एथेनोलिक मेथी का अर्क: त्वचा की उम्र बढ़ने के खिलाफ इसके आणविक तंत्र और नैनोएनकैप्सुलेशन द्वारा उन्नत कार्य 2

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2.5. मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता और कोलेजन उत्पादन पर एलएनएफ और मेथी के अर्क का प्रभाव

तैयार किए गए एलएनएफ की साइटोटोक्सिसिटी की जांच करने के लिए, कोशिकाओं को रिक्त, एलएनएफ, और मेथी के अर्क के साथ {{0}} ug/mL (दो गुना कमजोर पड़ने) के लिए 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था। सेल व्यवहार्यता को MTT परख का उपयोग करके मापा गया। जैसा कि चित्र 6a में दिखाया गया है, निकालने-उपचारित कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता कम हो गई, जबकि रिक्त और LNF- उपचारित कोशिकाओं में कोई प्रभाव नहीं देखा गया। डेटा ने संकेत दिया कि एलएनएफ ने अर्क की तुलना में कम विषाक्तता दिखाई। हमने आगे मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कोलेजन उत्पादन को शामिल करने पर एलएनएफ की क्षमता की जांच की। कोशिकाओं को 7 कुरूप/एमएल अर्क और 1 {{2 0}} 0 एलएनएफ के कुरूप/एमएल 7 कुरूप/एमएल निकालने के साथ इलाज किया गया था, एक नियंत्रण के रूप में रिक्त कणों के साथ, for7 और 14 दिन। जैसा कि चित्र 6बी में दिखाया गया है, एलएनएफ के साथ उपचार के लिए, सना हुआ कोलेजन की मात्रा में उपचार निकालने की तुलना में क्रमशः 7 और 14 दिनों में 30 प्रतिशत और 50 प्रतिशत की वृद्धि हुई थी। इसके अतिरिक्त, चित्रा 2ए में, तैयार एलएनएफ ने एंटी-कोलेजनेज गतिविधि को बढ़ाया, क्योंकि मेथी निकालने (0.57 ± 0.02 मिलीग्राम / एमएल) की तुलना में आईसी 5o को 0.21 ± 0.03 मिलीग्राम / एमएल तक काफी कम कर दिया गया था। इन परिणामों ने प्रदर्शित किया कि एलएनएफ का निर्माण मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कोलेजन उत्पादन के एक प्रेरण को प्रबल कर सकता है और मेथी निकालने की एंटी-कोलेजनेज गतिविधि को बढ़ा सकता है। यह संभव है कि मेथी के अर्क का नैनो-सूत्रीकरण एंटी-एजिंग उत्पादों में एक सक्रिय संघटक के रूप में इसकी शक्ति में काफी सुधार करता है।

2.6. यूवी एक्सपोजर के बाद एमएमपी1, एमएमपी9, आईएल-6, और आईएल-8 निषेध पर तैयार एलएनएफ की भूमिका

हमने अगली बार एंटी-एजिंग गतिविधि पर एलएनएफ के कुछ संभावित तंत्रों की जांच की। यूवी एक्सपोजर त्वचा की उम्र बढ़ने के मुख्य नियामकों में से एक है, क्योंकि यह मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनस (एमपी) परिवार के कुछ सदस्यों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है, जो एमएमपी 1, एमएमपी 3 और एमएमपी 9 सहित कोलेजन के पतन का कारण बनता है [34,35] . हमने देखा कि यूवी एक्सपोजर सह-संवर्धित त्वचा कोशिकाओं (चित्रा 7 ए) के लिए अत्यधिक जहरीला था और एमएमपी 1 और एमएमपी 9 साइटोकिन्स (चित्रा 7 बी) के उत्पादन में वृद्धि हुई। इसके अलावा, मेथी निकालने और तैयार एलएनएफ के उपचार स्राव को काफी कम करने में सक्षम थे। यूवी विकिरण के बाद नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में MMP1 और MP9 की। ये परिणाम एंटी-एजिंग एजेंट नियंत्रण के रूप में रुटिन और रेस्वेराट्रोल के उपचार के अनुरूप थे। विशेष रूप से, LNF- उपचारित कोशिकाओं में MMP1 और MMP9 अभिव्यक्तियों की कमी अर्क उपचार की तुलना में काफी कम थी। इसलिए, एलएनएफ यूवी एक्सपोजर पर एमपीआई और एमएमपी 9 के स्राव को कम कर सकता है, और बाद में फोटो-प्रेरित त्वचा की उम्र बढ़ने को रोक सकता है।

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इसके अतिरिक्त, मानव त्वचा पर यूवीआर का एक्सपोजर भी सूजन और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन सक्रियण, जैसे टीएनएफ- और इंटरल्यूकिन्स, आईएल -1, आईएल -2, आईएल {{4} सहित शामिल करने में मध्यस्थता कर सकता है। }, और आईएल-8 [36]। हमने तब आईएल -6 और आईएल -8 सहित यूवी-उत्तेजित भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन के निषेध पर एलएनएफ के कार्य की जांच की। चित्रा 7 सी में, हमने देखा कि यूवी विकिरण ने आईएल के उत्पादन में काफी वृद्धि की है {{ 11}} और IL-8 सह-संवर्धित त्वचा कोशिकाओं में साइटोकिन्स। नियंत्रण की तुलना में मेथी निकालने के उपचार के साथ आईएल -6 और आईएल -8 अभिव्यक्तियों में उल्लेखनीय कमी देखी गई। दिलचस्प बात यह है कि मेथी के अर्क के उपचार ने रुटिन की तुलना में काफी अधिक आईएल -6 और आईएल -8 अवरोध प्रदर्शित किए, जहां ये निरोधात्मक गतिविधियां रेस्वेराट्रोल-उपचारित समूहों के समान थीं। विशेष रूप से, एलएनएफ-उपचारित कोशिकाओं में आईएल -6 और आईएल -8 के भाव यूवी एक्सपोजर के बाद मेथी निकालने वाले समूह की तुलना में काफी कम थे। साथ में, इन परिणामों ने संकेत दिया कि एलएनएफ संभावित रूप से यूवी-मध्यस्थ आईएल -6 और आईएल -8 उत्पादन को रोक सकता है, और बाद में फोटो-उत्तेजित त्वचा की सूजन और त्वचा की उम्र बढ़ने को रोक सकता है।नतीजतन, इन परिणामों से पता चलता है कि मेथी के एथेनॉलिक अर्क और इसके नैनो-निर्माण को संभावित रूप से उम्र बढ़ने की रोकथाम के लिए सक्रिय अवयवों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

3. चर्चा

कई अध्ययनों [29,37] में मेथी के अर्क में एंटीऑक्सिडेंट, एंटीरेडिकल और एंटी-इंफ्लेमेटरी गतिविधियों का प्रदर्शन किया गया है, हालांकि इसकी शिकन-रोधी संपत्ति का अभी भी दोहन नहीं किया गया है। यह शोध इन विट्रो कोलेजनेज इनहिबिटरी परख का उपयोग करके मेथी के अर्क की एक एंटी-एजिंग गतिविधि की पहचान करने वाला पहला था। पूर्व के अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि अंगूर पोमेस एक्सट्रैक्ट [38], ग्रीन टी एक्सट्रैक्ट [39], और मशरूम एक्सट्रैक्ट [40] जैसे कॉस्मीस्यूटिकल उत्पादों में सक्रिय संघटक के रूप में एंटी-कोलेजनेज गतिविधि वाले पौधे के अर्क का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कोलेजन उत्पादन पर मेथी के अर्क का प्रभाव कभी नहीं बताया गया है। तमारा एट अल। (2006) ने मेथी के अर्क के एक सक्रिय यौगिक के रूप में रुटिन का उपयोग करके मानव फाइब्रोब्लास्ट में कोलेजन संश्लेषण पर फ्लेवोनोइड्स के प्रभाव का प्रदर्शन किया है, जो कोलेजन को बढ़ाने में मदद करता है [41]। मेथी के इस अध्ययन ने अपनी होनहार विरोधी उम्र बढ़ने की क्षमता को दिखाया और एक जैविक मार्कर के रूप में रुटिन का प्रतिनिधित्व किया।

रुटिन (3),4',5.7-टेट्राहाइड्रॉक्सी-फ्लेवोन-3-रूटिनोसाइड) का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था क्योंकि यह एक फ्लेवोनोल ग्लाइकोसाइड है जिसे फागोपाइरम एस्कुलेंटम मोएनच, रूटा सहित कई पौधों में रिपोर्ट किया गया है। ग्रेवोलेंस एल, सोफोरा जैपोनिका एल।, नीलगिरी एसपीपी। [37एल, और मेथी [17] रुटिन में एंटीऑक्सिडेंट, साइटोप्रोटेक्टिव, एंटीकार्सिनोजेनिक, न्यूरोप्रोटेक्टिव और कार्डियो-प्रोटेक्टिव गतिविधियां होती हैं, जो उम्र बढ़ने और उम्र बढ़ने से संबंधित बीमारियों की रोकथाम में इसके ऐप्लिकेटर का प्रस्ताव करती हैं। हमारे परिणामों से पता चला है कि तैयार अर्क ने उच्च मात्रा में रुटिन सामग्री प्रदर्शित की, जो अन्य अध्ययनों में मेथी के अर्क के एक घटक के रूप में शायद ही पाया या पाया गया था। अधिकांश अन्य अध्ययनों ने मेथी के अर्क [18,37,38,42-47] के एक प्रमुख रासायनिक घटक के रूप में त्रिकोणलाइन की सूचना दी है।

यहां तक ​​कि मेथी के अर्क में एंटी-एजिंग एजेंट के रूप में संभावित गतिविधि होती है। इसका रंग और स्थिरता अभी भी इस एप्लिकेशन के लिए एक चुनौती है। नैनोएनकैप्सुलेशन को एक विशिष्ट तकनीक के रूप में सूचित किया गया है जो गंध को स्थिर करने, पानी की घुलनशीलता को बढ़ाने, जैविक यौगिकों की रिहाई को नियंत्रित करने और प्राकृतिक उत्पादों की भौतिक उपस्थिति में सुधार करने में सक्षम है। इस अध्ययन में लिपोनियोसोम को इसके अद्वितीय गुणों के कारण लागू किया गया है, जो हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक मोअर्स से बने होते हैं, जो विभिन्न घुलनशीलता वाले पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला को समाहित कर सकते हैं [50]। हमने मेथी का अर्क इनकैप्सुलेटेड लिपोसोम (LNF) तैयार किया, जो एक हाइब्रिड वाहक है जिसमें लिपोसोम और निओसोम विशेषताएं शामिल हैं। विकसित एलएनएफ के संकर घटकों की पुष्टि डीएससी का उपयोग करते हुए पिघलने के तापमान द्वारा की गई थी, जो लिपोसोम और निओसोम दोनों की तापीय विशेषताओं को दर्शाती है।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

स्ट्रेटम कॉर्नियम त्वचा की एक बाहरी परत है जो हानिकारक पदार्थों के खिलाफ प्रभावी अवरोध के रूप में काम करती है, जिससे त्वचा में उनके परिवहन को प्रतिबंधित किया जाता है। हालांकि, इस अवरोध के माध्यम से दवाओं या पदार्थों के प्रवेश को बढ़ाकर नैनोकैरियर्स का उपयोग ट्रांसडर्मल डिलीवरी में सुधार करने के लिए सिद्ध हुआ है। ट्रांसडर्मल डिलीवरी पर एलएनएफ की क्षमता की जांच करने के लिए, पूर्व विवो पोर्सिन त्वचा के प्रवेश को नियोजित किया गया है क्योंकि इसकी शारीरिक विशेषताएं ज्यादातर मानव त्वचा के समान होती हैं, त्वचा की मोटाई, कूपिक संरचना और बालों के घनत्व के मामले में [52]। हमारे परिणामों से पता चलता है कि एलएनएफ की पारगम्यता मेथी के अर्क और रुटिन की तुलना में अधिक और गहरी थी, और एलएनएफ के रिलीजिंग प्रोफाइल में मेथी के अर्क की तुलना में धीमी रिलीज थी, यह सुझाव देते हुए कि तैयार एलएनएफ त्वचा के प्रवेश पर निकालने की तुलना में काफी बेहतर था। इसके अतिरिक्त, तैयार एलएनएफ ने एंटी-कोलेजनेज गतिविधि को बढ़ाया, क्योंकि आईसी-ए को 0.205 ±0.03mg/mL मेथी की तुलना में काफी कम कर दिया गया था अर्क (0.567 ± 0.02 मिलीग्राम/एमएल)। इन परिणामों ने प्रदर्शित किया कि एलएनएफ का निर्माण मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कोलेजन उत्पादन के एक प्रेरण को प्रबल कर सकता है और मेथी निकालने की एंटी-कोलेजनेज गतिविधि को बढ़ा सकता है। मेथी के अर्क का नैनो-सूत्रीकरण संभावित रूप से उम्र बढ़ने की रोकथाम के लिए एक सक्रिय संघटक के रूप में इसका उपयोग करके इसकी शक्ति में सुधार करने में मदद करता है।

यूवी विकिरण का एक्सपोजर बाहरी त्वचा की उम्र बढ़ने का मुख्य कारक है, जिसे प्री-मेच्योर एजिंग या फोटोएजिंग के रूप में जाना जाता है [53.54]। विकिरण त्वचा केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट के सेल सतह रिसेप्टर्स के सक्रियण का कारण बनता है, जिससे त्वचीय बाह्य मैट्रिक्स अभिव्यक्तियों, विशेष रूप से मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस परिवार (एमपी) को शामिल किया जाता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि यूवीए की कम खुराक के लंबे समय तक संपर्क से कोलेजनेज के mRNA स्तर -1 (MMP1), स्ट्रोमेलीसिन -1 (MMP3), और जिलेटिनस A (MMP2) [55] में वृद्धि होती है। नतीजतन, त्वचा कोलेजन लोचदार फाइबर का क्षरण, साथ ही साथ नए कोलेजन संश्लेषण का बंद होना होता है। यह घटना त्वचा की अखंडता, लोच और संरचना को प्रभावित करती है, त्वचा के सुरक्षात्मक कार्यों के विनियमन के बाद, झुर्रियों के गठन और त्वचा की उम्र बढ़ने के संकेतों के लिए लेखांकन [54,56]। इसके अलावा, मानव त्वचा पर यूवीआर का एक्सपोजर टीएनएफ-अल्फा की अभिव्यक्ति में मध्यस्थता करता है, जो त्वचा में सूजन कैस्केड का एक महत्वपूर्ण नियामक है। यूवी विकिरण भी सूजन और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन स्राव दोनों की सक्रियता शुरू करता है, जैसे कि इंटरल्यूकिन -2 (आईएल -2) और इंटरल्यूकिन -6 (1 एल -6) [36] . नतीजतन, इस यूवीआर-प्रेरित सूजन प्रतिक्रिया में लाली, जलन, और एरिथेमा [35.59] के संकेतों के साथ जली हुई त्वचा को शामिल करने में महत्वपूर्ण भूमिका होती है।

इसलिए, समय से पहले बूढ़ा होने के कारण को रोकने के लिए, इन निवारक कार्यों के साथ कुछ नए सक्रिय एजेंटों की खोज आदर्श होगी। हमारे परिणामों ने प्रदर्शित किया कि एलएनएफ का निर्माण मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कोलेजन उत्पादन को शामिल कर सकता है, यूवी एक्सपोजर पर एमपी 1, एमपी 9, आईएल -6, और आईएल -8 के स्राव को कम कर सकता है, और कर सकता है मेथी के अर्क की एंटी-कोलेजनेज गतिविधि को बढ़ाएं। इसलिए, एक एथेनॉलिक मेथी का अर्क और इसका नैनो-सूत्रीकरण कॉस्मीक्यूटिकल उत्पादों में एक उपन्यास सक्रिय संघटक के रूप में संभावित उपयोग का हो सकता है और यह कि नैनोएनकैप्सुलेशन मेथी के अर्क के कार्य और गतिविधि को एक एंटी-एजिंग एजेंट के रूप में बढ़ाने में सक्षम है। 4. सामग्री और तरीके

4.1. संयंत्र सामग्री और रासायनिक अभिकर्मक

Fenugreek seed powder was received from Herbal Acharn'sHome Co.,Ltd. (Bangkok, Thailand). Rutin trihydrate (>98 प्रतिशत शुद्धता), ट्राइसीन बफर, क्लोस्ट्रीडियम हिस्टोलिटिकम से कोलेजनेज़ और FALGPA (N- [3 ({3}} फ़्यूरिल) एक्रिल) -ल्यू-ग्लाइ-प्रो-अला), प्रत्यक्ष लाल 80, पिक्रिक एसिड, और डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड थे। सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया एसीटोनिट्राइल, एथिल एसीटेट, एब्सोल्यूट इथेनॉल, फॉर्मिक एसिड, सोडियम डिहाइड्रेट फॉस्फेट, डिसोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट, हाइड्रोक्लोरिक एसिड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड कार्लो एर्बा (एमेन्डेन, जर्मनी) से खरीदे गए थे। वाणिज्यिक ग्रेड इथेनॉल इटालमार कं, लिमिटेड (बैंकॉक, थाईलैंड) से खरीदा गया था। कोलेस्ट्रॉल Cosmeplus Co., Ltd. (बैंकॉक, थाईलैंड) से खरीदा गया था। प्रोपलीन ग्लाइकोल और सॉल्युबिलाइज़र मिश्रण S.Tong Chemicals Co, Ltd से खरीदे गए थे। (नोंथबुरी, थाईलैंड)। Sorbitan oleate को Croda Co., Ltd. (बैंकॉक, थाईलैंड) से खरीदा गया था। कारगिल सियाम लिमिटेड (बैंकॉक, थाईलैंड) से फॉस्फोलिपिड (फॉस्फोलिपॉन 90 जी) का पीछा किया गया था। टोकोफेरोल एसीटेट नामसियांग कंपनी लिमिटेड (बैंकॉक, थाईलैंड) से खरीदा गया था। परिरक्षक Forecus Co., Ltd. (बैंकॉक, थाईलैंड) से खरीदा गया था। Paraformaldehyde हिमाडिया प्रयोगशालाओं (मुंबई, भारत) से खरीदा गया था और 3- (4, 5- डाइमिथाइलथियाज़ोल -2- yl) -2, 5- डिपेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड को Calbiochem से खरीदा गया था। (बर्लिंगटन, एमए, यूएसए)।

4.2.निष्कर्षण

मेथी के बीज का पाउडर (500 ग्राम) 3 दिनों के लिए 95 प्रतिशत इथेनॉल (1:5) के साथ मिश्रित किया गया था। निष्कर्षण को तीन बार (3×2500 एमएल) दोहराया गया था। पूरे अर्क समाधान को फ़िल्टर किया गया था, एक रोटरी बाष्पीकरण (हीडॉल्फ, श्वाबैक, जर्मनी) का उपयोग करके 40 डिग्री पर 100 एमबार के तहत इथेनॉल वाष्पित हो गया था। प्राप्त अर्क 5 प्रतिशत उपज (w/w) के साथ तैलीय पीले-भूरे रंग का पेस्ट था और इसे उपयोग करने तक 4 डिग्री पर रखा गया था।

4.3. यूएचपीएलसी सत्यापन और मेथी निकालने में रुटिन की पहचान

मेथी के अर्क का विश्लेषण करने के लिए एक मानक मार्कर के रूप में रुटिन ट्राइहाइड्रेट का उपयोग किया गया था। UHPLC पद्धति को रैखिकता, सटीकता, सटीकता और संवेदनशीलता के संदर्भ में विकसित और मान्य किया गया था [31,32] एक शिमदज़ु एलसी द्वारा -30 AD UHPLC सिस्टम जिसमें एक डायोड एरे डिटेक्टर SPD-M2 0A और शामिल हैं। एक ऑटोसैंपलर एसआईएल -30एसी। इस विधि में 30 डिग्री पर SUPLECO Titan C18column (5cm ×2.1mm,1.9 um, SUPLECO, Burlington,VT, USA) का इस्तेमाल किया गया और 26{{ की तरंग दैर्ध्य का पता लगाया गया। 19}} एनएम। मोबाइल चरण को केनी एट अल से अनुकूलित किया गया था। [45]। संक्षेप में, 0.0अल्ट्राप्योर पानी (ए) में 5 प्रतिशत वी/वी फॉर्मिक एसिड समाधान और एसीटोनिट्राइल (बी) में 0.05 प्रतिशत वी/वी फॉर्मिक एसिड तैयार किया गया था। ढाल मोड में 0.25 एमएल/मिनट के प्रवाह के साथ: प्रारंभिक स्थिति 1.0 मिनट के लिए 10 प्रतिशत बी थी, 3.5 मिनट के लिए 75 प्रतिशत बी तक बढ़ गई, 0.75 मिनट के लिए 10 प्रतिशत बी तक घट गई, और 0.25 मिनट के लिए आयोजित की गई।

4.4. कोलेजनेज़ परख

कोलेजन-विरोधी गतिविधि [60] को निर्धारित करने के लिए एक कोलेजनेज़ परख की गई। मिश्रण समाधान, जिसमें 50 एमएम ट्राइसिन बफर सॉल्यूशन pH7.5）, 2 यूनिट्स का 25 μL/एमएल कोलेजेनेज क्लोस्ट्रीडियम हिस्टोलिटिकम टाइप IA）, और नमूना का 25 μL शामिल है, तैयार किया गया था और 15 के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया था। मि. प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, सिंथेटिक सब्सट्रेट के 10 uL और N-[3-(2-Furyl) acryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA) के 2mM को मिश्रण समाधान में जोड़ा गया और इनक्यूबेट किया गया। 20 मिनट के लिए। प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला के अवशोषण में परिवर्तन को 340 एनएम (सिनर्जी एच1 माइक्रोप्लेट रीडर) पर मापा गया था और आईसीएसओ मूल्यों की गणना एक्स-अक्ष पर नमूना सांद्रता और वाई-अक्ष पर प्रतिशत अवरोध दिखाते हुए एक रैखिक प्रतिगमन वक्र की साजिश रचकर की गई थी। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके प्रतिशत निषेध की गणना की गई थी:

4.5. सेल संस्कृति

मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से खरीदा गया था: एटीसीसी (पीसीएस -201-010) और अमर मानव केराटिनोसाइट्स (एचसीएटी) सेल लाइन्स सर्विस, जर्मनी (कैट नंबर 300493) से खरीदे गए थे। 10 प्रतिशत FBS (गिब्को, यूके), 1 प्रतिशत पेनिसिलिन (100units/mL), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 ug/mL) (गिब्को, सेंट लुइस) के पूरक के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) (गिब्को, यूके) में कोशिकाओं की खेती की गई। , एमओ, यूएसए)। कोशिकाओं को 5 प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण के तहत 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था।

4.6. कोलेजन सामग्री और पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग

मानव त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 2.5 × 1 0 4 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 48 अच्छी प्लेटों में डाला गया और 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को तब लिपोनियो के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था-कुछ अर्क के बिना (रिक्त के रूप में इंगित), लिपोनियोसम एनकैप्सुलेटिंग मेथी निकालने (एलएनएफ), और मेथी निकालने के लिए 7 और 14 दिनों के लिए, 0 0 5 प्रतिशत के साथ डीएमएसओ वाहन नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। मीडिया को हर 2 दिन में बदल दिया गया। कोशिकाओं को तब पीबीएस से धोया गया था और 10 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पीएफए ​​​​के 100 यूएल के साथ तय किया गया था। कोशिकाओं को पीबीएस (दो बार) से धोया गया और 10 मिनट के लिए 0.1 प्रतिशत प्रत्यक्ष लाल 80 समाधान के 100 यूएल के साथ दाग दिया गया। धुंधला होने के बाद, अतिरिक्त डाई को धोने के लिए 70 प्रतिशत इथेनॉल में 0.01NHCl मिलाया गया। सना हुआ कोलेजन 0.5 एन NaOH के 10 यूएल के साथ भंग कर दिया गया था और अवशोषण को माइक्रोप्लेट रीडर (सिनर्जी एच 1 माइक्रोप्लेट रीडर) का उपयोग करके 540 एनएम पर मापा गया था। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके कोलेजन सामग्री के प्रतिशत की गणना की गई:

4.7. सेल व्यवहार्यता परख

मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 2 × 104 कोशिकाओं / कुओं में 96 अच्छी तरह से प्लेटों में डाला गया और 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन के बाद, बिना अर्क (रिक्त), एलएनएफ, और मेथी के अर्क के लिपोसोम के विभिन्न सांद्रता (0-100 कुरूप / एमएल) जोड़े गए और 24 घंटे के लिए खेती की गई। फिर, एमटीटी 1 मिलीग्राम/एमएल） के 100 μL को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और 4 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। फॉर्मेज़ान उत्पाद को भंग करने के लिए डीएमएसओ जोड़ा गया था। एक माइक्रोप्लेट रीडर (सिनर्जी एचएल माइक्रोप्लेट रीडर) का उपयोग करके अवशोषण को 570 एनएम पर मापा गया था। सेल व्यवहार्यता के प्रतिशत की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की गई थी:

4.8.लिपोनियोसोम सूत्रीकरण

होमोजेनाइजेशन के बाद प्री-इमल्सीफिकेशन को लिपोसोम फॉर्मूलेशन के लिए नियोजित किया गया था। एक फॉस्फोलिपिड और इमल्सीफायर मिश्रण का उपयोग गोलाकार लिपिड बाईलेयर बनाने के लिए किया गया था और कोलेस्ट्रॉल का उपयोग कणों की कठोरता को बढ़ाने के लिए किया गया था [15]। संक्षेप में, सोयाबीन लेसिथिन, कोलेस्ट्रॉल और पायसीकारकों को प्रोपलीन ग्लाइकोल में फैलाया गया और 70-80 डिग्री (तेल चरण) पर गर्म किया गया, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। मेथी के अर्क को प्रोपलीन ग्लाइकोल / पानी (पानी के चरण) में भंग कर दिया गया था और गर्म किया गया था। एक ही पानी का स्नान। अर्क के जलीय घोल को लगातार लिपिड घटकों में जोड़ा गया था और उच्च गति वाले सरगर्मी (हीडॉल्फ साइलेंट क्रशर एम, केनिलवर्थ, एन, यूएसए) का उपयोग करके 8000-100 आरपीएम पर 5-10 मिनट के लिए समरूप बनाया गया था। मिश्रण को ठंडा किया गया था। 50 डिग्री और टोकोफेरॉल एसीटेट जोड़ा गया और एलएनएफ प्राप्त करने के लिए एक और 1 0 मिनट के लिए समरूप बनाया गया। एलएनएफ की आकृति विज्ञान ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम, जेईओएल, पीबॉडी, एमए, यूएसए) द्वारा देखा गया था, जिसमें हाइड्रोडायनामिक आकार, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स पीडीएल, और जीटा क्षमता की जांच गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस, नैनोसाइज़र जेडएस, मालवर्न इंस्ट्रूमेंट्स, वोरस्टरशायर) का उपयोग करके की गई थी। यूके)। अंतर स्कैनिंग कैलोरीमेट्री (डीएससी, मेट्टलर टोलेडो डीएससी 1) का उपयोग करके लिपोसोम-पिघलने वाले व्यवहार की पुष्टि की जांच की गई थी। नमूने की चिपचिपाहट को एक डिजिटल ब्रुकफील्ड विस्कोमीटर (मॉडल HBDV-IIIU CP) द्वारा मापा गया था। संक्षेप में, 0.5 ग्राम नमूनों का उपयोग किया गया था और परिवेश के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.5 आरपीएम पर नियंत्रित गति के साथ सीपी -40 स्पिंडल का उपयोग करके चिपचिपाहट की जांच की गई थी।

एलएनएफ की स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए, कणों को 4 डिग्री, 25 डिग्री और 3 महीने के लिए 40 डिग्री पर रखा गया था, और कण आकार और आकारिकी में परिवर्तन की जांच की गई थी।

लिपोसोम और नॉइज़म एनकैप्सुलेशन मेथी का अर्क (LF और NF) LNF के समान विधि का उपयोग करके तैयार किया गया था। तेल चरण में सॉर्बिटान ओलेट को शामिल किए बिना एलएफ तैयार किया गया था, जबकि निओसोम (एनएफ) फॉस्फोलिपिड घटक को शामिल किए बिना तैयार किया गया था। पूरक तालिका S1 में उनके भौतिक रासायनिक लक्षण बताए गए थे।

4.9. एनकैप्सुलेशन दक्षता और बायोएक्टिव लोडिंग का प्रतिशत

एलएनएफ की एनकैप्सुलेशन दक्षता (प्रतिशत ईई) और बायोएक्टिव लोडिंग (प्रतिशत बीएल) की गणना अल्ट्राफिल्ट्रेशन तकनीक का उपयोग करके एनकैप्सुलेटेड दवा की मात्रा निर्धारित करके की गई थी। रुटिन की मात्रा को एक मानक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एलएनएफ के 20 मिलीग्राम/एमएल को डीआई पानी में घोलने के बाद, इसे 80, 000 आरपीएम पर 4 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और फिर अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी तकनीक (UHPLC) [61] का उपयोग करके अनकैप्सुलेटेड रुटिन का मूल्यांकन किया गया था। प्रतिशत ईई और प्रतिशत बीएल की गणना निम्नलिखित समीकरणों द्वारा की गई:

4.10.फ्रांज डिफ्यूजन सेल

मेथी के अर्क और एलएनएफ के 7mg/mL के इन विट्रो पारगम्य अध्ययन की जांच फ्रांज डिफ्यूजन सेल सिस्टम [62] में की गई थी। सिंथेटिक झिल्ली (बायोमैक्स 5 0 0 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिस्क, मर्क, एमए, यूएसए) को डोनर और रिसेप्टर कम्पार्टमेंट के बीच रखा गया था। 5.5 के पीएच के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 50 आरपीएम (37 डिग्री) पर उभारा गया था और एक रिसेप्टर माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया गया था। मेथी का अर्क और एलएनएफ को डोनर सेल कैप में झिल्ली पर लगाया गया था। नमूनों को झिल्ली के माध्यम से पार किया गया और रिसेप्टर डिब्बे से 0,2,4,6,8,12, और 24 घंटे में एकत्र किया गया। संचयी पारगम्य रुटिन का मूल्यांकन और गणना यूएचपीएलसी तकनीक द्वारा की गई थी।

4.11.पोर्सिन त्वचा पारगम्यता

पोर्सिन त्वचा के माध्यम से एलएनएफ के पारगमन की कल्पना मास माइक्रोस्कोप (IMS, SHIMADZU, मॉडल: iMScopoe TRIO, क्योटो, जापान) की इमेजिंग द्वारा की गई थी। सुअर की त्वचा को 1.5 × 1.5 सेमी2 में काटा गया था। रुटिन, मेथी का अर्क और एलएनएफ को कटे हुए पोर्सिन की त्वचा पर लगाया गया और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। नमूनों को क्रायोस्टेट का उपयोग करके काटा गया था, एक इंडियम टिन ऑक्साइड-लेपित ग्लास स्लाइड पर रखा गया था, और एक 9-एमिनोएक्रिडीन मैट्रिक्स पदार्थ (9-एए) द्वारा छिड़काव किया गया था। नमूने -20 डिग्री पर संग्रहीत किए गए थे। विश्लेषण से पहले। रुटिन की ऑप्टिकल छवियों के ओवरले का विश्लेषण 609.15 मीटर/जेड पर किया गया था।

4.12.डिफरेंशियल स्कैनिंग कैलोरीमीटर (डीएससी) विशेषता

डिफरेंशियल स्कैनिंग कैलोरीमीटर (DSC) विश्लेषण LNF के गलनांक को निर्धारित करने के लिए एक डिफरेंशियल स्कैनिंग कैलोरीमीटर (DSC, Mettler Toledo DSC1) [63] का उपयोग करके किया गया था। सटीक वजन के बाद, नमूनों को एल्यूमीनियम पैन में रखा गया और ढक्कन के साथ सील कर दिया गया। स्कैनिंग प्रक्रिया में, तापमान रेंज में 40 एमएल/मिनट पर शुद्ध नाइट्रोजन गैस के तहत 10 डिग्री की ताप दर 25 से 350 डिग्री तक लागू की गई थी। 4.13.मानव सह-संवर्धित त्वचा कोशिकाओं का निर्माण

मानव त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 8.5 × 104 कोशिकाओं / कुओं में 12 अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण (कॉर्निंग, कॉर्निंग, एनवाई, यूएसए) में डाला गया और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया। त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट की दूसरी और तीसरी परतों को लगातार दिनों में पहली परत पर बार-बार जोड़ा गया। तीसरी परत जोड़ने के 24 घंटे के बाद, HaCaT को तब 8.5 × 10 डिग्री कोशिकाओं/अच्छी तरह से गठित फ़ाइब्रोब्लास्ट परतों पर रखा गया था और प्रयोग से पहले 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था।

4.14. सह-संवर्धित त्वचा कोशिकाओं में यूवी एक्सपोजर के बाद सेल व्यवहार्यता और एमएमपी स्राव की जांच

मानव सह-संवर्धित त्वचा कोशिकाओं को एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 100 कुग/एमएल के अर्क और 100 कुरूप/एमएल के एलएनएफ (7 कुरूप/एमएल के अर्क तुल्यता) के साथ 100 कुरूप/एमएल खाली और 10 कुरूप/एमएल के साथ ढोंग किया गया था। , 24 घंटे के लिए। सह-सुसंस्कृत त्वचा कोशिकाओं को दो बार पीबीएस के साथ धोया गया और यूवीए के 5 जे / सेमी 2 और यूवीबी विकिरण के 30 एमजे / सेमी 2 (सौर सिमुलेटर, एनवाई, यूएसए) के अधीन किया गया। यूवी विकिरण के बाद, सह-सुसंस्कृत त्वचा कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए परीक्षण किए गए नमूनों के साथ जोड़ा गया। सतह पर तैरनेवाला तब MMP1 और MP9 परिमाणीकरण के लिए एकत्र किया गया था। मानव सह-संवर्धित त्वचा कोशिकाओं में यूवी-प्रेरित MMP1 और MMP9 स्राव के स्तर को निर्माण प्रोटोकॉल के अनुसार एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख किट (MMP1: ab215083 और MMP9: ab100610, abcam, कैम्ब्रिज, यूके) द्वारा मापा गया था।

यूवी एक्सपोजर के बाद मानव सह-सुसंस्कृत त्वचा कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन सेलटाइटर-ग्लो ल्यूमिनसेंट सेल व्यवहार्यता परख किट (पेमरेगा, मैडिसन, WI, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। यूवी एक्सपोजर के 24 घंटे के बाद, सह-सुसंस्कृत त्वचा कोशिकाओं को दो बार पीबीएस के साथ धोया गया और प्रत्येक कुएं में 100 μL ग्लो लाइसिस बफर (पेमरेगा, मैडिसन, WI, यूएसए) जोड़ा गया। 10 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, सेलटाइटर-ग्ल अभिकर्मक के 50 यूएल को जोड़ा गया और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया। ल्यूमिनसेंट सिग्नल को तब एक माइक्रोप्लेट ल्यूमिनोमीटर (स्पेक्ट्रामैक्स एल, आणविक उपकरण) का उपयोग करके मापा गया था।

4.15.सांख्यिकीय विश्लेषण

परिणाम माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में दर्शाए गए थे। महत्वपूर्ण अंतरों का विश्लेषण छात्र के परीक्षण या विचरण (ANOVA) के एक-तरफ़ा या दो-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किया गया, इसके बाद टकी के पोस्ट हॉक टेस्ट (ग्राफपैड प्रिज्म 9), p मानों के साथ किया गया।<0.05 considered="" statistically="">

5। निष्कर्ष

सामूहिक रूप से, इस शोध ने दो वैकल्पिक सुझाव दिए। सबसे पहले, रुटिन को न केवल पराबैंगनी विकिरण संरक्षण और एंटीऑक्सिडेंट पदार्थ के संदर्भ में देखा गया था, बल्कि क्रोमैटोग्राम उंगलियों के निशान के एक मानक मार्कर के रूप में भी इस्तेमाल किया गया था और मेथी के बीज पाउडर के अर्क से एंटी-एजिंग गतिविधि का एक प्रमुख संदर्भ था। दूसरे, उम्र बढ़ने के खिलाफ एथेनॉलिक अर्क के अंतर्निहित आणविक तंत्र का प्रदर्शन किया गया। अर्क ने नए जैविक गुणों को दिखाया, जैसे कि एंटी-कोलेजनेज गतिविधि, कोलेजन उत्पादन को प्रेरित करना, और कोलेजन गिरावट को रोकना, जो एंटी-एजिंग उत्पादों के लिए एक संभावित वैकल्पिक प्राकृतिक एंटी-एजिंग एजेंट को संदर्भित करता है। इनकैप्सुलेशन तकनीकों का उपयोग बायोएक्टिव यौगिकों और रासायनिक और भौतिक क्षरण प्रक्रियाओं की रक्षा के लिए किया जा सकता है, और उपयोग तक उनकी जैविक गतिविधि को लम्बा खींच सकता है। यह तकनीक हर्बल अर्क की विषाक्तता को भी कम करती है। इस अध्ययन में, तैयार किए गए लिपोसोम अत्यधिक स्थिर होते हैं और लंबे समय तक रिलीज होते हैं। नैनो-सूत्रीकरण एंटी-एजिंग गुणों पर मेथी के अर्क की शक्ति को भी बढ़ा सकता है। इस अध्ययन के आधार पर, हम सुझाव देते हैं कि एलएनएफ संभावित रूप से त्वचा की उम्र बढ़ने की रोकथाम में एक आशाजनक सक्रिय घटक के रूप में लागू किया जा सकता है।

यह लेख फार्मास्यूटिकल्स 2022, 15, 254 से निकाला गया है। https://doi.org/10.3390/ph15020254 https://www.mdpi.com/journal/pharmaceuticals