स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-निकोटिनमाइड-प्रेरित मधुमेह चूहों में पुरुष प्रजनन कार्य पर सिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क का प्रभाव-Ⅰ

1 परिचय

मधुमेह मेलेटस (डीएम) एक ऐसी स्थिति है जिसमें वृद्धि हो जाती हैग्लूकोज का स्तरपर्याप्त इंसुलिन का उत्पादन करने में अग्न्याशय की अक्षमता, या शरीर द्वारा इसे प्रभावी ढंग से उपयोग करने में असमर्थता के कारण रक्त में। WHO के अनुसार, मधुमेह से पीड़ित लोगों की संख्या 1980 में 108 मिलियन से बढ़कर 2014 में 422 मिलियन हो गई [1]। चार मुख्य श्रेणियां हैं: प्री-डायबिटीज (मधुमेह से पहले एक चरण), टाइप 1 (जहां अग्न्याशय इंसुलिन का उत्पादन करने में विफल रहता है), टाइप 2 (शरीर इंसुलिन का उपयोग करने में विफल रहता है), और गर्भकालीन मधुमेह (जो गर्भावस्था के दौरान होता है)। ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और एंटीऑक्सिडेंट्स के उत्पादन के बीच असंतुलन के कारण होता है [2] जो अंततः मधुमेह की स्थिति का कारण बनता है। मधुमेह की जटिलताओं में गुर्दे की विफलता, तंत्रिका क्षति, अंधापन, स्ट्रोक, दिल का दौरा, भ्रूण की मृत्यु और बांझपन शामिल हैं। [1]. अध्ययनों से पता चलता है कि पुरुष मधुमेह रोगियों में शुक्राणु नाभिक, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए), और माइटोकॉन्ड्रिया काफी क्षतिग्रस्त हो गए थे [3]। शुक्राणु के परिवहन के दौरान ऑक्सीडेटिव तनाव पुरुष प्रजनन प्रणाली की प्रक्रिया को बदल देगा [4,5]।

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शुक्राणुजनन की प्रक्रिया हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-गोनैडल (एचपीजी) अक्ष द्वारा नियंत्रित होती है। हाइपोथैलेमस द्वारा उत्पादित गोनैडोट्रोपिन-रिलीजिंग हार्मोन (जीएनआरएच) ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और कूप-उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) के उत्पादन को उत्तेजित करता है। लेडिग कोशिकाएँ अर्धवृत्ताकार नलिका के समीप पाई जाती हैंटेस्टोस्टेरोन का उत्पादन करेंएलएच के नियंत्रण में. एफएसएच एंटीजन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) के उत्पादन को ट्रिगर करता है जो पुरुष हार्मोन को पारित करने में मदद करता है। इस प्रकार, बांझपन और अन्य समस्याएं मुख्य रूप से एचपीजी अक्ष में होने वाली गड़बड़ी के कारण उत्पन्न होती हैं। स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-निकोटिनमाइड के संयोजन का प्रशासन प्रायोगिक चूहों में मधुमेह उत्पन्न करता है। स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन एक रासायनिक यौगिक है जो अग्न्याशय में इंसुलिन-उत्पादक कोशिकाओं के लिए विषाक्त है और निकोटिनमाइड एक पानी में घुलनशील विटामिन है जो कोशिकाओं को पूर्ण क्षति से बचाता है [6]।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा एक रेगिस्तानी पौधे की प्रजाति है जिसे "रौ कांग-रोंग" [7] के नाम से भी जाना जाता है। यह एक गैर-क्लोरोफिलिक परजीवी पौधा है जो मुख्य रूप से कैलोट्रोपिस प्रोसेरा पेड़ की जड़ पर उगता है और गांसु, किंघई, झिंजियांग, मंगोलिया, ईरान और भारत की शुष्क भूमि में व्यापक रूप से वितरित होता है। सिस्टैंच ट्यूबुलोसा का सामान्य नाम "रेगिस्तानी जलकुंभी" है। इसे चीनी पारंपरिक चिकित्सा में व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है और इसे "रेगिस्तान का जिनसेंग" नाम दिया गया है। इसका व्यापक रूप से औषधीय क्षेत्र में रुग्ण ल्यूकोरिया, विपुल मेट्रोरेजिया, क्रोनिक रीनल रोग, कब्ज, नपुंसकता और बांझपन के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है। के रासायनिक घटकसिस्टैंच ट्यूबुलोसा में गैर-वाष्पशील फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड होते हैं(पीएचजी), इरिडोइड्स, लिग्नांस, वाष्पशील तेल, एल्डिटॉल्स, ऑलिगोसेकेराइड्स और पॉलीसेकेराइड्स [8]। अध्ययन यह दर्शाते हैंइचिनाकोसाइडयह जड़ी बूटी आरओएस स्तर को विनियमित करके क्षतिग्रस्त फ़ाइब्रोब्लास्ट की रक्षा करती है [9]। यह यौगिक न्यूरोप्रोटेक्शन और ऑस्टियोपोरोसिस की रोकथाम के साथ-साथ एंटीऑक्सिडेंट, वैसोरिलैक्सेशन और एंटी-इंफ्लेमेटरी गतिविधियों का उत्पादन करता है [10,11]।

इस अध्ययन का उद्देश्य के प्रभाव की जांच करना थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्कस्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-निकोटिनमाइड-प्रेरित मधुमेह चूहे के प्रजनन संबंधी रोग पर ईसीएच युक्त।

2। सामग्री और विधि

2.1. सामग्री

ECH और CTE को सिंफर फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड (यिलान, ताइवान) से खरीदा गया था। उन्नत ग्लाइकेशन अंतिम उत्पाद (एजीई) बायोविज़न (सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। LC-540 और TM3 सेल लाइनें खाद्य उद्योग अनुसंधान और विकास संस्थान (सिंचू, ताइवान) से खरीदी गई थीं। पांच सप्ताह के स्प्रैग-डावले (एसडी) नर चूहों को राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (ताइपेई, ताइवान) से खरीदा गया था। फ़ीड लैब डाइट® को पीएमआई न्यूट्रिशन इंटरनेशनल, इंक. (ताइपेई, ताइवान) से खरीदा गया था। 2,2-डिफेनिल-1-पिक्रिलहाइड्राजाइल (डीपीपीएच) सिग्मा (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। मेथनॉल और 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपेराज़ीनेथेनसल्फोनिक एसिड (HEPES) भी सिग्मा से खरीदे गए थे। डुल्बेको का संशोधित ईगल मीडियम/एफ12 और ट्रिप्सिन-ईडीटीए गिब्को (न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल)-2, 5-डाइफेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी), डाइक्लोरो-डायहाइड्रो-फ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए), डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ), और नाइट्रोब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी) सिग्मा से खरीदे गए थे। ग्लूकोज एंजाइमैटिक किट क्योकुटोसियाकु, टोक्यो, जापान से प्राप्त किए गए थे। इंसुलिन एलिसा किट मर्कोडिया एबी इंक., सिल्वेनियसगेटन 8ए (उप्साला, स्वीडन) से खरीदी गई थीं। टी-पर ऊतक प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक थर्मो साइंटिफिक (शिकागो, आईएल, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। एंटी-ह्यूमन/माउस/चूहा परमाणु कारक-कप्पा बी एनएफ-κबी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए से खरीदे गए थे। उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पादों (रेज) पॉलीक्लोनल एंटीबॉडीज, एंटी-ह्यूमन/माउस/रैट स्टार पॉलीक्लोनल एंटीबॉडीज, और एंटी-ह्यूमन/माउस/चूहा साइटोक्रोम पी450 17ए1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज के लिए एंटी-माउस/चूहा रिसेप्टर जीन से खरीदे गए थे। टेक्स (इरविन, सीए, यूएसए)। मानव-विरोधी/चूहा/चूहा CYP11A1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (बेवर्ली, पीए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। ईज़ी-ब्लू अभिकर्मक इनविट्रोजन, थर्मो फिशर साइंटिफिक (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। एगरोज़ और डीएनए मार्कर 100 बीपी क्रोमेगा, कॉर्पोरेशन (मैडिसन, WI, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। RNeasy लिपिड टिश्यू मिनी किट QIAGEN, हिल्डेन, जर्मनी से खरीदा गया था।

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2.2. तरीकों

2.2.1. इन विट्रो विश्लेषण

LC{0}} और TM3 सेल कल्चर: LC-540 सेल लाइनों को अर्ल के बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (EBSS) माध्यम में 37 ◦C पर सोडियम बाइकार्बोनेट (1.5 ग्राम/ली) के साथ संवर्धित किया गया था। एल-ग्लूटामाइन (2 मिमी), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड ({{12%).1 मिमी), सोडियम पाइरूवेट (1.{{21%) मिमी), और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (10%) एक में 5% CO2 इनक्यूबेटर (CO2 इनक्यूबेटर, नैप्को 5410, ताइवान)। TM3 सेल लाइन को डुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में ग्लूकोज (4.5 ग्राम/एल), सोडियम पाइरूवेट (0.5 एमएम), एल-ग्लूटामाइन (2.5 एमएम), सोडियम बाइकार्बोनेट (1.2 ग्राम/एल), {{ के साथ संवर्धित किया गया था। 5% में 37 ◦C पर 28}}(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपेराज़ीनेथेनसल्फोनिक एसिड (HEPES, 15 mM), और भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS, 10%) या घोड़ा सीरम (5%) CO2 इनक्यूबेटर.

की सेल व्यवहार्यता का निर्धारणइचिनाकोसाइड (ईसीएच): 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,{5}} डिफेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (MTT) अभिकर्मक का उपयोग सेल व्यवहार्यता परख के लिए किया गया था। सेल सांद्रता को एक 96-वेल प्लेट में 2 × 105 सेल/एमएल पर समायोजित किया गया था। फिर, 20 μL ECH (2% माध्यम में पतला) मिलाया गया और 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 ◦C पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। बाद में, 100 µL एमटीटी अभिकर्मक जोड़ा गया और अंधेरे परिस्थितियों में 37 ◦C पर 4 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। अवशोषण 570 एनएम (एलिसा रीडर, डायनाटेक एमआर5000, क्लोटेन, स्विट्जरलैंड) पर मापा गया था।

सापेक्ष सेल व्यवहार्यता (%)=[(570 एनएम पर नमूना - 570 एनएम पर एब्लैंक)]/[(570 पर एक नियंत्रण - 570 पर एब्लैंक)] × 100।

नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी) न्यूनीकरण परख और 2,2-डिफेनिल-1-पिक्रिलहाइड्राजाइल (डीपीपीएच) परख: कोशिकाओं की संख्या को 1× 1{{10}}6 कोशिकाओं/ पर समायोजित किया गया था। एमएल. फिर, ईसीएच, रेस्वेराट्रोल (आरईएस), और उन्नत ग्लाइकेशन अंत-उत्पाद (एजीई) (नियंत्रण) के 5 {{29 }} मिलीग्राम/एमएल को जोड़ा गया और 37 ◦C पर 18 घंटे के लिए सह-संस्कृत किया गया। फिर, 0.3 एमएल एनबीटी समाधान (0.1 मिलीग्राम/एमएल एनबीटी, 5% एफबीएस, और 3% डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) 10 एमएल डीएमईएम में भंग) जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 में 37 ◦C पर ऊष्मायन किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद (3 मिनट के लिए 800× ग्राम पर) सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया और 200 µL डीएमएसओ जोड़ा गया और एक अल्ट्रासोनिक ऑसिलेटर (डेल्टा अल्ट्रासोनिक क्लीनर डी 200, कीलुंग, ताइवान) में 5 मिनट के लिए हिलाया गया। अवशोषण 630 एनएम पर मापा गया था। डीपीपीएच रेडिकल परख के लिए, ट्रॉलोक्स (95% अल्कोहल में) को मानक के रूप में लिया गया था। फिर, 0.5 मिमी डीपीपीएच समाधान के 75 μL को 25 μL नमूनों के साथ मिलाया गया और 30 मिनट के लिए एक अंधेरी जगह में कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई। मिश्रण को हिलाया गया और अवशोषण 517 एनएम मापा गया।

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) सामग्री विश्लेषण: सेल संख्या को 2% एफबीएस युक्त एक 12- वेल प्लेट में 2 × 105 सेल/एमएल पर समायोजित किया गया था। फिर, ईसीएच, आरईएस और एजीई के 50 μL/mL को प्लेट में जोड़ा गया और 24 घंटे के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। 24 घंटे के बाद, 20,{9}}डाइक्लोरोफ्लोरेसिन-डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) मिलाया गया और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन (400× ग्राम, 5 मिनट) के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) से दो बार धोया गया। इसके बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के 1 एमएल में निलंबित कर दिया गया और फ्लो साइटोमीटर (फ्लो साइटोमीटर, बेक्टन डिकिंसन, सीए, यूएसए) का उपयोग करके आरओएस का स्तर निर्धारित किया गया।

Identification and Quantitative Analysis of Protein: Proteins were extracted by using a protein extraction reagent (T-PER). The cell density was adjusted to 2 × 105 cells/mL in a 12-well plate and 50 µL/mL of ECH, RES, and a receptor for the advanced glycation endproduct (RAGE) antagonist, and AGEs were added and incubated at 37 ◦C in a 5% CO2 incubator for 24 h. After, 400 µL of T-PER were added, scraped off the cells, and centrifuged at 125,000× g for 20 min (4 ◦C). The supernatant was collected and stored at −80 ◦C (−80 ◦C freezer, Nuaire, Plymouth, MN, USA) for further analysis. A bicinchoninic acid (BCA) kit was used for protein quantification. Then, 10 µL of standard cell solution and 200 µL of BCA reagent were added to 8-well plates and incubated at 37 ◦C in a 5% CO2 incubator for 30 min. The absorbance was measured at 562 nm. Protein identification analysis was performed by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis. Samples were prepared by adding protein lysate to a protein loading buffer and western blot analysis was performed to detect the specific proteins.

2.2.2. विवो विश्लेषण में

पशु मॉडल डिज़ाइन: साठ {0}}सप्ताह के नर स्प्राग-डावले (एसडी) चूहों को राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (ताइपेई, ताइवान) से खरीदा गया था। प्रत्येक चूहे को 12 घंटे प्रकाश/12 घंटे अंधेरे चक्र के साथ नियंत्रित तापमान (23 ± 1 ◦C) और आर्द्रता (40-60%) के तहत कीटाणुनाशक स्टेनलेस स्टील पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से रखा गया था। इबिटम में भोजन और पानी मुहैया कराया गया। प्रत्येक चूहे को पहले सप्ताह में पालतू बनाया गया और मुख्य आहार के रूप में प्रयोगशाला कृंतक आहार 5001 दिया गया। सभी प्रक्रियाएं राष्ट्रीय ताइवान महासागर विश्वविद्यालय, ताइवान की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC अनुमोदन संख्या 101026) के मानक का पालन करती हैं। पालतू बनाने के बाद, चूहों को दो समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रण समूह (कॉन) जिसे प्रयोगशाला आहार 5001 खिलाया गया, और मधुमेह समूह जिसे पूरे प्रयोग के लिए उच्च वसा वाला आहार (एचएफडी, 40%) खिलाया गया। 4 सप्ताह तक एचएफडी खिलाने के बाद, मधुमेह समूह के चूहों को मधुमेह मेलेटस (डीएम) प्रेरित करने के लिए स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन (65 मिलीग्राम/किग्रा) (एसटीजेड) का इंजेक्शन लगाया गया। एसटीजेड इंजेक्शन लगाने के 15 मिनट के भीतर, निकोटिनमाइड (230 मिलीग्राम/किलोग्राम शारीरिक वजन) इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन के एक सप्ताह बाद, मधुमेह मेलेटस (डीएम) के सफल प्रेरण को निर्धारित करने के लिए एक मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (ओजीटीटी) आयोजित किया गया था। उसके बाद, जानवरों को छह समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रण (प्रयोगशाला आहार 5001 के साथ खिलाया गया); डीएम समूह (डीएम + 45% एचएफडी); डीएमआर समूह (डीएम + रोसिग्लिटाज़ोन: 0.571 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू) + 45% एचएफडी; डीएमई1 समूह (डीएम + सीटीई: 80 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू) + 45% एचएफडी; डीएमई2 समूह (डीएम + सीटीई: 160 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू) + 45% एचएफडी; और DME4 समूह (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD। रोसिग्लिटाज़ोन (आरएसजी) को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लिया गया था। ताइवान खाद्य एवं औषधि प्रशासन (टीएफडीए) स्वास्थ्य खाद्य कार्यात्मक मूल्यांकन दिशानिर्देशों की सिफारिश के अनुसार सीटीई (80, 160, और 320 मिलीग्राम/किग्रा) की तीन खुराक का उपयोग किया गया था। प्रयोग के अंत तक उपचार दिए गए। 6 सप्ताह के बाद सभी प्रायोगिक चूहों की बलि दे दी गई। चूहों से एकत्र किए गए रक्त को 4 ◦C पर 15 मिनट के लिए 3000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। निम्नलिखित विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला की जांच की गई:

कुल ग्लूकोज, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल का निर्धारण: ग्लूकोज का निर्धारण ग्लूकोज एंजाइमेटिक किट द्वारा किया गया था। फिर, 20 μL रक्त प्लाज्मा नमूनों को अभिकर्मकों में जोड़ा गया और 5 मिनट के लिए 37 ◦C पर रखा गया। कुल ट्राइग्लिसराइड्स और कुल कोलेस्ट्रॉल सांद्रता ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल एंजाइमेटिक किट का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। फिर, अभिकर्मकों में 10 μL रक्त प्लाज्मा जोड़ा गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रयोग किया गया। अवशोषण 510 एनएम पर मापा गया था।

प्लाज्मा कुल ग्लूकोज/ट्राइग्लिसराइड/कोलेस्ट्रॉल (मिलीग्राम/डीएल)=(एसैंपल - एब्लैंक)/(एस्टैंडर्ड - एब्लैंक) × 200।

नमूना: रक्त के नमूनों का अवशोषण, एब्लैंक: नमूने के बिना किटों का अवशोषण मूल्य, एस्टैंडर्ड: मानक अभिकर्मक का अवशोषण मूल्य, 200: 200 मिलीग्राम/डीएल की सांद्रता पर मानक अभिकर्मक।

इंसुलिन, लेप्टिन, और होमोस्टैटिक मॉडल मूल्यांकन-इंसुलिन प्रतिरोध (HOMA-IR) निर्धारण:इंसुलिन का स्तर इंसुलिन एलिसा किट द्वारा निर्धारित किया गया था। यहाँ, 25µरक्त प्लाज्मा का एल जोड़ा गया थाअभिकर्मकों, और अवशोषण 450 एनएम पर मापा गया था। कुल लेप्टिन सामग्री का उपयोग करके निर्धारित किया गया थालेप्टिन एंजाइम इम्यूनोमेट्रिक परख किट।फिर, 100µप्लाज्मा के एल का विश्लेषण किया गया और अवशोषण किया गयाएलिसा रीडर का उपयोग करके 450 एनएम मापा गया। पूरा प्रयोग इसी के अनुरूप किया गयानिर्माता के निर्देश. HOMA-IR मान होमोस्टैसिस मॉडल से निर्धारित किया गया थामूल्यांकन समीकरण=उपवास प्लाज्मा इंसुलिन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल)× उपवास प्लाज्मा ग्लूकोजसांद्रता (mmol/L)/22.5.

प्लाज्मा लिपिड पेरोक्सीडेशन: यहां, {0}}.5 एमएल रक्त प्लाज्मा को 1 एमएल अभिकर्मक (15%, w/v ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड {{6%) में मिलाया गया था। 25 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) ) और 0.375%, w/v थियोबार्बिट्यूरिक एसिड 0.25 एन एचसीएल में) और पानी के स्नान (जल स्नान, बुची 461, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) में 15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया। ठंडा होने के बाद, 1 एमएल एन-ब्यूटेनॉल मिलाया गया, जोर से हिलाया गया और 10 मिनट के लिए 1500× ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और अवशोषण 532 एनएम [12] पर मापा गया।

मैलोन्डियलडिहाइड (एमडीए) सांद्रता (एनएम/एमएल)=[(532 एनएम पर एक नमूना - 532 एनएम पर एब्लैंक)/ (532 एनएम पर एक मानक - 532 एनएम पर एब्लैंक)] × 5।

532 एनएम पर मानक - 532 एनएम पर एब्लैंक)] × 5। प्लाज्मा टेस्टोस्टेरोन और ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) स्तर का निर्धारण: टेस्टोस्टेरोन एलिसा किट का उपयोग रक्त प्लाज्मा में टेस्टोस्टेरोन के स्तर को मापने के लिए किया गया था। एलएच सांद्रता निर्धारित करने के लिए आरआईए किट का उपयोग किया गया था। फिर, 50 µL प्लाज्मा जोड़ा गया और गणना हार्मोन LH-RP-3 (मानक) की सांद्रता पर आधारित थी। निर्माता के निर्देशों के अनुसार आगे के कदम उठाए गए।

ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) - और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6) एकाग्रता का निर्धारण: कैप्चर किए गए एंटीबॉडी को कोटिंग बफर में 25 0 बार पतला किया गया था, 96- में जोड़ा गया था। वेल प्लेट (100 µL/वेल), और रात भर के लिए 4 ◦C पर रखें। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट किया गया और वॉशिंग बफर (1 बार पीबीएस, 0.05% ट्वेन 20) के साथ पांच बार धोया गया। 200 माइक्रोग्राम परख मंदक के साथ ऊष्मायन (1 घंटे) के बाद, कोशिकाओं को वॉशिंग बफर के साथ 5 बार धोया गया और 100 μL टीएनएफ- मानक समाधान या परीक्षण नमूने प्रत्येक कुएं में जोड़े गए और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। धोने के बाद, 100 μL IL-6- पाए गए एंटीबॉडी को जोड़ा गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा की गई और 5 बार धोया गया। फिर, 480 µL एंजाइम एविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट किया गया और वॉशिंग बफर से पांच बार धोया गया। फिर, 100 µL सब्सट्रेट घोल मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। बाद में, प्रत्येक कुएं में 50 µL स्टॉप सॉल्यूशन (1M फॉस्फोरिक एसिड) मिलाया गया और अवशोषण 450 एनएम पर मापा गया।

यौन क्रिया की मरम्मत के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

शुक्राणु और वृषण मापदंडों का विश्लेषण

शुक्राणु नमूना संग्रह: शुक्राणु नमूना संग्रह पहले [13] में बताई गई विधि के अनुसार किया गया था। शुक्राणु को सतह पर तैरनेवाला से एकत्र किया गया और आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया।

शुक्राणु की संख्या, शुक्राणु की गतिशीलता और असामान्य शुक्राणु: शुक्राणु की संख्या की गणना हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू समाधान का उपयोग करके की गई थी। फिर, 100 μL शुक्राणु तरल को ट्रिपैन ब्लू घोल के साथ मिलाया गया और हेमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके शुक्राणु, गतिशीलता और असामान्य शुक्राणु की संख्या की गणना की गई [14]।

नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम एनबीटी कटौती और शुक्राणु और वृषण के लिपिड पेरोक्सीडेशन: लिपिड पेरोक्सीडेशन और एनबीटी कमी का विश्लेषण प्लाज्मा विश्लेषण की एक ही प्रक्रिया के अनुसार किया गया था।

सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) और कैटालेज गतिविधि का निर्धारण: सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) गतिविधि का विश्लेषण RANSEL किट का उपयोग करके किया गया था। यहां, {{0}}.05 एमएल वृषण होमोजेनेट्स को 1.7 एमएल प्रतिक्रिया समाधान ({{13%).05 एमएम ज़ेन्थाइन, 0.025 एमएम 2-({) में जोड़ा गया था {9}}आयोडोफेनिल)- 3-(4-नाइट्रोफेनॉल)-5-फेनिलटेट्राजोलियम क्लोराइड (आईएनटी))। मिश्रण के बाद, 0.25 एमएल ज़ेन्थाइन ऑक्सीडेज (80 यू/एल) मिलाया गया और 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया की गई। अवशोषण 505 एनएम पर मापा गया था। वृषण होमोजेनेट की प्रोटीन सांद्रता बायो-रेड डीसी प्रोटीन परख किट द्वारा निर्धारित की गई थी और इसकी विशिष्ट गतिविधि (यू/एमजी प्रोटीन) की गणना की गई थी। कैटालेज़ (सीएटी) गतिविधि पहले बताई गई विधि [15] के अनुसार निर्धारित की गई थी।

एच एंड ई (हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन) धुंधलापन

वृषण को 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में भिगोया गया और 4 ◦C पर संग्रहित किया गया। ऊतक सूक्ष्म आकार में थे और स्लाइड से जुड़े हुए थे। निर्धारण (95% मेथनॉल + 5% एसिटिक एसिड) के बाद, स्लाइडों को 3 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन में डुबोया गया, 5 मिनट के लिए बहते पानी से धोया गया, और फिर उन्हें 50%, 70% और 90% अल्कोहल के साथ भिगोया गया। एक मिनट. उसके बाद, स्लाइडों को 10 सेकंड के लिए ईओसिन से रंगा गया और एक मिनट के लिए 100% अल्कोहल में भिगोया गया जब तक कि यह फीका न पड़ जाए। अंत में, स्लाइड को एक मिनट के लिए जाइलीन में भिगोया गया। बाद में स्लाइड को हवा में सुखाकर सील कर दिया गया। आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए दागदार ट्यूब को एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (उल्टे चरण अंतर माइक्रोस्कोप, ओलंपस सीके -2, टोक्यो, जापान) में रखा गया था।

हाइपोथैलेमस का विश्लेषण

माउस KISS1, जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPR) 54, साइटोकिन सिग्नलिंग 3 (SOCS -3) का दमनकर्ता, और सिर्टुइन 1 (SIRT1) जीन अनुक्रमों की पहचान एनसीबीआई (नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन) जीन डेटाबेस से की गई थी। और एक विशिष्ट प्राइमर को प्राइमर 5 का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया था। 0 प्रीमियर बायोसॉफ्ट, पालो ऑल्टो, सीए, यूएसए।)। प्रयोग में प्रयुक्त प्राइमर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

हाइपोथैलेमस से राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए) का निष्कर्षण। मस्तिष्क के हाइपोथैलेमस से आरएनए का निष्कर्षण आरनेसी लिपिड टिशू मिनी किट का उपयोग करके किया गया था। प्राप्त एमआरएनए को मात्रात्मक रूप से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा मापा गया था। आरटी विश्लेषण से प्राप्त कॉम्प्लीमेंट डीएनए को बाद में उपयोग के लिए -20 ◦C पर संग्रहीत किया गया था। निकाले गए डीएनए को टाक पोलीमरेज़ का उपयोग करके पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण के अधीन किया गया था। फिर, पीसीआर उत्पाद का 5~10 μL लिया गया और 1.5% अगर कोलाइड पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया। छवि यूवीपी बायोडॉक-इट इमेजिंग सिस्टम में ली गई थी। रिवर्स-ट्रांसक्राइब्ड पूरक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए) लिया गया और आईक्यू एसवाईबीआर ग्रीन सुपरमिक्स किट का उपयोग करके पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। बाद में इसका विश्लेषण iQTM 5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर से किया गया। प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक (टी-पीईआर) का उपयोग करके प्रोटीन निकाला गया। फिर, 20 मिलीग्राम टेस्टिकुलर होमोजेनेट को 400 μL टी-पीईआर में जोड़ा गया और 4 ◦C (125,000× g) पर सेंट्रीफ्यूज (हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूज, हेटिच सीआर -12, टटलिंगन, जर्मनी) किया गया। ) 20 मिनट के लिए। निम्नलिखित विधि इन विट्रो विश्लेषण में "प्रोटीन की पहचान और मात्रा का ठहराव विश्लेषण" के समान थी।

2.3. सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रयोगात्मक परिणामों को माध्य ± मानक विचलन (माध्य ± एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था और डेटा का विश्लेषण सांख्यिकीय उत्पाद और सेवा समाधान (एसपीएसएस) 11. 0 सॉफ्टवेयर, आईबीएम, आर्मोंक, न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए का उपयोग करके किया गया था। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण विचरण के एक-तरफ़ा विश्लेषण (एनोवा) द्वारा किया गया। डंकन के परीक्षण द्वारा महत्वपूर्ण स्तर के रूप में p <{3}}.05 के मान पर विभिन्न समूहों की एकाधिक तुलनाओं का विश्लेषण किया गया।

3. परिणाम

3.1. इन विट्रो विश्लेषण

3.1.1. ईसीएच, सीटीई और आरईएस की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों की तुलना

दीर्घकालिक एचऑक्सीडेटिव तनाव और पुरानी सूजन मधुमेह के मुख्य कारण हैंजटिलताएँ [16]. CTE में विभिन्न शामिल हैंइचिनाकोसाइड जैसे फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड(ईसीएच) और एक्टियोसाइड, एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि की संभावना के साथ [17]. डीपीपीएच कट्टरपंथी सफाईईसीएच की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए परख आयोजित की गई थी। ट्रॉलोक्स और रेस्वेराट्रोल(3,5,4'-ट्राइहाइड्रोक्सिस्टिलबीन, आरईएस) को क्रमशः मानक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लिया गया। के रूप में दिखायाचित्र में1, ईसीएच ने बेहतर कट्टरपंथी सफाई गतिविधि दिखाई और गतिविधि काफी अधिक थीसकारात्मक नियंत्रण (आरईएस) की तुलना में।

3.1.2. एलसी-540 और टीएम3 लेडिग कोशिकाओं पर ईसीएच की सेल व्यवहार्यता

ईसीएच की विभिन्न सांद्रता की सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए एमटीटी परख की गई। एलसी-540 लेडिग कोशिकाओं और टीएम3 लेडिग कोशिकाओं ने ईसीएच (चित्रा 2) के साथ इलाज के बाद 80% से अधिक व्यवहार्यता दिखाई। अन्य सांद्रता की तुलना में, ECH की 100-µM सांद्रता (2% FBS में 100 µM का पतलापन) ने TM3 लेडिग कोशिकाओं में बेहतर सेल व्यवहार्यता दिखाई। परिणाम ने संकेत दिया कि ईसीएच की बढ़ी हुई सांद्रता कोशिकाओं में किसी भी महत्वपूर्ण विषाक्तता का योगदान नहीं करती है।

3.1.3. एलसी-540 और टीएम3 लेडिग कोशिकाओं में एनबीटी परख द्वारा एजीई-प्रेरित सुपरऑक्साइड उत्पादन पर ईसीएच का प्रभाव

AGE ग्लूकोज के ऑक्सीकरण और मुक्त कणों जैसे कि O{0}}, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल और कार्बोनिल समूहों के निर्माण के कारण शरीर में ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनता है [18]। 50 ug/mL AGEs से उत्तेजित होने के बाद, LC -540 (चित्र 3a) और TM3 (चित्र 3b) कोशिकाओं को ECH और RES (प्रत्येक 5 μM और 10 μM) से उपचारित किया गया। परिणामों से पता चला कि नियंत्रण समूह (उत्तेजित AGEs) में सुपरऑक्साइड आयन का उत्पादन बढ़ गया था, लेकिन नियंत्रण समूह (उत्तेजित AGEs) के बाद सुपरऑक्साइड आयन का उत्पादन कम हो गया था, लेकिन सुपरऑक्साइड उत्पादन और संरक्षित के बाद सुपरऑक्साइड आयन का उत्पादन कम हो गया। कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाता है। एलसी -540 कोशिकाओं के मामले में, 10 µM ईसीएच ने सामान्य समूह के साथ लगभग समान गतिविधि दिखाई। ईसीएच और आरईएस दोनों की सांद्रता में वृद्धि के साथ दोनों कोशिकाओं में सुपरऑक्साइड का उत्पादन कम हो गया था।

यौन क्रिया में सुधार के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. AGE-उत्तेजित LC-540 लेडिग कोशिकाओं में H2O2 उत्पादन पर ECH का प्रभाव

ऑक्सीडेटिव प्रजातियों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए डीसीएफएच-डीए परख निष्पादित की गई थी। कोशिकाओं में प्रवेश करने के बाद, फ्लोरोसेंट डाई DCFH-DA इंट्रासेल्युलर H2O2 द्वारा ऑक्सीकृत हो जाता है और डाइक्लोरोफ्लोरेसिन (DCF) बनाता है। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, AGE-उत्तेजित समूह (नियंत्रण) में इंट्रासेल्युलर H2O2 उत्पादन में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, जबकि 10 µM ECH और RES के जुड़ने से कोशिकाओं में H2O2 उत्पादन काफी कम हो गया था। 10 µM ECH के प्रशासन के परिणामस्वरूप केवल 47.1% H2O2 उत्पादन हुआ, जो नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम है।

3.1.5. AGE-उत्तेजित LC-540 लेडिग कोशिकाओं में RAGE और NF-κB प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर पर ECH का प्रभाव

एलसी-540 लेडिग कोशिकाओं में रेज की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया था। AGEs-उत्तेजित लेडिग कोशिकाओं में RAGE (चित्र 5a) और NF-κB (चित्र 5b) प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर पर ECH का प्रभाव चित्र 5 में दिखाया गया था। परिणामों से पता चला कि AGEs की 50 µg/mL सांद्रता ने उच्च RAGE और NF- को प्रेरित किया। एलसी में κबी की अभिव्यक्ति -540 लेडिग कोशिकाओं और ईसीएच और आरईएस की 10 µM सांद्रता ने रेज और एनएफ-κबी की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया। NF-κB की अभिव्यक्ति RAGE प्रतिपक्षी की तुलना में RES और ECH में काफी कम थी। तो, परिणामों ने पुष्टि की कि ECH ने RAGE और NF-κB के स्तर को कम करके सूजन के स्तर को कम कर दिया है।

3.1.6. एजीई-उत्तेजित एलसी -540 लेडिग कोशिकाओं में टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण मार्ग पर ईसीएच का प्रभाव।

शुक्राणुजनन और पुरुष बांझपन की प्रक्रिया टेस्टोस्टेरोन की उपस्थिति पर निर्भर करती है। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, AGE-उत्तेजित LC में StAR (चित्र 6a), CYP11A1 (चित्र 6b), CYP17A1 (चित्र 6c), और HSD17 3 (चित्र 6d) प्रोटीन की अभिव्यक्तियाँ काफी कम हो गई थीं। }} लेडिग कोशिकाएं (नियंत्रण समूह)। जब RAGE प्रतिपक्षी, RES और ECH को जोड़ा गया तो StAR, CYP11A1, CYP17A1 और HSD17 3 प्रोटीन की अभिव्यक्तियाँ काफी बढ़ गईं। StAR और CYP11A1 प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति ECH- और RES-उपचारित दोनों समूहों में देखी गई। CYP17A1 का अभिव्यक्ति स्तर RES और ECH समूहों में लगभग समान था। ECH-उपचारित लेडिग कोशिकाओं में HSD17 3 प्रोटीन की अभिव्यक्तियाँ RES और RAGE प्रतिपक्षी-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में बहुत अधिक थीं। StAR, CYP11A1, CYP17A1, और HSD17 3 प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति ने टेस्टोस्टेरोन के सामान्य उत्पादन का संकेत दिया।