इचिनाकोसाइड HBX/TREM2-मध्यस्थ NF‑κB सिग्नलिंग मार्ग को अवरुद्ध करके मानव गुर्दे की ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देता है

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यू फैन झांग, किनफैनग वू, लीमिन झोंग, डॉनग्वेई गोंग

सार।

हेपेटाइटिस बी वायरस एक्स (एचबीएक्स) प्रोटीन एचबीवी की प्रतिकृति के लिए आवश्यक है और मनुष्यों में हेपेटाइटिस की प्रगति में भूमिका निभाता है। हालांकि, एचबीवी-प्रेरित क्रोनिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस (एचबीवी-जीएन) के दौरान एचबीएक्स का अंतर्निहित कार्य अज्ञात है। (सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)(ईसीएच) सिस्टैंच जीनस का एक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड है, जिसमें मजबूत एंटीपैप्टोसिस और न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधियां होती हैं। वर्तमान अध्ययन में, HBX के कार्य और मानव वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (rTecs; HK -2 सेल लाइन) में HBX और ecH के बीच संबंध का पता लगाया गया। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस का इस्तेमाल क्रमशः एचके -2 कोशिकाओं में एचबीएक्स के एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया गया था। सेल प्रसार का विश्लेषण करने के लिए सेल काउंटिंग किट -8 परख की गई। एपोप्टोसिस की दर निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग किया गया था। एचबीएक्स ने एचके -2 कोशिकाओं में एंटीप्रोलिफेरेटिव और प्रॉपोपोटिक प्रभाव दिखाया और मायलोइड सेल 2 (ट्रेएम 2) अभिव्यक्ति पर व्यक्त ट्रिगरिंग रिसेप्टर के साथ सकारात्मक रूप से जुड़ा था। इसके अलावा, ईसीएच ने एचबीएक्स सप्रेसर के रूप में कार्य करते हुए एचके -2 कोशिकाओं में एचबीएक्स के कार्य को बाधित कर दिया। इसके अलावा, एक विशिष्ट NF‑κB अवरोधक, PdTc, का उपयोग HBX और nF-κB के बीच संबंधों की और जांच करने के लिए किया गया था। परिणामों ने सुझाव दिया कि nF-κB HBX/TreM2 सिग्नलिंग मार्ग में शामिल था और RTECS में नकारात्मक रूप से विनियमित TreM2 अभिव्यक्ति। वर्तमान अध्ययन ने एचबीएक्स के कार्य में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान की, और एचबीवी-जीएन के लिए चिकित्सीय एजेंट के रूप में ईसीएच के संभावित मूल्य का भी संकेत दिया।

परिचय

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) एक हेपडनविरिडे वायरस है, जो मनुष्यों में तीव्र और पुरानी हेपेटाइटिस की ओर जाता है (1)। एचबीवी, न केवल जिगर में लगातार या क्षणिक संक्रमण का कारण बनता है, बल्कि अग्न्याशय, पित्त नली, लिम्फोइड सिस्टम और गुर्दे (2) सहित अतिरिक्त ऊतक को भी संक्रमित करता है। इसके अलावा, एचबीवी संक्रमण क्रोनिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस (एचबीवी-जीएन) के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है; हालांकि, HBV-Gn के दौरान HBV के आणविक तंत्र को पूरी तरह से समझा नहीं गया है (3,4)।

एचबीवी रेगुलेटरी हेपेटाइटिस बी वायरस एक्स (एचबीएक्स) प्रोटीन एचबीवी प्रतिकृति (5,6) के लिए आवश्यक है। कई अध्ययनों ने बताया है कि HBX, HBV संक्रमण से जुड़े हेपेटोकार्सिनोमा (7-9) के दौरान कोशिका प्रसार को बढ़ावा देता है। मानव वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं (rTecs) वृक्क ट्यूबलर इंटरस्टिटियम का एक प्रमुख हिस्सा हैं और गुर्दे की सूजन (10) में सक्रिय भूमिका निभाती हैं। rTec एपोप्टोसिस ट्यूबलर इंटरस्टिटियम की शिथिलता के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है, जो बाद में HBV-Gn (10) की प्रगति की ओर जाता है। HBX मुख्य रूप से rTec कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और HBV-Gn (11,12) के रोगियों में rTec एपोप्टोसिस और रीनल ट्यूब घावों का कारण बनता है। इसके अलावा, HBX को चूहे rTecs (13) के प्रसार को दबाने के लिए सूचित किया गया है, और HBX overexpression प्राथमिक rTecs में G1 से S चरण तक सेल चक्र की प्रगति को तेज करता है, जिससे S चरण (14) में सेल चक्र गिरफ्तारी होती है। इसलिए, HBX अवरोधक की पहचान HBV-Gn के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय प्रदान कर सकती है। हालांकि, मानव rTecs में HBX के सटीक आणविक नेटवर्क को पूरी तरह से समझा नहीं गया है।(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)(ईसीएच) से निकाला गया एक प्राकृतिक यौगिक हैसिस्टांचेपौधे, जो एंटीपैप्टोटिक और विरोधी भड़काऊ प्रभाव दिखाते हैं (15,16)। एक पिछले अध्ययन ने बताया कि ईसीएच प्रसार को प्रेरित करता है और आंतों के उपकला कोशिकाओं (17) के एपोप्टोसिस को रोकता है। इसके अलावा, ईसीएचएच को ऑस्टियोब्लास्ट कोशिकाओं (18) के प्रसार को बढ़ाकर हड्डी पुनर्जनन में तेजी लाने के लिए सूचित किया गया है। ईसीएच एचबीवी प्रतिकृति, प्रतिजन अभिव्यक्ति और चूहे की आंतों के उपकला कोशिकाओं (16,19) में सूजन को भी कम कर सकता है। हालाँकि, rTecs पर ecH के जैविक प्रभाव को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है।

TreM2 ओवरएक्प्रेशन ने ग्लियोमा कोशिकाओं (22) के प्रसार को बढ़ावा दिया। इसके विपरीत, TreM2 नॉकडाउन अपक्षयी मानव नाभिक पल्पोसस कोशिकाओं (23) में नाभिक में nF-κB के अनुवाद को कम कर देता है। इसके अलावा, TreM2 को मानव इंटरवर्टेब्रल डिस्क डिजनरेशन (23) के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में पहचाना गया है। हालाँकि, मानव rTecs में TreM2 के जैविक कार्य की सूचना नहीं दी गई है। वर्तमान अध्ययन में, HBX overexpression (oeHBX) मानव rTecs (HK -2 सेल लाइन) में प्रेरित किया गया था और बाद में, ecH (सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड) ट्रांसफ़ेक्टेड ओएचबीएक्स कोशिकाओं पर जांच की गई। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एचबीवी-जीएन के लिए एक प्रभावी चिकित्सीय एजेंट के रूप में एचबीएक्स के कार्यों और ईसीएच के संभावित मूल्य की जांच करना था।

सामग्री तथा तरीकों

कक्ष संस्कृति।मानव rTec सेल लाइन HK-2 को शंघाई याजी बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था। HK-2 कोशिकाओं को DME/F12 मीडिया (कैट नं। SH30023.01B; Hyclone; cytiva) में संवर्धित किया गया था, जो 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (बिल्ली संख्या 16000‑044; गिब्को; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के साथ पूरक था। ।), 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (कैट। नं। पी 1400-100; बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) 37˚C पर 5 प्रतिशत CO2 के साथ।

शाही सेना एकांत तथा उल्टा प्रतिलेखन (मात्रात्मक) पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर)।निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, Trizol® (कैट नं। 1596 -026; इंविट्रोजन; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) का उपयोग करके एचके -2 कोशिकाओं से कुल आरएनए निकाला गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल (कैट नं। K1622; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के अनुसार फर्स्ट-स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट का उपयोग करके कुल आरएनए को सीडीएनए में उलट दिया गया था। qPCR को निर्माता के प्रोटोकॉल (कैट नं। K0223; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के अनुसार SYBr-ग्रीन प्रीमिक्स का उपयोग करके ABI-7300 रियल-टाइम डिटेक्टर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) पर प्रदर्शित किया गया था। पीसीआर की शर्तें थीं: 10 मिनट के लिए 95˚C और उसके बाद 15 सेकंड के लिए 95˚C के 40 चक्र, 45 सेकंड के लिए 60˚C। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए तीन दोहराव की आवश्यकता थी। qPCR के लिए निम्नलिखित प्राइमर जोड़े का उपयोग किया गया था: HBX फॉरवर्ड, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' और रिवर्स, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 फॉरवर्ड, 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' और रिवर्स, 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; और GaPdH आगे, 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' और उल्टा, 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'। 2‑ΔΔCq विधि का उपयोग करके mRNA स्तर की मात्रा निर्धारित की गई और आंतरिक संदर्भ जीन के लिए सामान्यीकृत किया गयाGAPDH (24).

अतिअभिव्यक्ति तथा मार गिराना।HBX और TreM2 के ओवरएक्प्रेशन को प्रेरित करने के लिए, पूर्ण-लंबाई वाले HBX या TreM2 सीडीएनए अनुक्रमों को दोहरे पाचन द्वारा plVX-puro वेक्टर (क्लीनटेक लेबोरेटरीज, इंक।) में डाला गया था।पिछलाiii औरइकोआरआई) इसके बाद, पुनर्संयोजित प्लास्मिड (1.5 माइक्रोग्राम) को एचके -2 कोशिकाओं (2x105) में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। नकली प्लास्मिड (एक खाली वेक्टर, 1 माइक्रोग्राम) को लिपोफ़ेक्टामाइन® 2000 (बिल्ली संख्या 11668-027, इंविट्रोजन, थर्मो का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण (ओएनसी) के रूप में एचके -2 कोशिकाओं (2x105) में क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। फिशर साइंटिफिक, इंक।) ईसीएच(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)(कैट। नं। 82854-37-3; बायोप्यूरिफाई फाइटोकेमिकल्स, लिमिटेड।) को डीएमएसओ (कैट। नंबर d2650; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीए) में 1, 2.5, 5, 10, 20 और की सांद्रता में भंग कर दिया गया था।

क्रमशः 50 मिलीग्राम / एल; और ट्रांसफ़ेक्ट OEHBX या oeTreM2 कोशिकाओं की संस्कृति में जोड़ा गया। बाद का प्रयोग 48 घंटे बाद शुरू हुआ।

TreM2 अभिव्यक्ति को कम करने के लिए, तीन छोटे हस्तक्षेप (si) RNA (siTreM 2-1, siTreM 2-2 और siTreM 2-3; 20 µM) को लक्षित करके TreM2 को संश्लेषित किया गया (शंघाई मेजरबियो बायो-फार्मा टेक्नोलॉजी सह लि।) और बाद में निर्माता के प्रोटोकॉल (इंविट्रोजन; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के अनुसार लिपोफ़ेक्टामाइन® 2000 का उपयोग करके एचके -2 कोशिकाओं (2x105) में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। एक गैर-विशिष्ट तले हुए siRNA अनुक्रम (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negative control (nc) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। TreM2 सिरना के लक्षित स्थान और क्रम तालिका Si में दिए गए हैं। बाद का प्रयोग 48 घंटे बाद किया गया।

वेस्टर्न धब्बाएचके-2 कोशिकाओं से कुल प्रोटीन निकाला गया

RIPA lysis बफर का उपयोग करना (कैट नं। BYl40825; Jrdun Biotech Co., Ltd.)। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बाइसीनोनिक एसिड परख किट (बिल्ली नं। PICPI23223; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी और 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन / लेन को 15 प्रतिशत जेल पर SDS-PaGe के माध्यम से अलग किया गया था। नमूनों की डेंसिटोमेट्री एक माइक्रोप्लेट रीडर (dnM -9602, पुलंगक्सिन) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। इसके बाद, अलग किए गए प्रोटीन को एक PVDF झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया गया। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5 प्रतिशत गैर-वसा वाले सूखे दूध के साथ अवरुद्ध होने के बाद, झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका SII) के साथ रातोंरात 4˚C पर ऊष्मायन किया गया था और द्वितीयक एंटीबॉडी एंटी-माउस आईजीजी (1: 1,) के साथ फिर से ऊष्मायन किया गया था। 000, कैट नं. a0216, बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए। एक ईसीएल सिस्टम (साइटिवा) का उपयोग करके इम्यूनोएक्टिव प्रोटीन बैंड की कल्पना की गई थी। तीन प्रतियों में धमाकों का प्रदर्शन किया गया।GAPDHऔर H3 का उपयोग क्रमशः साइटोप्लाज्मिक और परमाणु प्रोटीन के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था।

परिणाम

ईसीएच (सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)दबा कार्यक्रम का एचबीएक्स में एचके‑2 कोशिकाएं।आकलन करना

एचबीएक्स, एचबीएक्स ओवरएक्प्रेशन के कार्य को एचके -2 कोशिकाओं में प्रेरित किया गया था। एचबीएक्स के सापेक्ष एमआरएनए और प्रोटीन का स्तर ओईएचबीएक्स कोशिकाओं में ओएनईसी कोशिकाओं (छवि 1 ए और बी) की तुलना में काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। इसके बाद, OEHBX कोशिकाओं को ecH (1, 2.5, 5, 10, 20 और 50 mg/l; e1, e2.5, e5, e10, e20 और e50, क्रमशः) के विभिन्न सांद्रता के साथ सुसंस्कृत किया गया। एचबीएक्स ओवरएक्प्रेशन ने एचके -2 कोशिकाओं के प्रसार को काफी कम कर दिया, और यह कमी ईसीएच द्वारा 24 और 48 घंटे (छवि 1 सी) पर खुराक पर निर्भर तरीके से उलट गई।

इसके अलावा, ओएचबीएक्स कोशिकाओं के प्रसार दर ने ई 1-उपचारित कोशिकाओं (छवि 1 सी) की तुलना में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इसके विपरीत, e10 उपचार ने E20 और E50 उपचार की तुलना में oeHBX कोशिकाओं के प्रसार दर में काफी वृद्धि की, जिसमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (चित्र। 1c)। इसलिए, एपोप्टोसिस पर ईसीएच के प्रभाव की जांच e2.5, e5 और e 10-उपचारित कोशिकाओं में की गई। एचबीएक्स ओवर-एक्सप्रेशन ने एचके ‑2 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस में काफी वृद्धि की, और ओएचबीएक्स कोशिकाओं की एपोप्टोसिस दर एक खुराक पर निर्भर तरीके से ईसीएच उपचार के साथ कम हो गई (छवि 1 डी)। कुल मिलाकर, परिणामों ने सुझाव दिया कि ईसीएचएच ने एचके -2 कोशिकाओं में एचबीएक्स के कार्य को खुराक पर निर्भर तरीके से बाधित किया।

TREM2 अभिव्यक्ति है संकोची द्वारा ईसीएच(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड) में ट्रांसफ़ेक्ट ओएचबीएक्स

कोशिकाएं।rT-qPcr और वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग क्रमशः OEHBX कोशिकाओं में TreM2 के सापेक्ष mrna और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों की जांच करने के लिए किया गया था। ओईएन कोशिकाओं (छवि 2 ए और बी) की तुलना में ओएचबीएक्स कोशिकाओं में ट्रेएम 2 एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। हालाँकि, ecH ने खुराक पर निर्भर तरीके से ट्रांसफ़ेक्ट oeHBX कोशिकाओं में TreM2 के अभिव्यक्ति स्तर को कम कर दिया (चित्र 2a और B)। इसलिए, परिणामों ने सुझाव दिया कि HBX अभिव्यक्ति सकारात्मक रूप से TreM2 अभिव्यक्ति के साथ जुड़ी हुई थी, और आगे HK -2 कोशिकाओं में HBX पर ecH के दमनात्मक प्रभाव का संकेत दिया।

मार गिराना तथा अतिअभिव्यक्ति का TREM2 में एचके‑2 कोशिकाएं।TreM2 के कार्य का और अधिक आकलन करने के लिए, TreM2 नॉकडाउन और ओवरएक्प्रेशन को क्रमशः आरएनए हस्तक्षेप और एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करके एचके -2 कोशिकाओं में प्रेरित किया गया था। नॉक-डाउन परख के लिए, मानव जीन को लक्षित करने वाले तीन siRNAsTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 और siTreM2-3) को HK-2 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और एक गैर-विशिष्ट siRNA का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण (sinc) के रूप में किया गया था। तीनों TreM2 सिरना ने HK -2 कोशिकाओं (चित्र 3a और B) में TreM2 की अंतर्जात अभिव्यक्ति को सफलतापूर्वक खटखटाया। हालाँकि, सबसे कम सापेक्ष TreM2 mrna और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर siTreM 2-1 और siTreM 2-2- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (चित्र 3a और B) में देखे गए, इसलिए, siTreM 2-1 और siTreM {{13 }}ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को बाद के प्रयोग के लिए चुना गया था। ओवरएक्प्रेशन प्रयोगों के लिए, पूर्ण लंबाई वाले मानव TreM2cdna अनुक्रम युक्त एक प्लास्मिड का निर्माण किया गया और बाद में HK -2 कोशिकाओं (oeTreM2) में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। एक

नकली प्लास्मिड एक नकारात्मक नियंत्रण (ओएनसी) के रूप में कार्य करता है। TREM2 अभिव्यक्ति का स्तर ओईटीआरईएम 2 कोशिकाओं में ओईएनसी कोशिकाओं (छवि 3 सी और डी) की तुलना में काफी बढ़ गया था। इसलिए, बाद के प्रयोग के लिए oeTreM2 कोशिकाओं का उपयोग किया गया।

TREM2 गुप्तता कम हो जाती है apoptosis का ओएचबीएक्स कोशिकाएं।OEHBX कोशिकाओं के एपोप्टोसिस प्रोफाइल को siTREM2 या sinc के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। खुली कोशिकाओं की तुलना में OEHBX प्लस sinc कोशिकाओं की एपोप्टोसिस दर काफी अधिक थी। हालाँकि, oeHBX प्लस siTreM 2-1 या siTreM 2-2 कोशिकाओं में oeHBX प्लस sinc कोशिकाओं (चित्र। 4a) की तुलना में एपोप्टोसिस दर में काफी कमी आई थी। परिणामों ने सुझाव दिया कि TreM2 नॉकडाउन ने HK -2 सेल एपोप्टोसिस के दौरान HBX के कार्य को बाधित कर दिया।

उत्तरजीवी एक एपोप्टोसिस प्रोटीन परिवार के अवरोधक से संबंधित है, जो एपोप्टोटिक गतिविधि को रोकता है और कोशिका मृत्यु को दबाता है (25)। टारगेटिंग सर्वाइविन को रीनल सेल कार्सिनोमा (26) के उपचार के लिए एक नए दृष्टिकोण के रूप में पहचाना गया है। nF-κB भी एक एपोप्टोसिस अवरोधक है जो एंटीपैप्टोटिक ट्यूमर प्रक्रियाओं (27) में भूमिका निभाता है। इसके अलावा, caspase3 सक्रियण एपोप्टोसिस (28) के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। वर्तमान अध्ययन में, HK‑2 कोशिकाओं में TreM2, उत्तरजीवी और cleaved caspase3 की प्रोटीन सामग्री निर्धारित की गई थी। OEHBX प्लस sinc कोशिकाओं (छवि 4B) की तुलना में OEHBX प्लस siTreM 2-1 / 2 कोशिकाओं में TREM2 अभिव्यक्ति का स्तर काफी कम हो गया था। OEHBX कोशिकाओं की तुलना में oeHBX plus siTreM 2-1/2 कोशिकाओं में उत्तरजीविता अभिव्यक्ति का स्तर काफी बढ़ गया था। इसके अतिरिक्त, OEHBX प्लस sinc कोशिकाओं (छवि 4B) की तुलना में oeHBX plus siTreM 2-1/2 कोशिकाओं में cleaved caspase3 अभिव्यक्ति का स्तर काफी कम हो गया था। इसके अलावा, OEHBX ने NF‑κB के नाभिक में अनुवाद को काफी कम कर दिया, और siTREM2‑1 / 2 अभिकर्मक ने nF-κB परमाणु अनुवाद (छवि 4B) में काफी वृद्धि की। एक साथ लिया गया, परिणामों ने सुझाव दिया कि TreM2 HK -2 कोशिकाओं में HBX का डाउनस्ट्रीम कारक था, इसलिए, HBX मानव rTecs में TreM2 अभिव्यक्ति को विनियमित करके एपोप्टोसिस को बढ़ावा दे सकता है।

TREM2 अतिअभिव्यक्ति दबा अनुवादन काएनएफ‑κB प्रति नाभिक में एचके‑2 कोशिकाएं।ईसीएच . का प्रभाव(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)oeTreM पर2-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। TreM2 overexpression ने HK -2 कोशिकाओं (चित्र 5a) के एपोप्टोसिस को बढ़ावा दिया। OETREM2 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को ECH उपचार (E10; अंजीर। 5A) द्वारा काफी कम किया गया था। इसके अलावा, ECH ने oeTreM2 कोशिकाओं में TreM2 की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया। TREM2 ओवरएक्प्रेशन ने सर्वाइवर के अभिव्यक्ति स्तर को काफी कम कर दिया, हालाँकि, अभिव्यक्ति में यह कमी ecH द्वारा उलट दी गई थी। इसके अतिरिक्त, oec कोशिकाओं की तुलना में oeTreM2 कोशिकाओं में cleaved caspase3 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि हुई थी; एक प्रभाव जो ईसीएच उपचार से काफी कम हो गया था। इसके अलावा, ecH ने oTreM2 कोशिकाओं (चित्र 5B) में nF-κB के नाभिक में अनुवाद को बढ़ावा दिया। एक साथ लिया गया, परिणामों ने संकेत दिया कि ecH ने मानव rTec कोशिकाओं में TreM2 के कार्य को भी दबा दिया।

एचबीएक्स फ़ंक्शन हैं दबा दिया द्वारा एनएफ‑κB अवरोधक पीडीटीसीमें मानव आरटीईसी।के बीच संबंधों का और अधिक आकलन करने के लिए

HBX और nF-κB, HK‑2 कोशिकाओं को एक विशिष्ट nF-κB अवरोधक, PdTc (10 μmol / l; P10) के साथ सुसंस्कृत किया गया था। ओईएचबीएक्स कोशिकाओं की सेल एपोप्टोसिस दर में ओएनसी कोशिकाओं (छवि 6 ए) की तुलना में काफी वृद्धि हुई थी। हालाँकि, OEHBX प्लस PdTc कोशिकाओं ने oeHBX कोशिकाओं की तुलना में काफी बढ़ी हुई एपोप्टोसिस दर प्रदर्शित की। इसके अलावा, OEHBX कोशिकाओं (छवि 6B) की तुलना में OEHBX प्लस PdTc कोशिकाओं में TreM2 के सापेक्ष mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर में कमी आई है। इसलिए, परिणाम

ने सुझाव दिया कि nF-κB ने oeHBX-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में TreM2 अभिव्यक्ति को नकारात्मक रूप से विनियमित किया।

एनएफ‑κB अवरोधक पीडीटीसी दबा TREM2 प्रमोटर गतिविधि में ओएचबीएक्स कोशिकाएं।एक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर (pGl3-enhancer-luc2) जिसमें TreM2 (pGl3-एन्हांसर-लुक2-pTreM2) के वाइल्ड-टाइप प्रमोटर सीक्वेंस शामिल हैं, का निर्माण किया गया और बाद में इसे oec , OEHBX और ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। OEHBX प्लस P10 संवर्धित कोशिकाएं।

जंगली प्रकार के TREM2 प्रमोटर वाले रिपोर्टर वेक्टर की ल्यूसिफरेज गतिविधि को oec कोशिकाओं की तुलना में OEHBX कोशिकाओं में काफी वृद्धि हुई थी। हालाँकि, PdTc ने oeHBX कोशिकाओं (चित्र 7) में रिपोर्टर की ल्यूसिफरेज गतिविधि को काफी दबा दिया। कुल मिलाकर, परिणामों ने संकेत दिया कि PdTc ने oeHBX कोशिकाओं में TreM2 की प्रमोटर गतिविधि को दबाकर TreM2 के प्रतिलेखन को रोक दिया।

बहस

HBX मुख्य रूप से HBV-Gn वाले रोगियों के rTecs में व्यक्त किया जाता है, और वायरल रोगजनन (11,29) के निर्धारक के रूप में कार्य करता है। इसलिए, एचबीवी-जीएन के उपचार के लिए एक नया दृष्टिकोण विकसित करने में एचबीएक्स अणु नेटवर्क के कार्य का ज्ञान बढ़ाना एक महत्वपूर्ण कदम है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य HBX के कार्य की और जांच करना और मानव rTecs में इसके संभावित आणविक नेटवर्क का पता लगाना था।

HBX rTecs (11) के प्रसार को रोकता है। वर्तमान अध्ययन में, मानव RTECs में HBX के एंटीप्रोलिफरेशन और प्रो-एपोप्टोसिस कार्यों की पहचान की गई थी, यह सुझाव देते हुए कि HBX ने मानव rTecs के विकास को दबा दिया था। पिछले अध्ययन ने संकेत दिया था कि ecH(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)एचबीवी प्रतिकृति और प्रतिजन अभिव्यक्ति (19) को रोकता है। वर्तमान अध्ययन में, ईसीएच(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)उपचार ने HK-2 कोशिकाओं में HBX के कार्य को बाधित कर दिया, इसलिए, HBX, HK-2 कोशिकाओं में ecH से प्रभावित हो सकता है।

आण्विक चिकित्सा रिपोर्ट 22: 1137-1144, 2020 1143

इसके अलावा, परिणामों ने सुझाव दिया कि ecH(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)HBV-Gn के लिए संभावित चिकित्सीय एजेंट के रूप में काम कर सकता है।

TreM2 एक जन्मजात प्रतिरक्षा रिसेप्टर है जो भड़काऊ प्रतिक्रिया (30) में भूमिका निभाता है। वर्तमान अध्ययन में, HBX अभिव्यक्ति मानव RTECS में TreM2 अभिव्यक्ति के साथ सकारात्मक रूप से जुड़ी हुई थी। इसके अलावा, TREM2 नॉकडाउन ने oeHBX कोशिकाओं की एपोप्टोसिस दर और ecH . को काफी कम कर दिया(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)उपचार ने सेल एपोप्टोसिस पर oeTreM2 के प्रभाव को कम कर दिया। एक साथ लिया गया, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि TreM2 को HBX द्वारा HK -2 कोशिकाओं में लक्षित किया गया था। इसलिए, ईसीएच(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)HBX/TreM2 सिग्नलिंग मार्ग की गतिविधि को अवरुद्ध करके मानव rTecs के एपोप्टोसिस को रोक सकता है।

एक पिछली रिपोर्ट ने प्रदर्शित किया कि nF-κB, न केवल सेल एपोप्टोसिस में एक भूमिका निभाता है, बल्कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और सूजन के नियमन में भी शामिल है (31)। इसके अलावा, अल्जाइमर रोग और धब्बेदार अध: पतन (32,33) के दौरान nF-κB-संवेदनशील माइक्रोआरएनए -34 द्वारा TreM2 की मध्यस्थता की जाती है। वर्तमान अध्ययन में, PdTc की उपस्थिति में oeHBX कोशिकाओं की एपोप्टोटिक दर में काफी वृद्धि हुई थी। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, वर्तमान अध्ययन ने पहली बार सुझाव दिया कि, NF‑κB अवरोध करनेवाला PdTc ने TreM2 की प्रमोटर गतिविधि को दबा दिया। इसके अलावा, परिणामों ने सुझाव दिया कि TreM2 ने HK -2 कोशिकाओं में nF-κB के नाभिक में अनुवाद को नकारात्मक रूप से विनियमित किया, लेकिन सकारात्मक रूप से cleaved caspase3 अभिव्यक्ति स्तरों के साथ जुड़ा हुआ था। TreM2 ने HK -2 कोशिकाओं में मानव अपक्षयी न्यूक्लियस पल्पोसस और ग्लियोमा कोशिकाओं (22,23) में अपनी भूमिका के विपरीत भूमिका निभाई। इसलिए, वर्तमान अध्ययन ने सुझाव दिया कि विभिन्न प्रकार की मानव कोशिकाओं में TreM2 के अलग-अलग कार्य हो सकते हैं।

एक साथ लिया गया, वर्तमान अध्ययन ने न केवल यह संकेत दिया कि nF-κB HBX / TreM2 सिग्नलिंग मार्ग का एक उपन्यास घटक था, बल्कि यह भी सुझाव दिया कि nF-κB मानव rTecs में TreM2 अभिव्यक्ति को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है। हालाँकि, वर्तमान अध्ययन की प्रमुख सीमाएँ की कमी थींमें विवोप्रयोग और नैदानिक ​​डेटा। इसलिए, आगेमें विवोऔर नैदानिक ​​अध्ययन वर्तमान अध्ययन के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं।

वर्तमान अध्ययन में, ecH . का कार्य(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)जांच की गई और परिणामों ने ecH . के संभावित प्रभावों का सुझाव दिया(सिस्टैंच से इचिनाकोसाइड)मानव rTecs में सिग्नलिंग मार्ग पर। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन ने मानव rTec कोशिकाओं में ecH के जैविक कार्य के मौजूदा ज्ञान को बढ़ाया और HBV-Gn के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय एजेंट के रूप में इसकी क्षमता का भी सुझाव दिया।

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