य के अध्ययन समान रणनीतियाँ विकसित कर सकते हैं और ऑर्गेनॉइड परिपक्वता का समर्थन करने के लिए कार्यात्मक संकेत शामिल कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, जैसा कि चित्र 5C में बताया गया है, एक झरझरा मचान को सुगंधित चैनलों के साथ कॉन्फ़िगर किया जा सकता है और प्रत्यारोपण के माध्यम से एक प्रासंगिक ऑर्गेनॉइड विकास प्रणाली विकसित करने के लिए मॉर्फोजेनिक कारकों के साथ लोड किया जा सकता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ प्री-सीडिंग निर्देशित पोत विकास का समर्थन कर सकती है, जबकि खुली छिद्रपूर्ण संरचना को एचआईपीएससी के साथ सीड किया जा सकता है और ऑर्गेनॉइड विकास के लिए मॉर्फोजेनेटिक कारकों के माध्यम से प्रोग्राम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, गुर्दे के ऊतकों से स्रावित बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम), स्वयं, गुर्दे के ऑर्गेनॉइड ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक मचान सामग्री के रूप में काम कर सकता है। उदाहरण के लिए, ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता का समर्थन करने के लिए डीसेल्यूलराइज्ड किडनी का उपयोग किया गया है। उन मैट्रिक्स का उपयोग ऑर्गेनॉइड के संवर्धन और प्रत्यारोपण के लिए या उन बायोमटेरियल से ऊतक-इंजीनियरिंग मचान प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

इसके अलावा, मचान चुने हुए स्थानों में कई ऑर्गेनोइड वंशावली को एक साथ एम्बेड करने का एक अप्रयुक्त अवसर प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, तागुची और निशिनाकामुरा (2017) और त्सुजिमोटो एट अल। (2020) यूबी और एनपी दोनों ऑर्गेनोइड को प्रत्यारोपित किया गया, जिससे उन्हें संवहनीकरण की अनुमति मिली [17,24]; हालाँकि, उनके पास अपने बहु-वंश ऑर्गेनोइड को उन्मुख करने के लिए एक बाह्य कोशिकीय मचान का अभाव था। मचान का उपयोग करके, हम एक मचान के केंद्र और तल में यूबी ऑर्गेनोइड को उन्मुख करके एक एकल एकत्रित संरचना के आसपास नेफ्रॉन पीढ़ी की नकल कर सकते हैं। साथ ही, हम एनपी ऑर्गेनॉइड को बाहरी भाग में बीजित कर सकते हैं (चित्र 5सी देखें)। ऑर्गेनॉइड परिपक्वता को आगे बढ़ाने के लिए समान ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण विकसित किए जा सकते हैं। फिर भी, ऑर्गेनॉइड के प्रत्यारोपण के लिए ऊतक इंजीनियरिंग-आधारित दृष्टिकोण को डिजाइन करते समय, किडनी की जरूरतों के अनुसार, बायोमटेरियल्स के कॉन्फ़िगरेशन और अनुकूलता जैसे मापदंडों को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए।

प्र. 5। निष्कर्ष

का विकासकिडनी ऑर्गेनॉइडइन विट्रो में एक बड़ी सफलता हैकिडनी रोग मॉडलिंग. किडनी ऑर्गेनोइड्सके व्यक्तिगत अध्ययन की अनुमति देंआनुवांशिक किडनी रोगऔर मानव-व्युत्पन्न प्लेटफ़ॉर्म में ड्रग स्क्रीनिंग। हालांकि वे जबरदस्त संभावनाएं रखते हैं, किडनी ऑर्गेनॉइड अपने वर्तमान स्वरूप में अपरिपक्व और अलग-थलग हैं। वास्तव में मॉडल बनाने के लिएमानव किडनीऔर संबंधित बीमारियों के लिए, हमें विकासशील गुर्दे की अंतःक्रियाओं को दोहराकर उन्हें परिपक्व करने की आवश्यकता है। विशेष रूप से, हमें इन विट्रो में यूबी और एमएम के बीच बातचीत को आगे बढ़ाने और किडनी ऑर्गेनोइड में मानव-व्युत्पन्न वास्कुलचर को पेश करने की आवश्यकता है। हमें विवो मानव भ्रूण विकास के समानांतर ग्रेडिएंट-आधारित मॉर्फोजेन दृष्टिकोण पर भी विचार करना चाहिए। किडनी ऑर्गेनॉइड वयस्कों के आनुवंशिक अध्ययन के लिए काफी संभावनाएं रखते हैंभ्रूण के गुर्दे की बीमारीऔर दवा स्क्रीनिंग। उनकी उन्नति से जीवन-रक्षा का विकास हो सकता हैगुर्दा रोगइस तरह से उपचार जो पहले से कहीं अधिक तेज़ और सटीक है।

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