संबंधित खाद्य-ग्रेड वाणिज्यिक एंजाइमों के लिए एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस विकसित किया गया था

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2.2. कोलेजन हाइड्रोलाइज़ेट गुणों पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रभाव

प्रारंभिक हाइड्रोलाइज़ेट की संरचना और अध्ययन की जा रही गतिविधि के आधार पर, वांछित आणविक आकार और उच्च जैव-सक्रियता के साथ छोटे पेप्टाइड अंशों के उत्पादन के लिए एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया एक उपयोगी, औद्योगिक रूप से लाभप्रद विधि हो सकती है। घुलनशीलता, मुक्त अमीनो समूह सामग्री, और lyophilization के बाद सीएच की उपज को दिखाया गया है (तालिका 1)। नियंत्रण की घुलनशीलता और मुक्त अमीनो समूह सामग्री क्रमशः 11.95 प्रतिशत और 0.79 प्रतिशत थी। 3 kDa आणविक भार कट-ऑफ के साथ एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस और अल्ट्राफिल्ट्रेशन के बाद, CH-Alcalase में उच्चतम घुलनशीलता (21.17 प्रतिशत), और मुक्त अमीनो समूह सामग्री (14.17 प्रतिशत) देखी गई।<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

प्रोटीन हाइड्रोलाइज़ेट्स का औसत आणविक भार एक महत्वपूर्ण कारक है जो उनके जैविक गुणों को निर्धारित करता है [19]। आम तौर पर, मेगावाट के साथ एक औसत अंश<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa कोलेजन का प्रतिनिधित्व करता है [20,21]। नियंत्रण के सापेक्ष आणविक भार वितरण (प्रीट्रीटमेंट नमूना), सीएच-अल्कलेज़, और सीएच-अल्केलेस<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

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सीएच में अमीनो एसिड संरचना को दिखाया गया है (तालिका 2)। विभिन्न प्रोटीज द्वारा सीएचएस में अलग-अलग अमीनो एसिड रचनाएं और एंटीऑक्सीडेंट गुण [23] थे। कोलेजन की अमीनो एसिड संरचना ग्लाइसीन (ग्लाइ), प्रोलाइन (प्रो), और ग्लूटामिक एसिड (ग्लू) में समृद्ध थी। CHs की अमीनो एसिड सामग्री (CH-Alcalase और CH-Alcalase .)<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">सिस्टैंच स्टेमइन अमीनो एसिड को लिपिड में उनकी बढ़ी हुई घुलनशीलता या मुक्त कट्टरपंथी प्रतिक्रियाओं [1,24] के कारण एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है।

2.3. कोलेजन हाइड्रोलिसेट्स की एंटीऑक्सीडेंट और एंटी-एजिंग गतिविधियां

सीएच की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों को 2,2'-और-बीआईएस-(3-एथिलबेन्जोथियाजोलिन-6-सल्फोनिक एसिड) (एबीटीएस) रेडिकल-स्कैवेंजिंग गतिविधि परख और शक्ति परख को कम करने का उपयोग करके मापा गया था। नियंत्रण (कोलेजन निलंबन), CH-Alcalase, और CH-Alcalase की ABTS कट्टरपंथी-स्कैवेंजिंग गतिविधि<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">सिस्टैंच साल्सा अर्कसामान्य तौर पर, पेप्टाइड्स की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि उनके अमीनो एसिड अनुक्रमों, मौजूद मुक्त अमीनो एसिड की संख्या, हाइड्रोलिसिस की डिग्री और पेप्टाइड्स के आणविक भार [26,27] से प्रभावित हो सकती है। विशेष रूप से, कम आणविक भार हाइड्रोलाइज़ेट्स में उच्च आणविक भार हाइड्रोलाइज़ेट्स [2,26] की तुलना में मजबूत एंटीऑक्सीडेंट गुण होते हैं।

चित्रा 5. 2,2'-और-बीआईएस-(3-एथिलबेन्जोथियाजोलिन-6-सल्फोनिक एसिड) (एबीटीएस) रेडिकल मैला ढोने (ए) और कम करने की शक्ति (बी) में कोलेजन हाइड्रोलिसेट्स (सीएच) की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियां। परख विभिन्न अक्षरों (एसी) द्वारा दर्शाए गए डेटा विभिन्न उपचारों के आधार पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं (पी .)<0.05).>सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे और साइड इफेक्टविभिन्न अक्षरों (AD) द्वारा दर्शाए गए डेटा सांद्रता के आधार पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं (p < 0.05)।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

नियंत्रण की कम करने वाली शक्तियाँ, CH-Alcalase, और CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">सिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्कइसी तरह की टिप्पणियों ने सुझाव दिया कि अल्ट्राफिल्टेड कोलेजन पेप्टाइड्स [30] की तुलना में क्रूड कोलेजन हाइड्रोलाइज़ेट शक्ति को कम करने में अधिक प्रभावी हो सकता है।

इन विट्रो एंटी-एजिंग प्रभाव [20] में टायरोसिनेज, कोलेजनेज और इलास्टेज गतिविधि के निषेध का उपयोग उनके सत्यापन के लिए किया गया था। नियंत्रण के टायरोसिनेस, कोलेजेनेस, और इलास्टेज गतिविधि के निषेध के परिणाम, सीएच-अल्कैलेस, और सीएच-अल्केलेस<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>इलास्टेज (कोई गतिविधि नहीं)। सीएच-Alcalase<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>इलास्टेज (कोई गतिविधि नहीं)। एक अन्य अध्ययन में बताए गए इसी तरह के रुझानों से संकेत मिलता है कि कोलेजन हाइड्रोलाइज़ेट्स ने एंटी-एजिंग एजेंट और कोलेजनेज़ इनहिबिटर [20] के रूप में कार्य करने की क्षमता दिखाई है।

3. सामग्री और तरीके

3.1. पोर्सिन स्किन प्रीट्रीटमेंट

पोर्सिन त्वचा एक स्थानीय आपूर्तिकर्ता (सियोल, कोरिया) से खरीदी गई थी, और पोर्सिन त्वचा के सभी दृश्यमान वसा और संयोजी ऊतकों को रेजर ब्लेड का उपयोग करके हटा दिया गया था। इस अध्ययन में प्रयुक्त पोर्सिन त्वचा को जैविक भिन्नता को कम करने के लिए एक सुअर से प्राप्त किया गया था। वसा और अवशिष्ट पदार्थों को हटाने के लिए छंटनी की गई पोर्सिन त्वचा को 90 डिग्री पर 1 मिनट के लिए चार बार पानी में धोया गया। फिर त्वचा को 1 सेमी वर्ग वर्गों में काट दिया गया और चार-पंख वाले ब्लेड ब्लेंडर (सीएनएचआर -26, बॉश, हांगकांग, चीन) का उपयोग करके 3 मिनट के लिए आसुत जल में चूर्णित किया गया। अल्ट्रा टरैक्स (T25, IKA लैबोटेक्निक, स्टॉफेन, जर्मनी) का उपयोग करके 5 मिनट के लिए चूर्णित पोर्सिन त्वचा को उच्च गति (25, 000 आरपीएम) पर समरूप बनाया गया था। लगभग 100 ग्राम पोर्सिन त्वचा मिश्रण (50 प्रतिशत अंतिम ठोस सामग्री) को वैक्यूम-पैक किया गया और -20 डिग्री पर जमे हुए और 1 महीने के भीतर उपयोग के लिए संग्रहीत किया गया।

3.2. वाणिज्यिक प्रोटीज और अभिकर्मक

Alcalase, Flavorzyme, Neutase, और Protamex को Novozymes (Bagsvaerd, डेनमार्क) से खरीदा गया था। ब्रोमेलैन और पापेन को दासोंग संगसा (सियोल, कोरिया) से खरीदा गया था। एंटीऑक्सिडेंट और एंटी-एजिंग परीक्षणों के लिए सभी रसायन सिग्मा-एल्ड्रिच केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमएस, यूएसए) से खरीदे गए थे। इस अध्ययन में प्रयुक्त अन्य सभी अभिकर्मक और सॉल्वैंट्स विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे।

3.3. एंजाइम हाइड्रोलिसिस

एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस का उपयोग संबंधित खाद्य-ग्रेड वाणिज्यिक एंजाइमों के लिए किया गया था (निर्माता की सिफारिशों के आधार पर; तालिका 4)। तैयार पोर्सिन त्वचा मिश्रण को आसुत जल से 5 प्रतिशत की अंतिम ठोस सामग्री तक पतला किया गया था। इसकी कम चिपचिपाहट के कारण प्रवाह व्यवहार सुनिश्चित करने के लिए इस एकाग्रता का चयन किया गया था। 5 प्रतिशत पोर्सिन त्वचा मिश्रण को कोलेजन निलंबन (या नियंत्रण) कहा जाता था। एक एंजाइम पर छह खाद्य-ग्रेड वाणिज्यिक एंजाइमों का उपयोग करके रिएक्टरों में कोलेजन निलंबन को हाइड्रोलाइज्ड किया गया था: सब्सट्रेट अनुपात 1:1 00। नमूना विभाज्य (5 एमएल) को 1, 3,6, 12, और 24 घंटे के हाइड्रोलिसिस पर खींचा गया और एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए तुरंत 10 मिनट के लिए 100 डिग्री पर गर्म किया गया, इसके बाद बर्फ के पानी का उपयोग करके 0 डिग्री तक ठंडा किया गया। नमूना लेने के समय, पीएच को उपयुक्त के रूप में 1 एम NaOH का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था। ठंडा होने के बाद, नमूने 15 मिनट के लिए 4000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किए गए, और सतह पर तैरनेवाला (कोलेजन हाइड्रोलाइज़ेट; सीएच ) एकत्र किया गया। 3 kDa आणविक भार कट-ऑफ (MWCO) (UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, बर्लिंगटन, एमए, यूएसए) 60 साई नाइट्रोजन गैस पर, 20 डिग्री पर।सिस्टैंच ट्यूबुलोसा समीक्षातैयार सीएच को फ्रीज-ड्राय किया गया और विश्लेषण तक 20 डिग्री पर एयर-टाइट कंटेनर में रखा गया।

3.4. पीएच का निर्धारण, प्रोटीन रिकवरी, घुलनशीलता मुक्त अमीनो समूह सामग्री, और उत्पादन उपज नमूनों का पीएच (नियंत्रण और सीएच) एक पीएच मीटर (मॉडल S220, मेट्टलर टोलेडो जीएमबीएच, कोलंबस, ओएच, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। मानक के रूप में सीरम एल्ब्यूमिन के साथ निर्माता के निर्देशों (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमएस, यूएसए) के अनुसार, बाइसीनोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री का आकलन करके प्रोटीन की वसूली या घुलनशीलता निर्धारित की गई थी। मानक के रूप में एल-ल्यूसीन का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) के अनुसार 2,4, 6- ट्रिनिट्रोबेंजीन सल्फोनिक एसिड (टीएनबीएसए) परख के माध्यम से नि: शुल्क अमीनो समूह सामग्री निर्धारित की गई थी। उत्पादन क्षेत्र की गणना के लिए गीले और सूखे दोनों वजनों को मापा गया।

3.5. आणविक भार वितरण

3.5.1.सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज)

नमूने (नियंत्रण और सीएच) के एसडीएस-पेज पैटर्न को पहले बताई गई विधि [1 0] के अनुसार मापा गया था। नमूने 8 एम यूरिया (अंतिम प्रोटीन एकाग्रता, 4 मिलीग्राम / एमएल) से पतला थे। प्रत्येक नमूना कोमा बायोटेक इंक से केटीजी 020 नमूना बफर (ग्लिसरॉल का 10 प्रतिशत, एसडीएस का 2 प्रतिशत, ब्रोमोफेनॉल नीला का 0.003 प्रतिशत, -मर्कैप्टोएथेनॉल का 5 प्रतिशत, और 63 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 6.8) के एक हिस्से के साथ मिलाया गया था। ।, सियोल, कोरिया）, और 2 मिनट के लिए उबाले। नमूना मिश्रण 20 μL） को EzWayTM PAG 6 प्रतिशत एक्रिलामाइड जैल (KOMA Biotech Inc., सियोल, कोरिया) में लोड किया गया था। वैद्युतकणसंचलन के बाद, जेल को ठीक किया गया, दाग दिया गया और दाग हटा दिया गया। आणविक भार 10 और 210 kDa के बीच व्यापक श्रेणी के आणविक भार मानकों का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे।

3.5.2. जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी)

नमूनों का आणविक भार वितरण पहले बताई गई विधि [3] के अनुसार निर्धारित किया गया था। जेल परमिशन क्रोमैटोग्राफी (GPC) को YL91 0 0 उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) सिस्टम (YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, कोरिया) का उपयोग करके तीन अल्ट्राहाइड्रोजेल TM 120 कॉलम से लैस किया गया था। वाटर्स (मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) से 7.8×3000 मिमी)। मोबाइल चरण 1.0 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर आसुत / विआयनीकृत पानी था, और कोलेजन पेप्टाइड्स के आणविक भार वितरण की निगरानी 40 डिग्री पर YL 9100 अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर का उपयोग करके की गई थी। एक आणविक भार मानक किट (106-67,500 Da, पॉलिमर मानक सेवा, मेंज़, जर्मनी) ने मानक के रूप में कार्य किया।

3.6.अमीन0 अम्ल संरचना

नमूनों की अमीनो एसिड संरचना का विश्लेषण {0}}फ्लोरेनिल एथॉक्सी कार्बोनिल (FMOC) -क्लोराइड और o-phthalic dialdehyde (OPA) के साथ एक अंतिम 3 0 एचपीएलसी प्रणाली पर व्युत्पन्न के माध्यम से किया गया था। डायोनेक्स, इडस्टीन, जर्मनी) दो डिटेक्टरों (एक फ्लोरोसेंस डिटेक्टर और एक यूवी डिटेक्टर） और एक वीडीएसफेर 100 सी 18- ई 4.6 मिमी × 150 मिमी, 3.5 माइक्रोन कण आकार, वीडीएस ऑप्टिलाब, बर्लिन, जर्मनी) से लैस है। इंजेक्शन की मात्रा 1.0 एल थी, और मोबाइल चरण दो एलुएंट्स से बना था: एक 40 मिमी सोडियम फॉस्फेट डिबासिक (पीएच 7) और एक 45 प्रतिशत (ओ / वी) एसीटोनिट्राइल / 45 प्रतिशत (वी / वी) मेथनॉल समाधान। एक यूवी डिटेक्टर और फ्लोरेसेंस डिटेक्टर को जोड़कर, 338 एनएम पर पराबैंगनी किरणों का पता लगाया गया, ओपीए व्युत्पन्न को 450 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य और 340 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर पाया गया, एफएमओसी व्युत्पन्न को उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के 305 एनएम पर और 266 एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के एनएम। अंशांकन के लिए एक अमीनो एसिड मिश्रण (प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए 1.0 nmol mL-I) का उपयोग किया गया था।

जहां 6 एम एचसीएल (24 घंटे के लिए 130 डिग्री पर) का उपयोग करके हाइड्रोलिसिस के बाद एटोटालामिनो एसिड सामग्री थी, और आसुत जल में घुलनशीलता के बाद एफ्री एमिनो एसिड सामग्री थी।

3.7. एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का मूल्यांकन

3.7.1.2,2'-एज़िनो-बीआईएस-(3-एथिलबेनज़ोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड) (एबीटीएस) रेडिकल-स्कैवेंजिंग गतिविधि

सीएच की एबीटीएस कट्टरपंथी-मैला ढोने की गतिविधि को पहले बताई गई विधि [2 0] के अनुसार मापा गया था। ABTS रेडिकल कटियन ABTS स्टॉक सॉल्यूशन (7. 0 mM) को पोटेशियम परसल्फेट (2.45 mM) के साथ मिलाकर और परिणामी मिश्रण को रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करके उत्पन्न किया गया था। ABTS रेडिकल सॉल्यूशन को 734 एनएम पर 0.70 ± 0.02 के अवशोषण स्तर तक 5.0 एमएम फॉस्फेट-बफर खारा (पीएच7.4) में पतला किया गया था। पतला एबीटीएस कट्टरपंथी समाधान का एक एमएल प्रत्येक नमूने के 1 एमएल के साथ मिलाया गया था। दस मिनट बाद, नमूना (नमूना के साथ एक नमूना) और नियंत्रण (नमूना के बिना एक नियंत्रण) अवशोषण को 734 एनएम पर मापा गया। एबीटीएस रेडिकल-स्कैवेंजिंग गतिविधि (प्रतिशत) की गणना इस प्रकार की गई:

3.7.2. शक्ति को कम करना

सीएच की कम करने की शक्ति को पहले बताई गई विधि [2 0] अनुसार मापा गया था। प्रत्येक नमूने के एक एमएल को 1 एमएल 0.2 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.6) और 1 एमएल 1 प्रतिशत पोटेशियम फेरिकैनाइड के साथ मिलाया गया था। मिश्रण को 20 मिनट के लिए 5 0 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था, और फिर 10 प्रतिशत ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड का 1 एमएल जोड़ा गया था। इस ऊष्मायन मिश्रण से 2 एमएल का एक विभाज्य 2 मिलीलीटर आसुत जल और 0.4 एमएल 0.1 प्रतिशत फेरिक क्लोराइड के साथ मिलाया गया था। 10 मिनट के बाद, परिणामी समाधान का अवशोषण एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (ऑप्टिज़ेन, मेकैसिस कं, डेजॉन, कोरिया) पर 700 एनएम पर मापा गया था, प्रतिक्रिया मिश्रण के बढ़े हुए अवशोषण (700 एनएम पर) को कम करने वाली शक्ति को इंगित करने के लिए माना जाता था।

3.8. एंटी-एजिंग प्रभाव का मूल्यांकन

3.8.1. टायरोसिनेस गतिविधि का निषेध

टायरोसिनेस निषेध पहले वर्णित विधि [20] द्वारा निर्धारित किया गया था। एक प्रीमिक्सचर सॉल्यूशन जिसमें 0.1 एम फॉस्फेट बफर pH6.8）,30uLof मशरूम tyrosinase（167U/mL का 70 μL होता है; सिग्मा-एल्ड्रिच, यूएसए), और 20 एल नमूना 30 डिग्री पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। लगभग 100μL 3,4-डायहाइड्रॉक्सी फिनाइल-एल-अलैनिन （L-DOPA） को तब एंजाइमी प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए जोड़ा गया था। L-DOPA गठन की निगरानी के लिए 20 मिनट के लिए 492 एनएम पर अवशोषण मापा गया था। एस्कॉर्बिक एसिड (1 मिलीग्राम / एमएल) ने एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया, जिसका उपयोग तुलना के लिए किया गया था। निषेध अनुपात की गणना निम्नानुसार की गई थी:

जहां ए बिना नमूने के टायरोसिनेस का मिश्रण था; बी नमूना और टायरोसिनेस के बिना मिश्रण था; सी नमूना और टायरोसिनेस के साथ एक मिश्रण था, और डी एक नमूने के साथ मिश्रण था लेकिन टायरोसिनेस के बिना।

3.8.2. कोलेजनेज गतिविधि का निषेध

Collagenase निषेध पहले वर्णित विधि [2 0] द्वारा निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, 50 mM ट्राइसिन बफर (pH7.5) जिसमें 10 mM कैल्शियम क्लोराइड और 400 mM सोडियम क्लोराइड तैयार किया गया था। फिर, 50mLof a 1.0mM N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala घोल और 0.2 mg/ml कोलेजेनेज (क्लोस्ट्रीडियम हिस्टोलिटिकम से, टाइप IA, 0.{ {19}} FALGPA U/mg सॉलिड; सिग्मा-एल्ड्रिच, यूएसए) को नमूनों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में जोड़ा गया। साइट्रिक एसिड (6 प्रतिशत) जोड़कर प्रतिक्रिया को रोक दिया गया था। प्रतिक्रिया मिश्रण को एथिल एसीटेट जोड़कर अलग किया गया था। सतह पर तैरनेवाला का अवशोषण 345 एनएम मापा गया था। एस्कॉर्बिक एसिड (1 मिलीग्राम / एमएल) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता था और तुलना के लिए उपयोग किया जाता था। निषेध के प्रतिशत की गणना इस प्रकार की गई:

जहां ए बिना नमूने के कोलेजिनेज का मिश्रण था; बी नमूना और कोलेजेनेज के बिना मिश्रण था; सी नमूना और कोलेजनेज के साथ एक मिश्रण था, और डी एक नमूने के साथ मिश्रण था, लेकिन बिना कोलेजनेज़ के।

3.8.3.इलास्टेज गतिविधि का निषेध

इलास्टेज निषेध पहले वर्णित विधि [2 0] द्वारा निर्धारित किया गया था। N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) ने सब्सट्रेट के रूप में कार्य किया, और p-nitroaniline की रिहाई की निगरानी 2{{20}} के लिए की गई। 25 डिग्री पर न्यूनतम। IV पोर्सिन अग्नाशयी इलास्टेज (पीपीई) का एक भाग (1 कुरूप) 0 के 1 एमएल में भंग कर दिया गया था। 2 एम ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 8. 0)। प्रतिक्रिया मिश्रण में 0.2 एम ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 8.0), 1 पीपीएम पीपीई, 0.8 मिमी सुक-अला-अला-अला-पीएनए, नमूना और उपरोक्त सब्सट्रेट शामिल थे। 214 एनएम पर अवशोषण मापा गया था । एस्कॉर्बिक एसिड (1 मिलीग्राम / एमएल) तुलना के लिए उपयोग किए जाने वाले सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। निषेध अनुपात की गणना निम्नानुसार की गई थी:

जहां ए इलास्टेज के साथ और बिना नमूने का मिश्रण था; बी नमूना और इलास्टेज के बिना मिश्रण था; सी नमूना और इलास्टेज के साथ एक मिश्रण था, और डी एक नमूने के साथ मिश्रण था लेकिन इलास्टेज के बिना था।

3.9.सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। समूहों के बीच अंतर के महत्व का मूल्यांकन कई तुलनाओं और विचरण (ANOVA) के विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था, इसके बाद तुकी ईमानदार महत्वपूर्ण अंतर (HSD) परीक्षण किया गया था। 0.05 से कम के p मानों वाले अंतरों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया।

4। निष्कर्ष

इस अध्ययन में, कोलेजन हाइड्रोलिसेट्स, एक कार्यात्मक खाद्य घटक, एंजाइमी हाइड्रोलिसिस के माध्यम से सफलतापूर्वक उत्पादित किया गया था, इसके बाद अल्ट्राफिल्ट्रेशन और शुद्धिकरण किया गया था। उचित कोलेजन हाइड्रोलिसेट्स के निर्माण में उनकी संभावित उपयोगिता के लिए विभिन्न वाणिज्यिक प्रोटीज का परीक्षण किया गया। अल्कलेज़ द्वारा हाइड्रोलाइज्ड सीएचएस सबसे प्रभावी रूप से हाइड्रोलाइज्ड सीएच था, और शुद्धिकरण के बाद अल्ट्राफिल्ट्रेशन कम आणविक भार वाले सक्रिय पेप्टाइड्स बनाने में प्रभावी था। परिणामों से पता चला कि सीएच ने उत्कृष्ट एंटीऑक्सीडेंट और कोलेजनेज़ अवरोध गतिविधियों को प्रदर्शित किया। इसलिए, इस अध्ययन से प्राप्त सीएच का उपयोग भोजन, सौंदर्य प्रसाधन, या दवा उद्योगों में एक प्राकृतिक योजक के रूप में किया जा सकता है, जिसमें एंटी-ऑक्सीडेटिव और एंटी-एजिंग गुण होते हैं। मानव त्वचा में सक्रिय पेप्टाइड्स की उम्र बढ़ने की गतिविधियों के इन विवो मूल्यांकन से जुड़े आगे के अध्ययन उपयोगी साबित हो सकते हैं।

यह लेख अणु 2019, 24, 1104 से निकाला गया है; डीओआई:10.3390/अणु24061104 www.mdpi.com/journal/molecules