एक्स्ट्रासेल्युलर एसिडोसिस एक-कार्बन चयापचय को प्रतिबंधित करता है और टी सेल स्टेमनेस को संरक्षित करता है
Dec 22, 2023
ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर अम्लीय चयापचय अपशिष्ट उत्पादों का संचय ट्यूमर-फुलाने वाले लिम्फोसाइटों (टीआईएल) के प्रभावकारी कार्यों को रोकता है। हालाँकि, यह स्पष्ट नहीं है कि अम्लीय वातावरण टी सेल चयापचय और भेदभाव को कैसे प्रभावित करता है। यहां हम दिखाते हैं कि एसिड रिप्रोग्राम्स के लंबे समय तक संपर्क टी सेल इंट्रासेल्युलर चयापचय और माइटोकॉन्ड्रियल फिटनेस और टी सेल स्टेमनेस को संरक्षित करता है। यांत्रिक रूप से, ऊंचा बाह्य कोशिकीय अम्लरक्तता SLC7A5 के डाउनरेगुलेशन के माध्यम से मेथियोनीन ग्रहण और चयापचय को बाधित करता है, इसलिए प्रमुख टी सेल स्टेमनेस जीन के प्रमोटरों पर H3K27me3 जमाव को बदल देता है। ये परिवर्तन 'स्टेम-जैसी मेमोरी' स्थिति के रखरखाव को बढ़ावा देते हैं और चूहों में दीर्घकालिक दृढ़ता और एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता में सुधार करते हैं। हमारे निष्कर्ष न केवल टी कोशिकाओं के स्टेम-जैसे गुणों को बनाए रखने के लिए बाह्य कोशिकीय एसिडोसिस की अप्रत्याशित क्षमता को प्रकट करते हैं, बल्कि हमारी समझ को भी आगे बढ़ाते हैं कि मेथिओनिन चयापचय टी सेल स्टेमनेस को कैसे प्रभावित करता है।
सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली
सिस्टैंच इनहांस इम्युनिटी उत्पादों को देखने के लिए यहां क्लिक करें
【अधिक के लिए पूछें】 ईमेल:cindy.xue@wecistanche.com / व्हाट्स ऐप: 0086 18599088692 / वीचैट: 18599088692
ट्यूमर-एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का दत्तक स्थानांतरण कैंसर चिकित्सा के क्षेत्र में एक प्रमुख प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि इससे कुछ घातक बीमारियों का पूर्ण प्रतिगमन हो गया है। इसकी चिकित्सीय प्रभावकारिता स्थानांतरित टी कोशिकाओं1,2 की दृढ़ता और विभेदन स्थिति पर बहुत अधिक निर्भर करती है। कम विभेदित मेमोरी टी कोशिकाएं अपने स्वयं-नवीकरण और मल्टीपोटेंसी 3,4 के स्टेम-सेल जैसे गुणों के कारण गोद लेने वाले टी सेल ट्रांसफर (एसीटी) के लिए पसंदीदा आबादी हैं। दरअसल, एसीटी के लिए स्टेम-जैसी मेमोरी टी कोशिकाओं का उपयोग बेहतर एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है। टर्मिनली विभेदित प्रभावकारी टी कोशिकाओं की तुलना में, स्टेम-जैसी टी कोशिकाएं अलग-अलग हॉलमार्क प्रदर्शित करती हैं। मानव और माउस स्टेम-जैसी टी कोशिकाओं दोनों को एंटीजन-अनुभवी और होमिंग-जुड़े अणुओं की अभिव्यक्ति की विशेषता है, जिसमें सीडी 62 एल और सीसीआर 7 (रेफरी 7) के उच्च स्तर शामिल हैं। स्टेम-जैसी टी कोशिकाओं को विनियमित करने वाले ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल, एपिजेनेटिक संशोधनों और चयापचय मार्गों के बारे में हमारी समझ हाल के वर्षों में नाटकीय रूप से उन्नत हुई है। बताया गया है कि कई ट्रांसक्रिप्शनल कारक, जैसे टीसीएफ1, केएलएफ2 और एलईएफ1, टी सेल स्टेमनेस9 को चलाने या बनाए रखने में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। विशेष रूप से, टीसीएफ1 प्रमुख प्रतिलेखन कारक है जो लंबे समय तक रहने वाली मेमोरी टी कोशिकाओं11 की पीढ़ी को बढ़ावा देता है। क्रोनिक संक्रमण के दौरान, टीसीएफ 1+ स्टेम-जैसी टी कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश द्वितीयक संक्रमण 1,12 के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रियाओं को बनाए रखता है। एपिजेनेटिक परिवर्तन टी कोशिकाओं को ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन शुरू करने का एक साधन प्रदान करते हैं जो मेमोरी-सेल विशेषताओं के अधिग्रहण को रेखांकित करते हैं और इन ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति पैटर्न को बनाए रखते हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि K4 (H3K4me3) पर हिस्टोन H3 का ट्राइमेथिलेशन, एक सक्रियण-संबंधित संशोधन, अनुभवहीन CD के विभेदन के दौरान TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 और SELL सहित मेमोरी-संबंधित जीन लोकी में प्राप्त होता है। }} टी कोशिकाएं मेमोरी टी कोशिकाओं में, जबकि K27 (H3K27me3) पर H3 का ट्राइमेथिलेशन, एक दमनकारी संशोधन, इन लोकी13-15 पर खो जाता है। इसके विपरीत, प्रभावकारी-संबंधित जीन (जीजेएमबी, पीआरएफ1, आईएफएनजी, और टीबीएक्स21) प्रभावकारी टी कोशिकाओं13,16 में इन लोकी में दमनकारी में कमी और सक्रिय एपिजेनेटिक संशोधनों को बढ़ाते हैं। अंत में, सबूतों की बढ़ती श्रृंखला से पता चलता है कि चयापचय सर्किट टी सेल भाग्य निर्णयों को निर्देशित करते हैं और उनके एपिगेनेटिक और कार्यात्मक राज्यों को आकार देते हैं। अल्पकालिक प्रभावकारी टी कोशिकाएं अत्यधिक ग्लाइकोलाइटिक होती हैं और एक-कार्बन चयापचय 18,19 पर निर्भर होती हैं, जबकि स्टेम-जैसी मेमोरी टी कोशिकाएं बढ़े हुए फैटी एसिड ऑक्सीकरण (एफएओ) और माइटोकॉन्ड्रियल अतिरिक्त श्वसन क्षमता (एसआरसी), कार्डिनल द्वारा विशेषता विशिष्ट चयापचय प्रोफाइल प्रदर्शित करती हैं। दीर्घकालिक दृढ़ता में शामिल विशेषताएँ20-22। इसलिए, स्टेमनेस के कुशल अधिग्रहण और टी कोशिकाओं के दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग महत्वपूर्ण है।
पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें
कम पीएच, हाइपोक्सिया, ग्लूकोज की कमी और लैक्टिक एसिड संवर्धन द्वारा विशेषता इम्यूनोस्प्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई), उचित टी सेल विस्तार, भेदभाव और कार्यक्षमता में बाधा डालने वाली प्रमुख बाधा है। वास्तव में, टीएमई द्वारा लगाया गया चयापचय तनाव माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता और फिटनेस को ख़राब करता है, जिससे इंट्राट्यूमोरल टी सेल चयापचय अपर्याप्तता और शिथिलता उत्पन्न होती है। दिलचस्प बात यह है कि अधिकांश ट्यूमर-घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइट्स (टीआईएल) निष्क्रिय हैं, लेकिन एक छोटा सा अंश स्टेम-जैसी स्मृति या अग्रदूत गुण 7,29 को बरकरार रखता है। यह स्टेम-जैसा टीआईएल उपसमुच्चय प्रसार क्षमता और दृढ़ता को बरकरार रखता है और कैंसर11,30 वाले लोगों में प्रतिरक्षा जांच बिंदु नाकाबंदी (आईसीबी) और टीआईएल-एसीटी के अनुकूल प्रतिक्रिया से जुड़ा हुआ है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि उन्नत बाह्यकोशिकीय अम्लरक्तता (↑[H+]) ने इन विट्रो और विवो31-33 दोनों में टी कोशिकाओं की साइटोलिटिक गतिविधि को दबा दिया है। इसके अलावा, अम्लीय टीएमई का ट्यूमर-घुसपैठ करने वाली माइलॉयड कोशिकाओं, जैसे डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम) 34-36 की गतिविधि और भेदभाव पर काफी प्रभाव पड़ता है। हालाँकि, टी सेल स्टेमनेस और मेटाबोलिक फिटनेस पर ↑[H+] का प्रभाव काफी हद तक अज्ञात है। यहां, हम रिपोर्ट करते हैं कि लंबे समय तक इन विट्रो ↑[H+] एक्सपोज़र टर्मिनल इफ़ेक्टर CD8+ T कोशिकाओं की कीमत पर मानव और माउस स्टेम-जैसी CD8+ T कोशिकाओं के विभेदन की सुविधा प्रदान करता है। हमने पाया कि दीर्घकालिक ↑[H+ ] उपचार टी-सेल चयापचय को फिर से तैयार करता है और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता को बनाए रखता है। इसके अलावा, लगातार ↑[H+] एक्सपोज़र मेथियोनीन के अवशोषण और चयापचय को बाधित करता है, जिसके परिणामस्वरूप बाद में स्मृति-संबंधी जीन के H3K27me3 जमाव में कमी आती है, जिससे 'स्टेम-जैसी मेमोरी' स्थिति के रखरखाव में सुविधा होती है। अंत में, ↑[H+]-स्थितियों में संवर्धित टी कोशिकाओं का दत्तक स्थानांतरण, उनके कम थके हुए फेनोटाइप के अनुरूप, विवो में शक्तिशाली एंटी-ट्यूमर गतिविधि दिखाता है। इस प्रकार, हमारे अध्ययन से सेलुलर चयापचय और एपिजेनेटिक पैटर्न के रीमॉडलिंग के माध्यम से टी सेल स्टेमनेस को संरक्षित करने में बाह्य एसिडोसिस की अप्रत्याशित भूमिका का पता चलता है।
परिणाम
↑[H+ ] एक्सपोज़र सीडी8+ टी सेल स्टेमनेस को बढ़ावा देता है
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या बाह्यकोशिकीय ↑[H+] स्टेम-जैसे टी सेल भेदभाव को प्रभावित करता है, हमने नियंत्रण माध्यम में 12 दिनों के लिए संवर्धित मानव टी कोशिकाओं पर प्रमुख स्टेम-जैसे फेनोटाइप का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण किया, ↑[H+] मीडिया जिसमें 10 मिमी लैक्टिक एसिड होता है (पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों में लैक्टेट सांद्रता की नकल करना23,35) या अम्लीय माध्यम (~पीएच 6.6, हाइड्रोक्लोरिक एसिड द्वारा) (चित्र 1ए)। प्रारंभिक मेमोरी (CD45RO− CD27+ ) और केंद्रीय मेमोरी (CD45RO+ CD27+ ) सहित स्टेम-जैसी CD8+ T कोशिकाओं का उच्च अनुपात, ↑ में वातानुकूलित T कोशिकाओं में देखा गया था। [एच+] बनाम नियंत्रण माध्यम (विस्तारित डेटा चित्र 1ए)। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि ↑[H+] माध्यम में संवर्धित टी कोशिकाओं में स्टेम-जैसी कोशिकाओं (CCR7+ CD62L+) का प्रतिशत अधिक था (चित्र 1बी)। ध्यान दें, हमने उल्लेखनीय रूप से बढ़ी हुई टीसीएफ 1 अभिव्यक्ति देखी है, जो मानव और माउस दोनों सीडी में प्रोटीन स्तर पर स्टेम-जैसी और केंद्रीय मेमोरी भेदभाव को चलाने वाला प्रमुख कारक है। सीडी 8+ टी कोशिकाएं ↑ [एच +] (छवि 1 सी और) के संपर्क में हैं। विस्तारित डेटा चित्र 1बी)। इसके अलावा, CCR7 और TCF1 अभिव्यक्ति (विस्तारित डेटा चित्र 1c) पर एक [H+]-सांद्रण-निर्भर प्रभाव था। ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं के तने जैसे फेनोटाइप के अनुसार, इन कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर इंटरफेरॉन- (आईएफएन-) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ-) का उत्पादन काफी कम हो गया था (चित्र 1डी)।
टी सेल विभेदन स्थिति की बेहतर जांच करने के लिए, हमने आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) विश्लेषण किया और पाया कि लंबे समय तक इन विट्रो ↑[एच+] एक्सपोजर के परिणामस्वरूप एक अलग ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल (विस्तारित डेटा छवि 1डी) प्राप्त हुआ। ↑[H+] के संपर्क में आने से PRF1, GZMB और IFNG, और सह-निरोधात्मक रिसेप्टर BTLA (चित्र 1e,f और विस्तारित डेटा चित्र 1e) जैसे प्रभावकारी अणुओं को एन्कोडिंग करने वाले जीन की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय रूप से कमी आई। इसके विपरीत, ↑[H+]-संवर्धित टी कोशिकाओं ने BACH2, CCR7, LEF1 और TCF7 की उच्च अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जो टी सेल स्टेमनेस (छवि 1e, एफ और विस्तारित डेटा छवि 1e) के साथ सहसंबद्ध है। जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) से पता चला कि ↑[H+] एक्सपोज़र से प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल पैटर्न मेमोरी टी कोशिकाओं (छवि 1 जी और विस्तारित डेटा छवि 1 एफ) के समान था। इसके अलावा, मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) विश्लेषण ने ↑[H+] उपचार (छवि 1h) के बाद BACH2, KLF2, LEF1 और TCF7 की बढ़ी हुई mRNA अभिव्यक्ति की पुष्टि की। सामूहिक रूप से, ये अवलोकन इस तथ्य का समर्थन करते हैं कि ↑[H+] उपचार स्टेमनेस स्थापित करने के लिए टी कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को काफी आकार देता है। ध्यान दें, हमने पाया कि ↑[H+] उपचार ने टी कोशिका प्रसार को रोक दिया और कोशिका-चक्र वितरण को G1 चरण की ओर और S चरण से दूर कर दिया (पूरक चित्र 1a-c)। हमने अगली बार टीसीआर उत्तेजना के दौरान ↑[H+] उपचार पर टी सेल सक्रियण की जांच की और पाया कि ↑[H+] एक्सपोज़र का टी सेल सक्रियण मार्करों या सेल आकार (पूरक छवि 2 ए, बी) की अभिव्यक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है। इसके अतिरिक्त, हमने आगे पुष्टि की है कि टी सेल सक्रियण के बाद ↑[H+] एक्सपोज़र अभी भी टी कोशिकाओं की स्टेम-जैसी स्थिति को प्रेरित कर सकता है (पूरक छवि 2सी-एफ)। ये निष्कर्ष इस संभावना को खारिज करते हैं कि ↑[H+] के संपर्क में आने वाली टी कोशिकाएं उत्तेजना के प्रति केवल दुर्दम्य होती हैं, स्टेम जैसी अवस्था अपनाने के विपरीत।
सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार
पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि अम्लीय वातावरण इन विट्रो और विवो दोनों में टी कोशिकाओं की साइटोलिटिक गतिविधि को तीव्र रूप से रोकता है। हमने यह भी पाया कि अल्पकालिक ↑[H+] एक्सपोज़र ने साइटोकिन्स के उत्पादन को ख़राब कर दिया, लेकिन टी कोशिकाओं में स्टेम-जैसे फेनोटाइप पर बहुत कम प्रभाव पड़ा (विस्तारित डेटा चित्र 1g-i और अनुपूरक चित्र 3a-c)। इसके अलावा, ↑[H+] एक्सपोज़र द्वारा साइटोकिन उत्पादन के निरोधात्मक प्रभाव क्षणिक और प्रतिवर्ती होते हैं क्योंकि ↑[H+] को हटाने से टी कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन उत्पादन तेजी से बहाल हो जाता है (विस्तारित डेटा चित्र 1h)। इस प्रकार, अम्लीय परिवेश द्वारा टी सेल प्रभावकारक कार्य का अवरोध बहुत तेजी से होता है, जबकि टी सेल स्टेमनेस की पुन: प्रोग्रामिंग के लिए लंबे समय तक ↑[H+] एक्सपोज़र की आवश्यकता होती है। क्योंकि लैक्टेट या तो अपने असंबद्ध रूप (लैक्टिक एसिड) या आयन नमक (सोडियम लैक्टेट) के रूप में घोल में मौजूद होता है, हमने आगे यह निर्धारित करने की कोशिश की कि क्या सोडियम लैक्टेट ने टी सेल स्टेमनेस पर समान प्रभाव प्रदर्शित किया है और पाया कि सोडियम लैक्टेट ने स्टेमनेस हस्ताक्षर को भी बढ़ावा दिया है। हालाँकि इसकी प्रभावकारिता लैक्टिक एसिड उपचार (10 एमएम) (विस्तारित डेटा छवि 1 जे, के और अनुपूरक छवि 4 ए-एफ) की तुलना में बहुत कम थी। ये निष्कर्ष सीडी8+ टी कोशिकाओं के स्टेम-जैसे फेनोटाइप को शामिल करने में ↑[एच+] के महत्व और लैक्टेट आयन उपचार से इसके अंतर दोनों का सुझाव देते हैं।
![Fig. 1 | ↑[H+ ] exposure facilitates the differentiation of stem-like CD8+ T cells. a Schematic of human T cell activation in the indicated conditions: pH 7.4 (–↑[H+ ], control), pH 6.6 (+↑[H+ ], hydrochloric acid), or 10 mM lactic acid (+↑[H+ ]). PBMCs, peripheral blood mononuclear cells. b, Representative CCR7 and CD62L expression profiles in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. c, Representative histograms and quantification of TCF1 expression in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. MFI, mean fluorescence intensity. d, Human T cells were expanded as in a for 12 days and stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) containing brefeldin A (BFA) for 4.5 h. The intracellular expression profile of IFN-γ and TNF-α is depicted for T cells in the pH 7.4 (left), 10 mM lactic acid (middle), or pH 6.6 (right) condition. n = 3 independent samples. e,f, RNA-seq analysis of human T cells that were expanded in control (pH 7.4) or lactic acid (10 mM). Heat map of selected genes (e) and volcano plot of all genes in which genes associated with memory, effector, and exhausted T cells were labeled (f). In the volcano plot, the x-axis represents the log2-transformed fold change (FC) values for cells treated with lactic acid relative to controls at day 12, and the y-axis represents the adjusted P values. n = 4 independent samples. g, GSEA plot comparing control with lactic-acid conditioned T cells for effector versus memory enrichment. NES, normalized enrichment score. h, Quantitative mRNA expression of transcription factors associated with T cell stemness (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by unpaired two-tailed Student's t-test (b–d,h). Nominal P values and false-discovery rates (FDRs) were calculated with the default method of the GSEA software (g).](/Content/uploads/2023842169/20231219104316e880161f05a346bca771aace88a72449.png "Fig. 1 | ↑[H+ ] exposure facilitates the differentiation of stem-like CD8+ T cells. a Schematic of human T cell activation in the indicated conditions: pH 7.4 (–↑[H+ ], control), pH 6.6 (+↑[H+ ], hydrochloric acid), or 10 mM lactic acid (+↑[H+ ]). PBMCs, peripheral blood mononuclear cells. b, Representative CCR7 and CD62L expression profiles in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. c, Representative histograms and quantification of TCF1 expression in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. MFI, mean fluorescence intensity. d, Human T cells were expanded as in a for 12 days and stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) containing brefeldin A (BFA) for 4.5 h. The intracellular expression profile of IFN-γ and TNF-α is depicted for T cells in the pH 7.4 (left), 10 mM lactic acid (middle), or pH 6.6 (right) condition. n = 3 independent samples. e,f, RNA-seq analysis of human T cells that were expanded in control (pH 7.4) or lactic acid (10 mM). Heat map of selected genes (e) and volcano plot of all genes in which genes associated with memory, effector, and exhausted T cells were labeled (f). In the volcano plot, the x-axis represents the log2-transformed fold change (FC) values for cells treated with lactic acid relative to controls at day 12, and the y-axis represents the adjusted P values. n = 4 independent samples. g, GSEA plot comparing control with lactic-acid conditioned T cells for effector versus memory enrichment. NES, normalized enrichment score. h, Quantitative mRNA expression of transcription factors associated with T cell stemness (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by unpaired two-tailed Student's t-test (b–d,h). Nominal P values and false-discovery rates (FDRs) were calculated with the default method of the GSEA software (g).")
चित्र 1|↑[H+ ] एक्सपोज़र स्टेम-जैसी सीडी8+ टी कोशिकाओं के विभेदन की सुविधा प्रदान करता है। संकेतित स्थितियों में मानव टी सेल सक्रियण का एक योजनाबद्ध: पीएच 7.4 (-↑[एच+], नियंत्रण), पीएच 6.6 (+↑[एच+], हाइड्रोक्लोरिक एसिड), या 10 मिमी लैक्टिक एसिड (+↑[एच+])। पीबीएमसी, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं। बी, मानव सीडी में प्रतिनिधि सीसीआर7 और सीडी62एल अभिव्यक्ति प्रोफाइल 8+ दिन 12 में विभिन्न परिस्थितियों में टी कोशिकाएं। एन=3 स्वतंत्र नमूने। सी, दिन 12 में विभिन्न परिस्थितियों में मानव सीडी 8+ टी कोशिकाओं में टीसीएफ1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम और मात्रा का ठहराव। एन=3 स्वतंत्र नमूने। एमएफआई, माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता। डी, मानव टी कोशिकाओं को 12 दिनों के लिए विस्तारित किया गया और 4.5 घंटे के लिए ब्रेफेल्डिन ए (बीएफए) युक्त फोर्बोल 12- मिरिस्टेट 13- एसीटेट (पीएमए) से उत्तेजित किया गया। IFN- और TNF- की इंट्रासेल्युलर अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को पीएच 7.4 (बाएं), 10 मिमी लैक्टिक एसिड (मध्य), या पीएच 6.6 (दाएं) स्थिति में टी कोशिकाओं के लिए दर्शाया गया है। n=3 स्वतंत्र नमूने। ई, एफ, मानव टी कोशिकाओं का आरएनए-सीक्यू विश्लेषण जो नियंत्रण (पीएच 7.4) या लैक्टिक एसिड (10 मिमी) में विस्तारित किया गया था। चयनित जीनों का हीट मैप (ई) और सभी जीनों का ज्वालामुखी प्लॉट जिसमें स्मृति, प्रभावकारक और समाप्त टी कोशिकाओं से जुड़े जीनों को लेबल किया गया था (एफ)। ज्वालामुखी भूखंड में, x-अक्ष 12 दिन के नियंत्रण के सापेक्ष लैक्टिक एसिड से उपचारित कोशिकाओं के लिए परिवर्तित तह परिवर्तन (FC) मानों का प्रतिनिधित्व करता है, और y-अक्ष समायोजित P मानों का प्रतिनिधित्व करता है। n=4 स्वतंत्र नमूने। जी, जीएसईए प्लॉट प्रभावकारक बनाम स्मृति संवर्धन के लिए लैक्टिक-एसिड वातानुकूलित टी कोशिकाओं के साथ नियंत्रण की तुलना करता है। एनईएस, सामान्यीकृत संवर्धन स्कोर। एच, संकेतित शर्तों के तहत टी कोशिकाओं में टी सेल स्टेमनेस (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) से जुड़े प्रतिलेखन कारकों की मात्रात्मक एमआरएनए अभिव्यक्ति। n=3 स्वतंत्र नमूने। डेटा को माध्य ± सेम के रूप में प्रस्तुत किया गया है सांख्यिकीय विश्लेषण अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट (बी-डी, एच) द्वारा निर्धारित किए गए थे। नाममात्र पी मान और झूठी खोज दर (एफडीआर) की गणना जीएसईए सॉफ्टवेयर (जी) की डिफ़ॉल्ट विधि से की गई थी।
ऊंचा [एच+] मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग को ट्रिगर करता है
विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों से परे, स्टेम-जैसी टी कोशिकाएं भी अधिमानतः अद्वितीय चयापचय विशेषताओं को प्राप्त करती हैं, जिनमें ऊंचा एफएओ और प्रतिबंधित ग्लाइकोलाइटिक चयापचय 17,20,37 शामिल हैं। लंबे समय तक इन विट्रो ↑[एच+]-एक्सपोज़्ड टी कोशिकाओं की चयापचय विशेषताओं का पता लगाने के लिए, हमने जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन विश्लेषण किया और चयापचय मार्गों से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण अंतर पाया, जैसे कि छोटे-अणु चयापचय और ग्लाइकोलाइसिस (चित्र 2ए)। दरअसल, लंबी अवधि के ↑[एच+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं ने बढ़ी हुई लंबी-श्रृंखला फैटी एसिड चयापचय (विस्तारित डेटा छवि 2 ए, बी) के विपरीत ग्लाइकोलाइसिस और अमीनो एसिड चयापचय को कम प्रदर्शित किया। दीर्घकालिक ↑[H+] एक्सपोज़र के विपरीत, अल्पकालिक ↑[H+] उपचार ने केवल ग्लाइकोलाइसिस को रोक दिया, लेकिन एफएओ पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा (पूरक छवि 5 ए)। मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण ने आगे पुष्टि की कि ग्लाइकोलाइसिस जीन एसएलसी2ए1, एसएलसी2ए3 और एलडीएचए ↑[एच+]-एक्सपोज़्ड टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा छवि 2सी) में काफी कम हो गए थे। इसके विपरीत, ↑[H+] कंडीशनिंग ने कार्निटाइन पामिटॉयलट्रांसफेरेज़ 1 (CPT1A द्वारा एन्कोडेड) की अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया, जो FAO (विस्तारित डेटा चित्र 2c) में शामिल एक दर-सीमित एंजाइम है। ↑[H+] से प्रेरित चयापचय परिवर्तनों को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने एक निष्पक्ष चयापचय विश्लेषण किया और ↑[H+] बनाम नियंत्रण (विस्तारित डेटा चित्र 2डी) के साथ संवर्धित टी कोशिकाओं में 285 अलग-अलग मध्यवर्ती पाए। विशेष रूप से, ↑[H+] के संपर्क में आने से कई कार्निटाइन प्रजातियों में वृद्धि के बजाय ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती और कुछ आवश्यक अमीनो एसिड में काफी कमी आई है, फैटी एसिड का सक्रिय रूप जो ऑक्सीकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानांतरित होता है (विस्तारित डेटा चित्र 2e-g)। [13सी6]ग्लूकोज या [13सी16]पामिटेट का उपयोग करके मेटाबोलिक फ्लक्स विश्लेषण से पता चला है कि ↑[एच+] एक्सपोजर ने टीसीए मध्यवर्ती और लैक्टिक एसिड में [13सी6]ग्लूकोज के समावेश को काफी हद तक बाधित कर दिया है, जबकि एसिटाइल-सीओए और साइट्रेट में [13सी16]पामिटेट के समावेश को बढ़ावा दिया है, जो इस धारणा का समर्थन करता है। कि बाह्यकोशिकीय अम्लरक्तता ग्लाइकोलाइसिस को दबा देती है और टी कोशिकाओं में एफएओ को बढ़ा देती है (चित्र 2बी-ई)। इन ↑[एच+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं ने पोषक तत्वों के अवशोषण के संबंध में सीमाएं प्रदर्शित कीं, जैसा कि [13सी6]ग्लूकोज की कम खपत और लिपिड एनालॉग्स (बॉडीपीवाई एफएल सी16) के अवशोषण से प्रमाणित है, एक खोज जो बढ़ी हुई इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट के कारण हो सकती है (विस्तारित डेटा चित्र 2h, i)।
सीमित पोषक तत्व ग्रहण और सेलुलर-चयापचय स्विच टी कोशिकाओं में सिग्नलिंग नेटवर्क में परिवर्तन का कारण बन सकता है। लैक्टिक एसिड से उपचारित टी कोशिकाओं के जीओ संवर्धन विश्लेषण से पता चला कि अधिकांश प्रभावित जीन मुख्य रूप से पीआई3के-एकेटी, एमटीओआर और टीसीआर सिग्नलिंग (विस्तारित डेटा छवि 3 ए) से जुड़े हैं। एमटीओआर सिग्नलिंग टी कोशिकाओं के उचित सक्रियण के लिए प्रतिरक्षा संकेतों और चयापचय संकेतों को एकीकृत करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और एमटीओआर सिग्नलिंग का अवरोध कोशिकाओं को प्रभावकारी विभेदन38-40 के बजाय मेमोरी सीडी 8+ टी कोशिकाओं के निर्माण की ओर झुकाता है। हमारे जीएसईए विश्लेषण ने संकेत दिया कि ↑[एच+]-कंडिशन्ड टी कोशिकाओं में एकेटी-एमटीओआर और एनएफ-केबी सिग्नलिंग दोनों की गतिविधि नियंत्रण टी कोशिकाओं (छवि 2 एफ और विस्तारित डेटा छवि 3 बी) की तुलना में कम हो गई थी। ↑[H+ ]-कंडिशन्ड टी कोशिकाओं (छवि) में S6 (Ser235 और Ser236 पर), 4EBP1 (Thr37 और Th46 पर), AKT (Ser473 पर) और NF-кB (Ser536 पर) के घटे हुए फॉस्फोराइलेशन द्वारा इसकी पुष्टि की गई। 2जी,एच और विस्तारित डेटा चित्र 3सी)। एमटीओआर को कोशिका आकार, ऊर्जा उत्पादन और प्रोटीन संश्लेषण41 सहित विविध जैविक प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण नियामक माना जाता है। वास्तव में, हमने पाया कि ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं का सेल आकार नियंत्रण टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा चित्र 3डी) की तुलना में कम हो गया था। हमने अगली बार SCENITH का उपयोग करके ↑[H+ ]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं में बायोएनर्जी-निर्भर प्रोटीन संश्लेषण का आकलन किया, जो एक नई विकसित विधि है जो प्रोटीन-संश्लेषण स्तर42 के रीडआउट के रूप में पौरोमाइसिन निगमन का उपयोग करती है। जैसा कि अपेक्षित था, ↑[H+] एक्सपोज़र ने ऊर्जा-गहन प्रोटीन संश्लेषण (छवि 2i) को दबा दिया, जिससे पता चलता है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं में ऊर्जा चयापचय बदल गया था। ये परिणाम पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं कि रैपामाइसिन द्वारा एमटीओआर गतिविधि के निषेध ने स्टेमनेस से जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल कारकों (विस्तारित डेटा छवि 3e, एफ) की अभिव्यक्ति में वृद्धि की है। हमारे परिणामों को एक साथ लेते हुए, हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि दीर्घकालिक ↑[H+] एक्सपोज़र एक चयापचय स्विच को व्यवस्थित करता है और एमटीओआर गतिविधि को दबा देता है, जिससे टी सेल स्टेमनेस के अधिग्रहण और रखरखाव की सुविधा मिलती है।
सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार
↑[एच+]-मेथियोनीन चयापचय का त्वरित प्रतिबंध एपिजेनेटिक स्टेमनेस को संरक्षित करता है
साक्ष्यों की एकत्रित पंक्तियाँ बताती हैं कि एक-कार्बन चयापचय टी-सेल भाग्य निर्णयों को निर्देशित करता है और उनके कार्यात्मक राज्यों को आकार देता है।43,44। हमारे आरएनए-सीक्यू विश्लेषण ने टी कोशिकाओं में एक-कार्बन चयापचय प्रक्रिया और मेथियोनीन चक्र हस्ताक्षर के लिए खराब संवर्धन दिखाया, जो कि अल्पकालिक, ↑ [एच +] उपचार (चित्र 3 ए, विस्तारित डेटा चित्र 4 ए) के बजाय दीर्घकालिक के संपर्क में था। और अनुपूरक चित्र 5बी)। तदनुसार, ↑[H+] एक्सपोज़र ने मेथियोनीन चक्र (एमटीआर, एएचसीवाई और बीएचएमटी) के साथ-साथ फोलेट चयापचय (एसएचएमटी1 और एसएचएमटी2) (विस्तारित डेटा छवि 4 बी) से संबंधित जीन एन्कोडिंग एंजाइमों की अभिव्यक्ति को रोक दिया। आगे के मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण से पता चला कि लैक्टिक एसिड में संवर्धित टी कोशिकाओं ने मेथिओनिन, एस-एडेनोसिलमेथिओनिन (एसएएम) और एस-एडेनोसिलहोमोसिस्टीन (एसएएच) सहित मेथियोनीन चक्र में शामिल इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट्स में उल्लेखनीय कमी देखी है, लेकिन सेरीन और होमोसिस्टीन (विस्तारित) के स्तर में वृद्धि हुई है। डेटा चित्र 4सी)। [13सी5]मेथियोनीन ट्रेसिंग ने आगे पुष्टि की है कि मेथियोनीन का अवशोषण और इंट्रासेल्युलर प्रचुरता, 13सी-लेबल इंट्रासेल्युलर एसएएम (एम+5), एसएएच (एम+4) और 5′-मिथाइल-थियोएडेनोसिन (एमटीए, एम) +1) ↑[एच+]-उजागर टी कोशिकाओं (चित्र 3बी-डी और विस्तारित डेटा चित्र 4डी) में काफी कम हो गए थे। ध्यान दें, बहिर्जात मेथिओनिन अनुपूरण ने [13सी5] मेथियोनीन के अवशोषण और इंट्रासेल्युलर प्रचुरता के साथ-साथ ↑[एच+]-उजागर टी कोशिकाओं (छवि 3 सी, डी और विस्तारित डेटा छवि 4 डी) में प्रासंगिक मध्यवर्ती को बहाल किया, जो सुझाव देता है कि बहिर्जात मेथियोनीन अनुपूरण मेथिओनिन के अवशोषण और ↑[H+ ]-उजागर टी कोशिकाओं के चयापचय को बहाल कर सकता है। हमने अगली जांच की कि क्या मेथियोनीन प्रतिबंध टी सेल स्टेमनेस को बढ़ा सकता है। हमने पाया कि मेथिओनिन की कमी ने वास्तव में टीसीएफ 1+ सीडी 8+ टी सेल आबादी को शामिल करने को बढ़ावा दिया, लेकिन सीडी62एल और सीडी44 (विस्तारित डेटा चित्र 4ई, एफ) की अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ↑[H+ ]-प्रेरित टी सेल स्टेमनेस में मेथिओनिन चयापचय की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, हमने मेथिओनिन, एसएएम, या एसएएच के साथ पूरक ↑[H+] माध्यम के साथ टी कोशिकाओं को संवर्धित किया। बाह्यकोशिकीय एसिडोसिस से प्रेरित टी सेल स्टेमनेस का फेनोटाइप वास्तव में मेथियोनीन या एसएएम के साथ पूरकता द्वारा आंशिक रूप से प्रतिबंधित था, लेकिन एसएएच (छवि 3ई और विस्तारित डेटा छवि 4जी-आई) नहीं। इंट्रासेल्युलर मेथिओनिन को एसएएम में परिवर्तित किया जाता है, जो डीएनए और हिस्टोन मिथाइलेशन प्रतिक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण मिथाइल-समूह दाता है (विस्तारित डेटा चित्र 5 ए)। इस प्रकार, हमने हिस्टोन मिथाइलेशन पैटर्न की विशेषता बताई और पाया कि ऊंचे [H+] ने टी कोशिकाओं में कुल H3K27me3 स्तर को काफी कम कर दिया, लेकिन अन्य हिस्टोन मिथाइलेशन मार्करों (छवि 3 एफ और विस्तारित डेटा छवि 5 बी) की अभिव्यक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। जैसा कि अपेक्षित था, ↑[H+] एक्सपोज़र के तहत टी कोशिकाओं को मेथिओनिन अनुपूरण ने H3K27me3 अभिव्यक्ति के कुल स्तर को बहाल कर दिया (चित्र 3f)। लंबे समय तक ↑[H+] उपचार से गुजरने वाली टी कोशिकाओं में देखी गई H3K27me3 स्तर की विशिष्ट कमी ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि ↑[H+] एक्सपोज़र H3K27me3 के जमाव के लिए विशिष्ट मिथाइलट्रांसफेरेज़ को चुनिंदा रूप से नियंत्रित करता है। दरअसल, हमने ↑[H+]-एक्सपोज़्ड टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा छवि 5 सी, डी) में एमआरएनए और प्रोटीन दोनों स्तरों पर, एच3के27मी3 के लिए एक प्रमुख मिथाइलट्रांसफेरेज़, ईज़ेडएच2 की अभिव्यक्ति में काफी कमी देखी। इसके अलावा, एक अत्यधिक विशिष्ट अवरोधक, जीएसके126 द्वारा ईज़ेडएच2 गतिविधि के निषेध से टीसीएफ1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, साथ ही सीसीआर का प्रतिशत भी बढ़ा। , जो पिछली रिपोर्ट के अनुरूप था कि EZH2 चयनात्मक एपिजेनेटिक संशोधनों45 के माध्यम से मेमोरी-टी सेल क्षमता को विनियमित कर सकता है। ↑[H+]-प्रेरित टी सेल स्टेमनेस के एपिजेनेटिक पैटर्न में जीनोम-व्यापक परिवर्तनों की पहचान करने के लिए, हमने CUT&Tag-seq परख की और प्रमोटर, जीन बॉडी और के साथ विभिन्न उपचारित समूहों के बीच H3K4me3 और H3K27me3 जमाव की आनुपातिकता में न्यूनतम परिवर्तन पाया। इंटरजेनिक क्षेत्र (विस्तारित डेटा चित्र 5जी)। विशेष रूप से, एपिजेनोमिक प्रोफाइलिंग से दीर्घकालिक ↑[H+ ]-उपचारित टी कोशिकाओं (चित्र 3 जी) में मेमोरी से जुड़े जीन लोकी (उदाहरण के लिए, टीसीएफ 7, सीसीआर 7, आईडी 3, एलईएफ 1 और केएलएफ 2) पर दमनकारी हिस्टोन मार्कर H3K27me3 के कम स्तर का पता चला। . महत्वपूर्ण रूप से, ↑[H+] एक्सपोज़र के तहत मेथियोनीन को जोड़ने से उपरोक्त लोकी में H3K27me3 स्तर आंशिक रूप से बहाल हो गया, साथ ही साथ उनकी जीन अभिव्यक्ति भी, इन स्मृति-संबंधित जीनों के एपिजेनेटिक मॉड्यूलेशन में मेथियोनीन की एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देती है (चित्र 3 जी और)। विस्तारित डेटा चित्र 5h)। पिछले अध्ययन14 के अनुरूप, PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 और NR4A2 जैसे प्रभावकारी जीनों ने अनुकूल रूप से एक सक्रिय हिस्टोन-मिथाइलेशन पैटर्न (H3K4me3hi और H3K27me3lo) (छवि 3 जी) प्राप्त कर लिया। ध्यान दें, इन प्रभावकारी जीनों के प्रवर्तक क्षेत्रों में H3K4me3 का अधिभोग ↑[H+] एक्सपोज़र के तहत संवर्धित टी कोशिकाओं में क्षीण हो गया था और मेथिओनिन अनुपूरण (छवि 3 जी) द्वारा बहाल किया गया था। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि ↑[H+]-मेथियोनीन चक्र का त्वरित व्यवधान टी सेल स्टेमनेस के एपिजेनेटिक संरक्षण को बढ़ावा देता है।
SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 और SLC43A2 सहित कई मेथिओनिन ट्रांसपोर्टर (SLCs), मेथिओनिन परिवहन46 में मध्यस्थता कर सकते हैं। यह जांचने के लिए कि कैसे ↑[H+] के संपर्क से टी कोशिकाओं में मेथिओनिन का अवशोषण और चयापचय कम हो जाता है, हमने अलग-अलग एसएलसी के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया और पाया कि ↑[H+] ने नाटकीय रूप से SLC7A5 और SLC38A2 की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, लेकिन SLC38A1 अभिव्यक्ति (विस्तारित) पर बहुत कम प्रभाव पड़ा डेटा चित्र. 6ए,बी). इसके अलावा, ↑[H+] एक्सपोज़र ने MYC (विस्तारित डेटा छवि 6c,d) की अभिव्यक्ति और गतिविधि को कम कर दिया, जो कि SLC7A5 (संदर्भ 47) जैसे मेथिओनिन ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए रिपोर्ट किया गया है। हमने आगे SLC7A5 प्रमोटर पर और कुछ हद तक SLC38A2 प्रमोटर (विस्तारित डेटा चित्र 6e) पर MYC की उच्च अधिभोग का प्रदर्शन किया। महत्वपूर्ण रूप से, इन लोकी के लिए एमवाईसी बाइंडिंग में काफी कमी देखी गई, जो दीर्घकालिक ↑[एच+]-उपचारित टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा छवि 6ई) में देखी गई थी। इन अवलोकनों के अनुरूप, MYC की ओवरएक्प्रेशन ने ↑[H+]-एक्सपोज़्ड टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा छवि 6f) में SLC7A5 और SLC38A2 की अभिव्यक्ति को उल्लेखनीय रूप से बहाल कर दिया। ये परिणाम ↑[H+] एक्सपोज़र पर मेथिओनिन ट्रांसपोर्टरों की कम अभिव्यक्ति में MYC की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि मेथियोनीन का पूरक ↑[H+]-उजागर टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा चित्र 6g) में MYC और SLC7A5 की अभिव्यक्ति को भी बहाल कर सकता है, यह सुझाव देता है कि मेथियोनीन पूरक टी कोशिकाओं की मेथियोनीन-ग्रहण क्षमता को बहाल कर सकता है। MYC-निर्भर तरीके से मेथिओनिन ट्रांसपोर्टर SLC7A5 अभिव्यक्ति को अपग्रेड करना। पिछले अध्ययन से पता चला है कि सक्रिय टी कोशिकाओं47 में एसएलसी7ए5 सबसे प्रचुर मेथिओनिन ट्रांसपोर्टर है। यह, हमारे पिछले निष्कर्षों के साथ, सुझाव देता है कि SLC7A5 ↑[H+]-प्रेरित मेथिओनिन प्रतिबंध और स्टेम जैसी स्थिति के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। वास्तव में, हमने पाया कि SLC7A5 की अधिक अभिव्यक्ति ने ↑[H+ ]-प्रेरित स्टेम-जैसे फेनोटाइप (विस्तारित डेटा चित्र 6h, i) को आंशिक रूप से ख़राब कर दिया है, जो ↑[H+ ]-प्रेरित T सेल मेमोरी में मेथियोनीन ट्रांसपोर्टर SLC7A5 की भागीदारी का समर्थन करता है। - फेनोटाइप की तरह. विभिन्न ट्यूमर-घुसपैठ करने वाली सीडी 8+ टी सेल उप-जनसंख्या का विश्लेषण करके, हमने मेमोरी-जैसे सीडी 8+ टीआईएल (विस्तारित डेटा चित्र 7 ए, बी) में एमवाईसी और एसएलसी7ए5 दोनों की कम अभिव्यक्ति पाई, जो लाइन में है हमारे इन विट्रो निष्कर्षों के साथ। इस प्रकार, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि MYC-SLC7A5-मेथियोनीन अक्ष संभावित रूप से टीआईएल की मेमोरी जैसी स्थिति को संरक्षित करने में योगदान दे सकता है।
![Fig. 2 | ↑[H+ ] exposure triggers metabolic reprogramming and suppresses mTOR signaling. a, GO analysis using RNA-seq data, showing representative differentially expressed metabolic genes in control and lactic-acid-conditioned human T cells (adjusted P value < 4.23 × 10–2). b, Schematic of [13C6]glucose or [ 13C16]palmitate labeling patterns. c, Percentage of the indicated m+3 lactate out of total lactate or of m+3 pyruvate out of total pyruvate in T cells. n = 3 independent samples. d, Percentage of isotopomer for the TCA intermediates, such as citrate (m+2), malate (m+2), and succinate (m+2), derived from [13C6]glucose. n = 3 independent samples. e, Percentage of the indicated m+2 acetyl-CoA out of total acetyl-CoA or of m+2 citrate isotope out of total citrate in T cells from [13C16] palmitate. n = 4 independent samples. f, GSEA with statistical analysis of the gene set associated with mTORC1 signaling in control versus lactic-acid-conditioned (left) or pH 6.6-conditioned (right) human T cells. g,h, Flow cytometric analysis and quantification for S6 phosphorylated at Ser235 and Ser236 (g) and 4EBP1 phosphorylated at Thr37 and Thr46 (h) in human CD8+ T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. I, Flow cytometric analysis and quantification of energy-intensive protein synthesis in controls or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by one-sided Fisher exact test with Benjamini–Hochberg multiple-comparisons test (a) or unpaired two-tailed Student's t-test (c–e,g–i). Nominal P values and FDRs were calculated with the default method in the GSEA software (f).](/Content/uploads/2023842169/202312191044395da385e9aa8c4673a892ee5262c6dba0.png "Fig. 2 | ↑[H+ ] exposure triggers metabolic reprogramming and suppresses mTOR signaling. a, GO analysis using RNA-seq data, showing representative differentially expressed metabolic genes in control and lactic-acid-conditioned human T cells (adjusted P value < 4.23 × 10–2). b, Schematic of [13C6]glucose or [ 13C16]palmitate labeling patterns. c, Percentage of the indicated m+3 lactate out of total lactate or of m+3 pyruvate out of total pyruvate in T cells. n = 3 independent samples. d, Percentage of isotopomer for the TCA intermediates, such as citrate (m+2), malate (m+2), and succinate (m+2), derived from [13C6]glucose. n = 3 independent samples. e, Percentage of the indicated m+2 acetyl-CoA out of total acetyl-CoA or of m+2 citrate isotope out of total citrate in T cells from [13C16] palmitate. n = 4 independent samples. f, GSEA with statistical analysis of the gene set associated with mTORC1 signaling in control versus lactic-acid-conditioned (left) or pH 6.6-conditioned (right) human T cells. g,h, Flow cytometric analysis and quantification for S6 phosphorylated at Ser235 and Ser236 (g) and 4EBP1 phosphorylated at Thr37 and Thr46 (h) in human CD8+ T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. I, Flow cytometric analysis and quantification of energy-intensive protein synthesis in controls or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by one-sided Fisher exact test with Benjamini–Hochberg multiple-comparisons test (a) or unpaired two-tailed Student's t-test (c–e,g–i). Nominal P values and FDRs were calculated with the default method in the GSEA software (f).")
चित्र 2|↑[एच+] एक्सपोज़र मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग को ट्रिगर करता है और एमटीओआर सिग्नलिंग को दबा देता है। ए, आरएनए-सीक्यू डेटा का उपयोग करके जीओ विश्लेषण, नियंत्रण और लैक्टिक-एसिड-वातानुकूलित मानव टी कोशिकाओं (समायोजित पी मान <4.23 × 10-2) में प्रतिनिधि रूप से व्यक्त चयापचय जीन दिखा रहा है। बी, [13सी6]ग्लूकोज या [13सी16]पामिटेट लेबलिंग पैटर्न का योजनाबद्ध। सी, टी कोशिकाओं में कुल लैक्टेट में से संकेतित एम +3 लैक्टेट या कुल पाइरूवेट में से एम {14}} पाइरूवेट का प्रतिशत। n=3 स्वतंत्र नमूने। डी, टीसीए मध्यवर्ती के लिए आइसोटोपोमर का प्रतिशत, जैसे कि साइट्रेट (एम +2), मैलेट (एम {{17 }}), और सक्सिनेट (एम {{18 }}), जो [13सी6] ग्लूकोज से प्राप्त होता है। n=3 स्वतंत्र नमूने। ई, कुल एसिटाइल-सीओए में से संकेतित एम+2 एसिटाइल-सीओए का प्रतिशत या [13सी16] पामिटेट से टी कोशिकाओं में कुल साइट्रेट में से एम{25}} साइट्रेट आइसोटोप का प्रतिशत। n=4 स्वतंत्र नमूने। एफ, जीएसईए लैक्टिक-एसिड-कंडीशंड (बाएं) या पीएच 6 बनाम नियंत्रण में एमटीओआरसी1 सिग्नलिंग से जुड़े जीन सेट के सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ। 6- वातानुकूलित (दाएं) मानव टी कोशिकाएं। जी,एच, संकेतित स्थितियों के तहत मानव सीडी 8+ टी कोशिकाओं में एसर235 और सर्236 (जी) पर एस6 फॉस्फोराइलेटेड और थ्र37 और थ्र46 (एच) पर 4ईबीपी1 फॉस्फोराइलेट के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण और मात्रा का ठहराव। n=3 स्वतंत्र नमूने। I, फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण और नियंत्रण या लैक्टिक-एसिड- या पीएच 6 में ऊर्जा-गहन प्रोटीन संश्लेषण की मात्रा का ठहराव। 6- वातानुकूलित मानव टी कोशिकाएं। n=3 स्वतंत्र नमूने। डेटा को माध्य ± सेम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है सांख्यिकीय विश्लेषण बेन्जामिनी-होचबर्ग बहु-तुलना परीक्षण (ए) या अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट (सी-ई, जी-आई) के साथ एक तरफा फिशर सटीक परीक्षण द्वारा निर्धारित किए गए थे। नाममात्र पी मान और एफडीआर की गणना जीएसईए सॉफ्टवेयर (एफ) में डिफ़ॉल्ट विधि से की गई थी।
![Fig. 3 | Increased [H+ ] alters T cell methionine metabolism to preserve epigenetic stemness. a GSEA plot of the gene set associated with one-carbon metabolism and cysteine and methionine metabolism in control versus lactic acid-conditioned human T cells. b, Schematic of [13C5]methionine labeling patterns. c, Percentage of intracellular SAM (m+5), SAH (m+4), and MTA (m+1) derived from [13C5]methionine, out of their respective total pools, in T cells cultured in control conditions or with 10 mM lactic acid or 10 mM lactic acid supplemented with methionine (10 mM + Met). n = 3 independent samples. d, Relative abundance of [12C5]methionine and [13C5]methionine in T cells. e, Representative histogram and quantification of TCF1 in human CD8+ T cells cultured in various conditions. n = 3 independent samples. f, Effects of methionine supplementation on histone methylation in human T cells. H3K4me3, histone H3 trimethylated at K4; H3K79me2, H3 dimethylated at K79; H3K27me3, H3 trimethylated at K27; H3K9me2, H3 dimethylated at K9. n = 3 independent samples. g, Genome track view of representative gene loci showing H3K27me3 (red, above the line) or H3K4me3 (blue, below the line) peaks. CUT&Tag-seq data are from two independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Nominal P values and FDRs were calculated with the default method of the GSEA software (a). Statistical analyses were done using two-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's multiple-comparisons test (c–f).](/Content/uploads/2023842169/20231219104503793116dde85a413baf8c838599f2d1aa.png "Fig. 3 | Increased [H+ ] alters T cell methionine metabolism to preserve epigenetic stemness. a GSEA plot of the gene set associated with one-carbon metabolism and cysteine and methionine metabolism in control versus lactic acid-conditioned human T cells. b, Schematic of [13C5]methionine labeling patterns. c, Percentage of intracellular SAM (m+5), SAH (m+4), and MTA (m+1) derived from [13C5]methionine, out of their respective total pools, in T cells cultured in control conditions or with 10 mM lactic acid or 10 mM lactic acid supplemented with methionine (10 mM + Met). n = 3 independent samples. d, Relative abundance of [12C5]methionine and [13C5]methionine in T cells. e, Representative histogram and quantification of TCF1 in human CD8+ T cells cultured in various conditions. n = 3 independent samples. f, Effects of methionine supplementation on histone methylation in human T cells. H3K4me3, histone H3 trimethylated at K4; H3K79me2, H3 dimethylated at K79; H3K27me3, H3 trimethylated at K27; H3K9me2, H3 dimethylated at K9. n = 3 independent samples. g, Genome track view of representative gene loci showing H3K27me3 (red, above the line) or H3K4me3 (blue, below the line) peaks. CUT&Tag-seq data are from two independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Nominal P values and FDRs were calculated with the default method of the GSEA software (a). Statistical analyses were done using two-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's multiple-comparisons test (c–f).")
चित्र 3|बढ़ी हुई [एच+] एपिजेनेटिक स्टेमनेस को संरक्षित करने के लिए टी सेल मेथिओनिन चयापचय को बदल देती है। लैक्टिक एसिड-वातानुकूलित मानव टी कोशिकाओं बनाम नियंत्रण में एक-कार्बन चयापचय और सिस्टीन और मेथिओनिन चयापचय से जुड़े जीन सेट का एक जीएसईए प्लॉट। बी, [13सी5]मेथिओनिन लेबलिंग पैटर्न का योजनाबद्ध। सी, उनके संबंधित कुल पूल में से, [13सी5]मेथियोनीन से प्राप्त इंट्रासेल्युलर एसएएम (एम +5), एसएएच (एम +4), और एमटीए (एम +1) का प्रतिशत, में टी कोशिकाओं को नियंत्रण स्थितियों में या 10 एमएम लैक्टिक एसिड या मेथिओनिन (10 एमएम + मेट) के साथ पूरक 10 एमएम लैक्टिक एसिड के साथ संवर्धित किया गया। n=3 स्वतंत्र नमूने। डी, टी कोशिकाओं में [12सी5]मेथियोनीन और [13सी5]मेथियोनीन की सापेक्ष प्रचुरता। ई, मानव सीडी में टीसीएफ1 का प्रतिनिधि हिस्टोग्राम और मात्रा का ठहराव 8+ विभिन्न स्थितियों में संवर्धित टी कोशिकाएं। n=3 स्वतंत्र नमूने। एफ, मानव टी कोशिकाओं में हिस्टोन मिथाइलेशन पर मेथिओनिन अनुपूरण का प्रभाव। H3K4me3, हिस्टोन H3 को K4 पर त्रिमेथिलेटेड किया गया; H3K79me2, H3 K79 पर डाइमिथाइलेटेड; H3K27me3, H3 को K27 पर त्रिमेथिलेटेड किया गया; H3K9me2, H3 K9 पर डाइमिथाइलेटेड। n=3 स्वतंत्र नमूने। जी, प्रतिनिधि जीन लोकी का जीनोम ट्रैक दृश्य H3K27me3 (लाल, रेखा के ऊपर) या H3K4me3 (नीला, रेखा के नीचे) शिखर दिखा रहा है। CUT&Tag-seq डेटा दो स्वतंत्र नमूनों से हैं। डेटा को माध्य ± सेम नाममात्र पी मान के रूप में प्रस्तुत किया गया है और एफडीआर की गणना जीएसईए सॉफ्टवेयर (ए) की डिफ़ॉल्ट विधि से की गई थी। तुकी के बहु-तुलना परीक्षण (सी-एफ) के साथ विचरण के दो-तरफा विश्लेषण (एनोवा) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे।
↑[H+ ] के संपर्क से माइटोकॉन्ड्रियल फिटनेस बनी रहती है
↑[H+ ]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं में कम ऊर्जा-गहन प्रोटीन संश्लेषण को देखते हुए, हमने अनुमान लगाया कि ↑[H+] के लंबे समय तक संपर्क में रहने से सेलुलर ऊर्जावान चयापचय में काफी बदलाव आ सकते हैं। ग्लूकोज निर्भरता, माइटोकॉन्ड्रियल निर्भरता, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता और एफएओ और अमीनो एसिड ऑक्सीकरण क्षमता (छवि 4 ए और विस्तारित डेटा छवि 8 ए) की गणना करने के लिए नियंत्रण और ↑ [एच +] -कंडिशन्ड टी कोशिकाओं दोनों का विश्लेषण SCENITH42 का उपयोग करके किया गया था। हमारे मेटाबोलॉमिक्स और आइसोटोप-ट्रेसिंग परिणामों के अनुसार, हमने ↑[एच+]-एक्सपोज़्ड टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में वृद्धि देखी, जबकि ग्लाइकोलाइसिस दर कम हो गई थी (छवि 4 बी, सी और विस्तारित डेटा छवि 8 बी), जो इंट्रासेल्युलर के पुन: प्रोग्रामिंग का संकेत देती है। ↑[H+ ]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं में ऊर्जावान चयापचय। सीहॉर्स विश्लेषण से पता चला कि ↑[H+ ]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं ने उच्च ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के साथ-साथ एसआरसी, लंबे समय तक रहने वाली मेमोरी सीडी की एक प्रमुख विशेषता, टी कोशिकाओं 22 और कम बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर ( ईसीएआर) (चित्र 4डी-एच और विस्तारित डेटा चित्र 8सी-एफ)। चूंकि बढ़े हुए माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान/संलयन और घटी हुई माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (Δψm) टी सेल स्टेमनेस48-50 के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं, हमने आगे ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रा और गुणवत्ता की जांच की और पाया कि ↑[H+ ] उपचार ने मानव और माउस टी कोशिकाओं (छवि 4i, जे और विस्तारित डेटा छवि 8 जी, एच) दोनों में माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान को बढ़ाया, जो कम Δψm (छवि 4k और विस्तारित डेटा छवि 8i) भी बनाए रखता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चर विश्लेषण से पता चला कि ↑[एच+]-उजागर टी कोशिकाओं में साइटोप्लाज्म में फैले हुए बड़े, घने माइटोकॉन्ड्रिया थे और नियंत्रण टी कोशिकाओं की तुलना में कई तंग, संकीर्ण क्राइस्टे थे, जो संबंधित प्रकाशित परिणामों के अनुरूप है। मेमोरी टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान के लिए (चित्र 4एल,एम)। इस खोज के अनुरूप, हमने ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं (विस्तारित डेटा चित्र 8जे) में माइटोकॉन्ड्रियल संलयन के कई महत्वपूर्ण नियामकों की बढ़ी हुई जीन अभिव्यक्ति भी देखी, जिसे मेमोरी टी सेल पीढ़ी50 के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया है। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि ↑[H+] एक्सपोज़र स्टेम-जैसी टी कोशिकाओं के निर्माण को बढ़ावा देने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान/संलयन और फिटनेस को बढ़ाता है।
सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली
↑[एच+ ] एक्सपोज़र सीडी8+ टी सेल एंटी-ट्यूमर गतिविधि को बढ़ाता है
स्टेम-जैसी टी कोशिकाएं दत्तक इम्यूनोथेरेपी51 में संलग्नीकरण, विस्तार और एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता का पक्ष लेती हैं। यह जांचने के लिए कि क्या लंबे समय तक इन विट्रो में ↑[H+ ]-अनुरक्षित सीडी8+ टी कोशिकाएं स्थानांतरण पर बढ़े हुए विस्तार या दृढ़ता का प्रदर्शन करती हैं, सीडी45। 1+ ओटी-आई टी कोशिकाएं जो नियंत्रण में विस्तारित थीं या ↑[ H+ ]-वातानुकूलित माध्यम को CD45 में स्थानांतरित किया गया। 2+C57BL/6N चूहों में कोई प्रत्यारोपित ट्यूमर नहीं था (चित्र 5a)। यद्यपि ↑[H+] कंडीशनिंग (विस्तारित डेटा चित्र 9ए) पर एपोप्टोटिक कोशिकाओं की थोड़ी बढ़ी हुई संख्या का पता चला था, ↑[H+] स्थिति में विस्तारित टी कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित चूहों के परिधीय रक्त में टी कोशिकाओं का प्रतिशत काफी अधिक था। नियंत्रण माध्यम (नियंत्रण टी कोशिकाओं) में विस्तारित लोगों की तुलना में (छवि 5 बी)। इसी तरह, प्लीहा और लिम्फ नोड्स (एलएन) में टी कोशिकाओं की काफी उच्च आवृत्तियों का पता लगाया गया (विस्तारित डेटा चित्र 9 बी, सी)। इसके अलावा, हमने बी 16- ओवीए ट्यूमर वाले चूहों में ट्यूमर, प्लीहा और ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स में टी सेल संचय में काफी वृद्धि देखी है, जिसमें चूहों की तुलना में ↑ [एच +] -विस्तारित कोशिकाओं को गोद लिया गया था। प्राप्त नियंत्रण कोशिकाएँ, यह सुझाव देती हैं कि ↑[H+] में अनुरक्षित CD{26}} T कोशिकाओं ने दृढ़ता में सुधार किया है (चित्र 5c-e और विस्तारित डेटा चित्र 9d)। इन निष्कर्षों के अनुरूप, ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाएं प्राप्त करने वाले चूहों की तिल्ली और एलएन में मेमोरी टी कोशिकाओं का प्रतिशत काफी बढ़ गया था (चित्र 5एफ और विस्तारित डेटा चित्र 9ई)। विशेष रूप से, ↑[H+ ]-विस्तारित ओटी-आई टी कोशिकाओं ने नियंत्रण टी कोशिकाओं (छवि 5 जी) की तुलना में ट्यूमर के विकास में काफी देरी दिखाई। हमने अगली बार इन विवो ट्यूमर मॉडल के साथ ↑[H+]-विस्तारित CD19 काइमेरिक-एंटीजन-रिसेप्टर-संशोधित (CAR) T कोशिकाओं की चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच की, जिसमें CD19-K562 ट्यूमर कोशिकाओं को चमड़े के नीचे के पार्श्व भाग में इंजेक्ट किया गया था। एनसीजी चूहे (चित्र 5एच)। हमने पाया कि ↑[H+] एक्सपोज़र ने CAR-T सेल स्टेमनेस को भी बढ़ावा दिया, लेकिन एपोप्टोसिस (विस्तारित डेटा चित्र 9f) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जैसा कि CCR के उल्लेखनीय रूप से बढ़े हुए प्रतिशत से पता चलता है 7+ CD62L+ स्टेम-जैसे CAR-T कोशिकाओं के साथ-साथ टीसीएफ1 की अपग्रेडित अभिव्यक्ति (विस्तारित डेटा छवि 9जी,एच)। इसके अलावा, ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं (छवि 5i) के साथ आसव के बाद एनसीजी चूहों के ट्यूमर साइटों और प्लीहा में सीएआर-टी सेल संचय की उच्च दर थी। जैसा कि अपेक्षित था, एनसीजी चूहों को सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित किया गया था जिन्हें ↑[एच+] में विस्तारित किया गया था, उन चूहों की तुलना में प्रत्यारोपित सीडी 19+ ट्यूमर की अधिक निकासी देखी गई, जो सीएआर-टी कोशिकाओं को प्राप्त कर चुके थे जिनका विस्तार किया गया था नियंत्रण माध्यम में (चित्र 5जे)। एक साथ लेने पर, इन आंकड़ों से पता चला कि ↑[H+] उपचार टी कोशिकाओं की विवो दृढ़ता और एंटी-ट्यूमर गतिविधि को बढ़ावा देता है।
↑[H+ ] का एक्सपोजर टी-सेल थकावट को प्रतिबंधित करता है
इन विट्रो में टी सेल थकावट पर लगातार ↑[H+] एक्सपोज़र के प्रभावों का और अधिक पता लगाने के लिए, हमने ↑[H+ ]-प्राइमेड मानव टी कोशिकाओं में LAG-3 और TIM{2}} अभिव्यक्ति को मापा, जो कई दौर से गुजरी थीं। एंटी-सीडी3 एंटीबॉडी के साथ आगे की उत्तेजना और नियंत्रण माध्यम में वातानुकूलित किया गया (चित्र 6ए)। हमने पाया कि ↑[H+ ]-उजागर टी कोशिकाओं (चित्र 6बी और विस्तारित डेटा चित्र 10ए) में एलएजी-3 और टीआईएम-3 दोनों की अभिव्यक्ति कम हो गई थी, जो दर्शाता है कि ↑[एच+] उपचार के परिणाम कम हो गए हैं टी सेल थकावट. इसके अलावा, हमने पाया कि मेथियोनीन की उच्च सांद्रता निरोधात्मक मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि की ओर ले जाती है, जैसे कि पीडी-1, एलएजी-3, और टीआईएम-3, जबकि कम सांद्रता के साथ उपचार मेथिओनिन सांद्रता ने इन मार्करों की अभिव्यक्ति को थोड़ा कम कर दिया (पूरक छवि 6 ए-सी)। विशेष रूप से, लंबे समय तक इन विट्रो ↑[H+] एक्सपोज़र पर, ट्यूमर के भीतर ओटी-आई टी कोशिकाओं और सीडी 19- सीएआर टी कोशिकाओं में घुसपैठ करने वाली टीआईएम -3+ एलएजी -3+ की आवृत्ति काफी हद तक थी दत्तक स्थानांतरण के बाद कम हो गया (चित्र 6सी-ई और विस्तारित डेटा चित्र 10बी), जो इन विट्रो में उनकी कम थकावट और विवो में बेहतर ट्यूमर नियंत्रण क्षमता के अनुरूप है। इसके अलावा, हमने प्रदर्शित किया कि दीर्घकालिक ↑[H+]-वातानुकूलित टी कोशिकाओं ने इन विट्रो और विवो दोनों में टीओएक्स अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया है (छवि 6 एफ, जी और विस्तारित डेटा छवि 10 सी, डी)। जैसा कि पहले बताया गया है, थकी हुई टी कोशिकाओं को आम तौर पर पूर्वज-थका हुआ या टर्मिनली थका हुआ उपसमूह में विभाजित किया जा सकता है, जैसा कि टीसीएफ1 और टीआईएम -3 अभिव्यक्ति52,53 द्वारा निर्धारित किया गया है। इस प्रकार, हमने CD45 में TCF1 और TIM-3 के अभिव्यक्ति पैटर्न को मापा। 1+ TILs और देखा कि TCF1− TIM-3+ की अंतिम रूप से समाप्त हो चुकी T कोशिकाओं की आवृत्ति काफी हद तक कम हो गई थी, एक के साथ ↑[H+ ] कंडीशनिंग के तहत टीसीएफ {{43 }} टीआईएम {{44 }} - पूर्वज टी कोशिकाओं का प्रतिशत काफी बढ़ गया (चित्र 6 ह)। इसके अलावा, हमने बढ़ी हुई LY108+ TIM-3-पूर्वज T कोशिका जनसंख्या (विस्तारित डेटा चित्र. 10e) के साथ-साथ IFN- + TNF- + T की बढ़ी हुई आवृत्ति का प्रदर्शन किया। कोशिकाएं (विस्तारित डेटा चित्र 10एफ), इस तथ्य का समर्थन करती हैं कि लंबे समय तक इन विट्रो ↑[एच+]-विस्तारित दत्तक रूप से स्थानांतरित टी कोशिकाएं थकावट को सीमित करती हैं और स्टेमनेस को संरक्षित करती हैं।
बहस
दुर्दम्य ट्यूमर वाले व्यक्तियों के इलाज के लिए ट्यूमर-विशिष्ट एसीटी एक आशाजनक दृष्टिकोण है, लेकिन टीएमई में टी सेल डिसफंक्शन द्वारा चिकित्सीय प्रभाव काफी हद तक प्रतिबंधित हैं। हाल ही में, टी सेल स्टेमनेस को संरक्षित करने और चिकित्सीय परिणामों में सुधार करने के लिए इन विट्रो कल्चर के दौरान क्षणिक ग्लूकोज भुखमरी, ग्लूटामाइन प्रतिबंध, या ऊंचे बाह्य कोशिकीय पोटेशियम (↑[K+]) के साथ प्री-कंडीशनिंग टी कोशिकाओं पर काफी ध्यान दिया गया है। इस अध्ययन में, हमने प्रदर्शित किया कि प्राइमिंग के दौरान [एच+] के उच्च स्तर के तहत सीडी {5}} टी कोशिकाओं की खेती ने आश्चर्यजनक रूप से टी सेल स्टेमनेस के अधिग्रहण को बढ़ावा दिया और टी सेल थकावट के प्रतिरोध में वृद्धि की, जिससे ट्यूमर-विरोधी प्रभावों में काफी सुधार हुआ। दत्तक रूप से स्थानांतरित टी कोशिकाएं।
टीएमई के भीतर अत्यधिक लैक्टिक एसिड संचय को लंबे समय से ट्यूमर प्रतिरक्षा से बचने में एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है। उदाहरण के लिए, लैक्टिक एसिड और अम्लीय टीएमई को सीडी {{0}} टी सेल साइटोलिटिक गतिविधि और साइटोकिन उत्पादन31-33,57 को दबाने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इन निष्कर्षों के अनुरूप, हमने यह भी पाया कि इन विट्रो में ↑[H+] का अल्पकालिक एक्सपोजर प्रभावकारी साइटोकिन उत्पादन को गहराई से बाधित करने के लिए पर्याप्त था, लेकिन टीसीएफ1 अभिव्यक्ति या स्टेमनेस-संबंधी चयापचय विशेषताओं पर इसका कोई प्रभाव नहीं पड़ा। फिर भी लंबे समय तक ↑[H+] उपचार ने अप्रत्याशित रूप से टीसीएफ1 अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया और मेटाबॉलिक रिप्रोग्रामिंग और एपिजेनेटिक रीमॉडलिंग के माध्यम से स्टेम जैसी टी कोशिकाओं के फेनोटाइप को बनाए रखा। पूर्ण सक्रियण के बाद टी कोशिकाओं का ↑[H+] के संपर्क में आना भी स्टेम-जैसी फेनोटाइप को प्रेरित कर सकता है, इस प्रकार इस संभावना को छोड़कर कि कम पीएच के संपर्क में आने वाली टी कोशिकाएं स्टेम-जैसी स्थिति को अपनाने के बजाय उत्तेजना के प्रति दुर्दम्य हो गई हैं। स्वस्थ व्यक्तियों के रक्त में शारीरिक लैक्टिक एसिड सांद्रता लगभग 1.5-3.0 मिमी है, लेकिन टीएमई35,58 में यह 10 मिमी से 40 मिमी तक बढ़ सकती है। लगातार एंटी-सीडी3/सीडी28 उत्तेजना मॉडल का उपयोग करना, फेंग एट अल। हाल ही में रिपोर्ट की गई है कि सोडियम लैक्टेट की उच्च सांद्रता हिस्टोन डीएसेटाइलेज़ गतिविधि के निषेध के माध्यम से टीसीएफ7 सुपर-एन्हांसर लोकस पर एच3के27एसी स्तर को बढ़ाती है, जिससे टीसीएफ1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है और सीडी8+ टी सेल स्टेमनेस59 को बढ़ावा मिलता है। इसके विपरीत, हमने पाया कि लैक्टिक एसिड (10 एमएम) की अपेक्षाकृत कम सांद्रता के लंबे समय तक संपर्क, लेकिन सोडियम लैक्टेट नहीं, मेथियोनीन चयापचय के प्रतिबंध और H3K27me3 के विनियमन के माध्यम से टी कोशिकाओं के स्टेम-जैसे हस्ताक्षर को आसानी से ट्रिगर कर सकता है। स्टेमनेस से जुड़े जीन लोकी पर जमाव, जो स्पष्ट रूप से सोडियम लैक्टेट और लैक्टिक एसिड द्वारा अलग एपिजेनेटिक विनियमन का समर्थन करता है। हालाँकि, कम-अम्लता (पीएच 6.9) उपचार का लगातार एंटी-सीडी3/सीडी28 उत्तेजना के तहत टीसीएफ1 अभिव्यक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है, यह सुझाव देता है कि सीडी8+ टी कोशिकाओं के स्टेम-जैसे हस्ताक्षर ↑[एच+] से प्रेरित हैं। टीसीआर उत्तेजना द्वारा एक्सपोज़र को ओवरराइड किया जा सकता है। टीसीआर सक्रियण मेथियोनीन ग्रहण को बढ़ा सकता है और टी सेल सक्रियण 19,60 में सहायता के लिए मेथियोनीन चयापचय को पुन: प्रोग्राम कर सकता है। हमने अनुमान लगाया कि टीसीआर उत्तेजना ↑[एच+]-उपचारित टी कोशिकाओं में मेथिओनिन के अवशोषण को सुदृढ़ कर सकती है, जिसमें मेथिओनिन चयापचय प्रतिबंधित था, इसलिए ↑[एच+]-प्रेरित एपिजेनेटिक स्टेमनेस को परेशान कर रहा है। इसके अलावा, टी कोशिकाएं लगातार टीसीआर उत्तेजना की उपस्थिति या अनुपस्थिति में स्टेमनेस के अधिग्रहण की सुविधा के लिए लैक्टेट आयनों को एक बाह्य कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग कर सकती हैं। मेटाबोलिक गतिविधि टी सेल भेदभाव के साथ निकटता से जुड़ी हुई है, और कुछ मेटाबोलिक हस्तक्षेप लंबे समय तक रहने वाली मेमोरी-टी सेल गठन21,37,61,62 को बढ़ावा दे सकते हैं। तदनुसार, हमारे मेटाबोलॉमिक्स और आइसोटोप-ट्रेसिंग विश्लेषण इस धारणा का समर्थन करते हैं कि लंबे समय तक ↑[H+] एक्सपोज़र से मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग में कमी आती है, जैसे ग्लूकोज का कम होना और ग्लाइकोलाइसिस और टीसीए चक्र चयापचय में कमी। कई अध्ययनों से पता चला है कि सीडी 8+ टी मेमोरी कोशिकाएं अपनी ऊर्जा जरूरतों को पूरा करने के लिए एफएओ का उपयोग करती हैं, हालांकि यह संभवतः मेमोरी वंश भेदभाव के लिए एक अनुकूलन है, और सीपीटी1 की अधिक अभिव्यक्ति टी सेल दीर्घायु21,22,63,64 को बढ़ावा देती है। हालाँकि, Cpt1a, राउड एट अल के टी सेल-विशिष्ट आनुवंशिक विलोपन के उनके मॉडल में। हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि एलसी-एफएओ टी सेल सक्रियण और सीडी 8+ टी मेमोरी सेल्स65 के निर्माण के लिए काफी हद तक डिस्पेंसेबल है। ऐसी विसंगति को समझाना एक चुनौती बनी हुई है। हमारे अध्ययन के संदर्भ में, हम अनुमान लगाते हैं कि बाह्य कोशिकीय एसिडोसिस द्वारा संचालित फैटी एसिड चयापचय की पुन: प्रोग्रामिंग संभवतः मेमोरी टी कोशिकाओं की पीढ़ी से जुड़ी है, हालांकि इस परिकल्पना के अंतर्निहित सटीक तंत्र को आगे की जांच की आवश्यकता है। इसके अलावा, हमने पाया कि ↑[H+ ] एक्सपोज़र ने एमटीओआर गतिविधि को बाधित कर दिया, जो ग्लाइकोलाइटिक निषेध से प्रेरित हो सकता है। विशेष रूप से, एमटीओआर सिग्नलिंग का दमन ग्लाइकोलाइसिस से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में चयापचय बदलाव में भी योगदान दे सकता है। वास्तव में, इन ↑[H+ ]-विस्तारित टी कोशिकाओं ने बेहतर माइटोकॉन्ड्रियल फिटनेस का प्रदर्शन किया, जैसा कि एसआरसी और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान में उल्लेखनीय वृद्धि और Δψm में कमी से प्रमाणित है। ये माइटोकॉन्ड्रियल हस्ताक्षर, जो स्टेम-जैसी टी कोशिकाओं में समृद्ध हैं और विवो में दीर्घायु और बेहतर एंटी-ट्यूमर गतिविधि से संबंधित हैं, माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और विखंडन गतिशीलता 22,48,50 द्वारा बारीकी से संशोधित होते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली संलयन प्रोटीन OPA1 मेमोरी-टी सेल निर्माण50 में एक अनिवार्य भूमिका निभाता है। तदनुसार, हमने पाया कि बाह्य कोशिकीय अम्लरक्तता ने टी कोशिकाओं में OPA1 अभिव्यक्ति को भी बढ़ावा दिया, जिसके परिणामस्वरूप अंततः टी कोशिकाओं में संलयन की दिशा में आकृति विज्ञान संतुलन उत्पन्न हुआ। कई सेलुलर मेटाबोलाइट्स को सीधे तौर पर एपिजेनेटिक संशोधनों में योगदान करते दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, एक-कार्बन चयापचय हिस्टोन मिथाइलेशन66 के लिए सार्वभौमिक मिथाइल डोनर एसएएम उत्पन्न कर सकता है।
![Fig. 4 | Mitochondrial fitness is sustained in T cells exposed to ↑[H+ ]. a SCENITH analysis of the human T cells in control or lactic-acid-conditioned T cells. A representative translation level (anti-Puro) is shown (n = 3 independent samples). The dashed line represents the background level obtained after 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) treatment. b,c, Quantitative analysis of glycolytic capacity (b) and mitochondrial dependence (c) within a. n = 3 independent samples. d–f, OCR (d) of control and lactic-acid-conditioned T cells was measured in real-time under basal conditions in response to the indicated inhibitors. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/ AA, rotenone and antimycin A. Representative statistical analysis of basal OCR (e), maximal respiration (e) and SRC (f). n = 9 tests; 3 independent samples were analyzed and each sample was measured 3 times. g,h, ECAR (g) of control or lactic-acid-conditioned T cells measured in response to the indicated inhibitors. Representative statistical analysis of basal ECAR and stressed ECAR (h). n = 9 tests; 3 independent samples were detected and each sample was measured 3 times. i, Immunoblot analysis of COXIV and TIM23 in human T cells under the indicated conditions. Actin was used as a loading control. j,k, Representative histograms or contour plots and statistical analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potential (TMRM) (k), respectively, in the control or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. l,m, Representative mitochondrial morphology of T cells cultured in the control condition, lactic acid or the pH 6.6 condition for 12 days, analyzed by EM (scale bar, 1 μM) (l). The area of individual mitochondria in T cells (m), n = 45 cells. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/2023121910470232da8d22ab0a4279b68730f453fa0325.png "Fig. 4 | Mitochondrial fitness is sustained in T cells exposed to ↑[H+ ]. a SCENITH analysis of the human T cells in control or lactic-acid-conditioned T cells. A representative translation level (anti-Puro) is shown (n = 3 independent samples). The dashed line represents the background level obtained after 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) treatment. b,c, Quantitative analysis of glycolytic capacity (b) and mitochondrial dependence (c) within a. n = 3 independent samples. d–f, OCR (d) of control and lactic-acid-conditioned T cells was measured in real-time under basal conditions in response to the indicated inhibitors. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/ AA, rotenone and antimycin A. Representative statistical analysis of basal OCR (e), maximal respiration (e) and SRC (f). n = 9 tests; 3 independent samples were analyzed and each sample was measured 3 times. g,h, ECAR (g) of control or lactic-acid-conditioned T cells measured in response to the indicated inhibitors. Representative statistical analysis of basal ECAR and stressed ECAR (h). n = 9 tests; 3 independent samples were detected and each sample was measured 3 times. i, Immunoblot analysis of COXIV and TIM23 in human T cells under the indicated conditions. Actin was used as a loading control. j,k, Representative histograms or contour plots and statistical analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potential (TMRM) (k), respectively, in the control or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. l,m, Representative mitochondrial morphology of T cells cultured in the control condition, lactic acid or the pH 6.6 condition for 12 days, analyzed by EM (scale bar, 1 μM) (l). The area of individual mitochondria in T cells (m), n = 45 cells. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
चित्र 4|माइटोकॉन्ड्रियल फिटनेस ↑[H+] के संपर्क में आने वाली टी कोशिकाओं में बनी रहती है। नियंत्रण या लैक्टिक-एसिड-वातानुकूलित टी कोशिकाओं में मानव टी कोशिकाओं का एक दृश्य विश्लेषण। एक प्रतिनिधि अनुवाद स्तर (एंटी-प्यूरो) दिखाया गया है (n=3 स्वतंत्र नमूने)। धराशायी रेखा 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज + ओलिगोमाइसिन (2-डीजी+ओ) उपचार के बाद प्राप्त पृष्ठभूमि स्तर को दर्शाती है। बी,सी, ए के भीतर ग्लाइकोलाइटिक क्षमता (बी) और माइटोकॉन्ड्रियल निर्भरता (सी) का मात्रात्मक विश्लेषण। n=3 स्वतंत्र नमूने। डी-एफ, नियंत्रण और लैक्टिक-एसिड-वातानुकूलित टी कोशिकाओं के ओसीआर (डी) को संकेतित अवरोधकों के जवाब में बेसल स्थितियों के तहत वास्तविक समय में मापा गया था। एफसीसीपी, कार्बोनिल साइनाइड-पी-ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी फेनिलहाइड्राज़ोन; आरओटी/एए, रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए। बेसल ओसीआर (ई), अधिकतम श्वसन (ई) और एसआरसी (एफ) का प्रतिनिधि सांख्यिकीय विश्लेषण। n=9 परीक्षण; 3 स्वतंत्र नमूनों का विश्लेषण किया गया और प्रत्येक नमूने को 3 बार मापा गया। संकेतित अवरोधकों की प्रतिक्रिया में नियंत्रण या लैक्टिक-एसिड-वातानुकूलित टी कोशिकाओं के जी, एच, ईसीएआर (जी) को मापा जाता है। बेसल ईसीएआर और तनावग्रस्त ईसीएआर (एच) का प्रतिनिधि सांख्यिकीय विश्लेषण। n=9 परीक्षण; 3 स्वतंत्र नमूनों का पता लगाया गया और प्रत्येक नमूने को 3 बार मापा गया। i, संकेतित स्थितियों के तहत मानव टी कोशिकाओं में COXIV और TIM23 का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण। एक्टिन एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जे, के, प्रतिनिधि हिस्टोग्राम या समोच्च भूखंड और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान (एमटीजी) (जे) और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) (के) का सांख्यिकीय विश्लेषण, क्रमशः नियंत्रण या लैक्टिक-एसिड- या पीएच 6 में। {{30} }वातानुकूलित मानव टी कोशिकाएं। n=3 स्वतंत्र नमूने। एल, एम, 12 दिनों के लिए नियंत्रण स्थिति, लैक्टिक एसिड या पीएच 6.6 स्थिति में संवर्धित टी कोशिकाओं की प्रतिनिधि माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, ईएम (स्केल बार, 1 μM) (एल) द्वारा विश्लेषण किया गया। टी कोशिकाओं में व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया का क्षेत्र (एम), एन=45 कोशिकाएं। डेटा को माध्य ± सेम के रूप में प्रस्तुत किया गया है। सांख्यिकीय विश्लेषण अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था।
![Fig. 5 | ↑[H+ ]-expanded T cells display enhanced anti-tumor activity. a,b, Control or lactic-acid-expanded CD8+ T cells were analyzed for persistence after adoptive transfer (n = 6 mice). Freshly isolated mouse CD45.1+ OT-I T cells were activated with mouse IL-2 and plate-bound anti-mouse CD3 and anti-mouse CD28 antibodies for 2 days and then maintained in a culture medium with mouse IL-2 until adoptive transfer (CD3&CD28+IL-2). A schematic of the animal experiment (a) as well as representative FACS plots and statistical analysis of CD45.1+ and CD45.2+ T cells in the blood are shown in (b). c–g, CD45.1+ OT-I T cells were expanded in control or lactic acid medium for 7 days and transferred into B16-OVA-tumor-bearing mice, and the infiltration of ratio was evaluated (n = 5 mice). A schematic of the animal experiment using B16-OVA tumor-bearing mice (c), as well as representative FACS plots (left) and statistics for the number (right) of transferred CD45.1+ OT-I T cells in the tumor (d). s.c., subcutaneous injection. Statistics for the percentage of CD45.1+ T cells (e) and representative data (left) and statistics for the percentage (right) of CD62L+ CD44+ CD45.1+ T cells (f) in the spleen are shown. Tumor growth curve (g) (n = 5 mice, day 14). h–j, CD19-CAR T cells were expanded in control or lactic acid medium for 12 days and transferred into CD19-overexpressing K562 tumor-bearing NCG mice, and the infiltration ratio in tumor and spleen was evaluated (n = 6 mice). A schematic of the animal experiment (h), a representative percentage of transferred T cells in the tumor and spleen (i), and tumor growth curves (j) are shown (n = 6 mice, day 10). Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/20231219104719ae22f2dc6bc348bda4bf8bfe75b347db.png "Fig. 5 | ↑[H+ ]-expanded T cells display enhanced anti-tumor activity. a,b, Control or lactic-acid-expanded CD8+ T cells were analyzed for persistence after adoptive transfer (n = 6 mice). Freshly isolated mouse CD45.1+ OT-I T cells were activated with mouse IL-2 and plate-bound anti-mouse CD3 and anti-mouse CD28 antibodies for 2 days and then maintained in a culture medium with mouse IL-2 until adoptive transfer (CD3&CD28+IL-2). A schematic of the animal experiment (a) as well as representative FACS plots and statistical analysis of CD45.1+ and CD45.2+ T cells in the blood are shown in (b). c–g, CD45.1+ OT-I T cells were expanded in control or lactic acid medium for 7 days and transferred into B16-OVA-tumor-bearing mice, and the infiltration of ratio was evaluated (n = 5 mice). A schematic of the animal experiment using B16-OVA tumor-bearing mice (c), as well as representative FACS plots (left) and statistics for the number (right) of transferred CD45.1+ OT-I T cells in the tumor (d). s.c., subcutaneous injection. Statistics for the percentage of CD45.1+ T cells (e) and representative data (left) and statistics for the percentage (right) of CD62L+ CD44+ CD45.1+ T cells (f) in the spleen are shown. Tumor growth curve (g) (n = 5 mice, day 14). h–j, CD19-CAR T cells were expanded in control or lactic acid medium for 12 days and transferred into CD19-overexpressing K562 tumor-bearing NCG mice, and the infiltration ratio in tumor and spleen was evaluated (n = 6 mice). A schematic of the animal experiment (h), a representative percentage of transferred T cells in the tumor and spleen (i), and tumor growth curves (j) are shown (n = 6 mice, day 10). Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
चित्र 5|↑[एच+]-विस्तारित टी कोशिकाएं बढ़ी हुई एंटी-ट्यूमर गतिविधि प्रदर्शित करती हैं। ए, बी, नियंत्रण या लैक्टिक-एसिड-विस्तारित सीडी 8+ टी कोशिकाओं का दत्तक स्थानांतरण (एन=6 चूहों) के बाद दृढ़ता के लिए विश्लेषण किया गया था। ताज़ा अलग किए गए माउस CD45.1+ OT-I T कोशिकाओं को माउस IL-2 और प्लेट-बाउंड एंटी-माउस CD3 और एंटी-माउस CD28 एंटीबॉडी के साथ 2 दिनों के लिए सक्रिय किया गया और फिर एक कल्चर माध्यम में बनाए रखा गया दत्तक स्थानांतरण तक माउस IL-2 पशु प्रयोग का एक योजनाबद्ध (ए) साथ ही प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट और सीडी45 का सांख्यिकीय विश्लेषण। सी-जी, सीडी45.1+ ओटी-आई टी कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए नियंत्रण या लैक्टिक एसिड माध्यम में विस्तारित किया गया और बी 16-ओवीए-ट्यूमर-असर चूहों में स्थानांतरित किया गया, और अनुपात की घुसपैठ का मूल्यांकन किया गया (एन=5 चूहे)। बी16-ओवीए ट्यूमर-असर चूहों (सी), साथ ही प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट (बाएं) और स्थानांतरित सीडी45 की संख्या (दाएं) के आंकड़ों का उपयोग करते हुए पशु प्रयोग का एक योजनाबद्ध। 1+ ओटी- ट्यूमर में आईटी कोशिकाएं (डी)। एससी, चमड़े के नीचे इंजेक्शन। CD45 के प्रतिशत के लिए आँकड़े। ) तिल्ली में दिखाया गया है। ट्यूमर वृद्धि वक्र (जी) (एन=5 चूहे, दिन 14)। एच-जे, सीडी {{48} कार टी कोशिकाओं को 12 दिनों के लिए नियंत्रण या लैक्टिक एसिड माध्यम में विस्तारित किया गया और सीडी 19- ओवरएक्सप्रेसिंग K562 ट्यूमर-असर एनसीजी चूहों में स्थानांतरित किया गया, और ट्यूमर और प्लीहा में घुसपैठ का अनुपात था मूल्यांकन किया गया (n=6 चूहे)। पशु प्रयोग (एच) का एक योजनाबद्ध, ट्यूमर और प्लीहा (आई) में स्थानांतरित टी कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि प्रतिशत, और ट्यूमर वृद्धि वक्र (जे) दिखाया गया है (एन {{54%) चूहों, दिन 10)। डेटा को माध्य ± सेम के रूप में प्रस्तुत किया गया है। सांख्यिकीय विश्लेषण अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था।
![imageFig. 6 | ↑[H+ ] exposure restricts T cell exhaustion. a Schematic of chronic stimulation of human T cells in vitro. b, Representative FACS plots for LAG-3 and TIM-3 in chronically stimulated human T cells cultured in control or lactic acid conditions. n = 3 independent samples. c, The expression of LAG-3 and TIM-3 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). d, Quantification of the expression of LAG-3, TIM-3 and PD-1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA-tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). e, The expression of LAG-3 and TIM-3 in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice, as determined by flow cytometry (n = 6 mice). f, The expression of TOX in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). g, The histograms and statistical analysis of TOX in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice (n = 6 mice). h, Left, representative flow cytometry plots for TIM-3 and TCF1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). Right, the percentage of TCF1+ TIM-3– or TCF1– TIM-3+ populations. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/20231219104739789f56482ec84fdf8c79bfbf223df3ca.png "imageFig. 6 | ↑[H+ ] exposure restricts T cell exhaustion. a Schematic of chronic stimulation of human T cells in vitro. b, Representative FACS plots for LAG-3 and TIM-3 in chronically stimulated human T cells cultured in control or lactic acid conditions. n = 3 independent samples. c, The expression of LAG-3 and TIM-3 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). d, Quantification of the expression of LAG-3, TIM-3 and PD-1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA-tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). e, The expression of LAG-3 and TIM-3 in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice, as determined by flow cytometry (n = 6 mice). f, The expression of TOX in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). g, The histograms and statistical analysis of TOX in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice (n = 6 mice). h, Left, representative flow cytometry plots for TIM-3 and TCF1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). Right, the percentage of TCF1+ TIM-3– or TCF1– TIM-3+ populations. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
चित्र 6|↑[एच+] एक्सपोज़र टी सेल थकावट को प्रतिबंधित करता है। इन विट्रो में मानव टी कोशिकाओं की पुरानी उत्तेजना का एक योजनाबद्ध। बी, नियंत्रण या लैक्टिक एसिड स्थितियों में संवर्धित कालानुक्रमिक रूप से उत्तेजित मानव टी कोशिकाओं में एलएजी -3 और टीआईएम -3 के लिए प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट। n=3 स्वतंत्र नमूने। सी, सीडी45 में एलएजी {5 }} और टीआईएम {{6 }} की अभिव्यक्ति। बी से 8 8 टीआईएल ओवीए ट्यूमर वाले सी57 बीएल/6एन चूहों (एन 13 13 चूहों) ). डी, सीडी45 में एलएजी -3, टीआईएम -3 और पीडी -1 की अभिव्यक्ति की मात्रा। बी से 1+ टीआईएल {{19}ओवीए-ट्यूमर-असर सी57बीएल/ 6एन चूहे (एन=5 चूहे)। ई, ट्यूमर-घुसपैठ करने वाली सीडी में एलएजी और टीआईएम की अभिव्यक्ति, सीडी से सीएआर टी कोशिकाएं, 29 के562 ट्यूमर वाले एनसीजी चूहों, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया है। (एन=6 चूहे)। एफ, सीडी45 में टीओएक्स की अभिव्यक्ति। 1+ बी से टीआईएल {{35}ओवीए ट्यूमर-असर सी57बीएल/6एन चूहों (एन=5 चूहों)। जी, ट्यूमर-घुसपैठ करने वाली सीडी में टीओएक्स के हिस्टोग्राम और सांख्यिकीय विश्लेषण 19-सीडी से कार टी कोशिकाएं 19-के562 ट्यूमर-असर एनसीजी चूहों (एन=6 चूहों)। एच, बाएँ, सीडी45 में टीआईएम{46}} और टीसीएफ1 के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट्स। . ठीक है, टीसीएफ1+ टीआईएम-3- या टीसीएफ1- टीआईएम-3+ जनसंख्या का प्रतिशत। डेटा को माध्य ± सेम के रूप में प्रस्तुत किया गया है। सांख्यिकीय विश्लेषण अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था।
मेटाबोलाइट्स, जैसे कि एस {{0} हाइड्रॉक्सीग्लूटारेट और -हाइड्रॉक्सीब्यूटाइरेट, को मेमोरी-टी सेल भेदभाव 67,68 के एपिजेनेटिक नियामकों के रूप में कार्य करने की सूचना दी गई है। हमारे परिणामों से पता चला है कि लगातार ↑[H+] उपचार मेथियोनीन ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के निषेध के माध्यम से इंट्रासेल्युलर मेथियोनीन, एसएएम और एसएएच में कमी के साथ मेथियोनीन के अवशोषण और मेथियोनीन चयापचय को सीमित करता है। ये परिणाम आंशिक रूप से समझा सकते हैं कि टी कोशिकाएं टीएमई69 में मेथिओनिन ग्रहण के लिए ट्यूमर कोशिकाओं से प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम क्यों नहीं हैं। यांत्रिक रूप से, हमने प्रदर्शित किया कि ↑[H+] एक्सपोज़र ने नाटकीय रूप से MYC अभिव्यक्ति और SLC7A5 प्रमोटर के लिए इसके बंधन को कम कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप SLC7A5 अभिव्यक्ति में कमी आई और T कोशिकाओं में मेथिओनिन चयापचय में कमी आई। दिलचस्प बात यह है कि, मेथियोनीन अनुपूरण MYC और SLC7A5 की अभिव्यक्ति को बहाल कर सकता है, साथ ही ↑[H+]-उजागर टी कोशिकाओं में मेथियोनीन चक्र के प्रवाह को भी बहाल कर सकता है, जिससे पता चलता है कि मेथियोनीन ग्रहण करने की क्षमता की बहाली मेथियोनीन ट्रांसपोर्टर के अपग्रेडेशन के कारण होने की संभावना है। SLC7A5 MYC-निर्भर तरीके से। MYC अनुवाद70 को विनियमित करने के लिए mTOR गतिविधि की सूचना दी गई है। तदनुसार, हमने अनुमान लगाया कि ↑[H+ ]-MYC का प्रेरित डाउनरेगुलेशन एमटीओआर के प्रगतिशील निषेध और मेथियोनीन के बिगड़ा अवशोषण के माध्यम से ट्रांसलेशनल दमन के कारण होने की संभावना है। इस तरह के दमन को बहिर्जात मेथिओनिन अनुपूरण द्वारा उलटा किया जा सकता है, हालांकि सटीक तंत्र को आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। मेथियोनीन चक्र से प्राप्त एसएएम को इफ़ेक्टर-टी सेल भेदभाव दौरान हिस्टोन मिथाइलेशन और एपिजेनेटिक रीमॉडलिंग में मध्यस्थता करने वाला माना गया है। ↑[H+ ]-विस्तारित टी कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर एसएएम की कमी के अनुरूप, हमने पाया कि H3K27me3 की कुल प्रचुरता और टी सेल-स्टेमनेस लोकी के प्रमोटर पर इसका अधिभोग दोनों बहुत कम हो गए थे। H3K27me3 और H3K4me3 को चुनिंदा तरीके से संशोधित किया गया है जो टी कोशिकाओं14 के प्रभावकारक या स्टेमनेस कार्यक्रम के लिए केंद्रीय जीन की अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध है। दरअसल, ↑[H+]-विस्तारित टी कोशिकाओं में प्रभावकार-जीन प्रमोटरों के भीतर H3K4me3 का कम संवर्धन था। इस प्रकार, ↑[H+] स्थिति के तहत बिगड़ा हुआ मेथियोनीन अवशोषण और चयापचय के परिणामस्वरूप मिथाइल-डोनर एसएएम का कम स्तर एपिजेनेटिक परिवर्तनों को जन्म देता है जो अंततः स्मृति स्थिति में टी सेल भेदभाव का पक्ष लेते हैं। दिलचस्प बात यह है कि ↑[H+ ] एक्सपोज़र के तहत मेथियोनीन मिलाने से न केवल ↑[H+ ]-एक्सपोज़्ड टी कोशिकाओं में MYC और SLC7A5 की अभिव्यक्ति को बचाया जाता है, बल्कि H3K27me3 अभिव्यक्ति के कुल स्तर को भी बहाल किया जाता है, जो MYC-SLC7A5 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करता है। -मेथिओनिन चयापचय अक्ष ↑[H+]-प्रेरित एपिजेनेटिक स्टेमनेस को विनियमित करने में। वास्तव में, हमने पाया कि SLC7A5 की अधिकता ने ↑[H+ ]-प्रेरित स्टेमनेस-जैसे फेनोटाइप को आंशिक रूप से ख़राब कर दिया है, जो ↑[H+] एक्सपोज़र के तहत टी सेल मेमोरी-जैसे फ़ेनोटाइप के अधिग्रहण में मेथिओनिन ट्रांसपोर्टर SLC7A5 की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करता है।
अधिकांश टीआईएल को ऐतिहासिक रूप से ट्यूमर के भीतर लगातार टीसीआर एक्सपोजर के कारण समाप्त माना जाता है, लेकिन विरोधाभासी रूप से टीआईएल में टी सेल क्लोनोटाइप का एक छोटा उपसमूह प्रतिलेखन कारक टीसीएफ 1 व्यक्त करता है जो स्टेम-सेल जैसी गुणों को बरकरार रखता है। हमारे निष्कर्षों से पता चला है कि ↑[H+] एक्सपोज़र टी सेल इफ़ेक्टर फ़ंक्शन को ऑफसेट करता है और MYC-SLC7A5-मेथिओनिन चयापचय अक्ष के माध्यम से टी सेल स्टेमनेस को संरक्षित करता है, जो वर्तमान विरोधाभास के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण प्रदान करता है कि क्यों टीआईएल का एक छोटा सा अंश अभी भी स्टेम को बरकरार रखता है- जैसे स्मृति या पूर्ववर्ती गुण। वास्तव में, इसी तरह के निष्कर्षों की सूचना दी गई है जिससे टीएमई में पोटेशियम आयन टी सेल प्रभावक कार्य और स्टेमनेस दोनों को प्रभावित करने वाली दोहरी भूमिका निभाते हैं, जो टीएमई इम्यूनोस्प्रेसिव कारकों (उदाहरण के लिए, क्रोनिक टीसीआर उत्तेजना, हाइपोक्सिया और कम) के जटिल प्रभावों का समर्थन करते हैं। ग्लूकोज) टी सेल फ़ंक्शन और भेदभाव पर। इसके अलावा, ट्यूमर के भीतर अम्लीय क्षेत्र अत्यधिक गतिशील होते हैं और दोनों स्थानिक और अस्थायी रूप से विनियमित होते हैं, और बाह्य कोशिकीय एसिडोसिस के लिए अनुकूलित टी कोशिकाओं की फिटनेस की संभावना कम हो जाती है जब वे अन्य कठोर टीएमई कारकों का सामना करते हैं जो इंट्राटूमोरल टी सेल प्रभावक कार्य और भेदभाव को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, हमने पूर्वज-निकासित टी कोशिकाओं (LY108+ TIM-3– ) की तुलना में अंतिम रूप से समाप्त हो चुकी टी कोशिकाओं (LY108− TIM-3+ ) में MYC की उच्च अभिव्यक्ति देखी, जो है पिछली रिपोर्टों के अनुरूप कि MYClo T कोशिकाएँ अधिमानतः मेमोरी फ़ेट73 प्राप्त करती हैं। SLC7A5 की अभिव्यक्ति में कमी और ↑[H+ ]-उजागर टी कोशिकाओं में मेथियोनीन के अवशोषण के अनुरूप, SLC7A5 की अभिव्यक्ति भी LY 108+ TIM -3 - ट्यूमर के भीतर पूर्वज-निकास टी कोशिका आबादी में काफी कम हो गई थी, यह सुझाव देते हुए कि MYC-SLC7A5-मेथिओनिन नियामक अक्ष विवो में भी काम कर सकता है। अब यह स्पष्ट है कि कम विभेदित स्टेम-जैसी मेमोरी टी कोशिकाओं में दीर्घकालिक दृढ़ता और शिथिलता के विकास के प्रतिरोध के कारण बेहतर एंटी-ट्यूमर चिकित्सीय प्रभाव होते हैं। हमने यहां इस बात के पुख्ता सबूत दिए हैं कि लंबे समय तक ↑[H+ ]-वातानुकूलित CD8+ T कोशिकाओं ने विवो में बढ़ी हुई दृढ़ता और बेहतर एंटी-ट्यूमर क्षमता दिखाई, साथ ही अंतिम रूप से समाप्त हो चुकी T सेल आबादी (TCF1− TIM) भी कम हो गई। {39}} ) और ट्यूमर के भीतर बढ़ा हुआ तना-जैसा पूर्वज उपसमुच्चय (टीसीएफ1+ टीआईएम-3- )। निष्कर्ष में, हमारा वर्तमान अध्ययन टी सेल प्रभावक फ़ंक्शन के दमन पर ↑[H+] एक्सपोज़र के बहुआयामी प्रभावों और टी सेल स्टेमनेस पर इसके संयोग प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
तरीकों
चूहे और कोशिका रेखाएँ
सभी पशु प्रयोग सूज़ौ इंस्टीट्यूट ऑफ सिस्टम्स मेडिसिन (आईएसएम-आईएसीयूसी-0151-आर) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) की मंजूरी के साथ किए गए थे, और जानवरों को विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त माउस सुविधाओं में रखा गया था। चूहों को मानक परिस्थितियों में रखा गया था, जिसमें {{3} घंटे/12- घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र और नियंत्रित तापमान 22-24 डिग्री और आर्द्रता 6 0% थी, जिसमें अप्रतिबंधित भोजन और पानी शामिल था। उपलब्धता, और दैनिक जांच की गई। सभी ट्यूमर का बोझ सूज़ौ इंस्टीट्यूट ऑफ सिस्टम्स मेडिसिन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित अनुमति से अधिक नहीं था। CD45.1+ C57BL/6N पृष्ठभूमि पर मादा OT-I TCR ट्रांसजेनिक चूहों को एक साथ रखा गया था। CD45.2+ 6-8 सप्ताह की आयु वाली मादा C57BL/6N चूहों को वाइटल रिवर से प्राप्तकर्ता के रूप में खरीदा गया था। 6-8 सप्ताह की आयु वाली मादा एनसीजी (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) चूहों को GemPharmatech से खरीदा गया था। विवो में एक स्वतंत्र प्रयोग के लिए, CD45.1+ और CD45.2+ चूहों (6-12 सप्ताह) का लिंग-मिलान किया गया। अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) से एचईके -293 टी कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम माध्यम में बनाए रखा गया था। एटीसीसी से माउस मेलेनोमा सेल लाइन बी16 को ओवीए व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यूस किया गया और 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम माध्यम में बनाए रखा गया। ATCC से K562 कोशिकाओं को मानव CD19 को व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यूस किया गया और 10% FBS, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% ग्लूटामैक्स, 0.1 M HEPES, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 mM सोडियम पाइरूवेट और 50 के साथ पूरक RPMI 1640 माध्यम में संवर्धित किया गया। μM -मर्कैप्टोएथेनॉल। उपरोक्त सभी अभिकर्मक गिब्को से खरीदे गए थे।
प्राथमिक टी सेल अलगाव, सक्रियण, और रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन
माउस सीडी{0}} टी लिम्फोसाइटों को सीडी8 नैव टी सेल आइसोलेशन किट (बायोलेजेंड) का उपयोग करके 6-12 सप्ताह के नर या मादा ओटी-आई चूहों के प्लीहा से अलग किया गया और आरपीएमआई में संवर्धित किया गया। }माउस आईएल की उपस्थिति में 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% ग्लूटामैक्स, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.1 एम एचईपीईएस और 50 μM -मर्कैप्टोएथेनॉल के साथ मध्यम पूरक। -2 (20यू/एमएल, पेप्रोटेक)। इन विट्रो में एक स्वतंत्र प्रयोग के लिए, इस्तेमाल किए गए नर और मादा चूहों (6-12 सप्ताह) का लिंग-मिलान किया गया। शुद्ध कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए एंटी-माउस CD3 (2 ug/ml, BioLegend) और एंटी-माउस CD28 (1 ug/ml, BioLegend) एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय किया गया था। स्वस्थ दाताओं से मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी) सैलीबियो से खरीदी गईं और 5% मानव सीरम एबी (मिथुन), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक आरएमपीआई (28%) माध्यम में संवर्धित की गईं। 1% ग्लूटामैक्स, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.1 एम एचईपीईएस और 50 μM -मर्कैप्टोएथेनॉल मानव आईएल की उपस्थिति में -2 (100 यू/एमएल, पेप्रोटेक)। मानव-विरोधी CD3 (1 ug/ml, BioLegend) और मानव-विरोधी CD28 (1 ug/ml, BioLegend) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग 3 दिनों के लिए PBMCs को सक्रिय करने के लिए किया गया था। शुद्ध किए गए माउस और मानव टी कोशिकाओं को संकेतित संस्कृति स्थितियों में सक्रिय और विस्तारित किया गया: पीएच 7.4, पीएच 6.6, लैक्टिक एसिड (सैंगोन), या सोडियम लैक्टेट (सैंगोन)। पीएच 6.6 या लैक्टिक एसिड (10 एमएम) माध्यम के पूरक के लिए निम्नलिखित मेटाबोलाइट्स का उपयोग किया गया था: मेथिओनिन 800 μM (एमसीई), एसएएम 100 μΜ (एमसीई), या एसएएच 100 μM (सिग्मा)। वायरल ट्रांसडक्शन के लिए, 1 × 106 पीबीएमसी को प्रति कुएं 24- वेल प्लेटों में सक्रिय किया गया था। सक्रियण के 48 घंटे के बाद, अधिकांश माध्यम को 10 यूजी/एमएल पॉलीब्रिन (सांता क्रूज़) के साथ एक असंकेंद्रित रेट्रोवायरल सुपरनैटेंट के साथ बदल दिया गया था। 30 डिग्री पर 90 मिनट के लिए 600 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कोशिकाओं को ताजा माध्यम से 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया। ट्रांसडक्शन 24 घंटे बाद दोहराया गया और फिर संस्कृति के लिए एक नए माध्यम में वापस आ गया। संक्रमण दक्षता को मापने के लिए कम-एफ़िनिटी तंत्रिका विकास कारक रिसेप्टर (एलएनजीएफआर) का उपयोग किया गया था।
फ़्लो साइटॉमेट्री
कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी से रंगा गया और फिर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। सतह मार्कर धुंधलापन के लिए, कोशिकाओं को एफएसीएस बफर (2% एफबीएस के साथ फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस)) में फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी और लाइव / डेड फिक्सेबल डेड सेल स्टेन किट (इन्विट्रोजन) के साथ दाग दिया गया था, फिर 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (कैस्मार्ट) के साथ तय किया गया था। कमरे के तापमान पर 2{15}} मिनट के लिए। फॉस्फो-प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के लिए, पूर्व-दाग वाली कोशिकाओं को एक फिक्सेशन बफर (बायोलेजेंड) के साथ तय किया गया था और फिर एक परमेबिलाइजेशन बफर (इन्विट्रोजन) में फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। इंट्रासेल्युलर साइटोकिन्स का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को 4.5 घंटे के लिए ब्रेफेल्डिन ए (बीएफए) (बायोलेजेंड) की उपस्थिति में फोर्बोल मिरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) से उत्तेजित किया गया था। फिर, पहले से दागदार कोशिकाओं को स्थिर किया गया और एक पारगम्यीकरण बफर में साइटोकिन्स एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। इंट्रासेल्युलर ट्रांसक्रिप्शनल-फैक्टर स्टेनिंग के लिए, कोशिकाओं को सतह मार्करों का पता लगाने के लिए एफएसीएस बफर में लाइव/डेड फिक्सेबल डेड सेल स्टेन किट और फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ पूर्व-दाग दिया गया था। फिर कोशिकाओं को FOXP3/ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फिक्सेशन बफर (इन्विट्रोजन) का उपयोग करके बर्फ पर 30 मिनट के लिए रखा गया और परमेबिलाइजेशन बफर में ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। धुंधला होने के बाद, कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री के लिए FACS बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया। फ्लो साइटोमेट्री डेटा बीडी एलएसआर फोर्टेसा और बीडी एफएसीएसडीवा (v8.0.2) द्वारा एकत्र किया गया था, और फ्लोजो (v10.4) सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया था। प्रतिनिधि गेटिंग रणनीतियाँ विस्तारित डेटा चित्र 10बी में प्रदान की गई हैं।
आरएनए अनुक्रमण
जैसा कि चित्र 1ए में दिखाया गया है, संकेतित स्थितियों में संवर्धित दिन-विस्तारित टी कोशिकाओं का उपयोग करके आरएनए-सीक्यू विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, टी सेल विस्तार के 12 दिन बाद, कुल आरएनए को ट्राइज़ोल (टकारा) में समरूपीकरण द्वारा और तरल नाइट्रोजन के साथ आरएनएएस-मुक्त ट्यूबों में फ्रीज करके निकाला गया था। आरएनए अखंडता का मूल्यांकन एगिलेंट 21 {{19} 0 बायोएनालाइज़र (एगिलेंट) का उपयोग करके किया गया था। पुस्तकालयों का निर्माण ट्रूसेक आरएनए सैंपल प्रीप किट (एफसी-122-1001, इलुमिना) का उपयोग करके किया गया था। फिर लाइब्रेरियों को इलुमिना नोवासेक 6{24}}00 (पीई150) प्लेटफॉर्म का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया, और लगभग 40 मिलियन युग्मित-अंत रीड्स उत्पन्न किए गए (नोवोजीन)। कच्ची पढ़ी गई गणनाएँ निकाली गईं और फिर DESeq2 (v1.28.1) का उपयोग करके उनके पुस्तकालय आकार कारकों द्वारा सामान्यीकृत की गईं। नमूनों में भिन्नता को स्थिर करने के लिए नियमित लघुगणक (आर-लॉग) परिवर्तन का उपयोग किया गया था। विभेदित रूप से व्यक्त जीनों का GO और KEGG मार्ग संवर्धन विश्लेषण क्लस्टर प्रोफ़ाइल (v3.16.0) के साथ किया गया था। एक्सप्रेशन हीट मैप आर पैकेज 'फीटमैप' (v1.0.12) के साथ तैयार किए गए थे। GSEA विश्लेषण के लिए GSEA v.4.0 का उपयोग किया गया था।
कट और टैग-सेक
इलुमिना (TD903, Vazyme) के लिए हाइपरएक्टिव यूनिवर्सल CUT&टैग परख किट का उपयोग करके CUT&Tag-seq को पहले वर्णित75 के अनुसार निष्पादित किया गया था। संक्षेप में, मानव टी कोशिकाओं को 800 μM मेथियोनीन के साथ नियंत्रण स्थितियों, लैक्टिक एसिड या लैक्टिक एसिड के तहत 12 दिनों के लिए विस्तारित किया गया था। फिर, न्यूक्लिक सामग्रियों के निष्कर्षण के लिए 1 × 105 टी कोशिकाओं को लीज किया गया और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोना मोतियों के साथ इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-H3K27me3 या एंटी-H3K4me3) के साथ पूर्व-मिश्रित 50 μL एंटीबॉडी बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया और 4 डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। नमूनों को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया और फिर डीएनए विखंडन को परेशान करने के लिए 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रोटीन ए / जी-टीएन 5 ट्रांसपोज़ेज़ के साथ सह-ऊष्मायन किया गया। शुद्ध डीएनए का उपयोग पुस्तकालय की तैयारी के लिए किया गया था और इलुमिना नोवा 6000 सीक्वेंसर द्वारा PE150 का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया था।
कट एवं टैग-सेक विश्लेषण
अनुक्रमण पढ़ने की गुणवत्ता की जांच करने के लिए फास्टक्यूसी (v{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) का उपयोग किया गया था। ट्रिमोमैटिक (v{{55%).39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) का उपयोग करके रीड्स की गुणवत्ता को न्यूनतम 20 के Phred स्कोर तक ट्रिम किया गया था। . H3K27me3 और H3K4me3 के CUT&Tag-seq द्वारा उत्पादित सभी रीड्स को Bowtie2 (v2.2.8) (https:// Bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) का उपयोग करके विकल्पों के साथ hg38 मानव जीनोम से जोड़ा गया था: -स्थानीय- बहुत-संवेदनशील-स्थानीय-नो-अनल-नो-मिश्रित-नो-डिस्कॉर्डेंट-फ़्रेड33 -I 10 -X 700. स्पाइक-इन डीएनए के बिना नमूनों को ChIPseqSpikeInFree विधि का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था, जो एक है विभिन्न स्थितियों और उपचारों में नमूनों के लिए स्केलिंग कारकों को प्रभावी ढंग से निर्धारित करने के लिए नवीन सामान्यीकरण विधि76। H3K27me3 के लिए, चोटियों को MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ चोटी_कॉलिंग_macs का उपयोग करके बुलाया गया था .html) विकल्पों के साथ '-g hs -f BAMPE–keep-dup all–road–broad-cutoff 0.1'। H3K4me3 के लिए, पीक कॉलिंग में '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all' पैरामीटर के साथ MACS2 का उपयोग किया गया। चोटियों को चिपसीकर (v1.22.1) (https://guangshuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/) के साथ एनोटेट किया गया था, और डीपटूल्स (v3.5.1) (https://deptools.readthedocs.io/en) का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन बनाए गए थे। /डेवलप/) और pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/)।
क्यूआरटी-पीसीआर
निर्माता के निर्देशों के अनुसार, कुल आरएनए को ट्राइज़ोल (टकारा) के साथ अलग किया गया और हाईस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (वज़ाइम) के साथ सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एबीआई प्रिज्म 7500 वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर) और 2×एसवाईबीआर ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (बिमेक) का उपयोग किया गया था। ACTB का उपयोग आंतरिक मानक के रूप में किया गया था। एमआरएनए की सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना 2−ΔΔCT विधि का उपयोग करके की गई थी। क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर अनुक्रम अनुपूरक तालिका 1 में पाए जा सकते हैं।
पश्चिमी सोख्ता
प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को एकत्र किया गया और ठंडे पीबीएस से धोया गया, और बर्फ पर 1% एसडीएस (सांगॉन) का उपयोग करके कुल प्रोटीन निकाला गया। प्रोटीन सांद्रता को बीसीए प्रोटीन परख किट (मर्क) द्वारा मापा गया था। प्रोटीन के नमूनों को एसडीएस-पेज जैल द्वारा अलग किया गया और फिर पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोर) में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्लियों को पीबीएस में 5% गैर-वसा वाले दूध से अवरुद्ध किया गया था जिसमें ट्वीन20 था। अवरुद्ध करने के बाद, झिल्लियों को रात भर 4 डिग्री पर प्राथमिक एंटीबॉडी और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एचआरपी-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। एचआरपी सिग्नल को इलेक्ट्रोकेमिलुमिनसेंस (चेममिनी610) द्वारा विकसित किया गया था और सेज कैप्चर (v2.19.12) द्वारा एकत्र किया गया था। ImageJ (v1.8.0) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण किया गया था।
माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान विश्लेषण
वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में, पीबीएमसी को 3 दिनों के लिए मानव एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी 28 एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय किया गया था और 12 दिनों के लिए अलग-अलग परिस्थितियों में आरपीएमआई -1640 माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। फिर, 1 × 106 पीबीएमसी एकत्र किए गए और प्री-कूल्ड फिक्सेशन बफर (2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड, 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी), पीएच 7.4) में रात भर 4 डिग्री पर तय किए गए। तीन बार पीबीएस से धोने के बाद, कोशिकाओं को मानक प्रक्रिया के अनुसार, पीबीएस में 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में 2 घंटे के लिए पोस्ट-फिक्स्ड किया गया, निर्जलित किया गया और स्पर के राल में एम्बेडेड किया गया। अल्ट्राथिन खंडों को यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट से रंगा गया था। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को हिताची HT -7800 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) (v01.20) और AMT-XR81DIR कैमरे का उपयोग करके चित्रित किया गया था।
एंटीबॉडी और अभिकर्मक
प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडीज़ इस प्रकार थीं। एपीसी मानव-विरोधी एनजीएफआर (एफएसीएस के लिए बिल्ली संख्या 345108, 1:1, 000), एफआईटीसी मानव-विरोधी सीडी4 (एफएसीएस के लिए बिल्ली संख्या 357406, 1:200), पेसिफ़िक ब्लू मानव-विरोधी सीडी8 (बिल्ली संख्या 300928, एफएसीएस के लिए 1:200), एपीसी-साइ7 मानव-विरोधी/माउस सीडी44 (बिल्ली संख्या 103028, एफएसीएस के लिए 1:200), पीई मानव-विरोधी सीसीआर7 (बिल्ली संख्या 353204, 1) :एफएसीएस के लिए 200), पीई मानव-विरोधी टीएनएफ- (बिल्ली संख्या 502909, एफएसीएस के लिए 1:200), पीई-साइ7 मानव-विरोधी सीडी45आरओ (बिल्ली संख्या 304230, एफएसीएस के लिए 1:200), एपीसी विरोधी- मानव आईएफएन- (बिल्ली संख्या 502512, एफएसीएस के लिए 1:200), पीई-साइ7 मानव विरोधी एलएजी-3 (बिल्ली संख्या 369310, एफएसीएस के लिए 1:200), पीई मानव विरोधी टीआईएम {{ 52}} (बिल्ली संख्या 345006, एफएसीएस के लिए 1:200), बीवी711 मानव-विरोधी पीडी-1 (बिल्ली संख्या 329928, एफएसीएस के लिए 1:200), पर्कप-साइ5.5 मानव-विरोधी सीडी62एल (बिल्ली संख्या 304824, एफएसीएस के लिए 1:200), एपीसी मानव-विरोधी सीडी27 (बिल्ली संख्या 302810, एफएसीएस के लिए 1:200), बीवी711 एंटी-माउस सीडी8 (बिल्ली संख्या 100748, एफएसीएस के लिए 1:200) ), PE-Cy7 एंटी-माउस CD62L (कैट नंबर 104418, FACS के लिए 1:200), APC-Cy7 एंटी-माउस CD45.2 (कैट नंबर 830789, FACS के लिए 1:200), पैसिफिक ब्लू एंटी- माउस CD45.1 (कैट नं. 110722, FACS के लिए 1:200), APC एंटी-माउस Ly108 (कैट. नहीं। 134610, एफएसीएस के लिए 1:200), पीई एंटी-माउस एलएजी -3 (कैट नंबर 125207, एफएसीएस के लिए 1:200), एलेक्सा फ्लोर 488 एंटी-सी-एमवाईसी एंटीबॉडी (कैट नंबर 626811, 1) :FACS के लिए 200), PE एंटी-माउस TNF- (कैट नंबर 506306, FACS के लिए 1:200), और APC एंटी-माउस IFN- (कैट नंबर 505810, FACS के लिए 1:200) BioLegend से खरीदे गए थे। . लाइव/डेड फिक्सेबल डेड सेल स्टेन किट, PerCP-eFluor710 एंटी-माउस PD-1 (कैट नं. 46-9981-82, FACS के लिए 1:200), PE फॉस्फोर-S6 (Ser235/236) (कैट . संख्या {{139 }}, एफएसीएस के लिए 1:200), पीई एंटी-ह्यूमन/माउस टीओएक्स (बिल्ली संख्या {{143 }}, एफएसीएस के लिए 1:200), और पीई-साइ7 एंटी-माउस टीआईएम { {149}} (बिल्ली संख्या 25-5870-82, एफएसीएस के लिए 1:200) थर्मो फिशर से खरीदे गए थे। एलेक्सा फ्लोर 647 एंटी-टीसीएफ1 (एफएसीएस के लिए कैट नंबर 6709, 1:200) और फॉस्फोर -4ई-बीपी1 (थ्र37/46) (एफएसीएस के लिए कैट नंबर 2846, 1:200) यहां से खरीदे गए थे। सेल सिग्नलिंग प्रौद्योगिकी. एलेक्सा फ्लोर 647 एंटी-प्यूरोमाइसिन (बिल्ली संख्या MABE 343-AF647, FACS के लिए 1:800) मर्क से खरीदा गया था। वेस्टर्न ब्लॉट के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडीज़ इस प्रकार थीं। रैबिट एंटी-फॉस्फो-एक्ट (सेर473) (बिल्ली संख्या 4060, 1:1, 000 आईबी के लिए), एंटी-फॉस्फो-एनएफ-κबी पी65 (सेर536) (बिल्ली संख्या 3033, 1:1) ,000 आईबी के लिए), एंटी-सी-एमवाईसी (बिल्ली संख्या 18583, 1:1, 000 आईबी के लिए), एंटी-ईजेएच2 (बिल्ली संख्या 5246, 1:1,{ आईबी के लिए {200}}, एंटी-ट्राई-मिथाइल-हिस्टोन एच3 (एलआईएस27) (बिल्ली संख्या 9733, 1:1, आईबी के लिए {{209%), एंटी-ट्राई-मिथाइल-हिस्टोन एच3 (एलआईएस4) (आईबी के लिए बिल्ली संख्या 9751, 1:1,000), एंटी-डाई-मिथाइल-हिस्टोन एच3 (लिस9) (आईबी के लिए बिल्ली संख्या 4658, 1:1,000) , एंटी-डाई-मिथाइल-हिस्टोन H3 (Lys79) (बिल्ली नं. 5427, 1:1,000 IB के लिए), एंटी-हिस्टोन H3 (बिल्ली नं. 9715, 1:1,{{242) आईबी के लिए }}), एंटी-COXIV (बिल्ली संख्या 850, 1:1, 000 आईबी के लिए), खरगोश विरोधी आईजीजी (एचआरपी-लिंक्ड) (बिल्ली संख्या 7074, 1:2,{ आईबी के लिए {253%), और एंटी-माउस आईजीजी (एचआरपी-लिंक्ड) (कैट नंबर 7076, 1:2, आईबी के लिए {{259%) सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे। माउस एंटी-टिम23 (बिल्ली नं. 611223, 1:1, 000 आईबी के लिए) बीडी बायोसाइंसेज से था। माउस एंटी - -एक्टिन (कैट नं. 66009-1-आईजी, 1:5,000 आईबी के लिए), एंटी-एसएलसी7ए5 (कैट नं. 67951-1-आईजी, 1: आईबी के लिए 1,000), और खरगोश विरोधी एसएलसी38ए1 (बिल्ली नं. 12039-1-एपी, 1:1,000 आईबी के लिए) प्रोटीनटेक से थे। रैबिट एंटी-एसएलसी38ए2 (बिल्ली संख्या बीएमपी081, 1:1, आईबी के लिए 000) चिकित्सा और जैविक प्रयोगशालाओं से खरीदा गया था।
टी-सेल चयापचय परख
नियंत्रण या ↑[H+]-उपचारित T कोशिकाओं में BODIPY FL C16 के अवशोषण की जांच करने के लिए, T कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए ताज़ा विघटित 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) के साथ संवर्धित किया गया, फिर सतह पर धुंधला होने से पहले पीबीएस के साथ दो बार धोया गया। विभिन्न उपचार समूहों में चयापचय निर्भरता का और अधिक पता लगाने के लिए, SCENITH (प्रोफाइलिंग अनुवाद निषेध द्वारा एकल कोशिका ऊर्जावान चयापचय) विधि42 का उपयोग करके प्रयोग किए गए। संक्षेप में, टी कोशिकाओं को 1 × 106 कोशिकाओं/मिलीलीटर पर अच्छी तरह से प्लेटों में डाला गया था। फिर कोशिकाओं को नियंत्रण (Ctrl), डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज (अंतिम सांद्रता 100 mM), ओलिगोमाइसिन (अंतिम सांद्रता 5 μM), या 37 पर 40 मिनट के लिए अंतिम सांद्रता पर अवरोधकों के मिश्रण से उपचारित किया गया। डिग्री । पिछले 30 मिनट के दौरान प्यूरोमाइसिन (अंतिम सांद्रता 10 ug/ml) मिलाया गया था। पौरोमाइसिन उपचार के बाद, कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस से धोया गया और सतह मार्करों के खिलाफ लाइव/डेड फिक्सेबल डेड सेल स्टेन किट और एंटीबॉडी के साथ पूर्व-दाग किया गया। इंट्रासेल्युलर पौरोमाइसिन के धुंधलापन के बाद इंट्रासेल्युलर प्रतिलेखन कारकों के लिए धुंधला होने की प्रक्रिया शुरू हुई।
एलसी-एमएस/एमएस के साथ मेटाबोलॉमिक विश्लेषण
मेटाबोलॉमिक विश्लेषण और नमूना संग्रह पिछली रिपोर्ट77 की तरह ही किया गया था। संक्षेप में, पीबीएमसी को 3 दिनों के लिए मानव एंटी-सीडी3/सीडी28 द्वारा वेल प्लेटों में व्यक्तिगत रूप से सक्रिय किया गया था और 12 दिन तक नियंत्रण या लैक्टिक एसिड के साथ आरपीएमआई 164{27}} माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। फिर, 8 × प्रति नमूना 6 कोशिकाएं (प्रत्येक समूह में स्वतंत्र नमूने) एकत्र की गईं और 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए 1.{12}} एमएल ट्यूब में स्थानांतरित की गईं और फिर ठंडे पीबीएस से धोया. 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 80% ठंडा मेथनॉल जोड़ा गया और सेल गोली को पूरी तरह से बाधित करने के लिए सख्ती से घुमाया गया, और फिर कोशिकाओं को -80 डिग्री पर फ्रीजर में स्थानांतरित कर दिया गया। नमूनों को 4 डिग्री पर 10 मिनट के लिए 12,{21}} ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था. अंत में, अर्क को नोवोजेन में यूएचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा लिओफिलाइज़ किया गया और विश्लेषण किया गया। यूएचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा उत्पन्न कच्ची डेटा फ़ाइलों को प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए पीक एलाइनमेंट, पीक पिकिंग और क्वांटिटेशन करने के लिए कंपाउंड डिस्कवरर (v3.1, थर्मो फिशर) का उपयोग करके संसाधित किया गया था। आगे के डेटा विश्लेषण के लिए मेटाबोएनालिस्ट (v5.0) सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था, और फिर P <0.05 का उपयोग करके महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध पथों का चयन किया गया था।
स्थिर-आइसोटोप-लेबलिंग प्रयोग
13C मेटाबॉलिक फ्लक्स को पहले वर्णित विधियों60,78,79 का उपयोग करके टी कोशिकाओं पर निष्पादित किया गया था। संक्षेप में, जैसा कि ऊपर वर्णित है, पीबीएमसी को 3 दिनों के लिए मानव एंटी-सीडी3/सीडी28 के साथ 24-वेल प्लेटों में सक्रिय किया गया था। [13सी6] ग्लूकोज ट्रेसिंग के लिए, माध्यम को 11 दिनों के बाद 10% डायलाइज्ड एफबीएस (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 50 μM के साथ पूरक ग्लूकोज-मुक्त आरपीएमआई (गिब्को) में बदल दिया गया। -मर्कैप्टोएथेनॉल और 0.1 एम एचईपीईएस, जिसमें 11 एमएम [13सी6] ग्लूकोज (कैम्ब्रिज आइसोटोप लेबोरेटरीज) नियंत्रण या 10 एमएम लैक्टिक एसिड के साथ 24 घंटे के लिए होता है। [13सी16]पामिटेट ट्रेसिंग के लिए, 2 × 107 टी कोशिकाओं को सक्रिय किया गया और 12वें दिन नियंत्रण या 10 मिमी लैक्टिक एसिड स्थितियों के साथ एक पूर्ण माध्यम में रखा गया, जिसमें 200 μM [13सी16]पामिटेट (कैम्ब्रिज आइसोटोप प्रयोगशालाएं) शामिल थे, 8 के लिए एच। [13सी5]मेथिओनिन ट्रेसिंग के लिए, टी कोशिकाओं को 12 दिनों के लिए 800 μM मेथिओनिन स्थितियों के साथ नियंत्रण, लैक्टिक एसिड या लैक्टिक एसिड में विस्तारित किया गया था। फिर, 4 × 107 टी कोशिकाओं को मेथियोनीन-मुक्त पूर्ण आरपीएमआई माध्यम (गिब्को) में बदल दिया गया और नियंत्रण स्थितियों, लैक्टिक एसिड, या मेथियोनीन के साथ पूरक लैक्टिक एसिड (100 μM, 100 μM, या 800 μM [13C5] मेथियोनीन युक्त) के तहत सुसंस्कृत किया गया। (कैम्ब्रिज आइसोटोप प्रयोगशालाएँ), 8 घंटे के लिए। संबंधित सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और फिर -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन (300 ग्राम, 4 डिग्री, 5 मिनट) द्वारा पिलाया गया, खारे पानी से दो बार धोया गया, और तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रोजन किया गया और -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। मेटाबोलाइट्स को बर्फ के ठंडे एचपीएलसी-ग्रेड 80% मेथनॉल का उपयोग करके निकाला गया और संक्षेप में भंवर में डाला गया, इसके बाद 200 मिलीलीटर एचपीएलसी-ग्रेड पानी मिलाया गया, फिर 500 मिलीलीटर एचपीएलसी-ग्रेड क्लोरोफॉर्म (मेथनॉल: पानी: क्लोरोफॉर्म अनुपात, 5: 2: 5) ). चरण पृथक्करण प्राप्त करने के लिए मिश्रण को भंवर में डाला गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया। बाद के व्युत्पन्नीकरण के लिए सतह पर तैरनेवाला को वैक्यूम स्पिन द्वारा सुखाया गया, और फिर 37 डिग्री पर 60 मिनट के लिए पाइरीडीन में 2% (wt/vol) मेथॉक्सीमाइन हाइड्रोक्लोराइड (226904, सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ ऊष्मायन किया गया, और एन-मिथाइल-एन-( टर्ट-ब्यूटाइलडिमिथाइलसिलिल) ट्राइफ्लूरोएसिटामाइड 1% टर्ट-ब्यूटाइलडिमिथाइलक्लोरोसिलेन (टीबीडीएमएस, 18162-48-6, रेजिस टेक्नोलॉजीज) के साथ 45 डिग्री पर 30 मिनट के लिए। [13सी6] ग्लूकोज डेरिवेटिव का विश्लेषण जीसी-एचआरएमएस, ट्रेस 1310 गैस क्रोमैटोग्राफ (थर्मो फिशर) के साथ डीबी-35एमएस कॉलम (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) और क्यू एक्सएक्टिव जीसी ऑर्बिट्रैप जीसी-एमएस/एमएस सिस्टम (थर्मो फिशर) द्वारा किया गया था। जीसी-एमएस/एमएस मेटाबोलॉमिक्स परीक्षण मेटाबो-प्रोफाइल द्वारा आयोजित किए गए थे। मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा Xcalibur (v4.1) और ट्रेसफाइंडर (v5.1) (थर्मो फिशर) द्वारा निर्धारित की गई थी, जिसमें अवधारण समय, आयन टुकड़ों का चार्ज-टू-मास अनुपात और चरम तीव्रता शामिल थी। [13सी16] पामिटेट और [13सी5] मेथिओनिन डेरिवेटिव का विश्लेषण अल्ट्राहाई-प्रेशर तरल क्रोमैटोग्राफी-ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (यूपीएलसी-टीक्यूएमएस) द्वारा किया गया था। यूपीएलसी-टीक्यूएमएस के कच्चे डेटा का विश्लेषण मेटाबोलाइट्स के चरम निष्कर्षण, एकीकरण, पहचान और मात्रा निर्धारण के लिए वाटर्स मासलिंक्स सॉफ्टवेयर (v4.1, वाटर्स) का उपयोग करके किया गया था। बाद के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आर भाषा (v4.1.1) का उपयोग किया गया था।
बी16 ट्यूमर मॉडल और दत्तक कोशिका स्थानांतरण इम्यूनोथेरेपी
विवो में टी कोशिकाओं की ट्यूमर-विरोधी गतिविधि की जांच करने के लिए, 0.2 × 106 बी 16-ओवीए मेलेनोमा कोशिकाओं को मादा C57BL/6N चूहों में सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया था। ट्यूमर प्रत्यारोपण के नौ दिन बाद, चूहों को महिला ओटी-आई चूहों से 5 × 106 टी कोशिकाओं को अलग-अलग स्थितियों में 7 दिनों तक विस्तारित किया गया। ट्यूमर वाले चूहों को ACT से पहले 5 Gy सबलेथल विकिरण प्राप्त हुआ। ट्यूमर क्षेत्र को हर 2 दिन में मापा गया और लंबाई (मिमी) × चौड़ाई (मिमी) के रूप में गणना की गई। 300 मिमी2 के ट्यूमर क्षेत्र वाले चूहों को इच्छामृत्यु दी गई। विभिन्न स्थितियों में विस्तारित टी कोशिकाओं की दृढ़ता का पता लगाने के लिए, 4 × 106 CD45.1+ महिला OT-I चूहों से टी कोशिकाओं को मादा C57BL/6N चूहों में स्थानांतरित किया गया। एक सप्ताह बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और पृथक रक्त, प्लीहा और लिम्फ नोड्स से कोशिकाओं की गिनती की गई। स्थानांतरित टी कोशिकाओं का अनुपात प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से सीडी45.1+ और सीडी45.2+ को व्यक्त करने वाली टी कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था।
एनसीजी चूहों का मॉडल और सीडी19-सीएआर-टी थेरेपी
मादा एनसीजी चूहों को 1 × 106 सीडी 19- K562 कोशिकाओं के साथ चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया गया था। जब ट्यूमर की मात्रा 75 मिमी3 तक पहुंच गई, तो चूहों को नियंत्रण में या 10 मिमी लैक्टिक एसिड युक्त माध्यम में संवर्धित 5 × 106 गैर-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाएं और सीडी {9}}सीएआर टी कोशिकाएं प्राप्त हुईं। ट्यूमर की वृद्धि को हर 2 दिन में इलेक्ट्रॉनिक कैलीपर्स से मापा गया और लंबाई (मिमी) × चौड़ाई (मिमी) द्वारा गणना की गई। 300 मिमी2 से बड़े ट्यूमर क्षेत्र वाले चूहों को इच्छामृत्यु दी गई। ट्यूमर को एकत्र किया गया, पचाया गया और पेरकोल (सिग्मा) के साथ संसाधित किया गया, और फिर टी सेल फ़ंक्शन और फेनोटाइप को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया।
बेसल ऑक्सीजन खपत दर और बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर विश्लेषण
चयापचय विशेषताओं के विश्लेषण के लिए, OCR और ECAR का मूल्यांकन सीहॉर्स XF24 विश्लेषक (एगिलेंट) द्वारा किया गया था। संक्षेप में, 12 दिनों के लिए अलग-अलग परिस्थितियों में संवर्धित मानव टी कोशिकाओं को गैर-बफ़र्ड एक्सएफ माध्यम (गैर-बफ़र्ड आरपीएमआई 164 0 जिसमें 1 0 एमएम ग्लूकोज 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, और 2 एमएम ग्लूटामाइन) के साथ पूर्व-उपचार किया गया था। . इसके बाद, मानव टी कोशिकाओं को XF24 सेल कल्चर माइक्रोप्लेट में प्रति कुएं 0.5 × 106 कोशिकाओं पर रखा गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए गैर-सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया गया। सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए, प्लेटों को शून्य ब्रेक के साथ 100 ग्राम पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घुमाया गया। ऑक्सीजन की खपत और बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण का विश्लेषण बेसल स्थितियों के तहत किया गया और 1.25 μM ओलिगोमाइसिन, 50 mM 2- डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज, 1.5 μM FCCP, 0.5 μM रोटेनोन, और 0.5 μM एंटीमाइसिन ए के जवाब में किया गया। SRC की गणना घटाकर की गई अधिकतम ओसीआर से बेसल ओसीआर।
चिप-क्यूपीसीआर
ChIP-IT एक्सप्रेस एंजाइमैटिक शियरिंग किट (एक्टिव मोटिफ) के साथ प्रदान किए गए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (ChIP) का प्रदर्शन किया गया। संक्षेप में, नियंत्रण या 10 मिमी लैक्टिक एसिड स्थितियों में संवर्धित 15 मिलियन मानव टी कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फॉर्मेल्डिहाइड के साथ तय किया गया था, और 1 × ग्लाइसिन के अतिरिक्त निर्धारण प्रतिक्रिया को रोक दिया गया था। स्थिर कोशिकाओं को पीएमएसएफ और प्रोटीन अवरोध कॉकटेल के साथ पिलाया गया और कोशिका विश्लेषण से पहले -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। फिर, पिघली हुई गोली को परमाणु सामग्री प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर पीएमएसएफ और प्रोटीन निषेध कॉकटेल के साथ 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे लिसीस बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था। परमाणु गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया और 37 डिग्री पर 15 मिनट के लिए क्रोमैटिन को कतरने के लिए एक एंजाइमेटिक कॉकटेल के साथ पचाया गया। शियरड क्रोमैटिन को प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों के साथ एंटी-सी-एमवाईसी (सीएसटी, कैट नंबर 18583, चिप के लिए 1:100) और एंटी-आईजीजी (सीएसटी, कैट नंबर 2729, चिप के लिए 1:100) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। रात में 4 डिग्री तापमान. फिर, चुंबकीय मोतियों को चिप बफ़र्स के साथ चार बार धोया गया और 50 उल रेफरेंस बफर के साथ निक्षालित किया गया। उत्सर्जित डीएनए को 2.5 घंटे के लिए 65 डिग्री पर रिवर्स क्रॉसलिंक किया गया और फिर फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा शुद्ध किया गया। लक्ष्य जीन के प्रमोटरों पर MYC के संवर्धन का पता लगाने के लिए शुद्ध डीएनए का उपयोग चिप-क्यूपीसीआर करने के लिए किया गया था। चिप-क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर अनुपूरक तालिका 2 में पाए जा सकते हैं।
माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली संभावित विश्लेषण
माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली क्षमता का विश्लेषण मिटोट्रैकर ग्रीन और टेट्रामेथिरहोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम) का उपयोग करके किया गया था। कोशिका की सतह को धुंधला करने से पहले कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री (5% CO2) पर एक इनक्यूबेटर में 250 एनएम मिटोट्रैकर ग्रीन (थर्मो फिशर) या 50 एनएम टीएमआरएम (थर्मो फिशर) के साथ दाग दिया गया था। कोशिकाओं को तीन बार FACS बफर से धोया गया, इसके बाद आगे FACS विश्लेषण के लिए सतह मार्करों को धुंधला किया गया।
सांख्यिकीय विश्लेषण
सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म संस्करण 8 का उपयोग करके किया गया था। परिणाम माध्य ± सेम के रूप में प्रदर्शित किए जाते हैं नियंत्रण समूहों के साथ उपचार की तुलना करने के लिए दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। कई तुलनाओं के लिए तुकी के सिडाक या डननेट के बहु-तुलना परीक्षण के साथ दो-तरफा एनोवा लागू किया गया था। पी <{6}}.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
संदर्भ
1. गट्टिनोनी, एल., स्पाइसर, डी.ई., लिचटरफेल्ड, एम. और बोनिनी, सी. टी मेमोरी स्टेम सेल स्वास्थ्य और रोग में। नेट. मेड. 23, 18-27 (2017)।
2. गाओ, एस. एट अल. स्टेम सेल-जैसी मेमोरी टी कोशिकाएं: अंधेरे पक्ष से एक परिप्रेक्ष्य। सेल इम्यूनोल. 361, 104273 (2021)।
3. रोसेनबर्ग, एसए और रेस्टिफो, एनपी मानव कैंसर के लिए व्यक्तिगत इम्यूनोथेरेपी के रूप में एडॉप्टिव सेल ट्रांसफर। विज्ञान 348, 62-68 (2015)।
4. रिबास, ए. और वोल्चोक, जेडी कैंसर इम्यूनोथेरेपी चेकपॉइंट नाकाबंदी का उपयोग करके। विज्ञान 359, 1350-1355 (2018)।
5. लुगली, ई., गैलेटी, जी., बोई, एसके और यंगब्लड, बीए स्टेम, इफ़ेक्टर, और मेमोरी सीडी की संकर अवस्थाएँ 8+ टी कोशिकाएं। रुझान इम्यूनोल। 41, 17-28 (2020)।
6. गैलेट्टी, जी. एट अल. मनुष्यों में अलग-अलग भाग्य प्रतिबद्धताओं के साथ स्टेम-जैसी सीडी 8+ मेमोरी टी सेल पूर्वजों के दो उपसमूह। नेट. इम्यूनोल. 21, 1552-1562 (2020)।
7. गट्टिनोनी, एल. एट अल. स्टेम सेल जैसे गुणों वाला एक मानव मेमोरी टी सेल उपसमूह। नेट. मेड. 17, 1290-1297 (2011)।
8. फ्रेंको, एफ., जैकार्ड, ए., रोमेरो, पी., यू, वाईआर और हो, पीसी मेटाबोलिक और टी-सेल थकावट का एपिजेनेटिक विनियमन। नेट. मेटाब. 2, 1001-1012 (2020)।
9. केच, एसएम और कुई, डब्ल्यू। इफ़ेक्टर और मेमोरी सीडी का ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण 8+ टी सेल भेदभाव। नेट. रेव. इम्यूनोल. 12, 749-761 (2012)।
10. हुआंग, क्यू. एट अल। लिम्फ नोड्स को बाहर निकालने में पीडी -1/पीडी-एल1 नाकाबंदी के लिए प्रामाणिक प्रतिक्रियाकर्ताओं के रूप में ट्यूमर-विशिष्ट मेमोरी सीडी 8+ टी कोशिकाओं का प्रारंभिक भेदभाव। सेल 185, 4049-4066 (2022)।
11. सिद्दीकी, आई. एट अल। इंट्राट्यूमोरल टीसीएफ 1+ पीडी -1+ सीडी 8+ स्टेम जैसी गुणों वाली टी कोशिकाएं टीकाकरण और चेकपॉइंट नाकाबंदी इम्यूनोथेरेपी के जवाब में ट्यूमर नियंत्रण को बढ़ावा देती हैं। प्रतिरक्षा 50, 195-211 (2019)।
12. जेनेट, जी. एट अल. कार्यात्मक CD8 T सेल मेमोरी की स्थापना के लिए Wnt पाथवे इफ़ेक्टर Tcf-1 की आवश्यक भूमिका। प्रोक. नेटल एकेड. विज्ञान. यूएसए 107, 9777-9782 (2010)।
13. हेनिंग, एएन, रॉयचौधुरी, आर. और रेस्टिफो, एनपी एपिजेनेटिक नियंत्रण सीडी8+ टी कोशिका विभेदन। नेट. रेव. इम्यूनोल. 18, 340-356 (2018)।
14. क्रॉम्पटन, जेजी एट अल। सीडी8+ टी कोशिका उपसमुच्चय का वंश संबंध एपिजेनेटिक परिदृश्य में प्रगतिशील परिवर्तनों से प्रकट होता है। सेल मोल. इम्यूनोल. 13, 502-513 (2016)।
15. यू, बी. एट अल. एपिजेनेटिक परिदृश्य प्रतिलेखन कारकों को प्रकट करते हैं जो सीडी8+ टी कोशिका विभेदन को नियंत्रित करते हैं। नेट. इम्यूनोल. 18, 573-582 (2017)।
16. अराकी, वाई. एट अल. हिस्टोन मिथाइलेशन के जीनोम-व्यापी विश्लेषण से जीन प्रतिलेखन के क्रोमैटिन राज्य-आधारित विनियमन और मेमोरी सीडी 8+ टी कोशिकाओं के कार्य का पता चलता है। प्रतिरक्षा 30, 912-925 (2009)।
17. मोलर, एसएच, ह्यूह, पीसी, यू, वाईआर, झांग, एल. और हो, पीसी मेटाबोलिक प्रोग्राम वायरल संक्रमण, कैंसर और उम्र बढ़ने में टी सेल प्रतिरक्षा को तैयार करते हैं। सेल मेटाब. 34, 378-395 (2022)।
18. फ़ान, एटी एट अल। कांस्टीट्यूशनल ग्लाइकोलाइटिक मेटाबोलिज्म वायरल संक्रमण के दौरान सीडी8+ टी सेल इफ़ेक्टर मेमोरी विभेदन का समर्थन करता है। प्रतिरक्षा 45, 1024-1037 (2016)।
19. सिंक्लेयर, एलवी एट अल। टी कोशिकाओं में मेथिओनिन चयापचय का एंटीजन रिसेप्टर नियंत्रण। ईलाइफ 8, ई44210 (2019)।
20. ओ'सुलिवन, डी. एट अल। मेमोरी सीडी8+ टी कोशिकाएं विकास के लिए आवश्यक चयापचय प्रोग्रामिंग का समर्थन करने के लिए सेल-आंतरिक लिपोलिसिस का उपयोग करती हैं। प्रतिरक्षा 41, 75-88 (2014)।
21. पियर्स, ईएल एट अल। फैटी एसिड चयापचय को संशोधित करके सीडी8 टी-सेल मेमोरी को बढ़ाना। नेचर 460, 103-107 (2009)।
22. वैन डेर विंड्ट, जीजे एट अल। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता सीडी8+ टी सेल मेमोरी विकास का एक महत्वपूर्ण नियामक है। प्रतिरक्षा 36, 68-78 (2012)। 23. बोएडट्जर, ई. और पेडर्सन, एसएफ कैंसर के चालक के रूप में अम्लीय ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण। अन्नू. रेव्ह. फिजियोल. 82, 103-126 (2020)। 24. थॉमेन, डीएस और शूमाकर, टीएन टी सेल डिसफंक्शन इन कैंसर। कैंसर कोशिका 33, 547-562 (2018)।
25. शार्पिंग, एनई एट अल। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट इंट्राटूमोरल टी-सेल चयापचय अपर्याप्तता और शिथिलता को चलाने के लिए टी-सेल माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस को दबाता है। प्रतिरक्षा 45, 374-388 (2016)।
26. यू, वाईआर एट अल। सीडी 8+ टीआईएल में परेशान माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता टी-सेल थकावट को सुदृढ़ करती है। नेट. इम्यूनोल. 21, 1540-1551 (2020)।
27. चांग, सीएच एट अल। ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण में चयापचय प्रतिस्पर्धा कैंसर की प्रगति का चालक है। सेल 162, 1229-1241 (2015)।
28. शार्पिंग, एनई एट अल। हाइपोक्सिया के तहत निरंतर उत्तेजना से प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल तनाव तेजी से टी-सेल थकावट को बढ़ाता है। नेट. इम्यूनोल. 22, 205-215 (2021)।
29. जानसेन, सीएस एट अल। एक इंट्रा-ट्यूमरल आला स्टेम-जैसी सीडी 8 टी कोशिकाओं को बनाए रखता है और अलग करता है। प्रकृति 576, 465-470 (2019)।
30. मैं, एसजे एट अल। सीडी 8+ टी कोशिकाओं को परिभाषित करना जो पीडी -1 थेरेपी के बाद प्रोलिफ़ेरेटिव विस्फोट प्रदान करते हैं। प्रकृति 537, 417-421 (2016)।
31. हास, आर. एट अल. लैक्टेट टी सेल माइग्रेशन और प्रभावकारी कार्यों के नियंत्रण में चयापचय और प्रो-इंफ्लेमेटरी सर्किट को नियंत्रित करता है। PLoS बायोल. 13, ई1002202 (2015)।
32. वू, एच. एट अल. टी-कोशिकाएं अपने स्वयं के प्रभावकारी कार्यों को दबाने के लिए लिम्फ नोड्स में अम्लीय निचे उत्पन्न करती हैं। नेट. कम्यून. 11, 4113 (2020)।
33. कैल्सिनोटो, ए. एट अल. सूक्ष्म पर्यावरण अम्लता का मॉड्यूलेशन मानव और म्यूरिन ट्यूमर-घुसपैठ करने वाले टी लिम्फोसाइटों में ऊर्जा को उलट देता है। कैंसर रेस. 72, 2746-2756 (2012)। 34. गॉटफ्राइड, ई. एट अल. ट्यूमर-व्युत्पन्न लैक्टिक एसिड डेंड्राइटिक सेल सक्रियण और एंटीजन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। ब्लड 107, 2013-2021 (2006)।
35. कोलेजियो, या एट अल। ट्यूमर-व्युत्पन्न लैक्टिक एसिड द्वारा ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज का कार्यात्मक ध्रुवीकरण। प्रकृति 513, 559-563 (2014)।
36. एर्रा डियाज़, एफ. एट अल। एक्स्ट्रासेल्यूलर एसिडोसिस और एमटीओआर निषेध मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करते हैं। सेल प्रतिनिधि 31, 107613 (2020)।
37. सुकुमार, एम. एट अल। ग्लाइकोलाइटिक चयापचय को बाधित करने से सीडी8+ टी सेल मेमोरी और एंटीट्यूमर फ़ंक्शन में वृद्धि होती है। जे. क्लिन. निवेश करना। 123, 4479-4488 (2013)।
38. स्कोल्ज़, जी. एट अल. एमटीओआर सिग्नलिंग का मॉड्यूलेशन स्टेम सेल जैसी मेमोरी टी कोशिकाओं के निर्माण को ट्रिगर करता है। ईबीओमेडिसिन 4, 50-61 (2016)।
39. पोलिज़ी, केएन एट अल। mTORC1 और mTORC2 चुनिंदा रूप से CD8+ T सेल विभेदन को नियंत्रित करते हैं। जे. क्लिन. निवेश करना। 125, 2090-2108 (2015)।
40. झांग, एल. एट अल. रैपामाइसिन कॉम्प्लेक्स 2 का स्तनधारी लक्ष्य सीडी8 टी सेल मेमोरी विभेदन को फ़ॉक्सो{3}}निर्भर तरीके से नियंत्रित करता है। सेल प्रतिनिधि 14, 1206-1217 (2016)।
41. झोउ, एच. और हुआंग, एस. ट्यूमर कोशिका गतिशीलता, आक्रमण और मेटास्टेसिस में एमटीओआर सिग्नलिंग की भूमिका। कर्र. प्रोटीन पेप्ट. विज्ञान. 12, 30-42 (2011)।
42. अर्गुएलो, आरजे एट अल। SCENITH: एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन के साथ ऊर्जा चयापचय को कार्यात्मक रूप से प्रोफ़ाइल करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि। सेल मेटाब. 32, 1063-1075 (2020)।
43. रॉन-हेरेल, एन. एट अल। माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस और प्रोटीओम रीमॉडलिंग टी-सेल सक्रियण के लिए एक-कार्बन चयापचय को बढ़ावा देते हैं। सेल मेटाब. 24, 104-117 (2016)।
44. हान, सी., जीई, एम., हो, पीसी और झांग, एल. फ्यूलिंग टी-सेल एंटीट्यूमर इम्युनिटी: अमीनो एसिड चयापचय पर दोबारा गौर किया गया। कैंसर इम्यूनोल. रेस. 9, 1373-1382 (2021)।
45. काकारडोव, बी. एट अल. एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण द्वारा सीडी 8+ टी कोशिका विभेदन का प्रारंभिक ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक विनियमन प्रकट हुआ। नेट. इम्यूनोल. 18, 422-432 (2017)।
46. वांग, डब्लू. और ज़ू, डब्लू. अमीनो एसिड और टी सेल प्रतिरक्षा और कैंसर थेरेपी में उनके ट्रांसपोर्टर। मोल. सेल 80, 384-395 (2020)।
47. मार्चिंगो, जेएम, सिंक्लेयर, एलवी, हाउडेन, एजे और कैंट्रेल, डीए टी सेल सक्रियण के दौरान माइसी टी सेल प्रोटिओम और चयापचय मार्गों को कैसे नियंत्रित करता है, इसका मात्रात्मक विश्लेषण। ईलाइफ 9, ई53725 (2020)।
48. सुकुमार, एम. एट अल। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता सेलुलर थेरेपी के लिए बढ़ी हुई स्टेमनेस वाली कोशिकाओं की पहचान करती है। सेल मेटाब. 23, 63-76 (2016)।
49. अलीज़ादेह, डी. एट अल। IL15 mTORC1 गतिविधि को कम करके और उनके स्टेम सेल मेमोरी फेनोटाइप को संरक्षित करके CAR-T सेल एंटीट्यूमर गतिविधि को बढ़ाता है। कैंसर इम्यूनोल. रेस. 7, 759-772 (2019)।
50. बक, एमडी एट अल। माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता चयापचय प्रोग्रामिंग के माध्यम से टी सेल भाग्य को नियंत्रित करती है। सेल 166, 63-76 (2016)।
51. कृष्णा, एस. एट अल. स्टेम-जैसी सीडी8 टी कोशिकाएं मानव कैंसर के खिलाफ गोद लेने वाली सेल इम्यूनोथेरेपी की प्रतिक्रिया में मध्यस्थता करती हैं। विज्ञान 370, 1328-1334 (2020)।
52. बर्गर, एमएल एट अल। एंटीजन प्रभुत्व पदानुक्रम ट्यूमर में टीसीएफ 1+ पूर्वज सीडी 8 टी सेल फेनोटाइप को आकार देते हैं। सेल 184, 4996-5014 (2021)।
53. गुओ, वाई. एट अल. आईएल द्वारा अंतिम रूप से समाप्त हो चुकी सीडी 8+ टी कोशिकाओं की मेटाबोलिक रीप्रोग्रामिंग -10 एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को बढ़ाती है। नेट. इम्यूनोल. 22, 746-756 (2021)।
54. क्लेन गेल्टिंक, आरआई एट अल। दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए सीडी 8+ प्रभावकार टी कोशिकाओं की मेटाबोलिक कंडीशनिंग। नेट. मेटाब. 2, 703-716 (2020)।
55. सुजुकी, जे., नेबे, एस., यासुकावा, एम. और यामाशिता, एम. ग्लूटामाइन सीडी8 टी कोशिकाओं की एंटीट्यूमर गतिविधि को नियंत्रित करता है। गण तो कागाकु रयोहो 47, 11-15 (2020)।
56. वोडनाला, एसके एट अल। ट्यूमर में टी सेल स्टेमनेस और डिसफंक्शन एक सामान्य तंत्र द्वारा ट्रिगर होते हैं। विज्ञान 363, eaau0135 (2019)।
57. बोस्टिकार्डो, एम. एट अल। कम बाह्यकोशिकीय pH के कारण मानव टी लिम्फोसाइटों का पक्षपाती सक्रियण B7/CD28 कॉस्टिम्यूलेशन द्वारा विरोधित होता है। ईयूआर। जे. इम्यूनोल. 31, 2829-2838 (2001)।
58. पुचिनो, वी. एट अल। पुरानी सूजन की जगह पर लैक्टेट का निर्माण सीडी4+ टी सेल मेटाबोलिक रीवायरिंग को प्रेरित करके रोग को बढ़ावा देता है। सेल मेटाब. 30, 1055-1074 (2019)।
59. फेंग, क्यू एट अल। लैक्टेट एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को बढ़ाने के लिए सीडी 8+ टी कोशिकाओं की स्टेमनेस को बढ़ाता है। नेट. कम्यून. 13, 4981 (2022)।
60. रॉय, डीजी एट अल। मेथियोनीन चयापचय एपिजेनेटिक रिप्रोग्रामिंग के नियमन के माध्यम से टी हेल्पर सेल प्रतिक्रियाओं को आकार देता है। सेल मेटाब. 31, 250-266 (2020)।
61. झांग, एल. और रोमेरो, पी. सीडी का मेटाबोलिक नियंत्रण 8+ टी सेल भाग्य निर्णय और एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा। रुझान मोल. मेड. 24, 30-48 (2018)।
62. चाम, सीएम, ड्रिसेन्स, जी., ओ'कीफ, जेपी और गजेवस्की, टीएफ ग्लूकोज की कमी सीडी 8+ टी कोशिकाओं में कई प्रमुख जीन अभिव्यक्ति घटनाओं और प्रभावक कार्यों को रोकती है। ईयूआर। जे. इम्यूनोल.38, 2438-2450 (2008)।
63. ओ'सुलिवन, डी. एट अल। मेमोरी सीडी8+ टी कोशिकाएं विकास के लिए आवश्यक चयापचय प्रोग्रामिंग का समर्थन करने के लिए सेल-आंतरिक लिपोलिसिस का उपयोग करती हैं। प्रतिरक्षा 49, 375-376 (2018)।
64. लिन, आर. एट अल. फैटी एसिड ऑक्सीकरण गैस्ट्रिक एडेनोकार्सिनोमा में सीडी 8+ ऊतक-निवासी मेमोरी टी-सेल अस्तित्व को नियंत्रित करता है। कैंसर इम्यूनोल. रेस 8, 479-492 (2020)।
65. राउड, बी. एट अल. नियामक और मेमोरी टी कोशिकाओं पर एटोमॉक्सिर क्रियाएं सीपीटी1ए-मध्यस्थ फैटी एसिड ऑक्सीकरण से स्वतंत्र हैं। सेल मेटाब. 28, 504-515 (2018)।
66. शर्मा, यू. और रैंडो, ओजे एपिजेनोम में मेटाबोलिक इनपुट। सेल मेटाब. 25, 544-558 (2017)।
67. टायराकिस, पीए एट अल। एस-2-हाइड्रॉक्सीग्लूटारेट सीडी8+ टी-लिम्फोसाइट भाग्य को नियंत्रित करता है। प्रकृति 540, 236-241 (2016)।
68. झांग, एच. एट अल. केटोजेनेसिस-जनरेटेड बीटा-हाइड्रॉक्सीब्यूटाइरेट सीडी8+ टी-सेल मेमोरी विकास का एक एपिजेनेटिक नियामक है। नेट. सेल बायोल. 22, 18-25 (2020)।
69. बियान, वाई. एट अल. कैंसर SLC43A2 टी-सेल मेथिओनिन चयापचय और हिस्टोन मिथाइलेशन को बदल देता है। प्रकृति 585, 277-282 (2020)।
70. वॉल, एम. एट अल. रैपामाइसिन द्वारा सी-एमवाईसी का अनुवादात्मक नियंत्रण टर्मिनल माइलॉयड भेदभाव को बढ़ावा देता है। रक्त 112, 2305-2317 (2008)।
71. येरिंडे, सी., सिगमंड, बी., ग्लौबेन, आर. और वीडिंगर, सी. एपिजेनेटिक्स का मेटाबोलिक नियंत्रण और सीडी में इसकी भूमिका 8+ टी सेल भेदभाव और कार्य। सामने। इम्यूनोल. 10, 2718 (2019)।
72. ईल, आर. एट अल. ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर आयनिक प्रतिरक्षा दमन टी सेल प्रभावकारक कार्य को सीमित करता है। प्रकृति 537, 539-543 (2016)।
73. गुओ, ए. एट अल. सीबीएएफ जटिल घटक और एमवाईसी सीडी8+ टी सेल भाग्य में प्रारंभिक सहयोग करते हैं। प्रकृति 607, 135-141 (2022)।
74. रेनोर, जेएल, चैपमैन, एनएम और ची, एच. मेमोरी टी-सेल जेनरेशन और स्टेमनेस का मेटाबोलिक नियंत्रण। कोल्ड स्प्रिंग हार्ब. परिप्रेक्ष्य. बायोल. 13, ए037770 (2021)।
75. काया-ओकुर, एचएस एट अल। छोटे नमूनों और एकल कोशिकाओं की कुशल एपिजेनोमिक प्रोफाइलिंग के लिए कट एंड टैग। नेट. कम्यून. 10, 1930 (2019)।
76. जिन, एच. एट अल. ChIPseqSpikeInFree: स्पाइक-इन के बिना हिस्टोन संशोधनों में वैश्विक परिवर्तनों को प्रकट करने के लिए एक ChIP-seq सामान्यीकरण दृष्टिकोण। जैव सूचना विज्ञान 36, 1270-1272 (2020)।
77. सेलिक, सीए, हैनसेन, आर., स्टीफंस, जीएम, गुडाक्रे, आर. और डिक्सन, ए जे वैश्विक मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए निलंबन-संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं से मेटाबोलाइट निष्कर्षण। नेट. प्रोटोक. 6, 1241-1249 (2011)।
78. ली, सी. एट अल. अमीनो एसिड अपचय GCN2-eIF2 अक्ष के माध्यम से हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल प्रोटियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है। सेल स्टेम सेल 29, 1119-1134 (2022)।
79. वेन्स, एम. एट अल। माइटोकॉन्ड्रियल पाइरूवेट वाहक मेमोरी टी-सेल भेदभाव और एंटीट्यूमर फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है। सेल मेटाब. 34, 731-746 (2022)।
