बोवाइन वायरल डायरिया वायरस सबयूनिट वैक्सीन E2Fc और E2Ft के म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रभाव का मूल्यांकन

अमूर्त:

विश्व पशु स्वास्थ्य संगठन (ओआईई) द्वारा वर्ग बी संक्रामक रोग के रूप में वर्गीकृत, गोजातीय वायरल डायरिया/म्यूकोसल रोग गोजातीय वायरल डायरिया वायरस (बीवीडीवी) के कारण होने वाला एक तीव्र, अत्यधिक संक्रामक रोग है। बीवीडीवी के छिटपुट स्थानिक प्रभाव अक्सर डेयरी और बीफ उद्योगों को भारी आर्थिक नुकसान पहुंचाते हैं। बीवीडीवी की रोकथाम और नियंत्रण पर प्रकाश डालने के लिए, हमने निलंबित HEK293 कोशिकाओं के माध्यम से गोजातीय वायरल डायरिया वायरस E2 संलयन पुनः संयोजक प्रोटीन (E2Fc और E2Ft) को व्यक्त करके दो उपन्यास सबयूनिट टीके विकसित किए। हमने टीकों के प्रतिरक्षा प्रभावों का भी मूल्यांकन किया। परिणामों से पता चला कि दोनों सबयूनिट टीकों ने बछड़ों में तीव्र म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न की। यांत्रिक रूप से, E2Fc एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (APCs) पर Fc रिसेप्टर (Fc RI) से जुड़ जाता है और IgA स्राव को बढ़ावा देता है, जिससे एक मजबूत T-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (Th1 प्रकार) होती है। म्यूकोसल-इम्युनाइज्ड E2Fc सबयूनिट वैक्सीन द्वारा प्रेरित न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी टिटर 1:64 तक पहुंच गया, जो E2Ft सबयूनिट वैक्सीन और इंट्रामस्क्युलर इनएक्टिवेटेड वैक्सीन से अधिक था। इस अध्ययन में विकसित म्यूकोसल प्रतिरक्षा के लिए दो नवीन सबयूनिट टीके, ई2एफसी और ई2एफटी, का उपयोग सेलुलर और ह्यूमरल प्रतिरक्षा को बढ़ाकर बीवीडीवी को नियंत्रित करने के लिए नई रणनीतियों के रूप में किया जा सकता है।

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कीवर्ड: बीवीडीवी; सबयूनिट वैक्सीन; श्लैष्मिक टीकाकरण; आणविक सहायक; एफसी रिसेप्टर; ferritin

1 परिचय

बोवाइन वायरल डायरिया वायरस (बीवीडीवी), बॉर्डर डिजीज वायरस (बीडीवी) और स्वाइन फीवर वायरस (सीएसएफवी) के साथ, फ्लेविविरिडे परिवार के पेस्टीवायरस जीनस से संबंधित है [1]। बछड़ों में लगातार संक्रमण (पीआई) और साइटोपैथिक संक्रमण के संयोजन से अक्सर गंभीर म्यूकोसल रोग होता है, जिसमें मृत्यु दर 1{21}}0% तक होती है [2]। बीवीडीवी अपेक्षाकृत उच्च एंटीबॉडी-सकारात्मक दर के साथ दुनिया भर में व्यापक रूप से वितरित होता है। चीन में, प्रचलित प्रकार 1बी, 1एम, और 1क्यू प्रकार के हैं -1 बीवीडीवी [3-5]। फाइलोजेनेटिक विश्लेषण से पता चला कि बोवाइन वायरल डायरिया वायरस टाइप 1 को 1960 के दशक में चीन में आयात किया गया था और कम से कम आठ बीवीडीवी -1 जीनोटाइप चीन में प्रचलन में हैं। उनमें से, 1बी और 1एम प्रमुख जीनोटाइप हैं [6]। यह तिब्बत में बीवीडीवी की हमारी महामारी विज्ञान जांच के अनुरूप है। बीवीडीवी का गोलाकार विषाणु लगभग 40-60 एनएम व्यास का होता है और एक कैप्सूल से ढका होता है। बीवीडीवी के एकल प्लस-स्ट्रैंडेड वायरल आरएनए जीनोम की लंबाई लगभग 12.5 KB है। वायरल पॉलीप्रोटीन को बाद में मेजबान और वायरल प्रोटीज के संयोजन से चार संरचनात्मक (सी, ई0, ई1, ई2) और आठ गैर-संरचनात्मक (एनप्रो, पी7, एनएस2, एनएस3, एनएस4ए, एनएस4बी, एनएस5ए, एनएस5बी) प्रोटीन में विभाजित किया जाता है [7, 8]. बीवीडीवी-ई2 में मजबूत इम्युनोजेनेसिटी होती है, और सबूतों से पता चला है कि संक्रमित जानवरों में प्रेरित निष्क्रिय एंटीबॉडी (एनएबीएस) मुख्य रूप से ई2 [9] को लक्षित करते हैं। इस बीच, बीवीडीवी के प्रमुख परिसंचारी उपभेदों को लक्षित करने वाले बहुसंयोजक ई2 सबयूनिट टीके समजात उपभेदों के खिलाफ आंशिक सुरक्षा प्रदान कर सकते हैं। बीवीडीवी ई2 प्रोटीन और बोवाइन हर्पीसवायरस 1 (बीओएचवी-1) डी प्रोटीन से निर्मित एक पुनः संयोजक हर्पीसवायरस वैक्सीन ने इंट्रानैसल नेबुलाइजेशन के बाद मेजबान में दोनों वायरस के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित की। इसलिए, इम्युनोडोमिनेंट बीवीडीवी ई2 प्रोटीन को सबयूनिट वैक्सीन के रूप में नियोजित करके बीवीडीवी को नियंत्रित करना एक अच्छी रणनीति हो सकती है। नाक गुहा लिम्फोसाइटों और एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं में समृद्ध है, म्यूकोसल टीकाकरण के लिए एक उपयुक्त सूक्ष्म वातावरण प्रदान करता है, और प्रोटीन टीकों को एसिड और क्षार द्वारा अस्थिर होने से बचाता है। इसके अलावा, इंट्रानैसल वैक्सीन-प्रेरित इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए) और ऊपरी श्वसन पथ में रेजिडेंट मेमोरी बी और टी लिम्फोसाइट्स वायरल प्रतिकृति को प्रभावी ढंग से अवरुद्ध करने में सक्षम हैं [11]। नाक गुहा के माध्यम से टीकाकरण न केवल म्यूकोसल प्रतिरक्षा को प्रेरित करता है बल्कि व्यवस्थित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी उत्तेजित करता है, जो प्रतिरक्षा सुरक्षात्मक प्रभाव डालता है। पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि म्यूकोसल एपिथेलियम पर एम कोशिकाओं के नवजात एफसी रिसेप्टर (एफसीआरएन) को सबयूनिट टीकों को लक्षित करके एंटीजन को पूरी तरह से म्यूकोसल एपिथेलियम में पहुंचाया जा सकता है, जिससे विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावी ढंग से उत्तेजित किया जा सकता है [12-14]। आणविक सहायक और प्रतिरक्षा एंटीजन [15] के संलयन से बने घुलनशील पुनः संयोजक टीके का उपयोग करके नाक स्प्रे के टीकाकरण प्रभाव को काफी बढ़ाया जाता है। आईजीजीएफसी म्यूकोसल सतहों के माध्यम से आईजीजी के परिवहन में भाग लेने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सतह पर एफसीआरएन के साथ बातचीत करता है, जिससे स्तनधारियों में एफसी-फ्यूज्ड प्रोटीन की प्रतिरक्षात्मकता में सुधार होता है [16]। आईजीजीएफसी संलयन प्रोटीन को पुनः संयोजक प्रोटीन के आधे जीवन और स्थिरता को बढ़ाने के लिए एफसी हिंज क्षेत्र में डाइसल्फ़ाइड बांड के माध्यम से स्थिर डिमर बनाने की सूचना मिली है, जिससे सेलुलर, म्यूकोसल और ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सुधार होता है [17,18]। आईजीजीएफसी की मध्यस्थता से नवीन टीकों को इन्फ्लूएंजा ए वायरस (एचए-एचयूएफसी) [19] और स्वाइन फीवर वायरस (सीएसएफवी-ई2एफसी) [20] पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है।

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उपयुक्त सतह संशोधन नैनोकणों को रक्त संचार प्रणाली में स्थिर रूप से रहने में सक्षम बनाता है [21]। एक बड़े सतह क्षेत्र और एक खोखले गोलाकार संरचना द्वारा विशेषता, फेरिटिन (एफटी) को विभिन्न प्रकार के व्यक्त संलयन प्रोटीनों के साथ स्वयं-संयोजन द्वारा 24 समान पॉलीपेप्टाइड्स के नैनोकणों को बनाने की सूचना मिली थी, जिसने एंटीजन-प्रस्तुत कोशिकाओं द्वारा एंटीजन पहचान और ग्रहण को बढ़ावा दिया, जिससे एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करना [22,23]। वैक्सीन विकास में फेरिटिन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। SARS-CoV -2 स्पाइक प्रोटीन के रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (RBD) एंटीजन और स्व-इकट्ठे हेलिकोबैक्टर पाइलोरी गैर-हीम फेरिटिन के सहसंयोजक एकीकरण के परिणामस्वरूप एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने का एक शक्तिशाली उत्पादन होता है। फेरिटिन प्रोटीन नैनोकणों में एंटीजन स्थिरता में सुधार करने, जैविक बाधाओं को दूर करने और लक्षित वितरण प्राप्त करने की भी मजबूत क्षमता होती है। चूंकि नैनो-वैक्सीन को डेंड्राइटिक कोशिकाओं और मैक्रोफेज द्वारा कुशलतापूर्वक कैप्चर किया जा सकता है [24], फेरिटिन नैनोकण एंटीजन डिलीवरी के लिए एक नया और आशाजनक मंच है। वर्तमान में, बीवीडीवी के लिए मुख्य उपलब्ध टीके निष्क्रिय टीके और सबयूनिट टीके हैं, जिनमें इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा समय लेने वाली और श्रम-गहन टीकाकरण की आवश्यकता होती है। इस बीच, एमडीबीके कोशिकाओं के माध्यम से उत्पादित निष्क्रिय टीकों से बोवाइन नियोनेटल पैन्टीटोपेनिया (बीएनपी) उत्पन्न होने का खतरा होता है [25]। हालाँकि, सबयूनिट टीकों ने बेहतर सुरक्षा प्रोफ़ाइल दिखाई है [26]। इंट्रानैसल टीकाकरण को एफसी आर रिसेप्टर पर एंटीजन को लक्षित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे म्यूकोसल और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं होती हैं [15,16]। हालाँकि, बीवीडीवी टीकों के साथ इंट्रानैसल टीकाकरण के प्रतिरक्षा प्रभाव और आणविक सहायक (आईजीजीएफसी और एफटी) के साथ संयुक्त बीवीडीवी-ई2 की प्रभावशीलता का खराब अध्ययन किया गया है। इसलिए, उनकी प्रतिरक्षा प्रभावकारिता में सुधार के लिए बीवीडीवी-ई2 प्रोटीन के साथ म्यूकोसल टीकों का विकास इस क्षेत्र में सर्वोच्च प्राथमिकता है। वर्तमान अध्ययन में, HEK293 कोशिकाओं में E2 प्रोटीन-फ्यूज्ड Fc या Ft सबयूनिट टीके उत्पन्न किए गए थे। निष्कर्षों से पता चला कि बीवीडीवी ई2एफसी सबयूनिट वैक्सीन के साथ नाक का टीकाकरण ई2एफटी सबयूनिट वैक्सीन के साथ नाक के टीकाकरण की तुलना में अधिक प्रभावी था, जो इस संकेत का समर्थन करता है कि ई2एफसी फ्यूजन प्रोटीन एक अधिक शक्तिशाली सबयूनिट वैक्सीन विकल्प है।

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2. परिणाम

2.1. निलंबित HEK293 कोशिकाओं में पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति

E2, E2Ft, और E2Fc के संरचनात्मक आरेख चित्र 1A में दिखाए गए हैं। पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन की प्रतिरक्षा-अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए संरक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) बीवीडीवीई2 का उपयोग करके पहली बार अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख की गई। E2, E2Ft, या E2Fc जीन वाले प्लास्मिड से ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाएं एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करती हैं, जबकि मॉक-ट्रीटेड कोशिकाएं एक फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रदर्शित नहीं करती हैं (चित्रा 1बी)। इसने HEK293 कोशिकाओं में E2, E2Ft और E2Fc की मजबूत अभिव्यक्ति का संकेत दिया। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये प्रोटीन स्रावी रूप से व्यक्त किए गए थे, HEK293 कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला को E2, E2Ft, या E2Fc जीन वाले प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करके 6 दिनों के बाद एकत्र किया गया था। प्रत्येक प्रोटीन के इम्यूनो-अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण बीवीडीवी-ई2 एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा किया गया। परिणामों से पता चला कि E2, E2Ft, और E2Fc के जीन वाले प्लास्मिड से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ने क्रमशः 45 kDa, 60 kDa, और 80 kDa के आणविक द्रव्यमान के साथ संबंधित प्रोटीन व्यक्त किया (चित्र 1C)। एसडीएस-पेज और कूमासी ब्लू स्टेनिंग परिणामों से पता चला कि प्रत्येक नमूने के बैंड ब्लॉटिंग परिणामों (चित्र 1डी) के अनुरूप थे। प्रोटीन इम्यूनो-अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विशिष्टता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, बीवीडीवी-ई2 एमएबी की पूर्व-अवशोषण जांच पहले की गई और उसके बाद बीवीडीवी ई2 एमएबी की विशिष्टता को प्रमाणित करने के लिए वायरल प्रतिकृति जांच और वेस्टर्न ब्लॉट किया गया। परिणामों से पता चला कि एंटीबॉडी केवल BVDV-E2 प्रोटीन (चित्रा S1) पर प्रतिक्रिया कर सकती है। एक साथ लेने पर, साक्ष्य से पता चला कि पुनः संयोजक प्रोटीन E2, E2Fc, और E2Ft HEK293 कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में व्यक्त किए गए थे।

चित्र 1. HEK293 कोशिकाओं में E2, E2Ft, और E2Fc प्रोटीन की इम्यूनो-अभिव्यक्ति और पहचान। (ए) बीवीडीवी-ई2, बीवीडीवी-ई2एफटी, और बीवीडीवी-ई2एफसी के निर्माण आरेख। (बी) आईएफए द्वारा पुनः संयोजक प्रोटीन की प्रतिरक्षा-अभिव्यक्ति का पता लगाना; E2, E2Fc, या E2Ft के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करने के 48 घंटे बाद, HEK293 कोशिकाओं को IFA के लिए तय किया गया। बीवीडीवी ई2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और एफआईटीसी-बकरी एंटी-माउस आईजीजी को क्रमशः प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में लागू किया गया था। नाभिक डीएपीआई (नीला) से रंगा हुआ था। स्केल बार 20 µm का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन का पता लगाना। (डी) एसडीएस-पेज द्वारा शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन की पहचान।

2.2. BVDV-E2Fc द्वारा APC-Fc RI का सक्रियण

मैक्रोफेज द्वारा BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) की एंटीजन पहचान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। प्रतिरक्षा प्रणाली पर संलयन प्रोटीन के सक्रियण प्रभाव का पता लगाने के लिए, गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज (बीएएम) द्वारा संलयन प्रोटीन की पहचान कार्य और फागोसाइटिक गतिविधि को इन विट्रो में सत्यापित किया गया था। परिणामों से पता चला कि CD64 (Fc RI), जिसका पता Cy{5}}लेबल बकरी विरोधी खरगोश IgG एंटीबॉडी (लाल) मार्करों द्वारा लगाया गया था, गोजातीय मैक्रोफेज में साइटोप्लाज्म और कोशिका झिल्ली में स्थानीयकृत था। E2Fc का पता बकरी विरोधी माउस आईजीजी (हरी प्रतिदीप्ति) का उपयोग करके लगाया गया था। गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज (पीला रंग; चित्र 2ए) में सीडी64 (एफसी आरआई) और ई2एफसी के सह-स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए छवियों को मर्ज किया गया था। इसके विपरीत, CD64 ने E2 या E2Ft के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं किया। परिणामों से पता चला कि म्यूकोसल बाधा के पार E2Fc संलयन प्रोटीन का स्थानांतरण एफसी आरआई द्वारा मध्यस्थ किया गया था।

चित्र 2. BVDV-E2Fc द्वारा APC-Fc RI का सक्रियण। (ए) बीएएम पर ई2एफसी प्रोटीन के साथ सीडी64 (एफसी आरआई) के सह-स्थानीयकरण विश्लेषण का पता कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लगाया गया था। BAM पर CD64 (Fc RI) को क्रमशः प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में खरगोश विरोधी CD64 और Cy{10}} बकरी विरोधी खरगोश IgG के साथ दाग दिया गया था।

फागोसाइटोसिस, मैक्रोफेज द्वारा कणों का अवशोषण, फागोसाइटोसिस दर के रूप में मापा गया था। गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज द्वारा FITC-संयुग्मित माइक्रोस्फीयर, E2 प्रोटीन, E2Ft, और E2Fc की फागोसाइटोसिस दरें क्रमशः 28.9%, 55.6%, 57.1% और 65.6% थीं। दूसरे शब्दों में, E2Fc की फागोसाइटोसिस दर E2Ft की तुलना में अधिक थी, जिसने आगे साबित किया कि मोनोसाइट्स द्वारा एंटीजन का कब्जा इसकी सतह पर संबंधित लिगैंड के साथ एक विशिष्ट रिसेप्टर के बंधन द्वारा पूरा किया गया था। हालाँकि, गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज में E2 और E2Ft प्रोटीन के लिए कोई रिसेप्टर्स नहीं थे, और उन्होंने केवल फागोसाइटोसिस के माध्यम से विदेशी निकायों को हटा दिया, जो शरीर की सबसे बुनियादी रक्षा विधि है (चित्रा 2बी)।

2.3. विवो में E2Fc द्वारा प्रेरित शक्तिशाली म्यूकोसल और हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं

बछड़े के टीकाकरण की प्रक्रिया को चित्र 3ए में दर्शाया गया है। संलयन प्रोटीन से प्रतिरक्षित बछड़ों द्वारा उत्पादित आईजीए और एसआईजीए के स्तर का अप्रत्यक्ष एलिसा द्वारा पता लगाया गया था। सीरम, मल और नाक के म्यूकोसा के नमूने एकत्र किए गए और एक वाणिज्यिक एलिसा किट द्वारा उनका पता लगाया गया। E2Fc-प्रतिरक्षित समूह ने सीरम और म्यूकोसा में IgA और SIgA के उच्चतम स्तर का प्रदर्शन किया, दोनों इंट्रामस्क्युलर और म्यूकोसल-प्रतिरक्षित जानवरों में (p < 0.01) (चित्र 3B, C)। E{7}} E2-प्रतिरक्षित समूह और E2Ft-प्रतिरक्षित समूह के बीच IgA स्तरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया, लेकिन वे SIgA स्तरों (p <0.05) में भिन्न थे। निष्कर्ष में, E2Fc फ़्यूज़न प्रोटीन अन्य प्रोटीनों की तुलना में अधिक शक्तिशाली म्यूकोसल और ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम था।

2.4. E2Fc, Vivo में E2Ft की तुलना में BVDV के विरुद्ध मजबूत टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (Th1 प्रकार) उत्पन्न कर सकता है

टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं द्वारा व्यक्त Th{0}}प्रकार साइटोकिन IFN- सेलुलर प्रतिरक्षा में मध्यस्थता करता है, जो वायरस निकासी के लिए आवश्यक है। बछड़ों में आईएफएन-व्यक्त करने वाली सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं के वितरण का पता लगाने के लिए, टीकाकरण के 35 दिन बाद लिम्फोसाइटों को बछड़ों के पीबीएमसी से अलग किया गया था। लिम्फोसाइटों को निष्क्रिय बीवीडीवी से उत्तेजित किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री को बाद में आईएफएन {{7}स्रावित सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। E2Fc और E2Ft वाले म्यूकोसा-प्रतिरक्षित समूहों ने E2 समूह की तुलना में IFN{13}}स्रावित CD{14}} और CD{15}} T कोशिकाओं का काफी अधिक अनुपात प्रदर्शित किया। जिस समूह को E2Fc के साथ म्यूकोसा-प्रतिरक्षित किया गया था, उसमें निष्क्रिय BVDV (p < 0.05) से प्रतिरक्षित समूह की तुलना में IFN - - स्रावित CD 3+ व्युत्पन्न CD 8+ T कोशिकाओं का स्तर अधिक था। 4). हालाँकि, म्यूकोसा-प्रतिरक्षित E2Fc और निष्क्रिय BVDV वाले समूहों के बीच IFN - - व्युत्पन्न CD 3+ T कोशिकाओं के स्राव में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। संक्षेप में, E2Fc के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन और म्यूकोसल टीकाकरण दोनों E2Ft की तुलना में BVDV के खिलाफ मजबूत टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (Th1 प्रकार) उत्पन्न करते हैं।

चित्र 3. बछड़ा टीकाकरण प्रयोग प्रवाह चार्ट और विवो में E2Fc द्वारा प्रेरित म्यूकोसल और ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं। (ए) बीवीडीवी सबयूनिट वैक्सीन निर्माण और बछड़ों का टीकाकरण प्रयोग प्रवाह चार्ट। (बी, सी) एलिसा द्वारा माध्यमिक टीकाकरण के बाद 14वें दिन एकत्र किए गए नाक के स्वाब, मल और सीरम नमूनों में (बी) आईजीए और (सी) स्रावी आईजीए स्तर का माप। एन=5, * पी < 0.05, और ** पी < 0.01

चित्रा 4. विवो में बीवीडीवी के खिलाफ टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं। गोजातीय परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में उत्तेजना के बाद (ए) सीडी 4+ आईएफएन - + टी कोशिकाओं और (बी) सीडी 8+ आईएफएन - + टी कोशिकाओं का प्रतिशत। एन=5, * पी < 0। ** पी <0.0001.

2.5. रीकॉम्बिनेंट सबयूनिट टीकों के साथ टीकाकरण से Th1-प्रकार के साइटोकिन्स की मात्रा बढ़ जाती है

सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर पुनः संयोजक सबयूनिट वैक्सीन के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, हमने प्रतिरक्षित बछड़ों के परिधीय रक्त में लिम्फोसाइट और साइटोकिन प्रसार स्तर का विश्लेषण किया। सबसे पहले, टीकाकरण के 49 दिन बाद बछड़ों से एंटीकोआगुलंट्स एकत्र किए गए थे। पृथक्करण के बाद लिम्फोसाइटों को पराबैंगनी-निष्क्रिय बीवीडीवी द्वारा उत्तेजित किया गया था, और सहसंबद्ध सूचकांकों को मापा गया था। पीबीएस समूह की तुलना में, सबयूनिट टीकों (ई2, ई2एफसी, और ई2एफटी) से प्रतिरक्षित समूहों के लिम्फोसाइट उत्तेजना सूचकांक (एसआई) को उच्चतम लिम्फोसाइट उत्तेजना सूचकांक (पी <{5%) के साथ अलग-अलग डिग्री तक बढ़ाया गया था। 001) ई2एफसी-प्रतिरक्षित और निष्क्रिय टीका समूहों में (चित्र 5ए)। इसके अलावा, गोजातीय IFN-, IL-2, और IL{12}} के खिलाफ वाणिज्यिक डबल एंटीबॉडी सैंडविच एलिसा किट का उपयोग Th{13}} और Th{14}} प्रकार के साइटोकिन स्तरों का पता लगाने के लिए किया गया था। प्रतिरक्षित बछड़ों का परिधीय रक्त। पीबीएस-उपचारित बछड़ों की तुलना में, टीकाकरण के 49 दिनों के बाद प्रतिरक्षित बछड़ों में व्यक्त आईएफएन- और आईएल -2 का स्तर आईएल -4 से काफी अधिक था। IFN- का स्तर IN-E2Fc समूह में निष्क्रिय वैक्सीन समूह (p <0.05) की तुलना में अधिक था, लेकिन IM-E2Fc और IL -2 और IL -4 के बीच कोई अंतर नहीं था। निष्क्रिय टीका समूह (चित्र 5बी-डी)। इन परिणामों से पता चला कि IN-E2Fc सबयूनिट वैक्सीन ने बछड़ों में Th1- प्रकार की सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दिया।

चित्र 5. पुनः संयोजक सबयूनिट टीकों के साथ टीकाकरण के बाद Th1- प्रकार के साइटोकिन्स की सामग्री में वृद्धि। (ए) 49 दिनों के टीकाकरण के बाद बछड़ों के परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों के कोशिका प्रसार का पता लिम्फोसाइट प्रसार परख किट द्वारा लगाया गया था। (बी-डी) लिम्फोसाइट सतह पर तैरनेवाला में Th1 और Th2 साइटोकिन्स का पता बोवाइन IFN-, IL -2, IL -4 डबल-एंटीबॉडी सैंडविच एलिसा किट द्वारा लगाया गया। एन=5, * पी < {{10}}.05, ** पी <0.01, और *** पी < 0.00

2.6. बीवीडीवी-विशिष्ट एंटीबॉडी को वीवो में रीकॉम्बिनेंट ई2एफटी और ई2एफसी सबयूनिट टीकों द्वारा दृढ़ता से प्रेरित किया जा सकता है

E2, E2Ft, और E2Fc सबयूनिट टीकों से प्रेरित हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए एलिसा द्वारा बीवीडीवी-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाया गया था। टीकाकरण से पहले सभी बछड़ों में बीवीडीवी-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता नहीं लगाया जा सका। E2Ft और E2Fc सबयूनिट टीकों से प्रेरित एंटीबॉडी का स्तर टीकाकरण की शुरुआत (पहली खुराक) के 21 दिन बाद E2 समूह की तुलना में काफी अधिक था (पी < 0। 1). 35 दिन (दूसरी खुराक के 14 दिन बाद) और 49 दिन (तीसरी खुराक के 14 दिन बाद) में म्यूकोसल प्रतिरक्षा के लिए एंटीबॉडी का स्तर ई2एफटी और ई2 समूहों (पी <0.05) के बीच काफी भिन्न था। इसके अलावा, E2Fc E2 (p <0.001) से काफी अधिक था। म्यूकोसल टीकाकरण समूह (IN-E2Ft और IN-E2Fc समूह) का एंटीबॉडी स्तर इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन समूह (IM-E2Ft और IM-E2Fc समूह) की तुलना में अधिक था, और निष्क्रिय टीका समूह का एंटीबॉडी स्तर महत्वपूर्ण नहीं था IN-E2Fc समूह से भिन्न (चित्र 6)। एक साथ लेने पर, पुनः संयोजक E2Ft और E2Fc सबयूनिट टीके मजबूत ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम थे, और म्यूकोसल प्रतिरक्षा इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन से बेहतर थी, जो दर्शाता है कि पुनः संयोजक E2Fc और E2Ft सबयूनिट टीके अत्यधिक एंटीजेनिक थे।

चित्र 6. टीकाकरण के बाद दिन 0, 21, 35, और 49 में एलिसा द्वारा प्रतिरक्षित बछड़ों के सीरम नमूनों में एंटीबॉडी का पता लगाना। एन=5, * पी < 0.05 और *** पी < 0.001

2.7. विवो में रीकॉम्बिनेंट सबयूनिट टीकों द्वारा प्रेरित बीवीडीवी के खिलाफ एंटीबॉडी को निष्क्रिय करना

पहले टीकाकरण के बाद 0, 21, 35 और 49 दिनों में बछड़ों के गले की नस से रक्त के नमूने एकत्र किए गए। सीरम के नमूनों को सड़न रोकने योग्य तरीके से अलग किया गया और 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में निष्क्रिय कर दिया गया। अलग किए गए सीरम में एंटीबॉडी के स्तर को निर्धारित करने के लिए न्यूट्रलाइज़ेशन परीक्षण किए गए। बीवीडीवी के खिलाफ न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज को रीकॉम्बिनेंट सबयूनिट टीकों के साथ म्यूकोसल-प्रतिरक्षित समूहों में पाया गया, जिसमें ई2एफसी न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी का टिटर 1:64 तक था। यह निष्क्रिय टीके के साथ तुलनीय है और इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट किए गए E2Ft और E2Fc पुनः संयोजक सबयूनिट टीके (चित्रा 7) से बेहतर है।

चित्र 7. टीकाकरण के बाद दिन 0, 21, 35, और 49 में प्रतिरक्षित बछड़ों के सीरम नमूनों में निष्क्रिय एंटीबॉडी का पता लगाना। निष्क्रिय सीरम नमूनों को अनुपात में पतला किया गया और 1 घंटे के लिए 2 {{17} 0 TCID50 BVDV XZ02 के साथ प्री-इन्क्यूबेट किया गया। सीरम के नमूनों को बाद में वेल प्लेटों में कोशिकाओं में जोड़ा गया और 72 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। खरगोश विरोधी ई2 एंटीबॉडी और एफआईटीसी-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी को प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में नियोजित किया गया था। एन=5, * पी < 0.05, और ** पी < 0.01

3. चर्चा

यह बताया गया है कि स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त E2 प्रोटीन बैकुलोवायरस कीट अभिव्यक्ति प्रणाली (brE2) [27] से प्राप्त E2 प्रोटीन की तुलना में BVDV के खिलाफ सुरक्षा को बेअसर करने में अधिक प्रभावी है। स्तनधारी कोशिकाओं की निलंबन संस्कृति की विशेषता एक सरल प्रक्रिया और उच्च उपज है [28]। निलंबित HEK293 कोशिकाएं सीरम-मुक्त परिस्थितियों में बढ़ने में सक्षम हैं, और कोशिका संख्या अनुवर्ती संस्कृति की तुलना में कई गुना अधिक है, जिसका उपयोग एंटीबॉडी के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जा सकता है [29]। इस अध्ययन में लागू यूकेरियोटिक सस्पेंशन सेल क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ संयुक्त PCDNA3.1 की अभिव्यक्ति दक्षता अपेक्षाकृत अधिक थी, और पुनः संयोजक प्रोटीन को 30 mg·L -1 तक की एकाग्रता के साथ, ट्रांसफ़ेक्शन के छह दिन बाद एकत्र किया जा सकता था, जो बाद के पशु अनुप्रयोग के लिए पर्याप्त था।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

बोवाइन वायरल डायरिया वायरस मुख्य रूप से ऊपरी श्वसन पथ और पाचन तंत्र पर आक्रमण करता है, जो राइनोरिया, खांसी, सांस की तकलीफ, शरीर के तापमान में वृद्धि और ल्यूकोपेनिया का कारण बनता है, और जब वायरस रक्त में प्रवेश करता है तो इसके बाद विरेमिया होता है। इसलिए, इनहेल्ड इंट्रानैसल टीकाकरण उन टीकों की तुलना में अधिक प्रभावी सुरक्षा प्रदान कर सकता है जो सीधे वायरस संक्रमण स्थलों पर पहुंचाए जाते हैं। हाल ही में, यह दिखाया गया कि इंट्रानैसल टीकाकरण एफसी आर रिसेप्टर्स में एंटीजन पेश कर सकता है और म्यूकोसल और व्यवस्थित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकता है [16]। इसके अलावा, गोजातीय IgG1Fc, गोजातीय Fc R से बंधने में सक्षम था, जो IgG [30] के लिए एक उच्च-आत्मीयता रिसेप्टर है। हमारे परिणामों ने सबूत दिया कि गोजातीय आईजीजी1 से एफसी ट्रांसम्यूकोसल परिवहन प्राप्त करने के लिए गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज (बीएएम) पर एफसी आरआई के साथ बंध सकता है। यह शरीर में संलयन प्रोटीन की दीर्घायु को बढ़ा सकता है और विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन को बढ़ावा दे सकता है। हमारे परिणामों से पता चला कि म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2Fc द्वारा प्रेरित SIgA का स्तर म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2 (पी < 0.{{30}}1) की तुलना में काफी अधिक था। हालाँकि, इंट्रामस्क्युलर-इंजेक्टेड E2Fc समूह और म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2 समूह के बीच केवल एक छोटा सा अंतर देखा गया। यह इस तथ्य के कारण हो सकता है कि छोटी आंत के म्यूकोसा और मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स दोनों 1313VG के साथ E2Fc के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के जवाब में SIgA की एक छोटी मात्रा जारी करेंगे। E2Fc के साथ म्यूकोसा-टीकाकरण से प्राप्त IFN- का स्तर E2 (p <0.01) के साथ म्यूकोसल टीकाकरण, E2Fc के साथ इंट्रामस्क्युलर टीकाकरण और E2Ft के साथ म्यूकोसल टीकाकरण की तुलना में काफी अधिक था। E2Fc के साथ म्यूकोसा-टीकाकरण से प्राप्त IL{25}} का स्तर E2 के साथ म्यूकोसल टीकाकरण और E2Ft (पी <0.01) के साथ इंट्रामस्क्युलर टीकाकरण की तुलना में काफी अधिक था। अगले चरण में, तीसरे टीकाकरण के बाद समग्र एंटीबॉडी स्तर का पता लगाया गया। परिणामों से पता चला कि E2Fc के साथ म्यूकोसल टीकाकरण ने E2 (p <0.001) के साथ म्यूकोसल टीकाकरण की तुलना में समग्र एंटीबॉडी के काफी उच्च स्तर को प्रेरित किया, जबकि इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट किए गए E2Fc और म्यूकोसल टीकाकरण E2 से प्रेरित एंटीबॉडी का स्तर इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट किए गए E2Ft के बराबर था। समूह। E2Fc सबयूनिट वैक्सीन के म्यूकोसल टीकाकरण के समग्र प्रतिरक्षा प्रभाव इंट्रामस्क्युलर टीकाकरण से बेहतर थे। E2Fc के म्यूकोसल टीकाकरण ने न केवल SIgA के स्राव को प्रेरित किया, बल्कि विशिष्ट Th1- प्रकार की सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भी प्राप्त की।

यह बताया गया कि फेरिटिन नैनोकेज की सतह पर प्रदर्शित सीएसएफवी ई2 ग्लाइकोप्रोटीन ने खरगोशों में जन्मजात प्रतिरक्षा साइटोकिन्स आईएल -4 और आईएफएन- की शक्तिशाली अभिव्यक्ति को प्रेरित किया [31]। SARS-CoV के रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन (RBD) के साथ स्वयं-संयोजित फेरिटिन को सहसंयोजक रूप से बांधकर विकसित किया गया एक नैनोकण टीका भी एक मजबूत ह्यूमरल और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने में सक्षम साबित हुआ है [24]। नाक गुहा म्यूकोसा से जुड़े लिम्फोइड ऊतक में समृद्ध है, और हमने दिखाया है कि म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2Ft से प्रेरित SIgA स्तर E2 (p < 0.05) की तुलना में अधिक था। म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2Ft समूह में CD4+ और CD{15}} T कोशिकाएँ E2 समूह (p <0.01) की तुलना में काफी अधिक थीं। सीडी4+ और सीडी8+ टी कोशिकाएं वायरल संक्रमण से बचाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं [32]। तटस्थीकरण परीक्षण और एंटीबॉडी परख परिणामों से यह भी पता चला कि E2Ft के साथ म्यूकोसल टीकाकरण इंट्रामस्क्युलर E2Ft और E2 के साथ टीकाकरण की तुलना में अधिक प्रभावी था। ऐसा शायद इसलिए हुआ क्योंकि जीव की एंटीजन पहचान और प्रस्तुति प्रणाली ने 24 सबयूनिट पॉलिमर के साथ प्रभावी ढंग से फैगोसाइटोज्ड फेरिटिन (ई2एफटी) को नष्ट कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप विवो में एक संवेदनशील और प्रभावी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया हुई। एंटीबॉडी प्लाज्मा कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं, और प्रतिरक्षा प्रभाव का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी स्तर को निष्क्रिय करना एक महत्वपूर्ण संकेतक है। जब बीवीडीवी वैक्सीन की निष्क्रिय करने वाली एंटीबॉडी क्षमता 1:24 से अधिक होती है, तो यह इंगित करता है कि वैक्सीन इम्युनोजेनिक है [33]।

इस अध्ययन में, E2 पुनः संयोजक प्रोटीन द्वारा प्रेरित न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी स्तरों का मूल्यांकन करने के लिए न्यूट्रलाइजेशन परीक्षण किया गया। इसलिए, सीरम में आईजीजी एंटीबॉडी के स्तर का पता लगाने के लिए प्रतिरक्षित बछड़ों के गले का शिरापरक रक्त एकत्र किया गया था। परिणामों से पता चला कि सभी प्रतिरक्षित बछड़ों ने दूसरे टीकाकरण के 14 दिनों के बाद अलग-अलग डिग्री के निष्क्रिय एंटीबॉडी का उत्पादन किया। म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2Fc समूह और निष्क्रिय टीका समूह के बछड़ों में निष्क्रिय एंटीबॉडी का स्तर काफी बढ़ गया और तीसरे टीकाकरण के 14 दिनों के बाद 1:64 पर रहा (छठे सप्ताह तक निष्क्रिय एंटीबॉडी टाइटर्स का पता लगाया गया था)। हालाँकि, यह ध्यान देने योग्य है कि म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2 और E2Ft और इंट्रामस्क्युलर-प्रतिरक्षित E2Fc और E2Ft समूहों के तटस्थ एंटीबॉडी स्तर 1:8 और 1:16 के बीच बनाए रखा गया था। हम अनुमान लगाते हैं कि E2Fc पुनः संयोजक वैक्सीन के एंटीजन एफसी रिसेप्टर द्वारा धीरे-धीरे जारी किए जाते हैं, जिससे लंबे समय तक हास्य और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। इसके विपरीत, अन्य चार सबयूनिट टीके संबंधित रिसेप्टर की कमी के कारण शरीर में शीघ्र ही रहते हैं। इसलिए, अपेक्षित प्रतिरक्षा प्रभाव प्राप्त करने के लिए बूस्टर टीकाकरण या सहायक परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

4. सामग्री और विधियाँ

4.1. वायरस और कोशिकाएं

टाइप 1बी बीवीडीवी एक्सजेड02 स्ट्रेन (जेनबैंक एक्सेशन नंबर: एमएफ278652) को तिब्बत से अलग किया गया और मैडिन-डार्बी गोजातीय किडनी कोशिकाओं (एमडीबीके) का उपयोग करके संवर्धित किया गया। पोर्सिन महामारी डायरिया वायरस (पीईडीवी) को हमारी प्रयोगशाला में संरक्षित किया गया था। एमडीबीके कोशिकाओं को एटीसीसी (एटीसीसी-सीसीएल-22) से खरीदा गया था और डीएमईएम (कैट नं. एसएच302403.01, हाइक्लोन, शंघाई, चीन) में बनाए रखा गया था, और गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज कोशिकाओं (बीएएम) को आरपीएमआई में बनाए रखा गया था। {8}} (कैट नं. एसएच30027, साइटिवा, शंघाई, चीन); सभी माध्यमों में 10% हीट-इनएक्टिवेटेड हॉर्स सीरम (कैट नं. 16050122, गिब्को, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) शामिल था और 5% CO2 के साथ आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया था। निलंबित HEK293 कोशिकाओं को ATCC (ATCC CRL-1573) से खरीदा गया था और सीरम-मुक्त KOP293 माध्यम (कैट नं. M21201121A, KAIRUI-बायोटेक, झुहाई, चीन) में संवर्धित किया गया था।

4.2. एंटीबॉडी और परीक्षण किट

इस अध्ययन में निम्नलिखित एंटीबॉडी और परीक्षण किट का उपयोग किया गया: एंटी-बीवीडीवी ई2 एंटीबॉडी (कैट नं. ऑर्ब312169, बायोरबिट, कैम्ब्रिज, यूके); एचआरपी-बकरी एंटी-माउस एंटीबॉडी (कैट नं. एबी205719, एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके); Cy3-बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (कैट नं. AS008, एबीक्लोनल, बोस्टन, एमए, यूएसए); FITC-बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (कैट नं. ab150117, Abcam, कैम्ब्रिज, यूके); सीडी64 (एफसी आरआई) एंटीबॉडी (कैट नं. एबीएस135850, एब्सिन, शंघाई, चीन); एलेक्सा फ्लोर® 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी (कैट नं. ab150113, एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके); Cy3-बकरी विरोधी खरगोश IgG एंटीबॉडी (कैट नं. ab6939, Abcam, कैम्ब्रिज, यूके); FITC संयुग्मित माइक्रोस्फीयर (कैट नं. 17155, पॉलीसाइंसेज, वॉरिंगटन, पीए, यूएसए); FITC-CD4 एंटीबॉडी (कैट नं. MCA1653, BIO-RAD, हरक्यूलिस, CA, यूएसए); पीई-सीडी8 एंटीबॉडी (कैट नं. एमसीए837, बायो-आरएडी, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए); IFN- एंटीबॉडी (कैट नं. MCA1783A, BIORAD, हरक्यूलिस, CA, यूएसए); FITC-बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी (कैट नं. AS011, एबीक्लोनल, बोस्टन, एमए, यूएसए)। किट और अभिकर्मकों में BVDV-E2 एंटीबॉडी डिटेक्शन किट (कैट नं. SU-AN78401, विन-विन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेड, शंघाई, चीन) शामिल हैं; आईजीए डिटेक्शन किट (कैट नं. 177090बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन); एसआईजीए डिटेक्शन किट (कैट नं.177053बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन); आईएफएन- डिटेक्शन किट (कैट नं. 177020बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन); आईएल -2 डिटेक्शन किट (कैट नं. 177028बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन); आईएल-4 डिटेक्शन किट (कैट नं. 1770131बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन); टीए -293 अभिकर्मक अभिकर्मक (कैट नं. आर21203107ए, कैरुई बायोटेक, झुहाई, चीन); लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम (कैट नं. आरएनबीजे9540, सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए)।

4.3. प्लास्मिड निर्माण

TMHMM वेब टूल (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ को 12 पर एक्सेस किया गया) का उपयोग करके E2 (जीन अनुक्रम परिग्रहण संख्या: MF278652) के ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र को हटाकर छोटा E2 (इसके बाद E2 के रूप में दर्शाया गया) उत्पन्न किया गया था। जनवरी 2023) और सी-टर्मिनस में एक हिस्टिडीन टैग जोड़ना (चित्र 1ए)। जीन अनुक्रम अनुपूरक सामग्री S1 में दिखाया गया है। E2Fc प्लास्मिड का निर्माण E2 के सी-टर्मिनल में गोजातीय IgG1 (परिग्रहण संख्या: x62916.1) के काज क्षेत्र वाले एक Fc टुकड़े को जोड़कर किया गया था, जिसमें E{15}}सिंथेटिक लचीले पेप्टाइड-काज क्षेत्र की क्रमिक स्थिति थी। -CH2-CH3 डोमेन-6 × उसका [20]। जीन अनुक्रम को पूरक सामग्री S2 में दिखाया गया है। E2Ft प्लास्मिड का निर्माण लिंकर (ग्लाइ)3Ser [34] के माध्यम से E2 को हेलिकोबैक्टर पाइलोरी फेरिटिन (अवशेष 5-167) से जोड़कर किया गया था। जीन अनुक्रम अनुपूरक सामग्री S3 में दिखाया गया है। स्रावी अभिव्यक्ति [35] को सुविधाजनक बनाने के लिए आईएल -2 सिग्नल पेप्टाइड को ई2, ई2एफसी और ई2एफटी के एन-टर्मिनल में जोड़ा गया था। लक्ष्य जीन (E2, E2Ft, और E2Fc) को क्रमशः BamHI और XhoI के साथ PCDNA3.1 में क्लोन किया गया था।

4.4. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

घातीय चरण में निलंबित HEK293 कोशिकाओं के लगभग 1 0 संक्षेप में, 5 मिलीलीटर केपीएम (ट्रांसफेक्शन बफर) और 100 माइक्रोग्राम बाँझ प्लास्मिड डीएनए को एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ा गया था, और 5 एमएल केपीएम और 500 μL टीए -293 (कैट नं। R21203107A, KAIRUI बायोटेक, झुहाई, चीन) ) अभिकर्मक अभिकर्मकों को एक अन्य बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ा गया था। फिर, पतला प्लास्मिड में एक पतला अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ा गया और अच्छी तरह मिलाया गया। कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक ऊष्मायन के बाद, हिलाने के साथ कोशिकाओं में एक डीएनए-ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक कॉम्प्लेक्स जोड़ा गया। कोशिकाओं को 140 आरपीएम/मिनट की हिलती गति पर 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं को अभिकर्मक के छह दिन बाद 12, {20}} आरपीएम/मिनट पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया और अवशिष्ट कोशिका मलबे को हटाने के लिए 0.22 मिमी फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया। निकल एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम (कैट नं. 17531801, जीई, बोस्टन, एमए, यूएसए) को ई2, ई2एफटी, और ई2एफसी प्रोटीन [36] के हिस्टिडाइन (एचआईएस) टैग एफ़िनिटी शुद्धि के लिए नियोजित किया गया था। संक्षेप में, 100 एमएल नमूने 1 एमएल/मिनट की दर से एफ़िनिटी कॉलम में जोड़े गए थे। बाद में स्तंभों को 1 एमएल/मिनट की दर से बफर ए (0.1 एम पीबीएस, 300 मिमी NaCl, 5 मिमी) के पांच कॉलम वॉल्यूम (सीवी) से धोया गया। अंत में, मुख्य शिखर के अनुरूप तरल एकत्र करने के लिए इमिडाज़ोल (0 से 500 मिमी तक) के एकाग्रता ग्रेडिएंट्स को 1 एमएल/मिनट की दर से स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति दी गई। प्रोटीन सांद्रता को बीसीए प्रोटीन डिटेक्शन किट के साथ निर्धारित किया गया था। एकत्रित प्रोटीन का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए किया गया।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

4.5. पश्चिमी ब्लॉट

एसडीएस-पेज का उपयोग करके प्रोटीन को अलग किया गया। एनसी फिल्टर झिल्ली में स्थानांतरित होने के बाद, प्रोटीन को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 2% स्किम्ड दूध पाउडर के साथ अवरुद्ध किया गया और बाद में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एंटी-बीवीडीवी ई 2 एंटीबॉडी (कैट नं। ऑर्ब 312169, बायोरबिट, कैम्ब्रिज, यूके) के साथ ऊष्मायन किया गया। . टीबीएस-टी से तीन बार धोने के बाद, झिल्लियों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एचआरपी-बकरी एंटी-माउस (कैट नं. एबी205719, एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके) एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। टीबीएस-टी से तीन बार धोने के बाद, प्रोटीन इम्यूनो-अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए ईसीएल केमिलुमिनसेंस प्रणाली को नियोजित किया गया था।

4.6. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस

पुनः संयोजक प्रोटीन की इम्यूनो-अभिव्यक्ति की इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए, HEK293 कोशिकाओं को E2, E2Ft, और E2Fc को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया; ट्रांसफ़ेक्शन के 48 घंटे बाद, कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ तय किया गया। पीबीएस से तीन बार धोने के बाद, कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 0.5% ट्रिशन-एक्स100 से पारगम्य बनाया गया। पीबीएस के साथ गहन धुलाई के बाद, कोशिकाओं को बाद में 2% बीएसए के साथ अवरुद्ध किया गया और 2 घंटे के लिए 37 ◦C पर 1:500 पतला बीवीडीवी ई2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (हमारी प्रयोगशाला में तैयार) के साथ ऊष्मायन किया गया। Cy3 (कैट नं. AS008, ABclonal, बोस्टन, MA, USA) या FITC-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (कैट नं. ab150117, Abcam, कैम्ब्रिज, यूके) को द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में लागू किया गया था। नाभिक को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डीएपीआई से रंगा गया। प्रोटीन की कल्पना कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएसएम 510, ज़ीस, ओबेरकोचेन, जर्मनी) द्वारा की गई थी [37]।

4.7. E2Fc पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन का एपीसी-लक्ष्यीकरण

गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज (बीएएम) पर एफसी आरआई के लिए बीवीडीवी-ई2एफसी संलयन प्रोटीन के बंधन की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोलोकलाइज़ेशन विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, 3 माइक्रोग्राम शुद्ध E2, E2Ft, या E2Fc को गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज में जोड़ा गया था। 37 ◦C पर 12 घंटे तक ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) में 0.1% बीएसए के साथ धोया गया और 20 ◦ पर मेथनॉल/एसीटोन (1:1) के साथ तय किया गया। सी। कोशिकाओं को बाद में 15 मिनट के लिए 0.5% ट्रिशन-एक्स100 के साथ पारगम्य बनाया गया और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% बीएसए के साथ अवरुद्ध किया गया। फिर, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और 2 के लिए बीवीडीवी ई 2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (माउस स्रोत; हमारी प्रयोगशाला में तैयार) और गोजातीय सीडी 64 (एफसी आरआई) पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (कैट नं। एबीएस 135850, एब्सिन, शंघाई, चीन) के साथ ऊष्मायन किया गया। एच। कोशिकाओं को तीन बार पीबीएस से धोया गया और एलेक्सा फ्लोर® 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी (कैट नं. ab150113, एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके) और Cy{29}} लेबल बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी (कैट नं.) से ढक दिया गया। ab6939, Abcam, कैम्ब्रिज, यूके) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए। नाभिक डीएपीआई से रंगे हुए थे। छवियों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोलोकलाइज़ेशन (एलएसएम 880, ज़ीस, ओबेरकोचेन, जर्मनी) का उपयोग करके खींचा गया था।

4.8. बोवाइन एल्वोलर मैक्रोफेज की फागोसाइटिक दर का निर्धारण

गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज (बीएएम) के फागोसाइटोसिस पर पुनः संयोजक प्रोटीन E2, E2Ft, और E2Fc के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, 1 × 1 0 6 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता पर गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज को पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। E2, E2Ft, या E2Fc (सांद्रताएं 4 घंटे के लिए 350 ng/mL पर समायोजित की गईं)। पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, प्रत्येक कुएं में FITC-संयुग्मित माइक्रोस्फीयर (कैट नं. 17155, पॉलीसाइंसेज, वॉरिंगटन, पीए, यूएसए) का 1 {{24 }} μL और आरपीएमआई {{15 }} माध्यम का 990 μL जोड़ा गया। . ऊष्मायन के 2 घंटे के बाद, कोशिकाओं को बाह्य कोशिकीय एफआईटीसी-संयुग्मित माइक्रोस्फियर को हटाने के लिए पीबीएस से धोया गया था। अनुवर्ती मैक्रोफेज को 0.05% EDTA युक्त ट्रिप्सिन (गिब्को) के साथ पचाया गया था, और पूर्ण पाचन के बाद 1640 पूर्ण माध्यम के साथ पाचन समाप्त कर दिया गया था। फिर कोशिकाओं को 0.45 ग्राम ग्लूकोज और 0.3 ग्राम बीएसए के साथ 10 एमएल पीबीएस की शीर्ष परत में जोड़ा गया, इसके बाद 10 मिनट के लिए 400 × जी पर ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया। अलग की गई कोशिकाओं को पीबीएस से दो बार धोया गया और 800 μL पीबीएस के साथ पुनः निलंबित किया गया। 488 एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता बेकमैन प्रवाह साइटोमीटर (एमओफ्लोएस्ट्रियोस ईक्यू, बेकमैन, पासाडेना, सीए, यूएसए) द्वारा निर्धारित की गई थी।

4.9. टीका तैयार करना और टीकाकरण प्रक्रिया

HEK{0}} व्यक्त E2, E2Ft, और E2Fc को 200 µg/mL की अंतिम प्रोटीन सांद्रता के समान अनुपात में IMS 1313VG सहायक (सेपिक, फ्रांस) के साथ इमल्सीकृत किया गया, और 4 ◦C पर संग्रहीत किया गया। गुणवत्ता जांच। BVDV-E0 और BVDV-E2 एंटीबॉडी-नकारात्मक (कैट नं. SU-AN78401, विन-विन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड, शंघाई, चीन) 3-माह के बछड़े (n=35) थे सात समान समूहों में विभाजित। चार समूहों में बछड़ों को क्रमशः पीबीएस, ई2, ई2एफटी और ई2एफसी के साथ नाक-म्यूकोसल प्रतिरक्षित किया गया। शेष तीन समूहों में बछड़ों को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में E2Ft, E2Fc, और BVDV निष्क्रिय टीकों के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (आईएम) दिया गया (कैट नंबर 202002003, हुआवेईट, जियांग्सू, चीन)। प्रयोग के 1, 21 और 35वें दिन बछड़ों को टीका लगाया गया, और प्रत्येक बछड़े को 200 माइक्रोग्राम/एमएल की प्रोटीन सांद्रता के साथ 1 एमएल टीका लगाया गया। अन्य सूचकांकों के लिए प्रयोग के 1, 21, 35 और 49वें दिन बछड़ों से रक्त एकत्र किया गया (चित्र 3ए)। सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को पशुचिकित्सा महाविद्यालय, हुआज़होंग कृषि विश्वविद्यालय, हुबेई, चीन (नंबर HZAUCA-2022-0011) की अनुसंधान आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

4.10. मल और सीरम में IgA का उत्पादन

द्वितीयक टीकाकरण के 14वें दिन बछड़ों के नाक के स्वाब, मल और सीरम के नमूने एकत्र किए गए। ताजा गाय के मल को पीबीएस के साथ 15% फेकल सस्पेंशन में पतला किया गया था, सस्पेंशन को 30 मिनट के लिए 4 ◦C पर 18, {3}}× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और बाद में उपयोग के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। बाँझ कपास झाड़ू को गाय की नाक गुहा में 6-8 मोड़ों तक गहराई से घुमाकर नाक के स्वाब एकत्र किए गए थे। स्वैब को 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पीबीएस ट्यूब में डाला गया और बड़े पैमाने पर मिलाया गया। नमूनों को 10 मिनट के लिए 4 ◦C पर 18, 10 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और बाद में उपयोग के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया। गोजातीय रक्त के नमूने एथिलीनडायमिनेटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) युक्त एंटीकोआगुलेंट ट्यूब के साथ एकत्र किए गए थे, और सीरम के नमूने रक्त के नमूनों को 4 ◦C और 400 ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करके प्राप्त किए गए थे। निर्माता के निर्देशों के अनुसार आईजीए (कैट नंबर 177090बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन) और एसआईजीए का पता एलिसा किट (कैट नंबर 177053बी कैमिलो, नानजिंग, चीन) से लगाया गया।

4.11. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

रक्त में CD{5}} लिम्फोसाइटों के बीच IFN{0}}CD3+ CD{2}} और CD{3}} CD{4}} T कोशिकाओं का उत्पादन करने की आवृत्तियाँ थीं फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। बूस्टर टीकाकरण के 14 दिन बाद नमूने एकत्र किए गए [36]। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को फिर से निलंबित कर दिया गया और पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम के साथ 1 × 106 कोशिकाओं/एमएल तक पतला कर दिया गया, यूवी-निष्क्रिय बीवीडीवी एक्सजेड02 (एमओआई=0.1) से उत्तेजित किया गया, और 37 पर इनक्यूबेट किया गया। ◦सी 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ। कॉनकेनवेलिन ए (कॉन ए) (5 माइक्रोग्राम/एमएल; सिग्मा) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। प्रोटीन ट्रांसपोर्ट इनहिबिटर ब्रेफेल्डिन ए (बीएफए, 3 माइक्रोग्राम/एमएल, ईबीओसाइंस) को आईएफएन-स्राव को अवरुद्ध करने के लिए सेल हार्वेस्टिंग से 12 घंटे पहले सभी नमूनों में जोड़ा गया था। सेल की 200 μL की मात्रा को FCM ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया और अंधेरे में 4 ◦C पर 30 मिनट के लिए FITC-लेबल CD4 एंटीबॉडी (कैट नं. MCA1653, BIO-RAD, हरक्यूलिस, CA, यूएसए) के साथ दाग दिया गया। पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, कोशिकाओं को आर-पीई-लेबल सीडी 8 एंटीबॉडी (कैट नं। एमसीए 837, बीआईओ-आरएडी, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) के साथ ऊष्मायन किया गया था। तीन बार धोने के बाद, कोशिकाओं को इंट्रासेल्युलर साइटोकिन धुंधलापन के लिए अंधेरे में 20 मिनट के लिए माउस एंटी-बोवाइन आईएफएन-एंटीबॉडी (कैट नं। एमसीए 1783 ए, बीआईओ-आरएडी, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) के साथ ऊष्मायन किया गया था। धोने के बाद, कोशिकाओं को 1% एफबीएस वाले पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया गया। फ्लो साइटोमेट्री एफएसीएस कैलिबर फ्लो साइटोमीटर (बीडी बायोसाइंसेज, फ्रैंकलिन लेक, एनजे, यूएसए) के साथ आयोजित की गई थी, और डेटा एकत्र और विश्लेषण किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है [38]।

4.12. लिम्फोसाइट प्रसार और साइटोकिन का पता लगाना

टीकाकरण के 49वें दिन प्रत्येक बछड़े के एंटीकोआग्युलेटेड परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम (कैट नं. आरएनबीजे9540, सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके अलग किया गया था। बोवाइन परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स को 10% एफबीएस 1640 माध्यम से 1 × 106 कोशिकाओं/एमएल तक पतला किया गया था। फिर, 100 µL पतला कोशिकाओं को एक 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और क्रमशः यूवी-निष्क्रिय बीवीडीवी, कॉन्केनवेलिन (सकारात्मक नियंत्रण), या संस्कृति माध्यम (नकारात्मक नियंत्रण) से उत्तेजित किया गया। 5% CO2 के साथ 37 ◦C पर 72 घंटे के ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक कुएं में 30 µL एमटीएस जोड़ा गया, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर सुसंस्कृत किया जाता रहा। 492 एनएम पर अवशोषण को एक स्वचालित माइक्रोप्लेट विश्लेषक के साथ मापा गया था। प्रत्येक नमूने का लिम्फोसाइट प्रसार अनुमापांक उत्तेजना सूचकांक (एसआई) द्वारा निर्धारित किया गया था। परिकलित एसआई=(नमूने का ओडी-रिक्त नियंत्रण का ओडी)/(नकारात्मक नमूने का ओडी-रिक्त नियंत्रण का ओडी) [39]। इंटरफेरॉन (आईएफएन)-, इंटरल्यूकिन (आईएल)-2, और इंटरल्यूकिन (आईएल)-4 का पता एलिसा किट का उपयोग करके लगाया गया। संक्षेप में, पीबीएमसी को अलग किया गया और 10% एफबीएस युक्त आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ 4 × 106 कोशिकाओं/एमएल तक पतला किया गया और अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों में रखा गया। कोशिकाओं को 37 ◦C पर 48 घंटे के लिए निष्क्रिय BVDV XZ02 (MOI=1) से उत्तेजित किया गया था, और बाद में सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। आईएफएन- (कैट नं. 177020बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन), आईएल-2 (कैट नं. 177028बी, कैमिलो, नानजिंग, चीन), और आईएल-4 (कैट नं. 1770131बी, कैमिलो, निर्माता के निर्देशों के अनुसार संबंधित एलिसा किट का उपयोग करके नानजिंग, चीन) स्तर का पता लगाया गया था। नमूने में IFN-, IL -2, और IL -4 की सामग्री की गणना मानक वक्र का उपयोग करके की गई थी।

4.13. सीरोलॉजिकल परीक्षण

E2/E0 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए, टीकाकरण के बाद 0, 21, 35 और 49वें दिन प्रत्येक बछड़े से रक्त के नमूने एकत्र किए गए। रक्त के नमूनों को 20 मिनट के लिए 1000× ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके सीरम के नमूने एकत्र किए गए। सीरम नमूनों को बीवीडीवी ई2 एंटीबॉडी डिटेक्शन किट (कैट नं. एसयू-एएन78401, विन-विन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड, शंघाई, चीन) की आवश्यकताओं के अनुसार संसाधित किया गया था। बीवीबीवी ई2 एंटीजन से लेपित माइक्रोप्लेट्स को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए संतुलित किया गया। फिर, क्रमशः 50 μL नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण और सीरम नमूने माइक्रोप्लेट में जोड़े गए। बाद में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी)-लेबल डिटेक्शन एंटीबॉडी की 50 μL की मात्रा को माइक्रोप्लेट में जोड़ा गया और 60 मिनट के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। वॉशिंग बफर से पांच बार धोने के बाद, प्रत्येक टीकाकरण समूह में ई2 एंटीबॉडी के स्तर को निर्धारित करने के लिए 450 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर के अवशोषण को मापने के लिए एक क्रोमोजेनिक समाधान जोड़ा गया था। सीरम नमूनों के निष्क्रिय एंटीबॉडी स्तर का पता लगाने के लिए निश्चित वायरस कमजोर पड़ने वाली सीरम विधि को नियोजित किया गया था। संक्षेप में, पूरी तरह से निष्क्रिय प्रतिरक्षा सीरम नमूनों को 2−1 से 2−12 तक पतला किया गया था, और प्रत्येक कमजोर पड़ने वाले अनुमापांक पर 50 μL सीरम को अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़ा गया था। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में 200 TCID50- BVDV XZ02 वायरस युक्त 50 μL पतला वायरस घोल मिलाया गया। प्लेटों को धीरे से हिलाया गया और मिलाया गया। 37 ◦C पर 1 घंटे के ऊष्मायन के बाद, 5 × 105 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता वाली एमडीबीके कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़ा गया और 72 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 ◦C पर ऊष्मायन किया गया। सीरम नमूनों के निष्प्रभावी प्रभाव का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में ई {40}} विशिष्ट एंटीबॉडी (कैट नं. ऑर्ब312169, बायोरबिट, कैम्ब्रिज, यूके) और द्वितीयक के रूप में एफआईटीसी-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ इलाज किया गया था। एंटीबॉडी, (कैट नं. AS011, एबीक्लोनल, बोस्टन, एमए, यूएसए)। एक विशिष्ट हरे फ्लोरोसेंट संकेत ने तटस्थता की अनुपस्थिति का संकेत दिया। तस्वीरें एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TE2000, Nikon, टोक्यो, जापान) के तहत ली गईं। सीरम न्यूट्रलाइजेशन टिटर की गणना रीड-म्यूएन्च विधि के अनुसार की गई थी और सीरम का अधिकतम पतलापन जो प्रतिदीप्ति को पूरी तरह से रोक सकता था, उसे सीरम के न्यूट्रलाइजेशन टिटर के रूप में निर्धारित किया गया था।

4.14. बीवीडीवी ई2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की विशिष्टता का पता लगाना

बीवीडीवी ई2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पूर्व-अवशोषण परीक्षण पहले किए गए, उसके बाद बीवीडीवी ई2 एमएबी की विशिष्टता को प्रमाणित करने के लिए वायरल प्रतिकृति परीक्षण और वेस्टर्न ब्लॉट किया गया। वायरल प्रतिकृति परख के लिए, BVDV के 400 TCID50 को क्रमशः 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर पीबीएस और 100 μg या 200 μg E2 mAb के साथ प्री-इन्क्यूबेट किया गया था। ऊष्मायन के बाद, पूर्व-उपचारित बीवीडीवी को एमडीबीके कोशिकाओं में टीका लगाया गया था, और कोशिकाओं को एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 ◦C पर संवर्धित किया गया था। कोशिकाओं को 18 या 24 एचपीआई (संक्रमण के एक घंटे बाद) पर एकत्र किया गया और आरएनए को ट्राइज़ोल अभिकर्मक के साथ निकाला गया। बीवीडीवी ई2 जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर आयोजित किया गया था। वेस्टर्न ब्लॉट परख के लिए, E2 mAb को क्रमशः 4 ◦C पर 2 घंटे के लिए Tween20, PEDV S प्रोटीन, या BVDV E2 प्रोटीन के साथ TBS-T में प्री-इन्क्यूबेट किया गया था। BVDV E2 या PEDV S प्रोटीन की प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में पूर्व-उपचारित E2 mAb को वेस्टर्न ब्लॉट परख के अधीन किया गया था।

4.15. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी विश्लेषणों के लिए सांख्यिकीय कार्यक्रम ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग किया गया था। दो-पूंछ वाले अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग डेटा का विश्लेषण करने और पी मान (*, पी < 0.05; **, पी < 0) उत्पन्न करने के लिए किया गया था। 8}}1; ***, पी < 0.001, **** पी < 0.0001)। सिवाय जहां अन्यथा उल्लेख किया गया हो, डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में दिखाया गया है।

प्र. 5। निष्कर्ष

हमारे अध्ययन में, तीन पुनः संयोजक प्रोटीन, BVDV-E2, BVDV-E2Ft, और BVDV-E2Fc, व्यक्त किए गए, और संबंधित सबयूनिट टीके उत्पन्न किए गए। विवो परीक्षणों में पता चला कि E2Fc सबयूनिट वैक्सीन म्यूकोसल और इंट्रामस्क्युलर टीकाकरण दोनों में E2Ft और E2 की तुलना में अधिक प्रभावी थी। हमने पुष्टि की कि म्यूकोसल-प्रतिरक्षित E2Fc और E2Ft द्वारा प्रेरित न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी टाइटर्स क्रमशः 1:64 और 1:16 थे, जो आगे संकेत देता है कि E2Fc ट्रांसम्यूकोसल परिवहन प्राप्त करने के लिए गोजातीय वायुकोशीय मैक्रोफेज पर एफसी आरआई के साथ बंधा हुआ है। बीवीडीवी के मुख्य महामारी तनाव के मल्टीवैलेंट ई2एफसी सबयूनिट वैक्सीन के म्यूकोसल टीकाकरण से प्रतिरक्षा प्रभाव में काफी सुधार हुआ है, और यह व्यावहारिक उपयोग के लिए उपयुक्त है। हमारा अध्ययन म्यूकोसल वैक्सीन का उपयोग करके समय लेने वाली और श्रम-गहन पारंपरिक टीकाकरण का समाधान प्रदान करता है। बीवीडीवी ई2 प्रोटीन एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने के लिए एक आदर्श लक्ष्य है, और इस अध्ययन में निर्मित ई2एफसी और ई2एफटी संलयन प्रोटीन को बीवीडीवी संक्रमण के खिलाफ सुरक्षित और प्रभावी सबयूनिट टीके के रूप में आगे लागू किए जाने की उम्मीद है।

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