अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों में रक्तचाप और बाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग पर एंजियोटेंसिन II टाइप I रिसेप्टर ShRNA के प्रभाव

अमूर्त:

यह अध्ययन अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों में एंजियोटेंसिन II टाइप I रिसेप्टर (AT1R) shRNA के रक्तचाप और बाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। दस विस्टार क्योटो (WKY) चूहों को एक सामान्य रक्तचाप नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और 20 अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों (SHR) को प्रायोगिक और उच्च रक्तचाप नियंत्रण समूहों में बेतरतीब ढंग से विभाजित किया गया था। प्रायोगिक समूह में चूहों को एक पूंछ की नस के माध्यम से AT1R shRNA पुनः संयोजक एडेनोवायरस (Ad 5- AT1R-shRNA) के साथ इंजेक्ट किया गया था, और अन्य दो समूहों में चूहों को पुनः संयोजक एडिनोवायरस (Ad 5- EGFP) के साथ इंजेक्ट किया गया था। ). इंजेक्शन से पहले और बाद में चूहे की धमनी कौडालिस में सिस्टोलिक ब्लड प्रेशर (एसबीपी) को मापा गया था, और विज्ञापन 5- एटी1आर- के वितरण का निरीक्षण करने के लिए बार-बार इंजेक्शन के दो दिन बाद दिल, गुर्दे, महाधमनी और अधिवृक्क ऊतक प्राप्त किए गए थे। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत shRNA। Ad5-AT1R-shRNA के इंजेक्शन से पहले, प्रायोगिक समूह और उच्च रक्तचाप नियंत्रण समूह का रक्तचाप सामान्य रक्तचाप नियंत्रण समूह (P) की तुलना में काफी अधिक था<0.01). After two injections, the blood pressure in the experimental group decreased significantly, and the duration of blood pressure reduction reached 19 days. In the experimental group, the kidney, heart, aorta, and adrenal gland tissues showed vigorous fluorescence expression under the fluorescence microscope. Repeated administration of Ad5- AT1R-shRNA has a long-lasting hypotensive effect on SHR and can significantly improve ventricular remodeling.

चूहों पर किए गए प्रायोगिक अध्ययन में, हमने यह भी पाया कि सिस्टैंच का गुर्दे पर सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है, जो गुर्दे की क्षति को रोक सकता है और गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार कर सकता है। उनमें से, Cistanche ग्लोमेरुली और वृक्क नलिकाओं के ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया को कम कर सकता है, और गुर्दे के ऊतकों में मुक्त कणों के स्तर को कम कर सकता है। इसके अलावा, Cistanche गुर्दे की भड़काऊ प्रतिक्रिया को भी कम कर सकता है और गुर्दे की कोशिकाओं के पुनर्जनन और मरम्मत को बढ़ावा दे सकता है।

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परिचय

वेंट्रिकुलर (या मायोकार्डियल) रीमॉडेलिंग इस्केमिक कार्डियोमायोपैथी, उच्च रक्तचाप से ग्रस्त हृदय रोग, फैली हुई कार्डियोमायोपैथी और हृदय क्षति के अन्य रूपों के अध्ययन में प्रस्तावित एक अवधारणा है, जो मुख्य रूप से मायोकार्डियल चोट के बाद के परिवर्तनों की विशेषता है, जैसे कि कार्डियोमायोसाइट अतिवृद्धि, गैर-मायोसाइट प्रसार, और मायोकार्डियल फाइब्रोसिस, और हृदय गुहा का विस्तार और हृदय का वजन इस आधार पर बढ़ता है [1]। कार्डिएक हाइपरट्रॉफी उच्च रक्तचाप में सबसे आम रोग परिवर्तन है, जहां हाइपरट्रॉफिक मायोकार्डियम में अक्सर उपकोशिकीय आकारिकी और संरचना में परिवर्तन की एक श्रृंखला दिखाई देती है।

एक पिछले अध्ययन ने पुष्टि की है कि आरएएस सिस्टम (रेनिन-एंजियोटेंसिन सिस्टम) का अति-सक्रियण वैसोप्रेसर फ़ंक्शन, सेल विकास और प्रसार-प्रसार प्रभाव [2] के कारण उच्च रक्तचाप से ग्रस्त वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। Ang II RAS का मुख्य सक्रिय पदार्थ है और विशेष रूप से AT1R को सक्रिय करके जैविक प्रभाव डाल सकता है, जिसका कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट [3] की सतह पर उच्च संबंध है। इसके अलावा, एंग II में एक निश्चित वृद्धि कारक जैसा प्रभाव भी होता है और फाइबर कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स में आरएनए और प्रोटीन के संश्लेषण को सीधे बढ़ावा दे सकता है, जिससे वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग [4] होता है।

इसके अलावा, आरएनए इंटरफेरेंस तकनीक कोशिकाओं में सक्रिय आरएनए शॉर्ट इंटरफेरिंग आरएनए (siRNA) का उत्पादन करने के लिए shRNA का उपयोग करने को संदर्भित करती है और विशेष रूप से लक्ष्य जीन [5] की अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए, पूरक लक्ष्य जीन के mRNA को बांधती और नीचा दिखाती है। रिकॉम्बिनेंट एडेनोवायरस वेक्टर (विज्ञापन 5-AT1R-shRNA), आरएनए हस्तक्षेप के सिद्धांत के आधार पर डिज़ाइन किया गया, विशेष रूप से AT1R की अभिव्यक्ति को अवरुद्ध कर दिया और जांचकर्ताओं [6-8] द्वारा किए गए पिछले एंटीहाइपरटेंसिव अध्ययनों में महत्वपूर्ण काल्पनिक प्रभाव डाला। हालांकि, उच्च रक्तचाप के लिए जीन थेरेपी के एक अपेक्षाकृत नए रूप के रूप में, यह अज्ञात है कि क्या यह उच्च रक्तचाप के कारण वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग को प्रभावित करता है, और बार-बार अंतःशिरा इंजेक्शन के प्रभाव और दुष्प्रभाव की सूचना नहीं दी गई है।

वर्तमान अध्ययन में, अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों (SHR) को प्रायोगिक विषयों के रूप में चुना गया था, AT1R के जीन अवरोधन के प्रभाव की जांच करने के लिए Ad 5-AT1R-shRNA के बार-बार इंजेक्शन के बाद SHR के रक्तचाप और वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग को देखा गया। उच्च रक्तचाप में रीमॉडेलिंग पर Ad5-AT1R-shRNA द्वारा प्रेरित।

सामग्री और तरीके

ड्रग्स, अभिकर्मकों और उपकरणों

Ad5-AT1R-shRNA और कंट्रोल रिकॉम्बिनेंट एडेनोवायरस वेक्टर (Ad5-EGFP) एंजियोटेंसिन II टाइप 1 रिसेप्टर (AT1R) shRNA को ले जाने के लिए Benyuan-Zhengyang Gene Technology Co., Ltd द्वारा निर्मित और संश्लेषित किए गए थे । (बीजिंग चाइना)। हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन (एचवाईए) डिटेक्शन किट को नानजिंग जियानचेंग बायोलॉजिकल इंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट से खरीदा गया था। रैट टेल आर्टरी (पॉवरलैब, एडीइंस्ट्रूमेंट्स, न्यू साउथ वेल्स, ऑस्ट्रेलिया) के लिए नॉन-इनवेसिव ब्लड प्रेशर इंस्ट्रूमेंट हमारे कॉलेज में कार्डियोलॉजी की प्रयोगशाला द्वारा प्रदान किया गया था। 722 ग्रेटिंग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर शंघाई थर्ड एनालिटिकल इंस्ट्रूमेंट फैक्ट्री (शंघाई, चीन) द्वारा बनाए गए थे। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (फी टेकनाई जी 2 12 टाइप ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एफईआई कंपनी, हिल्सबोरो, ओआर, यूएसए) को टोंगजी मेडिकल कॉलेज, हुआज़होंग यूनिवर्सिटी ऑफ़ साइंस एंड टेक्नोलॉजी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप रूम द्वारा प्रदान किया गया था। वर्तमान अध्ययन को तियान जिन चेस्ट अस्पताल की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

पशु समूहन और प्रशासन

वयस्क नर SHR और विस्टार क्योटो (WKY) चूहे सभी 12 सप्ताह के थे और उनका वजन 280-320 ग्राम था। प्रति पिंजरे में 3-5 चूहे थे, कमरे का तापमान 24 ± 2 डिग्री पर रखा गया था, और सापेक्ष आर्द्रता 60-65 प्रतिशत पर बनाए रखी गई थी। एक 12-घं कृत्रिम दिन और रात चक्र प्रदान किया गया जिसमें 7:00 पूर्वाह्न–7:00 अपराह्न चक्र के प्रकाशित भाग को इंगित करता है, और 7:00 अपराह्न –7:00 AM चक्र के काले भाग को इंगित करता है। चूहे आराम से खा-पी सकते थे। चूहों के समूह में एक सामान्य रक्तचाप नियंत्रण समूह (WKY समूह, n =10), एक उच्च रक्तचाप नियंत्रण समूह (SHR समूह, n =10), और एक उच्च रक्तचाप प्रायोगिक समूह (प्रायोगिक समूह, n {) शामिल थे। {20}})।

प्रायोगिक समूह में चूहों को अंतःशिरा के 1 मिली एड 5- एटी1आर-शआरएनए के साथ टीसीआईडी ​​50 1.7 × 109 के टिटर के साथ पूंछ की नस के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था, और एसएचआर और डब्ल्यूकेवाई समूहों में चूहों TCID 50 1.7 × 109 के अनुमापांक के साथ टेल वेन के माध्यम से Ad 5- EGFP के 1 मिलीलीटर के साथ अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन का समय प्रयोग की शुरुआत में हुआ था, और जब रक्तचाप पहले इंजेक्शन के बाद प्रारंभिक अवस्था में वापस आ गया था।

प्रत्येक समूह में सभी चूहों के लिए, लगभग 80-90 ग्राम मायोकार्डियल ऊतक लिया गया था, और हाइड्रोक्सीको3ाइन डिटेक्शन किट के निर्देशों के अनुसार ऑपरेशन सख्ती से किया गया था।

रक्तचाप और हृदय गति का मापन और प्रायोगिक पशुओं का अवलोकन

पूंछ धमनी के सिस्टोलिक रक्तचाप (एसबीपी) और हृदय गति को टेल-कफ विधि द्वारा 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 पर शांत वातावरण में मापा गया था। इंजेक्शन के 11, 13, 15, 17, 19 और 21 दिन। उस चूहे की पूँछ को लगभग 40 डिग्री पर पहले से गरम करके आरामदायक स्थिति में स्थिर कर दिया गया था। संपीड़न कफ को चूहे की पूंछ की जड़ में रखा गया, फुलाया गया और दबाया गया। जब दबाव 270 मिमी एचजी (1 मिमी एचजी=0.133 केपीए) तक पहुंच गया, तो दबाव स्वचालित रूप से और धीरे-धीरे कम हो गया, और रक्तचाप और हृदय गति को मेडलैब जैविक कार्य प्रयोग प्रणाली द्वारा रिकॉर्ड किया गया जो एक दबाव ट्रांसड्यूसर से जुड़ा था और एक एम्पलीफायर। सभी चूहों को लगातार पांच बार मापा गया, और साधन की गणना की गई और एसबीपी और हृदय गति के रूप में उपयोग किया गया। प्रयोग के अंत तक भूख, गतिविधि, शरीर का तापमान, शरीर का वजन (BW), और जानवरों की अन्य प्रतिक्रियाएं प्रतिदिन देखी गईं।

मुख्य ऊतकों में पुनः संयोजक एडेनोवायरस वेक्टर के वितरण का पता लगाना

प्रायोगिक समूह के जानवरों को विज्ञापन {{0}} AT1R-shRNA के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया गया था। Ad5-AT1R-shRNA के बार-बार इंजेक्शन के दो दिन बाद, प्रायोगिक समूह के हृदय, गुर्दे, महाधमनी और अधिवृक्क ऊतक प्राप्त किए गए और फिर तुरंत जमे हुए वर्गों में तैयार किए गए। प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखी गई थी। रक्तचाप कम होने पर कुछ पशुओं की बलि देकर उनका वजन कराया जाता था। जानवरों को एनेस्थेसिया के लिए 0.4 मिली/100 ग्राम पेंटोबार्बिटल के साथ पेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था, और हृदय, गुर्दे, महाधमनी और अधिवृक्क ऊतकों को तेजी से हटा दिया गया था। एक तेज ब्लेड के साथ, इन अंगों को 1 × 1 × 1 सेमी छोटे ऊतक के टुकड़ों में काट दिया गया और पैथोलॉजी विभाग में भेज दिया गया, जहां उन्हें जमे हुए वर्गों में तैयार किया गया। उनकी मोटाई 5-8 µm के बीच मापी गई थी, और प्रमुख अंगों द्वारा Ad5-AT1R-shRNA के अवशोषण का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति प्रोटीन की अभिव्यक्ति देखी गई थी।

मायोकार्डियल नमूनों की तैयारी

प्रयोग के अंत में चूहों के बीडब्ल्यू को मापा गया। एनेस्थीसिया के लिए चूहों को {{0}}.4 मिली/100 ग्राम पेंटोबार्बिटल के साथ पेरिटोनली इंजेक्ट किया गया। छाती को खोलने के बाद, दिल को जल्दी से हटा दिया गया था, आसपास की रक्त वाहिकाओं को काट दिया गया था, फिल्टर पेपर के साथ दिल के रक्त को सुखाया गया था, पूरे दिल के गीले वजन (HW) को तौला गया था, और दिल के वजन का अनुपात BW (HW / HW) था। बीडब्ल्यू) की गणना [9, 10] की गई थी। कुछ 1-मिमी3 मायोकार्डिअल ऊतक के टुकड़े शिखर क्षेत्र से लिए गए, 0.1 mol/l फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ धोया गया, फिर शुरुआत में 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड (पीएच 7.2) के साथ तय किया गया। फिर उन्हें 1 प्रतिशत ऑस्मियम टेट्रोक्साइड घोल (पीएच 7.2) के साथ तय किया गया, आरोही ग्रेडिएंट अल्कोहल और एसीटोन द्वारा निर्जलित किया गया, भिगोया गया और एपॉक्सी राल के साथ एम्बेडेड किया गया, और अल्ट्राथिन वर्गों में तैयार किया गया। एचवाईए की माप के लिए बाएं वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम का एक और 60-100 ग्राम लिया गया।

अवलोकन सूचकांक

एक शांत जाग्रत अवस्था में पूंछ की धमनी का एसबीपी इंजेक्शन से पहले और इंजेक्शन के बाद सभी समय बिंदुओं पर दर्ज किया गया था। लगभग 80-90 ग्राम मायोकार्डिअल टिश्यू लिया गया था, और एचवाईए डिटेक्शन किट के निर्देशों के अनुसार मायोकार्डिअल टिश्यू में एचवाईए की सामग्री को एक जैविक विधि का उपयोग करके पता लगाया गया था, और फिर सूत्र के अनुसार कोलेजन सामग्री में परिवर्तित किया गया था: कोलेजन सामग्री=एचवाईए सामग्री × 7.46 [11]। चूहों के बीडब्ल्यू और एचडब्ल्यू दर्ज किए गए थे, और एचडब्ल्यू/बीडब्ल्यू अनुपात की गणना की गई थी। अल्ट्रैथिन वर्गों को यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट दोनों के साथ दाग दिया गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तहत देखा और फोटो खींचा गया था।

वास्तविक समय फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR) द्वारा AT1R mRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाना

प्रयोग के अंत में, {{0}}. AT1R mRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए सभी समूहों से बाएं वेंट्रिकल ऊतक का 5 ग्राम लिया गया। जेनबैंक (सीरियल नंबर NM _030685) पर चूहे AT1R जीन अनुक्रम का चयन किया गया था, और प्राइमर और जांच को प्राइमर प्रीमियर 5.0 का उपयोग करके डिजाइन किया गया था और सांगोन बायोटेक (शंघाई, चीन) द्वारा संश्लेषित किया गया था। AT1R अपस्ट्रीम प्राइमर 5'-ACG ATG CTG GTG GCC AAA GT -3' था, और डाउनस्ट्रीम प्राइमर 5'-ATG ATA AGG AAA GGG AAC AAG AAG C -3' था। जांच अनुक्रम 5'-एटीटी एटीजी एजीटी सीटीसी जीजीएएटीटी सीजीए सीजीसी टीसीसी सीसीए -3' था, और जांच संशोधन 5'-एफएएम, 3'-टीएएमआरए, 3'-पीओ4 था। -एक्टिन अपस्ट्रीम प्राइमर 5'-एजीजी जीएए एटीसी जीटीजी सीजीटी जीएसी एटी -3' था, और डाउनस्ट्रीम प्राइमर 5'- सीसीए टीएसी सीसीए जीजीए एजीजी एएजी जीसीटी -3' था। जांच क्रम 5'-CAC TGC CGC ATC CTC TTC CTC CCT GG -3' था, और जांच संशोधन 5'-FAM, 3'-TAMRA, 3'-PO4 था।

ट्राईज़ोल वन-स्टेप विधि का उपयोग करके ऊतकों से कुल आरएनए को निकाला गया था और मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस (एमएमएलवी) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम द्वारा सीडीएनए में उलट दिया गया था। मानक वक्र नमूनों की तैयारी में पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) द्वारा प्रवर्धित किए जाने के लिए आवश्यक नमूने के लक्ष्य जीन और हाउसकीपिंग जीन (-एक्टिन) शामिल थे। मानक वक्र बनाने के लिए उत्पाद को ढाल द्वारा पतला किया गया था। पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली 1 0 × बफर के 2 μl, MgCl2 के 2 μl और dNTPs के 0.5 μl थी। अपस्ट्रीम प्राइमर के {{1 0}}.5 μl, डाउनस्ट्रीम प्राइमर के 0.5 μl, जांच के 1 μl, Taq एंजाइम के 0.4 μl, और प्रतिक्रिया टेम्पलेट के 2 μl, और बाँझ विआयनीकृत मात्रा 20 μl तक पहुंचने तक पानी डाला गया। पीसीआर प्रणाली को एक फ्लोरोसेंट पीसीआर ट्यूब में रखा गया था, प्रवर्धन किया गया था, और रोटर-जीन प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर डिटेक्टर पर प्रतिदीप्ति संकेत एकत्र किए गए थे। प्रतिक्रिया की स्थिति इस प्रकार थी: 95 डिग्री, 5 मिनट; 94 डिग्री, 5 एस; 60 डिग्री, 30 एस कुल 45 प्रदर्शन किए गए चक्रों के लिए। फ्लोरोसेंट संकेतों को तब एकत्र किया गया था, और परिणामों का विश्लेषण किया गया था।

प्रयोग में परिणामों पर एमआरएनए मात्रा का ठहराव और पीसीआर की प्रतिक्रिया दक्षता के प्रभावों को समाप्त करने के लिए, आंतरिक नियंत्रण-एक्टिन की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की मात्रात्मक पहचान एक साथ की गई, एटी1आर से -एक्टिन की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या का अनुपात AT1R जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति के रूप में उपयोग किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर SPSS 12.0 का उपयोग करके डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। सहप्रसरण के विश्लेषण का उपयोग करके तीन समूहों के बीच बार-बार माप डेटा का विश्लेषण किया गया। सभी डेटा सेट ANCOVA को पूरा करने के लिए मान्यताओं को पूरा करते हैं। छात्र-न्यूमैन-केल्स (SNK)-q परीक्षण का उपयोग कई समूहों के साधनों के बीच कई तुलनाओं के लिए किया गया था। सभी समूहों में डेटा को माध्य ± SD के रूप में व्यक्त किया गया था। पी<0.05 was considered statistically significant.

परिणाम

विज्ञापन5-AT1R-shRNA ने SHR में SBP को काफी कम कर दिया

इंजेक्शन से पहले, SBP प्रायोगिक समूह में काफी अधिक था, और SHR समूह WKY समूह (P) की तुलना में अधिक था<0.05). Twenty-four hours after the first injection, SBP was significantly lower in the experimental group than in the SHR group (P<0.01), and="sbp=" did=" not=" decrease=" significantly=" in=" the=" shr=" group=" wky=" p=">0.05)। Ad 5-AT1R-shRNA के पहले इंजेक्शन के बाद, प्रायोगिक समूह में हाइपोटेंशन प्रभाव पांच दिनों तक चला, और रक्तचाप 7 वें दिन ठीक हो गया। दूसरे इंजेक्शन के बाद, रक्तचाप फिर से काफी कम हो गया, और अवधि पहले इंजेक्शन के बाद की तुलना में लंबी थी, जो 14 दिनों तक चली (चित्र 1)। जानवरों की स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिक्रियाएं हर दिन देखी गईं, और एनोरेक्सिया, वजन घटाने और तापमान में वृद्धि जैसी कोई असामान्यता नहीं पाई गई। तीन समूहों में हृदय गति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ, और तीन समूहों के बीच के अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे।

Ad5-AT1R-shRNA हृदय के ऊतकों में AT1R mRNA अभिव्यक्ति को काफी कम कर देता है

यह सत्यापित करने के लिए कि विज्ञापन 5-AT1R-shRNA के ऊतकों में AT1R mRNA की अभिव्यक्ति पर RNA हस्तक्षेप का प्रभाव है, विज्ञापन 5-AT1RshRNA इंजेक्शन के 21 वें दिन के बाद, हृदय ऊतक का कुल RNA था सभी समूहों में निकाला गया। सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद, वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर द्वारा जीन की प्रतिलिपि संख्या का पता लगाया गया था। पीसीआर प्रवर्धन वक्र के परिणामों से पता चला कि प्रायोगिक समूह में एटी1आर एमआरएनए की अभिव्यक्ति उच्च रक्तचाप नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम थी। इसके अलावा, अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी<0.05, Fig. 2).

ऊतकों में विज्ञापन5-AT1R-shRNA का वितरण

Ad5-AT1RshRNA (चित्र 3) के बार-बार इंजेक्शन के 2 दिनों के बाद प्रतिदीप्ति-लेबल वाले पुनः संयोजक एडेनोवायरस को हृदय, गुर्दे, महाधमनी और अधिवृक्क ऊतकों में वितरित किया गया था। चूंकि AT1R व्यापक रूप से ऊतक में वितरित किया गया था, इस अध्ययन के परिणाम AT1R के विवो वितरण के अनुरूप थे।

Ad5-AT1R-shRNA SHR में मायोकार्डियल हाइपरट्रॉफी को काफी कम कर देता है

एचडब्ल्यू और एचडब्ल्यू/बीडब्ल्यू अनुपात को मापकर चूहों में मायोकार्डियल हाइपरट्रॉफी की स्थिति को दर्शाया जा सकता है। चूहों के दिल के वजन और शरीर के वजन को मापने से, इस अध्ययन से पता चला कि HW और HW/BW WKY समूह (P) की तुलना में SHR समूह में काफी अधिक थे।<0.01). The result suggests that there was obvious myocardial hypertrophy in untreated SHR. On the 21st day after Ad5-AT1R-shRNA injection, HW and HW/ BW were lower in the experimental group than in the SHR group (P<0.05) (Fig. 4).

विज्ञापन 5-AT1R-shRNA SHR में मायोकार्डियल फाइब्रोसिस की डिग्री को कम कर सकता है

WKY समूह की तुलना में SHR समूह में HYA और कोलेजन की सामग्री काफी अधिक थी (P<0.01). These results suggest that obvious myocardial fibrosis has been found in the cardiac ventricle in the SHR group. The contents of HYA and collagen were significantly lower in the SHR group than in the SHR group (P<0.01) (Fig. 5).

विज्ञापन 5-AT1R-shRNA SHR के मायोकार्डियल अल्ट्रास्ट्रक्चर में महत्वपूर्ण सुधार करता है

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा मायोकार्डियम के अल्ट्रास्ट्रक्चरल अवलोकन से पता चला है कि डब्ल्यूकेवाई समूह में, मायोकार्डिअल कोशिकाओं की परमाणु झिल्ली बरकरार थी, मायोफिब्रिल्स स्पष्ट थे, व्यवस्था साफ थी, अनुप्रस्थ रेखाएं स्पष्ट थीं, माइटोकॉन्ड्रिया स्पष्ट थीं, और उनकी थी मायोकार्डियल इंटरस्टिटियम (अंजीर। 6 ए और बी) में कोई कोलेजन फाइबर प्रसार नहीं। SHR समूह में, मायोकार्डिअल कोशिकाओं की परमाणु झिल्ली बरकरार नहीं थी, मायोफिब्रिल फजी थे, और व्यवस्था अनियमित थी, कुछ मायोफिलामेंट गायब हो गए। यह देखा जा सकता है कि अनुप्रस्थ रेखाएँ स्पष्ट नहीं थीं, और माइटोकॉन्ड्रिया सूज गए थे और जमा हो गए थे। इसके अलावा, इसमें रिक्तिकाएं बनाई गईं, और बड़ी संख्या में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम हाइपरप्लासिया और कोलेजन फाइबर प्रसार को मायोकार्डिअल इंटरस्टिटियम (अंजीर। 6C और D) में देखा गया। WKY और SHR समूहों की तुलना में, प्रायोगिक समूह में, मायोकार्डियल कोशिकाओं की परमाणु झिल्ली अपेक्षाकृत बरकरार थी, मायोफिब्रिल्स स्पष्ट थे, व्यवस्था अपेक्षाकृत साफ थी, अनुप्रस्थ रेखाएँ स्पष्ट थीं, और माइटोकॉन्ड्रिया सूजे हुए नहीं थे। हालांकि, स्थानीय क्षेत्रों में माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में वृद्धि हुई, और मायोकार्डियल इंटरस्टिटियम (अंजीर। 6E और F) में कोई स्पष्ट कोलेजन फाइबर प्रसार नहीं हुआ।

बहस

वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया कि Ad5-AT1R-shRNA SHR के रक्तचाप को महत्वपूर्ण रूप से कम कर सकता है, और हृदय के ऊतकों में AT1R mRNA अभिव्यक्ति को कम कर सकता है। पुनः संयोजक एडेनोवायरस वेक्टर का एक निश्चित लक्ष्यीकरण प्रभाव होता है, जिसे टेल वेन इंजेक्शन के बाद AT1R युक्त ऊतक द्वारा अवशोषित किया जा सकता है। इसके अलावा, विज्ञापन 5-AT1R-shRNA SHR में मायोकार्डियल हाइपरट्रॉफी को कम कर सकता है, AT1R अभिव्यक्ति को बाधित करके SHR में मायोकार्डिअल फाइब्रोसिस में सुधार कर सकता है और SHR में मायोकार्डियम के अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों में सुधार कर सकता है।

सामान्य चूहों में, SBP 110-120 mmHg होता है, और SHR में, SBP 200 mmHg से अधिक हो सकता है। उच्च रक्तचाप की घटना 100 प्रतिशत थी, और इन चूहों ने उच्च रक्तचाप से ग्रस्त हृदय रोग का भी संकेत दिया। इसलिए, इस प्रकार का चूहा मानव उच्च रक्तचाप के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। स्वाभाविक रूप से उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहे आमतौर पर 10 सप्ताह की उम्र में बाएं वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि का प्रदर्शन करना शुरू करते हैं, जो उम्र के साथ उत्तरोत्तर बढ़ता जाता है, मायोकार्डियम में कोलेजन सामग्री काफी बढ़ जाती है, और मायोकार्डिअल फाइब्रोसिस और मायोकार्डिअल इंटरस्टीशियल रीमॉडेलिंग होती है [12, 13]। वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि 16-सप्ताह पुराने WKY चूहों, HW, HW/BW की तुलना में, HPA की सामग्री, और मायोकार्डियम में कोलेजन 16-सप्ताह पुराने SHR में काफी बढ़ गया। HW और HW/BW में वृद्धि कार्डियोमायोसाइट्स के प्रसार और अतिवृद्धि और हृदय के वजन में वृद्धि को दर्शाती है।

इसके अलावा, HYA कोलेजन फाइबर के लिए अद्वितीय है, और इसकी सामग्री कोलेजन सामग्री और फाइब्रोसिस डिग्री को दर्शा सकती है। इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक परीक्षा के परिणामों से पता चला कि SHR समूह में, मायोकार्डिअल कोशिकाओं की परमाणु झिल्ली बरकरार नहीं थी, मायोफिब्रिल्स फजी थे, व्यवस्था अनियमित थी, कुछ मायोफिलामेंट्स गायब हो गए, अनुप्रस्थ रेखाएं अस्पष्ट थीं, माइटोकॉन्ड्रिया सूज गए थे और जमा हुआ, और उसमें रसधानियाँ बन गईं। मायोकार्डियल इंटरस्टिटियम में बड़ी संख्या में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम हाइपरप्लासिया और कोलेजन फाइबर प्रसार देखा गया। परिणामों से पता चला कि वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग 16-सप्ताह पुराने SHR में स्पष्ट थी।

उच्च रक्तचाप के लिए जीन थेरेपी के अध्ययन से पता चला है कि एटी1आर और आरएएस प्रणाली के अन्य सदस्यों के भावों के एंटीसेन्स निषेध ने रक्तचाप को कम किया है और एसएचआर [14, 15] में हृदय के रोग संबंधी परिवर्तनों में सुधार किया है। पिछले अध्ययनों के परिणामों से पता चला है कि गुर्दे, हृदय, यकृत, महाधमनी और अधिवृक्क ऊतकों में shRNA अत्यधिक व्यक्त किया गया था। यह इस अध्ययन के परिणामों के समान है। इसके अलावा, Ad 5-ACE-AT1R-shRNA ACE और AT1R की अभिव्यक्तियों को कम-विनियमित करके कार्डियोमायोसाइट्स की पूर्ण संरचना में सुधार कर सकता है और रक्तचाप को कम कर सकता है।

इसी तरह, अन्य शोधकर्ताओं [16] द्वारा किए गए पिछले प्रयोगों में आरएनए हस्तक्षेप तकनीक का उपयोग किया गया था, जहां एटी1आर की जीन अभिव्यक्ति एड5-एटी1आरएसएचआरएनए के टेल वेन इन्फ्यूजन द्वारा बाधित हुई थी, जिससे रक्तचाप कम हुआ है। हमने जीन थेरेपी के माध्यम से बाएं निलय अतिवृद्धि और मायोकार्डियल फाइब्रोसिस को उलटने का प्रयास किया। वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि Ad5-AT1RshRNA के बार-बार इंजेक्शन के बाद, SHR में रक्तचाप ने न केवल एक स्पष्ट काल्पनिक प्रभाव का प्रदर्शन किया, बल्कि सुपरपोज़िशन का प्रभाव भी था, यानी दूसरे के बाद काल्पनिक प्रभाव का आयाम और अवधि इंजेक्शन पहले इंजेक्शन के बाद की तुलना में काफी अधिक थे। परिणाम बताते हैं कि Ad5-AT1R-shRNA के बार-बार इंजेक्शन का प्रभाव बेहतर है। HW, HW/BW, और हृदय में HYA और कोलेजन की सामग्री प्रायोगिक समूह में SHR समूह की तुलना में काफी कम थी। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी परीक्षा के परिणामों से यह भी पता चला कि SHR समूह की तुलना में प्रायोगिक समूह में मायोकार्डिअल क्षति काफी हल्की थी, और AT1R mRNA की अभिव्यक्ति SHR समूह की तुलना में प्रायोगिक समूह में काफी कम थी।

इन सभी परिणामों से पता चला कि Ad5-AT1RshRNA ने RNA हस्तक्षेप का प्रभाव उत्पन्न किया, जिसने उच्च रक्तचाप और वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग से प्रेरित Ang II और AT1R के संयोजन के जैविक प्रभावों की एक श्रृंखला को अवरुद्ध कर दिया, यह सुझाव देते हुए कि यह जीन थेरेपी कम नहीं कर सकती केवल रक्तचाप ही नहीं बल्कि SHR में वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग में भी सुधार करता है। एंजियोटेंसिन II टाइप 1 रिसेप्टर के जीन को अवरुद्ध करके प्लाज्मा एंजियोटेंसिन II स्तर बढ़ जाएगा। अपने लक्ष्य अंगों पर एंजियोटेंसिन II के शास्त्रीय प्रभाव ज्यादातर दो झिल्ली रिसेप्टर्स, टाइप 1 रिसेप्टर्स (AT1Rs) और टाइप 2 रिसेप्टर्स (AT2Rs) द्वारा मध्यस्थ होते हैं, जो विभिन्न कार्यों में मध्यस्थता करते हैं। AT1R विकास और प्रसार को बढ़ावा देने के लिए सिद्ध है, जैसे कि वाहिकासंकीर्णन, बीपी में वृद्धि, और कार्डियक सिकुड़न, और एंडोथेलियल डिसफंक्शन, हृदय रोग और सूजन सहित हानिकारक प्रभावों को मध्यस्थ करता है।

इसके विपरीत, AT2R को विरोधी प्रभावों को प्रेरित करने, विकास को बाधित करने, एपोप्टोसिस, वासोडिलेटेशन और हाइपोटेंशन को बढ़ावा देने और कार्डियोवास्कुलर रीमॉडेलिंग [17] को रोकने के लिए माना जाता है। बार-बार इंजेक्शन लगाने के बाद, एडेनोवायरस वेक्टर ने स्पष्ट प्रतिकूल प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं की, और काल्पनिक प्रभाव अधिक लंबे समय तक चलने वाला था। प्रयोग के अंत में, प्रायोगिक समूह में, रक्तचाप अनिवार्य रूप से प्रारंभिक अवस्था में लौट आया। हालाँकि, मायोकार्डियम में AT1R की अभिव्यक्ति SHR समूह की तुलना में कम थी। यह सुझाव नहीं देता है कि रक्तचाप में परिवर्तन सीधे मायोकार्डियम में AT1R की अभिव्यक्ति से संबंधित है। यह अनुमान लगाया जाता है कि स्थानीय ऊतक की आरएएस प्रणाली मुख्य रूप से ऊतक फाइब्रोसिस की भूमिका में शामिल है।

इस अध्ययन की एक सीमा यह थी कि रक्तचाप को रेडियो-टेलीमेट्री के साथ आक्रामक रूप से मापा जाना चाहिए, या कम से कम एक टेथर्ड सिस्टम द्वारा, लेकिन तकनीकी समस्याओं के कारण, हम केवल रक्तचाप के टेल-कफ माप का उपयोग कर सकते थे, जो बहुत विश्वसनीय नहीं था।

निष्कर्ष

AT1R अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए RNAi तकनीक का उपयोग करने वाली जीन थेरेपी को न केवल रक्तचाप को कम करने के लिए एक नई विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, बल्कि मायोकार्डियल रीमॉडेलिंग और दिल की विफलता में सुधार के लिए एक नई विधि होने की भी उम्मीद है। फिर भी, वर्तमान में यह नई तकनीक पशु अनुसंधान तक ही सीमित है। मानव उपचार में इसके उपयोग की सुरक्षा और प्रभावशीलता का और अध्ययन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ट्रांसडक्शन वेक्टर की सुरक्षा और दक्षता, और क्या यह जीन थेरेपी रणनीति अन्य प्रकार के मायोकार्डियल परिवर्तनों पर लागू की जा सकती है, इसके लिए और अध्ययन की आवश्यकता है।

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