स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन-निकोटिनामाइड-प्रेरित मधुमेह चूहों में पुरुष प्रजनन कार्य पर सिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क का प्रभाव

कीवर्ड:मधुमेह; बांझपन;सिस्टैंच ट्यूबुलोसानिचोड़(सीटीई);इचिनाकोसाइड(ईसीएच);सूजनरोधीगतिविधि;एंटीऑक्सिडेंटगतिविधि;Steroidogenesisप्रभाव

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1 परिचय

मधुमेह मेलिटस (डीएम) एक ऐसी स्थिति है जिसमें रक्त में ग्लूकोज का स्तर बढ़ जाता हैपर्याप्त इंसुलिन का उत्पादन करने में अग्न्याशय की अक्षमता, या इसका उपयोग करने के लिए शरीर की अक्षमता के लिएप्रभावी रूप से। डब्ल्यूएचओ के अनुसार, मधुमेह से पीड़ित लोगों की संख्या 1980 में 108 मिलियन से बढ़ी2014 में 422 मिलियन [1]. चार मुख्य श्रेणियां हैं: प्री-डायबिटीज (मधुमेह से पहले का एक चरण), टाइप 1(जहां अग्न्याशय इंसुलिन का उत्पादन करने में विफल रहता है), टाइप 2 (शरीर इंसुलिन का उपयोग करने में विफल रहता है), और गर्भकालीनमधुमेह (जो गर्भावस्था के दौरान होता है)। ऑक्सीडेटिव तनाव किसके बीच असंतुलन के कारण होता है?प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और एंटीऑक्सिडेंट का उत्पादन [2] अंत में मधुमेह की स्थिति की ओर जाता है।मधुमेह की जटिलताओं में गुर्दे की विफलता, तंत्रिका क्षति, अंधापन, स्ट्रोक, हृदय शामिल हैंहमले, भ्रूण की मृत्यु, और बांझपन। [1]. अध्ययनों से पता चलता है कि शुक्राणु नाभिक, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए),और माइटोकॉन्ड्रिया पुरुष मधुमेह रोगियों में महत्वपूर्ण रूप से क्षतिग्रस्त हो गए थे [3]. के दौरान ऑक्सीडेटिव तनावशुक्राणु का परिवहन पुरुष प्रजनन प्रणाली की प्रक्रिया को बदल देगा [4,5]. 

शुक्राणुजनन की प्रक्रिया हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-गोनाडल (एचपीजी) द्वारा नियंत्रित होती है।एक्सिस। हाइपोथैलेमस द्वारा निर्मित गोनैडोट्रोपिन-रिलीज़िंग हार्मोन (GnRH) को उत्तेजित करता हैल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और कूप-उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) का उत्पादन। लेडिग कोशिकाएँ पाई जाती हैंसेमिनिफेरस ट्यूब्यूल से सटे और एलएच के नियंत्रण में टेस्टोस्टेरोन का उत्पादन करते हैं। एफएसएच ट्रिगरएंटीजन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) का उत्पादन जो पुरुष हार्मोन को पारित करने में मदद करता है। इस प्रकार, बांझपनऔर अन्य समस्याएं मुख्य रूप से एचपीजी अक्ष में होने वाली गड़बड़ी के कारण उत्पन्न होती हैं। प्रशासन कीस्ट्रेप्टोज़ोटोकिन-निकोटिनामाइड का संयोजन प्रायोगिक चूहों में मधुमेह को प्रेरित करता है। स्ट्रेप्टोजोटोसीनइंसुलिन-उत्पादक के लिए एक रासायनिक यौगिक विषाक्त है अग्न्याशय और निकोटिनामाइड में कोशिकाएं होती हैं aपानी में घुलनशील विटामिन की रक्षा करता है पूर्ण क्षति से कोशिकाओं [6]. सिस्टैंच ट्यूबुलोसाएक रेगिस्तानी पौधे की प्रजाति है जिसे "रौ कांग-रोंग" के नाम से भी जाना जाता है [7]. यह है एकगैर-क्लोरोफिलिक परजीवी पौधा जो मुख्य रूप से किसकी जड़ पर उगता है?कैलोट्रोपिस प्रोसेरापेड़ और isगांसु, किंघई, झिंजियांग, मंगोलिया, ईरान और भारत की शुष्क भूमि में व्यापक रूप से वितरित। सामान्यके नामसिस्टैंच ट्यूबुलोसा"रेगिस्तान जलकुंभी" है। यह चीनी पारंपरिक चिकित्सा में व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता हैऔर इसे "रेगिस्तान का जिनसेंग" नाम दिया गया है। यह व्यापक रूप से औषधीय क्षेत्र में प्रयोग किया जाता हैरुग्ण प्रदर, विपुल मेट्रोरहागिया, पुरानी गुर्दे की बीमारियों, कब्ज, नपुंसकता, औरबांझपन। के रासायनिक घटकसिस्टैंच ट्यूबुलोसागैर-वाष्पशील फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स से मिलकर बनता है(पीएचजी), इरिडोइड्स, लिग्नांस, वाष्पशील तेल, एल्डीटोल्स, ओलिगोसेकेराइड्स और पॉलीसेकेराइड्स [8]. में पढ़ता हैदिखाएँ कि इस जड़ी बूटी से इचिनाकोसाइड आरओएस स्तरों को विनियमित करके क्षतिग्रस्त फाइब्रोब्लास्ट की रक्षा करता है [9]. यह यौगिक एंटीऑक्सीडेंट, वासोरेलेक्सेशन, और एंटी-इन्फ्लैमरेटरी गतिविधियों को एक साथ पैदा करता हैन्यूरोप्रोटेक्शन और ऑस्टियोपोरोसिस की रोकथाम [10,11]. इस अध्ययन का उद्देश्य के प्रभाव की जांच करना थासिस्टैंच ट्यूबुलोसानिचोड़पर ईसीएच युक्तस्ट्रेप्टोज़ोटोकिन-निकोटिनामाइड-प्रेरित मधुमेह चूहे की प्रजनन संबंधी शिथिलता।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. सामग्री

ECH और CTE को Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (यिलन, ताइवान) से खरीदा गया था। विकसितग्लाइकेशन एंडप्रोडक्ट्स (एजीई) बायोविज़न (सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। एलसी-540और TM3 सेल लाइनों को खाद्य उद्योग अनुसंधान और विकास संस्थान से खरीदा गया था(सिंचु, ताइवान)। पांच सप्ताह पुराने Sprague-Dawley (SD) नर चूहों को से खरीदा गया थाराष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (ताइपेई, ताइवान)। फ़ीड लैब आहार® PMI . से खरीदा गया थान्यूट्रिशन इंटरनेशनल, इंक. (ताइपेई, ताइवान)। 2,2-डाइफिनाइल-1-पिक्रिलहाइड्राज़िल (DPPH) प्राप्त किया गया थासिग्मा (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से। मेथनॉल और 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपरज़ीनेथेनेसल्फ़ोनिकएसिड (HEPES) भी सिग्मा से खरीदा गया था। Dulbecco का संशोधित ईगल माध्यम/F12 औरट्रिप्सिन-ईडीटीए GIBCO (न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल)-2,5-डाइफेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी), डाइक्लोरो-डायहाइड्रो-फ्लफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए), डाइमिथाइलसल्फोऑक्साइड (DMSO), और नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (NBT) सिग्मा से खरीदे गए थे। ग्लूकोज एंजाइमेटिककिट क्योकुटोसियाकु, टोक्यो, जापान से प्राप्त की गई थी। इंसुलिन एलिसा किट खरीदे गएMercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (उप्साला, स्वीडन) से। टी-प्रति ऊतक प्रोटीन निष्कर्षणअभिकर्मक थर्मो साइंटिफिक (शिकागो, आईएल, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। मानव विरोधी/माउस/चूहा परमाणुफ़ैक्टर-कप्पा बी एनएफ-κबी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी सांताक्रूज बायोटेक्नोलॉजी, सांता से खरीदे गए थेक्रूज़, सीए, यूएसए। उन्नत ग्लाइकेशन एंडप्रोडक्ट्स (रेज) पॉलीक्लोनल के लिए एंटी-माउस / रैट रिसेप्टरएंटीबॉडी, मानव-विरोधी/माउस/चूहा स्टार पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी, और मानव-विरोधी/माउस/चूहासाइटोक्रोम पी 450 17A1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जीन टेक्स (इरविन, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे।सेल सिग्नलिंग से मानव-विरोधी / माउस / चूहा CYP11A1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी प्राप्त किए गए थेप्रौद्योगिकी (बेवर्ली, पीए, यूएसए)। आसान-नीला अभिकर्मक इंविट्रोजन, थर्मो फिशर . से खरीदा गया थावैज्ञानिक (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए)। Agarose और DNA मार्कर 100 bp Promega से प्राप्त किए गए थे,निगम (मैडिसन, WI, यूएसए)। RNeasy Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN से खरीदा गया था,हिल्डेन, जर्मनी।

एक 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर (सीओ .)2 इनक्यूबेटर, नैप्को 5410, ताइवान)। TM3 सेल लाइन Dulbecco's . में सुसंस्कृत की गई थीसंशोधित ईगल माध्यम (DMEM) ग्लूकोज के साथ पूरक (4.5 g/L), सोडियम पाइरूवेट (0.5 mM),L-ग्लूटामाइन (2.5 एमएम), सोडियम बाइकार्बोनेट (1.2 ग्राम/ली), 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपरज़ीनेथेनेसल्फ़ोनिकएसिड (HEPES, 15 mM), और भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS, 10 प्रतिशत) या हॉर्स सीरम (5 प्रतिशत) 37 पर◦सी 5 प्रतिशत . मेंसीओ2 इनक्यूबेटर

इचिनाकोसाइड (ईसीएच) की सेल व्यवहार्यता का निर्धारण: 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-सेल व्यवहार्यता परख के लिए डिपेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) अभिकर्मक का उपयोग किया गया था। कोशिका सांद्रता2 . में समायोजित किया गया था× 105एक 96-वेल प्लेट में सेल / एमएल। फिर, 20µईसीएच का एल (मध्यम के 2 प्रतिशत में पतला)37 . पर 24 घंटे के लिए जोड़ा और ऊष्मायन किया गया था◦C 5 प्रतिशत CO . में2 इनक्यूबेटर बाद में, 100µएमटीटी अभिकर्मक का एल था37 . पर 4 घंटे के लिए जोड़ा और ऊष्मायन किया गया◦सी अंधेरी परिस्थितियों में। अवशोषण 570 एनएम . पर मापा गया था(एलिसा रीडर, डायनाटेक MR5000, क्लोटेन, स्विट्जरलैंड)।सापेक्ष सेल व्यवहार्यता (प्रतिशत)=[(ए570 एनएम . पर नमूना− A570 एनएम . पर खाली)]/[(A570 . पर नियंत्रण− A570 . पर खाली)] × 100.

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) सामग्री विश्लेषण:

सेल नंबर को समायोजित किया गया था2 × 105कोशिकाओं/एमएलएक 12-वेल प्लेट में 2 प्रतिशत FBS युक्त। फिर, 50µECH, RES, और AGEs का एल/एमएलप्लेट में जोड़ा गया और 37 . पर इनक्यूबेट किया गया◦24 घंटे के लिए सी। 24 घंटे के बाद, 20 ,70 -डाइक्लोरोफ्लोरेसिन-डायसेटेट(DCFH-DA) जोड़ा गया और 37 . पर ऊष्मायन किया गया◦सी 30 मिनट के लिए। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद (400 .)× g, 5 मिनट),

और AGE को जोड़ा गया और 37 . पर इनक्यूबेट किया गया◦C 5 प्रतिशत CO . में2 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर। के बाद, 400µटी-पेरो का एलजोड़े गए, कोशिकाओं को स्क्रैप किया गया, और 125 पर सेंट्रीफ्यूज किया गया,000× g 20 मिनट के लिए (4 .)◦सी)। सतह पर तैरनेवालापर एकत्र और संग्रहीत किया गया था−80 ◦C (−80 ◦सी फ्रीजर, नुएरे, प्लायमाउथ, एमएन, यूएसए) आगे के विश्लेषण के लिए।

प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए बाइसीनोनिक एसिड (बीसीए) किट का इस्तेमाल किया गया था। फिर, 10µमानक सेल समाधान का एलऔर 200µBCA अभिकर्मक के L को 8-वेल प्लेट्स में जोड़ा गया और 37 . पर इनक्यूबेट किया गया◦C 5 प्रतिशत CO . में2 अण्डे सेने की मशीन30 मिनट के लिए। अवशोषण 562 एनएम मापा गया था। प्रोटीन पहचान विश्लेषण किया गया थासोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) -पॉलीएक्रिलामाइड जेल (एसडीएस-पेज) वैद्युतकणसंचलन द्वारा। नमूने थेप्रोटीन लोडिंग बफर में प्रोटीन लाइसेट जोड़कर तैयार किया गया और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गयाविशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए।

2.2.2. विवो विश्लेषण में

पशु मॉडल डिजाइन: साठ 4-सप्ताह के नर स्प्राग-डावले (एसडी) चूहों को खरीदा गया थाराष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (ताइपेई, ताइवान)। प्रत्येक चूहे को व्यक्तिगत रूप से कीटाणुनाशक में रखा गया थानियंत्रित तापमान के तहत स्टेनलेस स्टील के पिंजरे (23 .)± 1 ◦सी) और आर्द्रता (40-60 प्रतिशत) 12 घंटे के साथप्रकाश/12 घंटे अंधेरा चक्र। इबिटम में भोजन और पानी मुहैया कराया गया। प्रत्येक चूहे को पहले पालतू बनाया गया थासप्ताह और प्रयोगशाला कृंतक आहार 5001 को मुख्य आहार के रूप में दिया। सभी प्रक्रियाओं ने मानक का पालन कियाराष्ट्रीय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी अनुमोदन संख्या 101026) कीताइवान महासागर विश्वविद्यालय, ताइवान। पालतू बनाने के बाद, चूहों को दो समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रणसमूह (कॉन) जिसे प्रयोगशाला आहार 5001 से खिलाया गया था, और मधुमेह समूह जिसे उच्च वसा वाले आहार से खिलाया गया था(एचएफडी, 40 प्रतिशत) पूरे प्रयोग के लिए। 4 सप्ताह के लिए एचएफडी के साथ खिलाए जाने के बाद, मधुमेह समूहमधुमेह मेलेटस (डीएम) को प्रेरित करने के लिए चूहों को स्ट्रेप्टोजोटोकिन (65 मिलीग्राम / किग्रा) (एसटीजेड) के साथ इंजेक्शन लगाया गया था। अंदरएसटीजेड इंजेक्शन लगाने के 15 मिनट, निकोटिनमाइड (230 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) को इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन के एक हफ्ते बाद,मधुमेह के सफल प्रेरण को निर्धारित करने के लिए एक मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (ओजीटीटी) आयोजित किया गया थामेलिटस (डीएम)। उसके बाद, जानवरों को छह समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रण (प्रयोगशाला आहार के साथ खिलाया गया .)5001); डीएम समूह (डीएम प्लस 45 प्रतिशत एचएफडी); डीएमआर समूह (डीएम प्लस रोसिग्लिटाज़ोन: 0.571 मिलीग्राम/किलोग्राम बीडब्ल्यू) प्लस 45 प्रतिशत एचएफडी;DME1 समूह (DM प्लस CTE: 80 mg/kg BW) प्लस 45 प्रतिशत HFD; DME2 समूह (DM प्लस CTE: 160 mg/kg BW)साथ ही 45 प्रतिशत एचएफडी; और DME4 ग्रुप (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) प्लस 45 प्रतिशत HFD। रोसिग्लिटाज़ोन (आरएसजी) थासकारात्मक नियंत्रण के रूप में लिया गया। सीटीई की तीन खुराक (80, 160, और 320 मिलीग्राम/किग्रा) का उपयोग के अनुसार किया गया थाताइवान खाद्य एवं औषधि प्रशासन (टीएफडीए) स्वास्थ्य खाद्य कार्यात्मक की सिफारिशमूल्यांकन दिशानिर्देश। प्रयोग के अंत तक उपचार दिया गया। सभी प्रायोगिक चूहे6 सप्ताह के बाद बलि दी गई। चूहों से लिया गया रक्त 3000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया15 मिनट 4◦सी. निम्नलिखित विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला की जांच की गई:कुल ग्लूकोज, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल

दृढ़ निश्चय:

ग्लूकोज निर्धारण थाग्लूकोज एंजाइमेटिक किट द्वारा किया जाता है। फिर, 20µएल रक्त प्लाज्मा के नमूनों को जोड़ा गयाअभिकर्मकों और 37 . पर रखा गया◦5 मिनट के लिए सी. कुल ट्राइग्लिसराइड्स और कुल कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता थेट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल एंजाइमेटिक किट का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। फिर, 10µएल रक्त प्लाज्मा थेअभिकर्मकों में जोड़ा गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रयोग किया गया।अवशोषण 510 एनएम मापा गया था।प्लाज्मा कुल ग्लूकोज/ट्राइग्लिसराइड/कोलेस्ट्रॉल (मिलीग्राम/डीएल)=(ए .)नमूना− Aखाली)/(Aमानक− Aखाली) × 200. एक नमूना: रक्त के नमूनों का अवशोषण, Aखाली: नमूने के बिना किट का अवशोषण मूल्य, मानक: मानक अभिकर्मक का अवशोषण मूल्य, 200: मानक अभिकर्मकों की एकाग्रता पर200 मिलीग्राम / डीएल।इंसुलिन, लेप्टिन, और होमोस्टैटिक मॉडल आकलन-इंसुलिन प्रतिरोध (HOMA-IR) निर्धारण:इंसुलिन का स्तर इंसुलिन एलिसा किट द्वारा निर्धारित किया गया था। यहां, 25µरक्त प्लाज्मा के एल जोड़े गए थेअभिकर्मकों और अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया था। कुल लेप्टिन सामग्री का उपयोग करके निर्धारित किया गया थालेप्टिन एंजाइम इम्यूनोमेट्रिक परख किट। फिर, 100µप्लाज्मा के एल का विश्लेषण किया गया और अवशोषणएलिसा रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर मापा गया था। पूरे प्रयोग के अनुसार आयोजित किया गया थानिर्माता के निर्देश। HOMA-IR मान होमोस्टैसिस मॉडल से निर्धारित किया गया थाआकलन समीकरण=उपवास प्लाज्मा इंसुलिन एकाग्रता (एमयू/एमएल)× उपवास प्लाजमा ग्लोकोजसांद्रता (mmol/L)/22.5.प्लाज्मा लिपिड पेरोक्सीडेशन: यहां, 0.5 एमएल रक्त प्लाज्मा को 1 एमएल अभिकर्मक (15 प्रतिशत,w/v ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड {{0}}.25 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) और 0.375 प्रतिशत में,w/v थायोबार्बिट्यूरिक एसिड0.25 एन एचसीएल) और पानी के स्नान (वाटर बाथ, बुची 461, ज्यूरिख, स्विटजरलैंड) में 100 बजे रखा गया◦सी के लिए15 मिनट। ठंडा करने के बाद, 1 mL n-butanol मिलाया गया, सख्ती से हिलाया गया, और 1500 . पर सेंट्रीफ्यूज किया गया× g 10 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और अवशोषण को 532 एनएम पर मापा गया था [12]. Malondialdehyde (MDA) सांद्रता (nM/mL)=[(एक नमूना532 एनएम . पर− A532 एनएम . पर खाली)/ (मानक532 एनएम . पर− A532 एनएम . पर खाली)] × 5. प्लाज्मा टेस्टोस्टेरोन और ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) स्तरों का निर्धारण: टेस्टोस्टेरोनरक्त प्लाज्मा में टेस्टोस्टेरोन के स्तर को मापने के लिए एलिसा किट का उपयोग किया गया था। आरआईए किट का इस्तेमाल किया गया थाएलएच एकाग्रता का निर्धारण। फिर, 50µप्लाज्मा के एल जोड़े गए और गणना आधारित थीहार्मोन एलएच-आरपी-3 (मानक) की एकाग्रता पर। आगे के कदमों के अनुसार आयोजित किया गयानिर्माता के निर्देशों के लिए।ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF) का निर्धारण - और इंटरल्यूकिन-6 (IL-6) एकाग्रता:कैप्चर किए गए एंटीबॉडी को कोटिंग बफर में 250 बार पतला किया गया, एक 96-वेल प्लेट (100 .) में जोड़ा गयाµएल/वेल),और 4 . पर रखा◦सी रात भर के लिए। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण था और धुलाई से पंद्रह बार धोया गयाबफर (1 बार पीबीएस, 0.05 प्रतिशत 20 के बीच)। 200 . के साथ ऊष्मायन (1 घंटे) के बादµपरख मंदक के जी, कोशिकाओं थेधुलाई बफर के साथ 5 बार धोया और 100µटीएनएफ का एल- मानक समाधान या परीक्षण नमूने थेप्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। धोने के बाद, 100µआईएल में से एल-6 का पता चला एंटीबॉडी जोड़े गए थेऔर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण था और 5 बार धोया गया था। फिर,480 µएंजाइम एविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) का एल जोड़ा गया और कमरे में 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गयातापमान। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण था और धुलाई बफर के साथ पांच बार धोया गया था। फिर, 100µL सब्सट्रेट समाधान जोड़ा गया और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। बाद में, 50µस्टॉप का एलप्रत्येक कुएं में घोल (1M फॉस्फोरिक एसिड) मिलाया गया और अवशोषण को 450 एनएम मापा गया।शुक्राणु और वृषण पैरामीटर्स का विश्लेषणशुक्राणु नमूना संग्रह: शुक्राणु नमूना संग्रह के अनुसार किया गया थापूर्व में रिपोर्ट की गई विधि [13]. शुक्राणु को सतह पर तैरनेवाला से एकत्र किया गया और इसके लिए इस्तेमाल किया गयाआगे के विश्लेषण।शुक्राणु की संख्या, शुक्राणु की गतिशीलता और असामान्य शुक्राणु: शुक्राणुओं की संख्या थीहेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन का उपयोग करके गणना की जाती है। फिर, 100µएल शुक्राणु तरल थेट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन के साथ मिश्रित और शुक्राणु, गतिशीलता और असामान्य शुक्राणुओं की संख्या थीएक हेमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गणना की गई [14]. नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम एनबीटी रिडक्शन एंड लिपिड पेरोक्सीडेशन ऑफ स्पर्म एंड टेस्टिस: द लिपिडप्लाज्मा विश्लेषण की एक ही प्रक्रिया के अनुसार पेरोक्सीडेशन और एनबीटी कमी का विश्लेषण किया गया।

सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) और कैटालेज गतिविधि का निर्धारण: सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज(एसओडी) गतिविधि का विश्लेषण रैनसेल किट का उपयोग करके किया गया था। यहां, 0.05 एमएल टेस्टिकुलर होमोजेनेट्स1.7 एमएल प्रतिक्रिया समाधान (0। 0 5 मिमी xanthine, 0.025 मिमी 2- (4-आयोडोफिनाइल) में जोड़ा गया था -{{0}}(4-नाइट्रोफेनॉल)-5-फेनिलटेट्राजोलियम क्लोराइड (INT))। मिश्रण के बाद, 0.25 एमएल xanthine ऑक्सीडेज (80 यू/एल)जोड़ा गया था और कमरे के तापमान पर कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए प्रतिक्रिया की गई थी। अवशोषण था505 एनएम पर मापा गया। वृषण समरूप की प्रोटीन सांद्रता द्वारा निर्धारित की गई थीबायो-रेड डीसी प्रोटीन परख किट और इसकी विशिष्ट गतिविधि (यू/मिलीग्राम प्रोटीन) की गणना की गई। उत्प्रेरित(कैट) गतिविधि पहले बताई गई विधि अनुसार निर्धारित की गई थी [15]. एच एंड ई (हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन) धुंधला हो जानावृषण को 10 प्रतिशत फॉर्मेलिन में 24 घंटे के लिए भिगोया गया और 4 . पर संग्रहीत किया गया◦C. ऊतकों को टुकड़ों में काट दियासूक्ष्म आकार और स्लाइड से जुड़ा हुआ है। निर्धारण के बाद (95 प्रतिशत मेथनॉल प्लस 5 प्रतिशत एसिटिक एसिड), स्लाइड थेहेमेटोक्सिलिन में 3 मिनट के लिए डुबोएं, 5 मिनट के लिए बहते पानी से धो लें, और फिर उन्हें भिगो देंएक मिनट के लिए 50 प्रतिशत, 70 प्रतिशत और 90 प्रतिशत शराब। उसके बाद, स्लाइड्स को 10 एस और . के लिए ईओसिन के साथ दाग दिया गयाएक मिनट के लिए 100 प्रतिशत अल्कोहल में भिगो दें जब तक कि यह फीका न हो जाए। अंत में, स्लाइड को xylene में एक के लिए भिगोया गया थामिनट। बाद में, स्लाइड को हवा में सुखाया गया और सील कर दिया गया। सना हुआ ट्यूब एक उल्टे चरण-विपरीत में रखा गया थामाइक्रोस्कोप (उल्टे चरण अंतर माइक्रोस्कोप, ओलिंप सीके-2, टोक्यो, जापान) का निरीक्षण करने के लिएआकृति विज्ञान।हाइपोथैलेमस का विश्लेषणमाउस KISS1, G-प्रोटीन युग्मित ग्राही (जीपीआर) 54, साइटोकाइन सिग्नलिंग 3 का शमन (SOCS-3)और सिर्टुइन 1 (एसआईआरटी 1)एनसीबीआई (नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी .) से जीन अनुक्रमों की पहचान की गई थीसूचना) जीन डेटाबेस और एक विशिष्ट प्राइमर को प्राइमर 5 का उपयोग करके डिजाइन किया गया था।0 प्रीमियर बायोसॉफ्ट,पालो ऑल्टो, सीए, यूएसए।) प्रयोग में प्रयुक्त प्राइमर तालिका में सूचीबद्ध हैं:1.

हाइपोथैलेमस से राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए) का निष्कर्षण। से आरएनए का निष्कर्षणमस्तिष्क के हाइपोथैलेमस को RNeasy Lipid Tissue Mini Kit का उपयोग करके किया गया था। प्राप्तmRNAs को मात्रात्मक रूप से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT) और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा मापा जाता था(पीसीआर)। आरटी विश्लेषण से प्राप्त कॉम्प्लिमेंट डीएनए को पर संग्रहीत किया गया था−20 ◦सी बाद में उपयोग के लिए।निकाले गए डीएनए को टैक पोलीमरेज़ का उपयोग करके पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण के अधीन किया गया था।फिर, 5~10µपीसीआर उत्पाद के एल को 1.5 प्रतिशत agar . पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा लिया और विश्लेषण किया गया थाकोलाइड छवि यूवीपी बायोडॉक-इट इमेजिंग सिस्टम में ली गई थी। रिवर्स-ट्रांसक्रिप्टेड पूरकडीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए) लिया गया और आईक्यू एसवाईबीआर ग्रीन सुपरमिक्स का उपयोग करके पीसीआर का प्रदर्शन किया गया।किट। बाद में, इसका विश्लेषण iQTM 5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर के साथ किया गया। का उपयोग करके प्रोटीन निकाले गएप्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक (टी-प्रति)। फिर, 20 मिलीग्राम वृषण समरूप को 400 . में जोड़ा गयाµL टी-पीईआर और सेंट्रीफ्यूज्ड (हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूज, हेटिच सीआर-12, टटलिंगेन, जर्मनी) 4 बजे◦C (125,000× g) 20 मिनट के लिए। निम्नलिखित विधि "पहचान और परिमाणीकरण" के समान थीप्रोटीन का विश्लेषण" इन विट्रो विश्लेषण में।2.3. सांख्यिकीय विश्लेषणप्रयोगात्मक परिणाम माध्य के रूप में व्यक्त किए गए थे± मानक विचलन (माध्य)± एसडी) औरसांख्यिकीय उत्पाद और सेवा समाधान (SPSS) 11.0 सॉफ्टवेयर, IBM, Armonk, का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया।न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया थाविचरण (एनोवा)। डंकन के परीक्षण द्वारा विभिन्न समूहों की कई तुलनाओं का विश्लेषण किया गयाका मूल्यp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3। परिणाम

3.1. इन विट्रो विश्लेषण

3.1.1. ECH, CTE और RES की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों की तुलना

लंबे समय तक उच्च ऑक्सीडेटिव तनाव और पुरानी सूजन मधुमेह के मुख्य कारण हैंजटिलताएं [16]. सीटीई में विभिन्न फेनिलएथेनॉयड ग्लाइकोसाइड होते हैं जैसे इचिनाकोसाइड(ईसीएच) और एक्टोसाइड, एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि की क्षमता के साथ [17]. डीपीपीएच कट्टरपंथी सफाईECH की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि के मूल्यांकन के लिए परख की गई। ट्रोलॉक्स और रेस्वेराट्रोल(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) को क्रमशः मानक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लिया गया। के रूप में दिखायाआकृति में1, ईसीएच ने बेहतर कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि दिखाई और गतिविधि काफी अधिक थीसकारात्मक नियंत्रण (आरईएस) की तुलना में।

3.1.2. LC-540 और TM3 लेडिग सेल पर ECH की सेल व्यवहार्यताECH की विभिन्न सांद्रता की सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए MTT परख की गई।एलसी-540 लेडिग कोशिकाओं और टीएम3 लेडिग कोशिकाओं ने इलाज के बाद 80 प्रतिशत से अधिक व्यवहार्यता दिखाईईसीएच (चित्र2) अन्य सांद्रता की तुलना में, एक 100-µएम एकाग्रता (100 . के कमजोर पड़ने)µM ईसीएच के 2 प्रतिशत एफबीएस में) ने टीएम3 लेडिग कोशिकाओं में बेहतर सेल व्यवहार्यता दिखाई। परिणाम ने संकेत दिया किईसीएच की बढ़ी हुई सांद्रता कोशिकाओं को कोई महत्वपूर्ण विषाक्तता योगदान नहीं देती है।

3.1.3. LC-540 और TM3 में NBT परख द्वारा AGE-प्रेरित सुपरऑक्साइड उत्पादन पर ECH का प्रभावलेडिग सेल

AGEs ग्लूकोज के ऑक्सीकरण और के गठन के कारण शरीर में ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनते हैंमुक्त कण जैसे O2-, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल और कार्बोनिल समूह [18]. से प्रेरित होने के बाद50 µAGEs का g/mL, LC-540 (चित्र3a) और TM3 (चित्र3बी) कोशिकाओं का इलाज ईसीएच और आरईएस . के साथ किया गया था(5 µएम और 10µएम प्रत्येक)। परिणामों से पता चला कि सुपरऑक्साइड आयनों का उत्पादन बढ़ गया थानियंत्रण समूह (उत्तेजित AGEs) में, लेकिन सुपरऑक्साइड आयनों का उत्पादन कम हो गया थाईसीएच और आरईएस के साथ उपचार। चित्र से3, यह समझा गया कि ईसीएच और आरईएस स्तर को कम करते हैंसुपरऑक्साइड का उत्पादन और कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाता है। एलसी-540 सेल के मामले में,10 µएम ईसीएच ने सामान्य समूह के साथ लगभग समान गतिविधि दिखाई। दोनों में सुपरऑक्साइड का उत्पादनईसीएच और आरईएस दोनों की एकाग्रता में वृद्धि के साथ कोशिकाओं में कमी आई थी।3.1.4. H . पर ECH का प्रभाव2O2 एजीई-उत्तेजित एलसी में उत्पादन-540 लेडिग सेलडीसीएफएच-डीए परख को ऑक्सीडेटिव प्रजातियों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए निष्पादित किया गया था। में प्रवेश करने के बादकोशिकाओं, FL फ्लोरोसेंट डाई DCFH-DA को इंट्रासेल्युलर H . द्वारा ऑक्सीकृत किया जाता है2O2 और डाइक्लोरोफ्लोरेसिन बनाता है(डीसीएफ)। जैसा कि आकृति में दिखाया गया है4, इंट्रासेल्युलर एच . में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी2O2 में उत्पादनआयु-उत्तेजित समूह (नियंत्रण) जबकि 10 . का जोड़µएम ईसीएच और आरईएस काफी कम हो गएहू2O2 कोशिकाओं में उत्पादन। 10 . का प्रशासनµM ECH का परिणाम H . का केवल लगभग 47.1 प्रतिशत था2O2 उत्पादन, नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम है।

3.1.5. क्रोध और एनएफ पर ईसीएच का प्रभाव-κB AGE-उत्तेजित LC में प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर-540लेडिग सेल

एलसी में रेज की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया था-540 लेडिगकोशिकाएं। क्रोध पर ईसीएच का प्रभाव (चित्र .)5ए) और एनएफ-κबी (चित्र5बी) प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तरएजीई-उत्तेजित लेडिग कोशिकाओं में चित्र . में दिखाया गया था5. परिणामों से पता चला कि, 50µजी/एमएलएजीई की एकाग्रता ने उच्च क्रोध और एनएफ- प्रेरित कियाκLC में B व्यंजक-540 लेडिग सेल और10 µईसीएच और आरईएस की एम एकाग्रता ने रेज और एनएफ की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया है-κB. एनएफ की अभिव्यक्ति-κबी आरईएस और ईसीएच में रेज प्रतिपक्षी की तुलना में काफी कम था। तो, परिणामपुष्टि की कि ईसीएच ने रेज और एनएफ के स्तर को कम करके सूजन के स्तर को कम कर दिया है-κB.

.1.6. एजीई-उत्तेजित एलसी -540 लेडिग कोशिकाओं में टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण मार्ग पर ईसीएच का प्रभाव।

शुक्राणुजनन और पुरुष बांझपन की प्रक्रिया टेस्टोस्टेरोन की उपस्थिति पर निर्भर करती है।जैसा कि आकृति में दिखाया गया है6, स्टार के भाव (चित्र6a), CYP11A1 (चित्र .)6बी), सीवाईपी17ए1 (चित्र6c), और एचएसडी17 3 (चित्र6d) AGE-उत्तेजित LC-540 Leydig . में प्रोटीन काफ़ी कम हो गए थेकोशिकाएं (नियंत्रण समूह)। Star, CYP11A1, CYP17A1, और HSD17 . के भाव 3 प्रोटीन थेजब RAGE प्रतिपक्षी, RES, और ECH को जोड़ा गया तो उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई। बढ़ा हुआECH- और RES- उपचारित दोनों समूहों में StAR और CYP11A1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति देखी गई।CYP17A1 का अभिव्यक्ति स्तर RES और ECH समूहों में लगभग समान था। के भावएचएसडी17 ECH- उपचारित लेडिग कोशिकाओं में 3 प्रोटीन RES और RAGE . की तुलना में बहुत अधिक थेप्रतिपक्षी-उपचारित कोशिकाएं। Star, CYP11A1, CYP17A1, और HSD17 . की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति 3 प्रोटीनटेस्टोस्टेरोन के सामान्य उत्पादन का संकेत दिया।

5कोशिकाओं/एमएल और आरईएस और ईसीएच के साथ उपचार(10µएम) 24 घंटे के लिए प्रशासित किया गया था। -एक्टिन को आंतरिक नियंत्रण के रूप में लिया गया था। सामान्य समूह (न ही)मध्यम के साथ इलाज किया गया था और नियंत्रण समूह (कॉन) का इलाज एजीई (50 .) के साथ किया गया थाµजी / एमएल)।

परिणाममाध्य के रूप में दिखाया गया था±एसडी (n = 3)। महत्वपूर्ण अंतर (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">डंकन के मल्टीपल रेंज टेस्ट द्वारा विश्लेषण किया गया।