हिप्पोकैम्पस न्यूरोफिजियोलॉजी और स्थानिक स्मृति भाग 2 में दैनिक भिन्नता और लिंग अंतर की जांच

संपूर्ण-सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

सभी डेटा ZT 2-6 (दिन) या ZT 13-17 (रात) के दौरान कोरोनल हिप्पोकैम्पल स्लाइस से मानक ACSF में 32 डिग्री पर एकत्र किए गए थे, जिसमें निम्नलिखित (मिमी में) शामिल थे: 125 NaCl, 2.5KCl, 1.25 Na2PO4, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, और 25ग्लूकोज, 95% O2/5% CO2 के साथ बुलबुला।

कोरोनल हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है जो मानव स्मृति प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

शोध से पता चलता है कि कोरोनल हिप्पोकैम्पस दीर्घकालिक यादों को संग्रहीत करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसे लोग "समय यात्री" कहते हैं जो लोगों को पिछले अनुभवों और अनुभूतियों में वापस ले जा सकता है। कोरोनल हिप्पोकैम्पस हमारी पहचान, भावनात्मक नियंत्रण, आत्म-समझ और पारस्परिक संबंधों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

समय के साथ हमारी याददाश्त कमजोर होती जाती है, लेकिन कुछ चीजें हैं जो हम अपनी याददाश्त को बेहतर बनाने के लिए कर सकते हैं। सबसे पहले, सकारात्मक दृष्टिकोण बनाए रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे तनाव कम हो सकता है और याददाश्त में सुधार हो सकता है। दूसरे, अधिक व्यायाम और आहार कोरोनरी हिप्पोकैम्पस के कार्य को बढ़ावा देने में मदद कर सकता है और शारीरिक स्वास्थ्य के लिए फायदेमंद हो सकता है। अंत में, स्मृति प्रशिक्षण और नोटपैड जैसे उपकरणों का उपयोग भी स्मृति को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है।

कुल मिलाकर, कोरोनल हिप्पोकैम्पस मानव स्मृति और संज्ञानात्मक प्रदर्शन में एक अपूरणीय भूमिका निभाता है। इसलिए हमें इसकी भूमिका पर ध्यान देना चाहिए और जितना हो सके इसे स्वस्थ अवस्था में रखना चाहिए। सक्रिय कदम उठाकर, हम अपनी याददाश्त में सुधार कर सकते हैं और इसकी गिरावट को धीमा कर सकते हैं ताकि हम स्पष्ट रूप से सोचना जारी रख सकें और सार्थक जीवन जी सकें। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टैंच डेजर्टिकोला न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना। ये पदार्थ याददाश्त और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, मांस रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषक तत्व और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो।

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CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की संपूर्ण-सेलपैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग ब्लाइंड पैच तकनीक का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। संक्षेप में, पैचपिपेट को क्षेत्र CA1 के मध्य या पार्श्व छोर पर रखा गया था (यह इस बात पर निर्भर करता है कि टुकड़ा बाएं या दाएं गोलार्ध से था) 50-150 मिमी की गहराई पर, सकारात्मक दबाव लागू किया गया था क्योंकि पिपेट धीरे-धीरे मध्य या पार्श्व से आगे बढ़ रहा था। पिपेट प्रतिरोध में तेजी से वृद्धि होने तक पिरामिड सेल परत ने न्यूरॉन के साथ संपर्क का संकेत दिया, जिस बिंदु पर सकारात्मक दबाव जारी किया गया था, एक तंग सील (.1 जीएक्स) प्राप्त की गई थी, और पूरे सेल पैच कॉन्फ़िगरेशन को प्राप्त करने के लिए थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू किया गया था।

मल्टीक्लैम्प700बी एम्पलीफायर, एक्सॉन डिजीडेटा 1440ए और 1550बी डिजिटाइज़र, और पीक्लैम्प10/11 सॉफ्टवेयर (आणविक उपकरण) का उपयोग करके डेटा प्राप्त किया गया था। पैच पिपेट (बीएफ150–086; सटर इंस्ट्रूमेंट्स) को सटर पी -97 क्षैतिज पुलर (सटर इंस्ट्रूमेंट्स) पर खींचा गया था )2.5 और 5 एमवी के बीच प्रतिरोध के लिए। प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग से पहले 5 मिनट के लिए कोशिकाओं का डायलिसिस किया गया। विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं में पहुंच प्रतिरोध, 30 एमवी था जो प्रत्येक 5- मिनट के प्रयोग की अवधि के लिए .20% तक नहीं बढ़ा।

वोल्टेज-क्लैंप प्रयोगों के लिए, सभी कोशिकाओं को 7 0 mV पर रखा गया था, और सिग्नलों को 5 kHz पर फ़िल्टर किया गया था और 1 0 kHz पर डिजिटाइज़ किया गया था। IPSC प्रयोगों में एक पैच पिपेट सॉल्यूशन का उपयोग किया गया जिसमें (mM में): 140 CsCl, 10 EGTA, 5 MgCl2, 2 NaATP, 0.3 Na-GTP, 10 HEPES, 0.2% बायोसाइटिन (pH 7.3, 290mm), और 5 QX-314 (सोडियम चैनल प्रतिपक्षी) उपयोग के समय जोड़ा गया। IPSC को 10 mM NBQX (AMPAR प्रतिपक्षी, HelloBio) और 5 mM CPP (NDMAR प्रतिपक्षी, Hello Bio) के स्नान छिड़काव के साथ औषधीय रूप से पृथक किया गया था।

ईपीएससी प्रयोगों में एक पैच पिपेट समाधान का उपयोग किया गया जिसमें (inmM): 1 {{3} 0 CsOH, 1 {{16} 0 ग्लूकोनिक एसिड (50%), 0.6 EGTA, 5MgCl2, 2 Na- उपयोग के समय ATP*3H2O, 0.3 Na-GTP, 40 HEPES, 7 फॉस्फोस्रीटाइन, बायोसाइटिन (0.2%), और 5 QX-314 मिलाया गया। ईपीएससी को औषधीय रूप से 10 एमएम गैबैजिन (जीएबीएएआर प्रतिपक्षी, हैलो बायो) के स्नान छिड़काव के साथ अलग किया गया था। लघु आईपीएससी और लघु ईपीएससी (एमआईपीएससी/एमईपीएससी) को मापने के लिए अलग-अलग प्रयोग 0.5 एमएम टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स; वोल्टेज-गेटेडसोडियम चैनल) के अतिरिक्त के साथ ऊपर दर्ज किए गए थे। अवरोधक, टोक्रिस)।

वर्तमान-क्लैंप प्रयोगों के लिए, सिग्नलों को 10 kHz पर फ़िल्टर किया गया और 20 kHz पर डिजिटाइज़ किया गया। पैच पिपेट समाधान में शामिल (एमएम में): 135 K-ग्लूकोनेट, 2 MgCl2, 0.1 EGTA,1{24}} HEPES, 4 KCl, 2 Mg-ATP, 0.5 Na-GTP, 10 फॉस्फोस्रीटाइन, और बायोसाइटिन (0.2%; pH 7.3, 310 mOsm, और 2-4 MV)। न्यूरोनल उत्तेजना का आकलन आराम से करंट को डीपोलराइज़ करने के प्रगतिशील चरणों (0-500 pA, D 20 pA) को इंजेक्ट करके और प्रत्येक 1000 के दौरान फायर किए गए ऐक्शन पोटेंशिअल की संख्या की गणना करके किया गया था। एमएस वर्तमान कदम.

प्रतिक्रिया ढलान फायरिंग आवृत्ति और इंजेक्ट किए गए करंट के बीच {{0}} से 400-pAsteps के बीच रैखिक संबंध की गणना करके प्राप्त किया गया था। अधिकतम एक्शन पोटेंशिअल (एपी), फायरिंग फ्रीक्वेंसी (अधिकतम) और करंट जिस पर अधिकतम घटित हुआ (आईमैक्स) को भी मापा गया। सैग को हाइपरपोलराइजिंग करंट इंजेक्शन से पीक वोल्टेज के आयाम (एमवी) के रूप में मापा गया था, जिसने 90-93 एमवी की स्थिर-अवस्था झिल्ली क्षमता हासिल की थी। इनपुट प्रतिरोध (एमएक्स) को हाइपरपोलराइजिंग करंट की एक श्रृंखला के लिए वर्तमान प्रतिक्रिया के ढलान के रूप में मापा गया था। इंजेक्शन (150 से 0 पीए, डी 50 पीए)।

रिओबेस को एकल एपी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक न्यूनतम धारा के रूप में परिभाषित किया गया था। रियोबेस द्वारा प्राप्त एकल एपी का उपयोग एक्शन पोटेंशिअल प्रॉपर्टीज (तालिका 1, 2) का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। एपी आयाम को एपी सीमा और उसके शिखर के बीच वोल्टेज अंतर के रूप में परिभाषित किया गया था। थ्रेशोल्ड को वोल्टेज (एमवी) के रूप में परिभाषित किया गया था जिस पर एपी पहला व्युत्पन्न (डीवी/डीटी) 20 एमवी/एस से अधिक हो गया था। एपी वृद्धि का समय एपी के लिए अपने चरम आयाम के 10% से 90% तक पहुंचने का समय (एमएस) था। क्षय समय एपी शिखर आयाम के 90% और 10% के बीच का समय था। आधी-चौड़ाई एपी तरंग के उत्थान और क्षय के आधे आयामों के बीच का समय (एमएस) था। आफ्टरहाइपरपोलराइजेशन (एएचपी) फास्ट-एएचपी (एफएएचपी) के लिए एपी थ्रेशोल्ड के बाद 3 एमएस और मध्यम-एएचपी (एमएएचपी) के लिए एपी थ्रेशोल्ड के बाद 10-50 एमएस के भीतर होने वाले बेसलाइन और सबसे हाइपरपोलराइज्ड पॉइंट के बीच का अंतर था।

पीक एपी वृद्धि और गिरावट को क्रमशः एपी वृद्धि और क्षय के लिए अधिकतम ढलान (DmV/Dms) के रूप में परिभाषित किया गया था। बेसलाइन झिल्ली क्षमता की गणना 0-pA चरण के दौरान 1400-ms स्वीप पर माध्य वोल्टेज के रूप में की गई थी। प्रारंभिक प्रयोग सिनैप्टिक ब्लॉकर्स की अनुपस्थिति में यह निर्धारित करने के लिए किए गए थे कि लिंग और दिन का समय बरकरार सर्किट में सीए 1 पिरामिडल न्यूरॉन उत्तेजना में कैसे योगदान देता है। बढ़ी हुई रात की उत्तेजना पर सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के प्रभाव का आकलन शुरू करने के लिए, GABAA प्रतिपक्षी, गैबज़ीन (10 मिमी), और ग्लूटामेटेरिक प्रतिपक्षी, NBQX (10 मिमी) और सीपीपी (5 मिमी) की उपस्थिति में एक अलग, अनुवर्ती प्रयोग किया गया था। .

इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

यह पुष्टि करने के लिए कि पोस्टसिनेप्टिक धाराओं को मापने के लिए दर्ज की गई कोशिकाएं CA1 पिरामिड कोशिकाएं थीं, सभी कोशिकाओं को कम से कम 2 0 मिनट के लिए बायोसाइटिन से भर दिया गया था। भरी हुई कोशिकाओं वाले स्लाइस को कम से कम 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया, फिर पीबीएस में 3-10 मिनट के लिए धोया गया, और 10% एनडीएस, 3% बीएसए, 1% ग्लाइसीन, 0.4 युक्त टीबीएस समाधान में आरटी पर 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। % ट्राइटन

फिर स्लाइस को पीबीएस में 3 से 10 मिनट तक धोया गया और डीएपीआई युक्त प्रोलॉन्गगोल्ड एंटीफेड माउंटिंग मीडिया के साथ ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप पर लगाया गया। स्लाइडों को BZ-X700 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (Keyence) पर देखा गया। कोई भी कोशिका जिसे स्थान और आकारिकी के आधार पर CA1पिरामिडल कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत नहीं किया जा सका, उसे विश्लेषण से बाहर रखा गया।

विश्लेषण और आँकड़े
एसपीएसएस (संस्करण 27/28) और प्रिज्म-ग्राफपैड सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण और कल्पना की गई। भिन्नता की सामान्यता और समरूपता सहित पैरामीट्रिक परीक्षणों की मान्यताओं का मूल्यांकन किया गया था, और यदि उल्लंघन किया गया, तो डेटा को रूपांतरित किया गया, या गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग किया गया। जब तक अन्यथा न कहा जाए, महत्व पी, 0.05 पर बताया गया था। सभी सांख्यिकीय परीक्षणों का सारांश विस्तारित डेटा तालिका 1-1 में प्रदान किया गया है।

वस्तु स्थान स्मृति

ओएलएम डेटा का विश्लेषण एक स्वतंत्र दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया था जिसमें दिन के समय और लिंग को स्वतंत्र चर के रूप में और भेदभाव सूचकांक को आश्रित चर (छवि 1 डी) के रूप में उपयोग किया गया था। कुल अन्वेषण समय और भेदभाव सूचकांक स्कोर के बीच संबंध का आकलन करने के लिए पियर्सन के सहसंबंध का उपयोग किया गया था और लिंग और दिन के समय में उच्च बनाम निम्न अन्वेषण समय के वितरण को निर्धारित करने के लिए एक आकस्मिक विश्लेषण का उपयोग किया गया था (विस्तारित डेटा चित्र। 1-1बी) .

फ़ील्ड रिकॉर्डिंग

दिन के समय, लिंग और उत्तेजना की तीव्रता के एक फ़ंक्शन के रूप में एफईपीएसपी ढलान के साथ एक रैखिक मिश्रित मॉडल का उपयोग करके इनपुट-आउटपुट डेटा का विश्लेषण किया गया था। एलटीपी प्रयोगों के लिए, एफईपीएसपी ढलानों को आधारभूत प्रतिक्रियाओं के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और मिनटपोस्ट-एचएफएस रिकॉर्डिंग अवधि के अंतिम 10 मिनट के दौरान प्राप्त प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण दोहराया उपायों (आरएम-एनोवा) के साथ तीन-तरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया था।

संपूर्ण-कोशिका पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

पोस्टसिनेप्टिक धाराओं (निरोधात्मक और उत्तेजक) को पीक्लैम्प के ईवेंट टेम्पलेट खोज का उपयोग करके एक 5- मिनट की रिकॉर्डिंग से स्वचालित रूप से पता लगाया गया था और फिर झूठी घटना का पता लगाने के लिए मैन्युअल रूप से निरीक्षण किया गया था। आयाम और अंतर-घटना अंतराल (आईईआई) का विश्लेषण एक सामान्यीकृत आकलन समीकरण (जीईई) का उपयोग करके किया गया था, जो विषयों के भीतर बार-बार माप के बीच सहसंबंधों को ध्यान में रखते हुए जनसंख्या-औसत मॉडल के साथ पैरामीटर अनुमान की अनुमति देता है (रीड और कास, 2010; कुक एट अल।, 2016)।

जीईई मॉडल ने एक असंरचित कामकाजी सहसंबंध मैट्रिक्स संरचना, सेल का एक विषय प्रभाव और पोस्टसिनेप्टिक घटनाओं का एक भीतर-विषय प्रभाव निर्दिष्ट किया। कच्चे डेटा में चरम मूल्यों के साथ एक महत्वपूर्ण सकारात्मक तिरछापन था और इस प्रकार, ऊपरी और निचले आउटलेर्स (10%) की छंटनी की गई, जिसके बाद आयाम डेटा के मामले में लॉग परिवर्तन या आईईआई डेटा के मामले में लॉग 1 1 परिवर्तन हुआ। , विश्लेषण से पहले सामान्य वितरण की धारणाओं को पूरा करना।

सभी वर्तमान-क्लैंप डेटा का विश्लेषण ईज़ीइलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (ईज़ी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आरआरआईडी: एससीआर _021190) के साथ किया गया था, जो एक सॉफ्टवेयर पैकेज है जो नियो (गार्सिया एटल, 2014) का उपयोग करता है। एक्शन पोटेंशिअल की गणना डिफ़ॉल्ट, ऑटोथ्रेशोल्ड स्पाइक एल्गोरिदम के साथ एक्शन पोटेंशियल काउंटिंग मॉड्यूल का उपयोग करके की गई थी। मौजूदा चरणों में ऐक्शन पोटेंशिअल का विश्लेषण करने के लिए एक आरएम-एनोवा का उपयोग किया गया था जिसमें डेटा ने रैखिकता और सामान्यता की धारणाओं का उल्लंघन नहीं किया: 160-400 पीए। अन्य सभी झिल्ली गुणों (सारणी 1, 2) का दिन और लिंग के समय के स्वतंत्र चर के साथ दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। अंतिम सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले सभी वर्तमान-क्लैंप डेटा को पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ स्थिति के आधार पर स्तरीकृत किया गया था।

परिणाम

ओएलएम प्रदर्शन में दिन-रात का अंतर सेक्स पर निर्भर करता है

सीखने और स्मृति की सर्कैडियन लय पर सेक्स के प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने हिप्पोकैम्पसस्पेशियल मेमोरी (बार्कर और वारबर्टन, 2011; ताकाहाशिएट अल) का आकलन करने के लिए ऑब्जेक्ट लोकेशन मेमोरी (ओएलएम) परख का उपयोग किया, जो नए स्थानों में वस्तुओं का पता लगाने के लिए चूहे की प्रवृत्ति पर निर्भर करता है। ., 2013; चाओ एट अल., 2016)। यद्यपि ओएलएम पर प्रदर्शन में सर्कैडियन और दैनिक अंतर की सूचना दी गई है (ताकाहाशी एट अल., 2013; स्नाइडर एट अल., 2016), ओएलएम प्रदर्शन में दैनिक भिन्नता पर सेक्स के प्रभाव को कम समझा गया है।

हमने पाया कि ओएलएम का प्रदर्शन दिन के समय के अनुसार बदलता रहता है; हालाँकि, प्रदर्शन में दैनिक अंतर का पैटर्न लिंगों के बीच भिन्न था (पी=0.023, दो-तरफा एनोवा इंटरैक्शन)।

जबकि नर चूहों ने दिन की तुलना में रात में बेहतर प्रदर्शन किया, जैसा कि अपेक्षित था (पी {{{{10 }}}}.028, पुरुषों में दिन बनाम रात की तुलना करने वाले सरल मुख्य प्रभाव; चित्र 1डी), मादा चूहों ने दिन के दौरान बेहतर प्रदर्शन किया रात (पी {{3%).004, महिलाओं में दिन बनाम रात की तुलना करने वाले सरल मुख्य प्रभाव;चित्र 1डी)। दिन के समय या सेक्स ऑन्टोटल अन्वेषण समय का कोई प्रभाव नहीं था (पी=0.926 और 0.936, दो-तरफा एनोवा मुख्य प्रभाव; विस्तारित डेटा चित्र। 1-1ए)। कुल अन्वेषण और डीआईस्कोर्स के बीच कोई संबंध नहीं था (आर(52)=0.053, एनएस पी=0.704, पियर्सन का सहसंबंध; विस्तारित डेटा चित्र। 1-1बी)।

लिंग की परवाह किए बिना, रात में एलटीपी का परिमाण दिन की तुलना में अधिक होता है
दीर्घकालिक पोटेंशिएशन (एलटीपी) को सीखने और स्मृति का सेलुलर सहसंबंध माना जाता है। सीए पर एलटीपी 3- सीए1 सिनैप्स मैलमिस में दिन की तुलना में रात में अधिक होता है (चौधरी एट अल., 2005; बेसिंग एट अल., 2017; डेविस एट अल., 2020), लेकिन हमारी जानकारी के अनुसार, ऐसा नहीं है वयस्क मादा चूहों में एलटीपी परिमाण पर दिन के समय के प्रभावों की रिपोर्ट प्रकाशित की गई। हमारी खोज को देखते हुए कि हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्मृति परख पर प्रदर्शन में दैनिक अंतर सेक्स पर निर्भर हैं, हमने आगे यह निर्धारित करने की कोशिश की कि क्या सेक्स एलटीपी में दैनिक अंतर को प्रभावित करता है।

सबसे पहले, CA{0}}CA1 सिनैप्स पर बेसल सिनैप्टिक ट्रांसमिशन की ताकत का आकलन करने के लिए, हमने बढ़ती उत्तेजना तीव्रता की एक श्रृंखला पर शेफ़र संपार्श्विक उत्तेजना के जवाब में CA1 स्ट्रेटम रेडिएटम से एफईपीएसपी ढलान को मापकर I/O वक्र उत्पन्न किया ( नर और मादा चूहों में दिन और रात के दौरान 0.2-200 एमए, डी 10 एमए) (चित्र 2ए,बी)। जबकि न तो सेक्स और न ही दिन के समय का परीक्षण की गई उत्तेजना श्रृंखला (क्रमशः पी {{10%).552 और 0.981, एलएमएममुख्य प्रभाव) पर बेसल सिनैप्टिक ट्रांसमिशन पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा, वहां महत्वपूर्ण सेक्स-दर-उत्तेजना तीव्रता इंटरैक्शन था ( पी, 0.001, एलएमएम; चित्र 2ए, बी)।

दिन के समय की परवाह किए बिना, पुरुषों में महिलाओं की तुलना में एफईपीएसपी ढलान केवल 18 {7 }}, 19 {{9 }}, और 200 एमए पर अधिक था (क्रमशः पी =0 .041, 0.043, और 0.035; सभी उत्तेजना तीव्रताओं में पुरुषों और महिलाओं की तुलना करने वाले सरल मुख्य प्रभाव; चित्र 2ए)। कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि दिन का समय बेसल सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को प्रभावित नहीं करता है और सेक्स केवल उच्चतम उत्तेजना तीव्रता पर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है।

इसके बाद, हमने एक संक्षिप्त, उच्च-आवृत्ति उत्तेजना (एचएफएस; छवि 2 सी, डी) के जवाब में एलटीपी को मापकर सीए 3- सीए 1 सिनैप्स पर सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का आकलन किया। जैसा कि पहले बताया गया था, नर और मादा दोनों चूहों में एलटीपी का परिमाण दिन की तुलना में रात में अधिक था (पी =0.003, तीन-तरफा आरएम-एनोवा; चित्र 2सी, डी); हालाँकि, सेक्स का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव या उसके साथ बातचीत नहीं हुई। साथ में, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि दिन का समय बेसल सिनैप्टिक ताकत को प्रभावित किए बिना नर और मादा चूहों में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को प्रभावित करता है।

लिंग की परवाह किए बिना, दिन के दौरान CA1 पिरामिड कोशिकाओं पर सिनैप्टिक अवरोध रात की तुलना में अधिक होता है

एलटीपी में परिवर्तन को सिनैप्टिक तंत्र और/या उत्तेजना में आंतरिक परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसलिए, हमने सबसे पहले यह निर्धारित करने की कोशिश की कि क्या दिन का समय और सेक्स CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स पर निरोधात्मक और उत्तेजक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को प्रभावित करते हैं। CA1 पिरामिड कोशिकाओं पर सिनैप्टिक निषेध की जांच करने के लिए, हमने दिन और रात के दौरान नर और मादा चूहों में पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप का उपयोग करके सहज आईपीएससी (एसआईपीएससी) के आयाम और आवृत्ति को मापा (छवि 3 ए)। हमने पाया कि दिन के दौरान एसआईपीएससी इंटरइवेंट अंतराल (आईईआई) रात की तुलना में कम था, चाहे सेक्स कुछ भी हो (दिन का समय: पी {{6%).033, जीईई; चित्र 3ए, सी), जो अधिक आवृत्ति का संकेत देता है दिन के दौरान निरोधात्मक घटनाओं का।

दिन के दौरान एसआईपीएससी का आयाम पुरुषों और महिलाओं दोनों में रात की तुलना में बड़ा था (दिन का समय:पी=0.008, जीईई; चित्र 3ए, ई)। दिन के समय बढ़ी हुई आवृत्ति और एसआईपीएससी का आयाम रात की तुलना में दिन के दौरान सीए1 पिरामिड न्यूरॉन्स के मजबूत अवरोध का सुझाव देता है।

दिन के दौरान मजबूत सिनैप्टिक अवरोध प्रीसानेप्टिक जीएबीए रिलीज में वृद्धि या पोस्टसिनेप्टिक जीएबीएएआर फ़ंक्शन में वृद्धि से उत्पन्न हो सकता है। इन संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए, हमने दिन और रात के दौरान नर और मादा दोनों चूहों में वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल ब्लॉकर टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) की उपस्थिति में लघु आईपीएससीएस (एमआईपीएससी) को मापा (चित्र 4 ए)। जबकि हमने पाया कि एमआईपीएससी आईईआई पर न तो लिंग (पी=0.392,जीईई) और न ही दिन के समय (पी=0.760, जीईई) का सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा, पुरुषों की घटनाएं प्रदर्शन की ओर बढ़ीं दिन-रात का अंतर (पी{{9%).068, दिन के समय सेक्स संबंध, जीईई; चित्र 3सी)।

महिलाओं में दिन-रात के अंतर की कमी से संकेत मिलता है कि एसआईपीएससी पर दिन के समय का प्रभाव संभवतः स्थानीय इंटिरियरन एक्शन पोटेंशिअल फायरिंग से प्रेरित होता है। पुरुषों में, दिन और रात के बीच का औसत मान 12 एमएस (माध्य और एसईएम: पुरुष दिन, 98.{5}}.05 एमएस; पुरुष रात, 85.{8}}.04 एमएस) से भिन्न होता है, जो उस कार्रवाई का सुझाव देता है संभावित-स्वतंत्र निरोधात्मक पुटिका रिलीज रात में अधिक बार हो सकती है (छवि 3 सी)। जब हमने एमआईपीएससी आयाम की जांच की, तो हमें अप्रत्याशित रूप से दिन के समय और लिंग (पी=0.038,जीईई) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतःक्रिया मिली, जिसमें महिलाओं में आयाम केवल दिन के दौरान पुरुषों की तुलना में बड़ा था (पी {{16} }.006, वाल्ड x2 जोड़ीवार तुलना; चित्र 4ई); हालाँकि, यह;2-pA अंतर संभवतः जैविक रूप से प्रासंगिक नहीं है (महिला-दिन: 34.68 6 1.01 pA;पुरुष-दिन: 32.67 6 1.02 pA, मतलब 6 SEM) .

एक साथ लेने पर, ये सहज और लघु IPSC डेटा सुझाव देते हैं कि कार्रवाई क्षमता-निर्भर निषेध, लेकिन CA1 पिरामिड कोशिकाओं पर सहज पुटिका संलयन नहीं, पुरुषों और महिलाओं दोनों में रात की तुलना में दिन के दौरान अधिक होता है।

CA1 पिरामिड कोशिकाओं पर सिनैप्टिक उत्तेजना लिंग पर निर्भर करती है

हम आगे यह निर्धारित करना चाहते थे कि क्या CA1 पिरामिडल न्यूरॉन्स पर सहज-उत्तेजक सिनैप्टिक इनपुट सेक्स और दिन के समय से प्रभावित था। सबसे पहले, हमने संपूर्ण-सेलवोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग (छवि 5 ए) का उपयोग करके सहज ईपीएससी (एसईपीएससी) को मापा। यद्यपि एसईपीएससी आयाम (चित्र 5ई) पर दिन के समय का कोई महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव नहीं था, लिंग की परवाह किए बिना (पी {{7%).371, जीईई), समय के एक महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव के लिए सांख्यिकीय प्रवृत्ति- दिन ने संकेत दिया कि दिन के दौरान दर्ज किया गया एसईपीएससी आईईआई रात में दर्ज की गई तुलना में अधिक हो सकता है (पी=0.052,जीईई), जो रात में उत्तेजक घटनाओं की अधिक आवृत्ति का सुझाव देता है (चित्र 5सी)। कुल मिलाकर, हमने पाया कि पुरुषों की तुलना में महिलाओं में अधिक उत्तेजक सिनैप्टिक इनपुट था, जिसमें पुरुषों की तुलना में बड़े एसईपीएस आयाम और छोटे आईईआई थे (क्रमशः पी=0.022 और 0.020, सेक्स का मुख्य प्रभाव, जीईई; चित्र 5सी, ई)।

इसके बाद, हमने वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल ब्लॉकर टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) की उपस्थिति में इन प्रयोगों को दोहराया और सीए 1 पिरामिडल न्यूरॉन्स (चित्र 6 ए) पर लघु सहज उत्तेजक सिनैप्टिक धाराओं (एमईपीएससी) को मापा। एमईपीएससी का आयाम लिंग या समय के अनुसार भिन्न नहीं हुआ। दिन का(पी{{5%).227 और पी{7}}.150, सेक्स का मुख्य प्रभाव और दिन का समय, क्रमशः, जीईई; चित्र 6ई); हालाँकि, mEPSC IEI में दिन-रात का बदलाव सेक्स पर निर्भर था (p{{13%).021, दिन-प्रतिदिन सेक्स इंटरैक्शन, GEE; चित्र 6C)। पुरुषों में, एमईपीएससी आईईआई दिन की तुलना में रात में छोटे थे (पी= 0.002, वाल्ड x2जोड़ीवार तुलना), जो पुरुष चूहों में रात में उत्तेजक घटनाओं की अधिक आवृत्ति का संकेत देता है और इसलिए प्रीसानेप्टिक रिलीज संभावना में संभावित वृद्धि; हालाँकि, महिलाओं में दिन-रात का कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (p{{22%).765, Wald x2 जोड़ीवार तुलना; चित्र 6C)।

कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि रात के समय एसईपीएससी आवृत्ति (विशेष रूप से महिलाओं में) में वृद्धि की प्रवृत्ति कार्रवाई क्षमता पर निर्भर है। हालाँकि, पुरुषों में, एक्शन पोटेंशिअल को अवरुद्ध करने से आवृत्ति में रात के समय वृद्धि का पता चलता है जो इन ईपीएससी में नहीं देखा गया था।

CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स रात में अधिक उत्तेजित होते हैं

मोटे तौर पर, हमारी टिप्पणियों से पता चलता है कि सिनैप्टिक निषेध रात में अधिक होता है और सिनैप्टिक उत्तेजना दिन के दौरान अधिक होती है; इस प्रकार, हम आगे यह निर्धारित करना चाहते थे कि क्या सिनैप्टिक उत्तेजक और निरोधात्मक इनपुट में दैनिक भिन्नता का विरोध करने से सीए 1 पिरामिडल न्यूरॉन उत्तेजना में दैनिक भिन्नता होती है। इस प्रयोजन के लिए, हमने CA1 पिरामिड कोशिकाओं को वर्तमान क्लैंप मोड में सर्किट बरकरार (यानी, सिनैप्टिक प्रतिपक्षी की अनुपस्थिति में) और क्लैम्पिंग सेल झिल्ली क्षमता के बिना पैच किया। हमने पिरामिड न्यूरॉन्स में विध्रुवण धारा (0-500 pA, D 20 pA, 1000-ms अवधि) की बढ़ती मात्रा को इंजेक्ट किया और प्राप्त क्रिया क्षमता की संख्या को मापा।

हिप्पोकैम्पस के पूर्वकाल-पश्च अक्ष में न्यूरॉन्स से डेटा एकत्र किया गया था। पहले प्रकाशित अध्ययनों में CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विविधता पाई गई थी जो अक्षों के पार स्थिति पर निर्भर हैं (स्प्रस्टन, 2008; मार्सेलिन एट अल।, 2012; डौघर्टी एट अल।, 2012, 2013; होनिग्सपर्गर एट अल।, 2015; किम और जॉन्सटन, 2015; मलिक एट अल., 2016; मिलिओर एट अल., 2016); इस प्रकार, हमने कोरोनल सेक्शन एनाटॉमी के आधार पर सभी न्यूरॉन्स को "पूर्वकाल" या "पश्च" के रूप में वर्गीकृत करके इस कारक को ध्यान में रखना चुना (एलन संदर्भ एटलस https://atlas.brain-map.org/ से; चित्र 7 ए)।

जब हमने अपने प्रारंभिक एनोवा मॉडल में वर्तमान कदम के अनुसार कई क्रिया संभावनाओं का आकलन करते हुए पूर्वकाल-पश्च अक्ष को एक कारक के रूप में शामिल किया, तो हमने पाया कि सबसे बड़ा योगदान देने वाला कारक क्षेत्र (p{{1%) था। मुख्य प्रभाव, चार-तरफा आरएम-एनोवा)। इसके अतिरिक्त, इनपुट प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्रीय अंतर पाए गए (ए: 64। : 146। {23}}.29 पीए. पी: 386.90 610.82 पीए, पी= 0.047, थ्री-वे एनोवा)।

पूर्वकाल और पश्च न्यूरॉन्स के बीच ये अंतर पहले प्रकाशित अध्ययनों के अनुरूप हैं, जिसमें पृष्ठीय और उदर CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच विविधता पाई गई थी। हालांकि हमारी कोरोनल स्लाइस तैयारी ने हमें वास्तव में उदर CA1 को अलग करने की अनुमति नहीं दी, लेकिन पीछे के खंडों में कुछ उदर CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स को शामिल करने की अधिक संभावना है। वास्तव में, हम पाया गया कि पीछे के न्यूरॉन्स में वेंट्रलसीए1 पिरामिडल न्यूरॉन्स में पहले प्रकाशित डेटा के अनुरूप गुण थे, जबकि पूर्वकाल न्यूरॉन्स पृष्ठीय पिरामिडल न्यूरॉन्स (डौघर्टी एट अल.,2012; मलिक एट अल., 2016) के समान थे।

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