अमूर्त

उद्देश्य: केवोलिन-1 (CAV1)/एक्वापोरिन 1 (AQP1) मार्ग को विनियमित करके फॉर्म-डेप्रिवेशन मायोपिया (FDM) चूहों में विकास कारक (TGF) अभिव्यक्ति, स्क्लेरल रीमॉडलिंग और जल परिवहन को बदलने पर सिस्टैंच युक्त फॉर्मूला (मूल रक्त-पौष्टिक और किडनी-टोनिंग जड़ी-बूटियों की जगह) के प्रभावों की जांच करना।

विधियाँ: चालीस एसपीएफ़-ग्रेड नर एसडी चूहों का चयन किया गया, जिनमें से 30 का उपयोग एफडीएम मॉडल स्थापित करने के लिए किया गया। सफल मॉडलिंग के बाद, चूहों को एफडीएम समूह, पाइरेंजेपाइन (पीआईआर) समूह और सिस्टैंच फॉर्मूला समूह में विभाजित किया गया, प्रत्येक समूह में 10 चूहे थे। शेष 10 गैर-मॉडल चूहों ने सामान्य समूह के रूप में कार्य किया। सामान्य समूह और एफडीएम समूह को कोई हस्तक्षेप नहीं मिला। पीआईआर समूह को दिन में दो बार (सुबह और शाम) पीआईआर आई ड्रॉप्स से इलाज किया गया, जबकि सिस्टैंच फॉर्मूला समूह को सिस्टैंच युक्त फॉर्मूला का इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन दिया गया। रेटिनोस्कोप और डायग्नोस्टिक उपकरण का उपयोग करके चूहों की अपवर्तक त्रुटि और अक्षीय लंबाई का पता लगाया गया। एचई स्टेनिंग का उपयोग स्क्लेरल ऊतक के रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। स्क्लेरल ऊतक में टीजीएफ - 2 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन का उपयोग किया गया था। स्क्लेरल ऊतक में AQP1 और CAV1 प्रोटीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट का उपयोग किया गया था। स्क्लेरल ऊतक में ग्लूटामेट-एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर (जीएलएएसटी) और ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (GLT-1) एमआरएनए के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को मापने के लिए आरटी-पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। परिणाम: सामान्य समूह की तुलना में, एफडीएम समूह, सिस्टैंच फॉर्मूला समूह और पीआईआर समूह में अपवर्तक त्रुटि, टीजीएफ - 2 अभिव्यक्ति स्तर, और AQP1 और CAV1 प्रोटीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर में काफी कमी आई थी, जबकि GLAST mRNA और GLT-1 mRNA की अक्षीय लंबाई और सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि हुई थी (सभी पी <0.05)। एफडीएम समूह की तुलना में, सिस्टैंच फॉर्मूला समूह और पीआईआर समूह में अपवर्तक त्रुटि, टीजीएफ - 2 अभिव्यक्ति स्तर, और AQP1 और CAV1 प्रोटीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि हुई थी, जबकि GLAST mRNA और GLT-1 mRNA की अक्षीय लंबाई और सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर में काफी कमी आई थी (सभी पी <0.05)। सिस्टैंच फॉर्मूला समूह की तुलना में, पीआईआर समूह में अपवर्तक त्रुटि, टीजीएफ - 2 अभिव्यक्ति स्तर, और AQP1 और CAV1 प्रोटीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर में काफी कमी आई थी, जबकि GLAST mRNA और GLT-1 mRNA की अक्षीय लंबाई और सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि हुई थी (सभी पी <0.05)। एचई स्टेनिंग के परिणामों से पता चला कि सामान्य समूह में प्रत्येक रेटिना परत की संरचना में कोई असामान्य परिवर्तन नहीं थे; एफडीएम समूह की रेटिना पतली हो गई थी और गैंग्लियन कोशिका परत में गंभीर रिक्तिका परिवर्तन दिखाई दिए; सिस्टैंच फॉर्मूला समूह और पीआईआर समूह की रेटिना मोटाई में वृद्धि हुई थी, सेल व्यवस्था मूल रूप से नियमित थी, गैंग्लियन कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई थी, और प्रत्येक परत में कोशिकाओं को सघन रूप से व्यवस्थित किया गया था, जिसमें सिस्टैंच फॉर्मूला समूह में सबसे महत्वपूर्ण प्रदर्शन था। निष्कर्ष: सिस्टैंच युक्त फॉर्मूला का एफडीएम के उपचार पर एक निश्चित सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, और इसका तंत्र CAV1, AQP1, और TGF- 2 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के साथ-साथ स्क्लेरल रीमॉडलिंग और जल परिवहन कार्यों को संतुलित करने और सुधारने से संबंधित हो सकता है।

 

 

किडनी के कार्य में सुधार के लिए सिस्तांचे जड़ी बूटी अनुपूरक

 

 

कीवर्ड

रूप-वंचन निकट दृष्टि; सिस्टैंच युक्त फार्मूला; परिवर्तनकारी विकास कारक- 2; एक्वापोरिन 1; केवोलिन-1; स्क्लेरल रीमॉडलिंग; जल परिवहन

 

हाल के वर्षों में, लोगों की जीवनशैली में बदलाव और इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के निरंतर विकास के साथ, मायोपिया की घटनाएं बढ़ रही हैं। एक सामान्य बीमारी के रूप में यह एक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या बन गई है। फॉर्म-डेप्रिवेशन मायोपिया (एफडीएम) एक विशेष प्रकार का मायोपिया है, जो आमतौर पर आंखों में दृश्य उत्तेजना के अभाव या कमी के कारण होता है। एफडीएम न केवल स्क्लेरल रीमॉडलिंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप करता है, बल्कि नेत्रगोलक के आकार में असामान्य परिवर्तन और जल परिवहन कार्य के विकारों का कारण बनता है, जो स्क्लेरल ऊतक क्षति और विरूपण को और बढ़ा सकता है। एक्वापोरिन 1 (AQP1) एक व्यापक रूप से विद्यमान प्रोटीन है जिसका मुख्य कार्य कोशिका झिल्ली में पानी के अणुओं के तेजी से परिवहन को बढ़ावा देना है। आँख में, AQP1 का वितरण और कार्य अंतःनेत्र द्रव के गतिशील संतुलन से संबंधित हैं। केवोलिन-1 (CAV1) एक प्रोटीन है जो कोशिका झिल्ली माइक्रोस्ट्रक्चर और सिग्नल ट्रांसडक्शन के निर्माण में शामिल होता है। आंखों में, CAV1 मुख्य रूप से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं और फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में मौजूद होता है, और दृश्य संकेतों के संचरण और अंतःकोशिकीय वातावरण की स्थिरता से संबंधित है। ट्रांसफ़ॉर्मिंग ग्रोथ फ़ैक्टर - 2 (टीजीएफ - 2) एक प्लियोट्रोपिक साइटोकिन है जिसमें कई जैविक प्रभाव होते हैं जैसे कोशिका प्रसार, विभेदन और प्रवासन को बढ़ावा देना। अंतर्गर्भाशयी वातावरण में, टीजीएफ- 2 कॉर्निया और श्वेतपटल के विकास और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वर्तमान में, एफडीएम का मुख्य उपचार ड्रग थेरेपी है।

पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) में, मायोपिया का गठन अपर्याप्त क्यूई और रक्त, और किडनी सार की कमी जैसे कारकों से संबंधित माना जाता है। किडनी को "जन्मजात आधार" माना जाता है और इसका आंखों के कार्य से गहरा संबंध है। टीसीएम का मानना ​​है कि "किडनी सार को नियंत्रित करती है, और सार आंखों को पोषण देता है; लीवर आंखों में खुलता है, और पर्याप्त लीवर रक्त स्पष्ट दृष्टि सुनिश्चित करता है"। इसलिए, टीसीएम में कमी सिंड्रोम के कारण होने वाली आंखों की बीमारियों के लिए किडनी को स्वस्थ बनाना और रक्त को पोषण देना हमेशा एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय सिद्धांत रहा है।

सिस्टैंच, जिसे "रेगिस्तान जिनसेंग" के रूप में जाना जाता है और टीसीएम में "नौ अमर दवाओं" में से एक है, का औषधीय घटक के रूप में 2,000 से अधिक वर्षों का इतिहास है। प्राचीन टीसीएम क्लासिक्स में एक शीर्ष श्रेणी की पौष्टिक औषधीय सामग्री के रूप में दर्ज, सिस्टैंच को किडनी को टोन करने, सार को फिर से भरने, रक्त को पोषण देने और शुष्कता को नम करने के प्रभावों के लिए अत्यधिक महत्व दिया जाता है। कई अन्य टीसीएम जड़ी-बूटियों के विपरीत, सिस्टैंच विशेष रूप से रेगिस्तानों में उगता है, मुख्य रूप से चीन के झिंजियांग, इनर मंगोलिया और गांसु जैसे क्षेत्रों में टैमरिक्स रामोसिसिमा की जड़ों पर परजीवी होता है। अद्वितीय रेगिस्तानी वातावरण इसे इचिनाकोसाइड, वर्बास्कोसाइड और फ्लेवोनोइड सहित समृद्ध सक्रिय अवयवों से संपन्न करता है, जो वैज्ञानिक रूप से मजबूत एंटीऑक्सीडेंट गुणों, सेल एपोप्टोसिस को कम करने और सेल प्रसार को बढ़ावा देने के लिए सिद्ध हुए हैं।

आधुनिक शोध से पता चला है कि सिस्टैंच में किडनी को पोषण देने वाले महत्वपूर्ण प्रभाव होते हैं। यह किडनी कोशिका एपोप्टोसिस को कम कर सकता है, किडनी कोशिका प्रसार को बढ़ावा दे सकता है, क्षतिग्रस्त किडनी कोशिकाओं की मरम्मत कर सकता है और गुर्दे की रक्त वाहिकाओं को चौड़ा कर सकता है, जिससे किडनी की कार्यप्रणाली में सुधार हो सकता है। इसके अलावा, सिस्टैंच लिम्फोसाइट प्रसार को बढ़ावा देकर प्रतिरक्षा को बढ़ा सकता है, यकृत ग्लाइकोजन उत्पादन को बढ़ाकर थकान का विरोध कर सकता है, और मुक्त कणों को हटाकर एंटी-एजिंग प्रभाव डाल सकता है। ये जैविक गतिविधियाँ "किडनी को टोन करने और सार को पोषण देने" के टीसीएम सिद्धांत के साथ अत्यधिक सुसंगत हैं, और नेत्र रोग उपचार में इसके अनुप्रयोग के लिए वैज्ञानिक आधार भी प्रदान करती हैं। किडनी को टोन करने और रक्त को पोषण देने के टीसीएम चिकित्सीय सिद्धांत के आधार पर, और सिस्टैंच की आधुनिक औषधीय विशेषताओं के संयोजन के आधार पर, इस अध्ययन ने मूल रक्त-पौष्टिक और किडनी-टॉनिफाइंग जड़ी-बूटियों को सिस्टैंच के साथ बदलकर एक नया सिस्टैंच युक्त फॉर्मूला बनाया, और एफडीएम के उपचार में इसकी प्रभावकारिता और तंत्र का पता लगाया, जिसका लक्ष्य मायोपिया के लिए प्राकृतिक हर्बल-आधारित उपचारों के विकास के लिए एक नया विचार प्रदान करना है।

1 सामग्री और विधियाँ

1.1 प्रायोगिक पशु

180-200 ग्राम वजन और 6-8 सप्ताह की आयु वाले चालीस एसपीएफ़-ग्रेड नर एसडी चूहों को बीजिंग केयू पशु प्रजनन केंद्र [लाइसेंस संख्या: एससीएक्सके (जिंग) 2022-0004] से खरीदा गया था और नियमित रूप से चीनी चिकित्सा विज्ञान अकादमी के चीन के नेत्र अस्पताल की पशु प्रयोगशाला में पाला गया था। यह प्रयोग "प्रायोगिक पशुओं के प्रशासन पर विनियम" के प्रासंगिक प्रावधानों का अनुपालन करता है और इसे चीन एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज के नेत्र अस्पताल की मेडिकल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था (बैच संख्या: YKEC-KT-2024-017-P001)।

1.2 मुख्य अभिकर्मक और उपकरण

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा (चेंग्दू वीसिस्टैन्च बायो-टेक कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया, जिसमें इचिनाकोसाइड 30.0% से अधिक या उसके बराबर, वर्बास्कोसाइड 12.0% से अधिक या उसके बराबर, और कुल फेनिथाइल अल्कोहल ग्लाइकोसाइड्स 75.0% से अधिक या उसके बराबर) सहित सक्रिय सामग्री का उपयोग मुख्य औषधीय सामग्री के रूप में किया गया था। पिरेंजेपाइन (पीआईआर, सूज़ौ होंगसेन फार्मास्युटिकल कंपनी, लिमिटेड); कंपाउंड ट्रोपिकैमाइड आई ड्रॉप्स (हेबेई जिन्याओ योंगगुआंग फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड, विशिष्टता 5 एमएल); 4 ग्राम एल⁻¹ ऑक्सीबुप्रोकेन हाइड्रोक्लोराइड आई ड्रॉप्स (शेडोंग बॉश एंड लोम्ब फ़्रेडा फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड); AQP1 एंटीबॉडी (वुहान फाइन बायोटेक कंपनी लिमिटेड); CAV1 एंटीबॉडी (वुहान बोटू बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड); -एक्टिन एंटीबॉडी (शंघाई जिंगके केमिकल टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड); बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (वानजाउ केमियाओ बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड); एचई स्टेनिंग किट (शंघाई ज़ेय बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड)।

1.3 मॉडलिंग विधि और समूहन

एफडीएम मॉडल स्थापित करने के लिए तीस चूहों का उपयोग किया गया था। चूहों को पेंटोबार्बिटल सोडियम (30 mg·kg⁻¹) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा संवेदनाहारी किया गया। दाहिनी आंख को पोविडोन-आयोडीन से साफ और कीटाणुरहित करने के बाद, दाहिनी आंख पर एक अपारदर्शी आई मास्क चिपका दिया गया। आई मास्क को अलग होने या हल्के रिसाव के लिए प्रतिदिन जांचा जाता था, और ढीला होने पर दोबारा चिपका दिया जाता था। बायीं आँख का इलाज नहीं किया गया। मोनोक्युलर रूप से वंचित होने के 4 सप्ताह के बाद, चूहों पर दूरबीन रेटिनोस्कोपी और अक्षीय लंबाई माप किया गया। मॉडलिंग के लिए सफलता मानदंड: साइक्लोप्लेजिया के बाद, अपवर्तक त्रुटि को रेटिनोस्कोप या स्वचालित रेफ्रेक्टोमीटर से मापा गया था, और वंचित आंख ने अपवर्तक स्थिति में एक महत्वपूर्ण मायोपिक बदलाव दिखाया था [यानी, दूरबीन अपवर्तक त्रुटि में अंतर 2 डी से अधिक या उसके बराबर को सफल मॉडलिंग माना जाता था, और नियंत्रण आंख की तुलना में वंचित आंख की औसत मायोपिक शिफ्ट लगभग (-4.5 ± 1.2) डी थी]। सभी 30 चूहों को सफलतापूर्वक मॉडलिंग किया गया और एफडीएम समूह, पीआईआर समूह और सिस्टैंच फॉर्मूला समूह में विभाजित किया गया, प्रत्येक समूह में 10 चूहे थे। शेष 10 गैर-मॉडल चूहों ने सामान्य समूह के रूप में कार्य किया।

1.4 हस्तक्षेप के तरीके

सामान्य समूह और एफडीएम समूह को कोई हस्तक्षेप नहीं मिला। पीआईआर समूह को 15 दिनों तक 2 मिनट के अंतराल पर दिन में दो बार (सुबह और शाम) दाहिनी आंख में पीआईआर आई ड्रॉप की 5 बूंदें दी गईं। सिस्टैंच फॉर्मूला समूह को सिस्टैंच युक्त फॉर्मूला के साथ हस्तक्षेप किया गया था। सिस्टैंच ट्यूबुलोसा (50 ग्राम, मुख्य घटक) को पानी के साथ काढ़ा किया गया और 1000 g·L⁻¹ की सांद्रता वाला एक औषधीय घोल बनाया गया। चूहों को 15 दिनों के लिए दिन में एक बार 12.70 ग्राम·किग्रा⁻¹ की खुराक पर इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन दिया गया। सिस्टैंच की खुराक उसके नैदानिक ​​अनुप्रयोग अनुभव और आधुनिक औषधीय अनुसंधान के आधार पर निर्धारित की गई थी, जिससे इचिनाकोसाइड और वर्बास्कोसाइड जैसे सक्रिय अवयवों की प्रभावी सांद्रता सुनिश्चित की गई थी।

1.5 पता लगाने के तरीके

1.5.1 अपवर्तक त्रुटि और अक्षीय लंबाई परिवर्तन का मूल्यांकन

रूपात्मक और अपवर्तक त्रुटि का पता लगाना: फॉर्म अभाव की समाप्ति के चौबीस घंटे बाद, पता लगाने के लिए प्रत्येक समूह से 3 चूहों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। प्रयोग से पहले, चूहों को 30 मिनट के लिए अंधेरे-अनुकूलित वातावरण में रखा गया था, फिर आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा संवेदनाहारी किया गया और एक विशेष पशु ब्रैकेट पर तय किया गया। नेत्रगोलक की पैनोरमिक स्कैनिंग के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन ओसीटी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग किया गया था। स्कैनिंग के दौरान, रेटिना और लेंस की स्पष्ट क्रॉस-अनुभागीय छवियां प्राप्त करने के लिए जांच को कॉर्निया के लंबवत समायोजित किया गया था। प्रत्येक आंख को लगातार 3 बार स्कैन किया गया था, और गोलाकार समतुल्य अपवर्तक त्रुटि की गणना करने के लिए पूर्वकाल कॉर्नियल सतह से रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम परत (यानी, अक्षीय लंबाई) की अक्षीय दूरी को सिस्टम के अंतर्निहित सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से मापा गया था। डेटा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, दो पेशेवर रूप से प्रशिक्षित शोधकर्ताओं ने स्वतंत्र रूप से छवियों का बिना सोचे-समझे विश्लेषण किया। यदि दो माप परिणामों के बीच का अंतर 0.50 डी से अधिक था, तो डेटा को हटा दिया गया और फिर से मापा गया। अक्षीय लंबाई की पुष्टिकारक पहचान: ओसीटी माप परिणामों को सत्यापित करने के लिए, ए-स्कैन अल्ट्रासाउंड डायग्नोस्टिक उपकरण का भी उपयोग किया गया था। सबसे पहले, ऑक्सीबुप्रोकेन हाइड्रोक्लोराइड आई ड्रॉप्स को सामयिक संज्ञाहरण के लिए चूहों की दोनों आंखों में डाला गया था, और फिर ए-स्कैन जांच को धीरे से कॉर्निया के संपर्क में रखा गया था। उपकरण को मैन्युअल मोड में समायोजित किया गया था, और सटीक अल्ट्रासोनिक प्रसार गति इंट्राओकुलर मीडिया के अनुसार निर्धारित की गई थी: पूर्वकाल कक्ष और कांच के लिए 1540 m·s⁻¹। ऑपरेशन के दौरान, प्रत्येक इंटरफ़ेस को मैन्युअल मार्किंग द्वारा स्थित किया गया था, और औसत मूल्य लेने के लिए प्रत्येक आंख को 3 बार बार-बार मापा गया था। यह प्रयोग बिना सोचे-समझे किया गया और सभी ऑपरेटरों को सुसंगत माप तकनीक सुनिश्चित करने के लिए एकीकृत प्रशिक्षण प्राप्त हुआ। माप से पहले उपकरण को कैलिब्रेट किया गया था, और कुछ नमूनों को इंट्राक्लास और इंटरक्लास सहसंबंध गुणांक (आईसीसी) का मूल्यांकन करने के लिए दोहराव परीक्षण के लिए यादृच्छिक रूप से चुना गया था। डेटा की वैज्ञानिकता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान सख्त मानकीकृत संचालन प्रक्रियाओं का पालन किया गया।

1.5.2 वह धुंधला हो जाना

अपवर्तक त्रुटि और अक्षीय लंबाई का पता लगाने के बाद, अत्यधिक संज्ञाहरण द्वारा चूहों का बलिदान किया गया। दोनों आंखों की पलकें और आसपास के ऊतकों को कीटाणुरहित कर दिया गया था, और कॉर्निया के मध्य बिंदु पर लंबवत नाक और टेम्पोरल लिंबस को चिह्नित किया गया था। कंजंक्टिवा को निशानों के अनुसार काटा गया था, और नेत्रगोलक को सम्मिलित किया गया था। पूर्वकाल खंड ऊतक और कांच को हटाने के लिए लिंबस को काटा गया था, और स्क्लेरल ऊतक को बरकरार रखा गया था। स्क्लेरल ऊतक को 24 घंटे के लिए 40 ग्राम एल⁻¹ पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ तय किया गया था, ग्रेडिएंट इथेनॉल के साथ निर्जलित किया गया था, नियमित रूप से पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था, जाइलीन के साथ साफ किया गया था, तटस्थ बाल्सम के साथ लगाया गया था, 5 माइक्रोन पर सेक्शन किया गया था, एचई के साथ दाग दिया गया था, और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत स्क्लेरल ऊतक के रूपात्मक परिवर्तनों के लिए देखा गया था।

1.5.3 टीजीएफ के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन- 2 स्क्लेरल ऊतक में अभिव्यक्ति

प्रत्येक समूह से दो चूहों का चयन किया गया। स्क्लेरल ऊतक वर्गों को एंटीजन पुनर्प्राप्ति और अवरुद्ध करने के अधीन किया गया, 24 घंटे के लिए माउस एंटी-टीजीएफ - 2 (1:3000) के साथ ऊष्मायन किया गया, धोया गया, 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (1:2000) के साथ ऊष्मायन किया गया, नियमित रूप से विकसित और प्रतिरंजित किया गया, तटस्थ बाल्सम के साथ लगाया गया, और ऊतक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत 2-3 छवियां ली गईं। सकारात्मक भाग का ग्रे मान एक छवि विश्लेषण प्रणाली द्वारा पता लगाया गया था।

1.5.4 स्क्लेरल ऊतक में AQP1 और CAV1 प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर का पश्चिमी धब्बा का पता लगाना

प्रत्येक समूह से दो चूहों का चयन किया गया। स्क्लेरल ऊतक को एक्साइज किया गया, समरूप बनाया गया और आरआईपीए लिसीस बफर जोड़कर कुल प्रोटीन निकाला गया। प्रोटीन विकृतीकरण, परिमाणीकरण, वैद्युतकणसंचलन, झिल्ली स्थानांतरण और अवरोधन का प्रदर्शन किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000), और -एक्टिन एंटीबॉडी (1:2000) को जोड़ा गया और रात भर 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। द्वितीयक एंटीबॉडी (1:2000) जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया। ईसीएल अभिकर्मक जोड़ा गया था, और इमेज लैब सॉफ्टवेयर के साथ प्रोटीन ग्रे मूल्य का विश्लेषण किया गया था। लक्ष्य बैंड के ग्रे मान का -एक्टिन के मान से अनुपात इसका सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर था।

1.5.5 आरटी-पीसीआर स्क्लेरल ऊतक में ग्लास्ट और GLT-1 एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाना

चूहों के बचे हुए स्क्लेरल ऊतक को लिया गया, और ट्राइज़ोल विधि के अनुसार कुल आरएनए निकाला गया। कुल आरएनए को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा गया था, और किट निर्देशों के अनुसार सीडीएनए को रिवर्स-ट्रांसक्राइब किया गया था। आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों के साथ तैयार की गई थी: 30 एस के लिए 75 डिग्री, 60 एस के लिए 85 डिग्री, 30 एस के लिए एनीलिंग के लिए 80 डिग्री, 30 एस के लिए विस्तार के लिए 65 डिग्री, कुल 40 चक्र। आंतरिक संदर्भ के रूप में -एक्टिन के साथ, ग्लूटामेट-एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर (GLAST) और ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (GLT-1) के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर की गणना 2⁻ΔΔCt विधि द्वारा की गई थी। प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं। समूहों के बीच तुलना के लिए विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण किया गया था, और समूहों के बीच जोड़ीवार तुलना के लिए एलएसडी-टी परीक्षण का उपयोग किया गया था। परीक्षण स्तर:=0.05.