सीरम अमाइलॉइड पी डिपोजिशन नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी की एक संवेदनशील और विशिष्ट विशेषता है

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क्रिस्टोफर पी. लार्सन1, श्री जी. शर्मा1, टिफ़नी एन. काज़ा1, डेनियल जे. केनन1, आरोन जे.स्टोरी2, रिकी डी. एडमंडसन2, क्रिश्चियन हर्ज़ोग2, और जॉन एम. आर्थर2

कीवर्ड:ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस; नकाबपोश जमा; जन स्पेक्ट्रोमेट्री; झिल्लीदार-जैसे ग्लोमेरुलोपैथी; उपउपकला निक्षेप

सिस्टैंच किडनी के कार्य में सुधार कर सकता है

नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा (एमजीएमआईडी) के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी अद्वितीय हिस्टोपैथोलॉजी के साथ ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस का हाल ही में वर्णित पैटर्न है। पैटर्न को सबपीथेलियल और / या मेसेंजियल द्वारा विशेषता हैप्रतिरक्षाजमा जो नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा इम्युनोग्लोबुलिन धुंधला करने के लिए "नकाबपोश" हैं, लेकिन प्रोटीज पाचन के बाद आईजीजी और कप्पा प्रकाश श्रृंखला के लिए दृढ़ता से दाग हैं। ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के इस पैटर्न वाले मरीजों में प्रोटीनूरिया के साथ पेश होने वाली सबसे अधिक युवा महिलाएं होती हैं और ऑटोम्यून्यून बीमारी का अस्पष्ट इतिहास जैसे कम टिटर एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडीज होता है। यहां हमने नौ एमजीएमआईडी गुर्दे की बायोप्सी से लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली के मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइल की तुलना आठ बायोप्सी के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के अन्य पैटर्न दिखाते हुए की। MGMID में सबसे महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा हुआ प्रोटीन सीरम अमाइलॉइड P था। इम्यूनोस्टेनिंग ने सीरम अमाइलॉइड P को MGMID के ग्लोमेरुली में IgG के साथ कोलोकलाइज़ किया, लेकिन PLA2R से जुड़े झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के साथ नहीं। सीरम अमाइलॉइड पी सभी 32 एमजीएमआईडी बायोप्सी के ग्लोमेरुली में सकारात्मक था, लेकिन अन्य प्रकार के झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथियों जैसे कि पीएलए2आर और टीएचएसडी7ए से जुड़ी बायोप्सी में नकारात्मक था। 173 बायोप्सी में ग्लोमेरुलर सीरम एमाइलॉयड पी धुंधला के साथ चार बायोप्सी थीं जो एमजीएमआईडी या एमाइलॉयडोसिस के मानदंडों को पूरा नहीं करती थीं। सकारात्मक सीरम अमाइलॉइड पी धुंधला के साथ इन चारों बायोप्सी में आईजीजी कप्पा जमा के साथ ग्लोमेरुलोपैथी का एक झिल्लीदार पैटर्न था जो केवल "मास्किंग" की कमी से एमजीएमआईडी से भिन्न था। इस प्रकार, सीरम अमाइलॉइड के लिए ग्लोमेरुलर जमा के भीतर सकारात्मक धुंधलापन ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के एक अद्वितीय रूप की पहचान करता है जो रोग के एक सामान्य पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र को साझा करता है।

नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा (एमजीएमआईडी) के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी 2014 में वर्णित ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस का एक हिस्टोपैथोलॉजिक पैटर्न है, जिसे नकाबपोश ग्लोमेरुलर जमा कहा जाता है, का पहला विवरण था। इस रोग की विशेषता हिस्टोपैथोलॉजी में मेसेंजियल और सबपीथेलियल की उपस्थिति शामिल है। आईजीजी कप्पा प्रतिबंध के साथ जमा। उत्सुकता से, हालांकि पूरक घटक 3 (सी 3) धुंधला अक्सर जमे हुए ऊतक पर नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा स्पष्ट होता है, आईजी धुंधला अक्सर मास्क होता है, जिसका अर्थ है कि यह नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गलत नकारात्मक धुंधला दिखाता है लेकिन प्रोटीज पाचन के बाद पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक पर दोहराया जाने पर सकारात्मक धुंधला हो जाता है। इस प्रकार, जब तक पैथोलॉजिस्ट इस इकाई के लिए संदेह का एक उच्च सूचकांक बनाए रखता है, इसे C3 ग्लोमेरुलोपैथी के रूप में गलत निदान किया जा सकता है। ग्लोमेरुलर जमा में इस मास्किंग घटना को दिखाने के लिए वर्णित अन्य संस्थाओं में मेम्ब्रेनोप्रोलिफेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस शामिल हैं जिसमें नकाबपोश मोनोटाइपिक आईजी जमा और क्रायोग्लोबुलिनमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस शामिल हैं। 2,3

बायोप्सी पर एमजीएमआईडी पाए गए मरीजों में आमतौर पर युवा महिलाएं होती हैं<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 प्रतिशत) सीरम प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन द्वारा मोनोक्लोनल Igs के लिए नकारात्मक थे, और अंतर्निहित हेमटोलोगिक दुर्दमता के साथ कोई भी मामला नहीं देखा गया है।4

यह अनुमान लगाया गया था कि एमजीएमआईडी रोगियों के बीच साझा क्लिनिकोपैथोलॉजिक निष्कर्ष उनकी बीमारी को चलाने वाले एक सामान्य आणविक पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र का संकेत हो सकता है। इस इकाई को पहली बार रिपोर्ट करने का हमारा इरादा आगे के विश्लेषण के लिए एक समूह को परिभाषित करना था। 1 हम यहां प्रोटीन सीरम एमिलॉयड पी घटक (एसएपी) की उपस्थिति का वर्णन करते हैं जो एमजीएमआईडी ग्लोमेरुली की जमा राशि में विशिष्ट रूप से पाए जाते हैं। ग्लोमेरुलर जमा में एसएपी के लिए इम्यूनोस्टेनिंग एमजीएमआईडी के निदान के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट तकनीक है जो रोगजनक अंतर्दृष्टि भी प्रदान करती है।

चित्र 1|सीरम अमाइलॉइड पी-कंपोनेंट (एसएपी) झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी वाले रोगियों के माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली में नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध है। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए मैक्सक्वांट (मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ बायोकैमिस्ट्री, प्लेनेग, जर्मनी) से सामान्यीकृत तीव्रता-आधारित निरपेक्ष परिमाणीकरण मूल्यों का उपयोग किया गया था। धराशायी लाइनें गुना परिवर्तन और पी-मान के लिए अनुमानी कटऑफ दर्शाती हैं। (ए) एक ज्वालामुखी प्लॉट 3 फॉस्फोलिपेज़ ए 2 रिसेप्टर (पीएलए 2 आर) की तुलना करता है - अन्य के साथ सकारात्मक झिल्लीदार मामलों में 2 प्रोटीन की पहचान होती है जो शीर्ष दाएं चतुर्थांश में स्पष्ट आउटलेयर होते हैं। (बी) ज्वालामुखी प्लॉट 2 थ्रोम्बोस्पोंडिन प्रकार 1 डोमेन-युक्त 7ए (टीएचएसडी7ए) की तुलना करता है - दूसरों के साथ सकारात्मक झिल्लीदार मामले 2 प्रोटीनों की पहचान करते हैं जो टीएचएसडी7ए के साथ स्पष्ट आउटलेयर हैं जो सबसे बड़ा गुना परिवर्तन दिखाते हैं। (सी) अन्य सभी प्रकार के झिल्लीदार मामलों के साथ नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार-जैसे ग्लोमेरुलोपैथी के नमूनों की तुलना करने वाला एक ज्वालामुखी भूखंड 6 प्रोटीन की पहचान करता है जो शीर्ष दाएं चतुर्थांश में स्पष्ट आउटलेयर हैं। सी 6, पूरक घटक 6; सी 7, पूरक घटक 7; CFHR1, पूरक कारक-H-संबंधित प्रोटीन 1; HP1BP3, हेटरोक्रोमैटिन प्रोटीन 1 बाध्यकारी प्रोटीन 3; HPRT1, हाइपोक्सैन्थिन फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज़ 1; IGHG3, Ig भारी स्थिर गामा 3.

परिणाम

लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली का मास स्पेक्ट्रोमेट्री

एमजीएमआईडी के 9 मामलों से लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की तुलना झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी (एमजी) के 8 मामलों के साथ की गई थी, जिसमें फॉस्फोलिपेज़ ए 2 रिसेप्टर (पीएलए 2 आर) -पॉजिटिव एमजी के 3 मामले, थ्रोम्बोस्पोन्डिन टाइप 1 डोमेन युक्त 7 ए के 2 मामले शामिल हैं। THSD7A) -पॉजिटिव एमजी, और ल्यूपस एमजी के 3 मामले। इस विश्लेषण में कुल 1695 प्रोटीनों की पहचान की गई। मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एमजी के रोग रोगजनन में शामिल प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है या नहीं, इसका परीक्षण करने के लिए एक प्रूफ-ऑफ-थ्योरी विश्लेषण आयोजित किया गया था। प्रत्येक ज्ञात झिल्लीदार प्रकार के लिए, सामान्यीकृत तीव्रता-आधारित निरपेक्ष परिमाणीकरण (iBAQ) मानों का उपयोग करके शेष समूहों के विरुद्ध प्रोटीन अंतर बहुतायत की तुलना की गई थी। वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था, और परिणाम एक ज्वालामुखी भूखंड पर देखे गए थे। PLA2R से जुड़े MG के मामलों में PLA2R काफी अधिक प्रचुर मात्रा में था और सबसे मजबूत गुना परिवर्तन (चित्र 1a) दिखाया। THSD7A ने THSD7A से जुड़े MG में सबसे मजबूत गुना परिवर्तन प्रदर्शित किए, हालांकि इस समूह में कम नमूना आकार (n 2; चित्र 1b) के कारण बड़े P -value के साथ। कुल मिलाकर, इस प्रूफ-ऑफ-थ्योरी विश्लेषण दानव ने कहा कि लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली का मास स्पेक्ट्रोमेट्री झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी में रोग के रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की पहचान कर सकता है।

हमने आगे इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए MGMID रोगजनन में संभावित रूप से शामिल प्रोटीन की पहचान करने की मांग की। अन्य समूहों (तालिका 1) के सापेक्ष MGMID नमूनों में कुल 6 समर्थक अधिक प्रचुर मात्रा में थे। उच्चतम गुना परिवर्तन वाला प्रोटीन SAP (चित्र 1c) था। शेष प्रोटीन में IgG कप्पा, 3 पूरक प्रोटीन और हेटरोक्रोमैटिन प्रोटीन 1-बाध्यकारी प्रोटीन 3 (HP1BP3) शामिल थे। SAP को शीर्ष उम्मीदवार माना गया क्योंकि यह सभी MGMID नमूनों में पाया गया था और गैर-MGMID नमूनों के सापेक्ष बहुतायत में सबसे बड़ा अंतर दिखाया गया था। आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के मामलों से लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने गए सभी आईजीएस को पूरक तालिका एस 1 में दिखाया गया है। सभी प्रोटीनों के नमूने द्वारा वर्णक्रमीय गणनाएं जो MGMID नमूनों में $1 log2 बढ़ी हुई बहुतायत दिखाती हैं और एक P -value #0.1 को अनुपूरक तालिका S2 में दिखाया गया है।

सिस्टांचेबेहतर हो सकता हैगुर्दासमारोह

झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के मामलों में एसएपी धुंधला हो जाना

एसएपी प्रोटीन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए) के खिलाफ एक पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी ने एमजीएमआईडी के मामलों के ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन के साथ मजबूत सकारात्मक धुंधलापन दिखाया जो कि आईजीजी के साथ मुखर विश्लेषण द्वारा कोलोकलाइज़ किया गया था। SAP ने PLA2R से जुड़े MG (चित्र 2) से ग्लोमेरुली में IgG के साथ सहस्थानीयकरण नहीं दिखाया। HP1BP3 के खिलाफ एक पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी का एमजीएमआईडी के साथ 4 बायोप्सी में परीक्षण किया गया था और सभी 4 मामलों के ग्लोमेरुलर जमा में नकारात्मक धुंधलापन दिखाया गया था।

SAP धुंधलापन कुल 211 . पर किया गया थागुर्दाबायोप्सीग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस (तालिका 2) के साथ। एसएपी के लिए प्रतिरक्षा-प्रकार की जमा राशि वाले कुल 36 मामले सकारात्मक हैं। सकारात्मक दाग वाले सभी मामलों में आईजीजी कप्पा प्रतिबंध के साथ मेसेंजियल और सबपीथेलियल जमा की उपस्थिति और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोई एंडोकेपिलरी या मेम्ब्रानोप्रोलिफेरेटिव परिवर्तन सहित कुछ हिस्टोपैथोलॉजिक विशेषताएं साझा की गईं। एसएपी सभी मामलों में नकारात्मक था, नकाबपोश जमा के साथ जो एमजीएमआईडी नहीं थे, जिसमें क्रायोग्लोबुलिनमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के 3 मामले और नकाबपोश मेम्ब्रेनोप्रोलिफेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के 3 मामले शामिल थे। यह मोनोक्लोनल आईजी जमा (पीजीएनएमआईडी) के साथ प्रोलिफेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के सभी 19 मामलों में भी नकारात्मक था, जिसमें आईजीजी 1 कप्पा (4 मामले), आईजीजी 2 लैम्ब्डा (1 मामला), आईजीजी 3 कप्पा (8 मामले), और आईजीजी 3 लैम्ब्डा (6 मामले) शामिल हैं। ) पॉलीक्लोनल मेम्ब्रेनस ग्लोमेरुलोपैथी (PLA2R, THSD7A, ल्यूपस और सेग्मल) के सभी 30 मामले SAP के लिए नकारात्मक थे। ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के अतिरिक्त रूपों का भी अध्ययन किया गया और वे नकारात्मक थे। संक्रमण से जुड़े ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में, आईजीजी धुंधला होने के लिए 7 सकारात्मक थे और 6 में सबपीथेलियल कूबड़ जमा होने के प्रमाण थे। जैसा कि अपेक्षित था, अमाइलॉइडोसिस के सभी 6 मामलों में अमाइलॉइड जमा में सकारात्मक धुंधलापन दिखा। हालांकि, बयान का धुंधला पैटर्न एमजीएमआईडी के मामलों में मौजूद दानेदार धुंधलापन के विपरीत था। विभिन्न गुर्दे की बीमारियों की एक किस्म से एसएपी दाग ​​पर ग्लोमेरुली के प्रतिनिधि फोटोमिकोग्राफ को पूरक चित्रा एस 1 में दिखाया गया है।

एमजीएमआईडी के रूप में पहले पहचाने गए सभी 32 मामले एसएपी के लिए सकारात्मक थे। इसके अलावा, मोनोटाइपिक आईजीजी बयान के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के 25 में से 4 मामलों में ग्लोमेरुली में एसएपी के लिए सकारात्मक धुंधलापन था जो नियमित रूप से मुखौटा नहीं था

इम्यूनोफ्लोरेसेंस, जिसमें IgG1 कप्पा के साथ 13 में से 4 मामले, IgG1 लैम्ब्डा के साथ 2 मामलों में से 0, IgG2 कप्पा के साथ 5 मामलों में से 0, IgG3 कप्पा के साथ 4 मामलों में से 0, और {{ 12}} आईजीजी4 कप्पा के साथ 1 मामले में। कुल मिलाकर, एसएपी-पॉजिटिव ग्लोमेरुलोपैथी के 36 (89 प्रतिशत) में से 32 नकाबपोश थे और एमजीएमआईडी श्रेणी में फिट थे, जबकि 36 में से अन्य 4 (11 प्रतिशत) बेनकाब थे और आईजीजी 1 कप्पा जमा के साथ एमजी के रूप में निदान किया गया था। मोनोटाइपिक मेम्ब्रेनस ग्लोमेरुलोपैथी वाले मरीज़ जो मास्क नहीं लगाते थे, लेकिन SAP के लिए सकारात्मक थे, उनकी औसत आयु 33 वर्ष थी, जिसमें महिला-से-पुरुष अनुपात 4:0 था। मोनोटाइपिक झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी वाले मामले जो मुखौटा नहीं थे लेकिन एसएपी के लिए नकारात्मक थे, उनकी औसत आयु 59.3 वर्ष थी, जिसमें महिला-से-पुरुष अनुपात 15:4 था।

तालिका 1|रोगियों के ग्लोमेरुली में प्रोटीन महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा हैझिल्लीदार-जैसे ग्लोमेरुलोपैथीनकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ, जैसा कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा दिखाया गया है

SAP के लिए सीरम प्रतिक्रियाशीलता

MGMID के 22 रोगियों में से सेरा, PLA2R पॉजिटिव मेम्ब्रेनस ग्लोमेरुलोपैथी के साथ 12, और एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) द्वारा SAP के लिए IgG प्रतिक्रियाशीलता के लिए 6 सामान्य नियंत्रणों का परीक्षण किया गया। यद्यपि प्रत्येक समूह में रोगियों के बीच कुछ परिवर्तनशीलता मौजूद थी, लेकिन समूहों के बीच SAP के प्रति IgG प्रतिक्रियाशीलता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (पूरक चित्रा S2)।

चित्र 2|आईजीजी और सीरम अमाइलॉइड पी-घटक (एसएपी) का कोलोकलाइज़ेशन। (ए-सी) नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के निदान वाले रोगी से गुर्दे की बायोप्सी नमूने पर किए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग (ए) एसएपी और (बी) आईजीजी के लिए दानेदार ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली धुंधला दिखाते हैं। (सी) ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली जमा में एसएपी और आईजीजी का मजबूत कोलोकलाइज़ेशन है। (डी-एफ) इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों ने 3 फॉस्फोलिपेस ए 2 रिसेप्टर-पॉजिटिव मेम्ब्रेनस ग्लोमेरुलोपैथिस वाले एक मरीज से गुर्दे की बायोप्सी नमूने पर प्रदर्शन किया (डी) एसएपी के लिए नकारात्मक ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन स्टेनिंग और (ई) आईजीजी के लिए पॉजिटिव ग्रेन्युलर ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन स्टेनिंग। (च) इस रोगी में 3 फ़ॉस्फ़ोलिपेज़ ए 2 रिसेप्टर से जुड़े झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथियों के साथ कोलोकलाइज़ेशन की कमी है। इस छवि को देखने का अनुकूलन करने के लिए, कृपया इस लेख का ऑनलाइन संस्करण तालिका 2 में देखें|गुर्दे की बायोप्सी में सीरम अमाइलॉइड पी घटक (एसएपी) धुंधला होने के परिणाम

एए, अमाइलॉइड ए; एएल, अमाइलॉइड प्रकाश श्रृंखला; सी 3, पूरक घटक 3; जीबीएम, ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन; एमजी, झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी; एमजीएमआईडी, नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी; एमपीजीएन, मेम्ब्रेनोप्रोलिफेरेटिव; ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस; पीजीएमएनआईडी, मोनोक्लोनल आईजीजी कप्पा जमा के साथ प्रोलिफेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस; PLA2R, फॉस्फोलिपेज़ A2 रिसेप्टर; THSD7A, थ्रोम्बोस्पोंडिन टाइप 1 डोमेन-युक्त 7A।

बहस

एमजीएमआईडी ग्लोमेरुलोपैथी का हाल ही में वर्णित और अनूठा पैटर्न है, जो कि सबपीथेलियल और मेसेंजियल जमा द्वारा विशेषता है जो पैराफिन आईएफ (चित्रा 3) द्वारा आईजीजी कप्पा के लिए दाग है। ग्लोमेरुलोपैथी के इस पैटर्न वाले मरीजों में युवा महिलाएं होती हैं (उम्र<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

एसएपी एक 25-केडीए पेंटामेरिक प्रोटीन है जो पेंट्राक्सिन परिवार के भीतर है जो एपीसीएस जीन द्वारा एन्कोडेड है और सीरम में प्रचुर मात्रा में है और ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली के एक घटक के रूप में है। हालांकि एसएपी का सटीक कार्य स्पष्ट नहीं है, यह ज्ञात है पूरक घटकों, एपोलिपोप्रोटीन, और जमावट और प्रोटियोलिसिस के नियामकों सहित विभिन्न प्रकार के प्रोटीन के साथ प्लाज्मा में बातचीत करने के लिए। यह प्रोटीन, लिपोप्रोटीन और डीएनए सहित अपने लिगैंड के साथ स्थिर कैल्शियम-निर्भर इंटरैक्शन बनाता है, उन्हें गिरावट से बचाता है। SAP एक घुलनशील पैटर्न-पहचान अणु के रूप में कार्य करता है जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल होता है, जो विभिन्न प्रकार के रोगज़नक़ों को पहचानता है- और क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न, जिसमें माइक्रोबियल घटक और एपोप्टोटिक सेल मलबे शामिल हैं। 7 रोगज़नक़- या क्षति से जुड़े आणविक के साथ SAP की बातचीत पैटर्न घटक 1q (C1q) के पूरक और शास्त्रीय पूरक मार्ग के सक्रियण के लिए प्रत्यक्ष बंधन द्वारा एपोप्टोटिक सेल मलबे के पूरक-मध्यस्थता निकासी को बढ़ावा देता है। पूरक सक्रियण के बावजूद, एसएपी को इम्युनोरेग्यूलेशन प्रदान करने के लिए जाना जाता है, न्यूट्रोफिलिक को कम करता हैसूजन और जलनकम एंडोथेलियल आसंजन के माध्यम से ऊतकों के भीतर, 8 कम इलास्टेज फ़ंक्शन, 9 और ऊतकों के लिए कम होमिंग। एसएपी को प्लाज्मा के भीतर डीएनए और क्रोमैटिन के लिए प्रमुख बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में भी जाना जाता है।

रोग में, SAP को अमाइलॉइडोसिस के जमाव का एक हिस्सा होने के लिए जाना जाता है। हालांकि कम अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, इस बात के भी सबूत हैं कि यह ऑटोइम्यून बीमारी के मानव और पशु मॉडल में भूमिका निभा सकता है। SAP एंटीबॉडी की पहचान रोगियों में की गई हैस्व-प्रतिरक्षितबीमारी, और घटी हुई SAP अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया हैस्वरोगक्षमतामरीन मॉडल में। एसएपी के खिलाफ एंटीबॉडी की पहचान सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस के 44 प्रतिशत रोगियों में की जाती है, जिसमें एंटीबॉडी टाइटर्स रोग गतिविधि से संबंधित होते हैं। 12 एसएपी की कमी ऑटोइम्यून-प्रवण C57BL / 6 चूहों और गैर-ऑटोइम्यून में सहज ऑटोइम्यूनिटी के विकास के परिणामस्वरूप पाई गई थी। प्रोन 129/एसवी चूहों को जब C57BL/6 चूहों (129/Sv x C57BL/6 F2)13 के साथ पार किया जाता है, लेकिन अकेले 129/Sv स्ट्रेन में नहीं, यह सुझाव देता है कि ऑटोइम्यूनिटी को प्रेरित करने के लिए SAP की कमी के लिए अंतर्निहित आनुवंशिक संवेदनशीलता की आवश्यकता हो सकती है।14 चूहे एंटीन्यूक्लियर एंटीबॉडी, एंटी-सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए, एंटी-डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए एंटीबॉडी और रुमेटीड कारकों का उत्पादन दिखाते हैं। वे एक प्रोलिफ़ेरेटिव विकसित करते हैंप्रतिरक्षाजटिल-मध्यस्थ ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस, अधिक बार महिलाओं में। 13 ल्यूपस नेफ्रैटिस के एक murine मॉडल में जहां ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस सीरम में सक्रिय स्व-डीएनए के इंजेक्शन से प्रेरित होता है, एक प्लास्मिड वेक्टर द्वारा एसएपी जीन थेरेपी ने डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए एंटीबॉडी के उत्पादन को कम कर दिया। , प्रतिरक्षा जटिल जमाव, और गुर्दे की सूजन, और ल्यूपस नेफ्रैटिस की शुरुआत को रोका।15

चित्र 3|नकाबपोश आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी में गुर्दे की बायोप्सी का पता लगाना। चित्र 2 में दिखाए गए बायोप्सी से फोटोमाइक्रोग्राफ यहां दिखाए गए हैं। (ए) सेगमेंटल स्पाइक्स ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन के साथ मौजूद हैं, जोन्स मिथेनमाइन सिल्वर स्टेन (मूल आवर्धन × 400) द्वारा। (बी) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली (मूल आवर्धन × 12, 000) के साथ मौजूद उप-उपकला जमा को प्रकट करता है। (सी) ताजा ऊतक (प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस; मूल आवर्धन × 400) पर नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा आईजीजी के लिए ग्लोमेरुली दाग ​​नकारात्मक। (डी) प्रोटीज पाचन (प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस; मूल आवर्धन × 400) के बाद पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक पर एक ही मामले से ग्लोमेरुली सकारात्मक दाग। (ई) ग्लोमेरुली कप्पा के लिए धुंधला दिखाई देता है और (एफ) प्रोटीज-पचाने वाले पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक (प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस; मूल आवर्धन × 400) पर लैम्ब्डा नहीं। इस छवि को देखने का अनुकूलन करने के लिए, कृपया इस लेख का ऑनलाइन संस्करण www.गुर्दा-international.org।

बायोप्सी पर देखे जाने वाले प्रकाश श्रृंखला-प्रतिबंध के बावजूद, वर्तमान में इस इकाई के अंतर्निहित लिम्फोप्रोलिफेरेटिव विकारों या परिसंचारी मोनोक्लोनल Igs.4 से जुड़े होने का कोई सबूत नहीं है, इस प्रकार, MGMID को गुर्दे के महत्व के मोनोक्लोनल गैमोपैथी के स्पेक्ट्रम के भीतर नहीं माना जाना चाहिए। समय। SAP स्वप्रतिपिंडों की भूमिका भी अनिश्चित है। झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के अन्य रूपों के विपरीत, जिसमें प्रोटीन विशेष रूप से प्रतिरक्षा जमा में मौजूद होता है, जैसे कि PLA2R से जुड़ी बीमारी, 16 MGMID SAP के खिलाफ निर्देशित ऑटोएंटीबॉडी द्वारा संचालित नहीं प्रतीत होता है, क्योंकि हम MGMID रोगियों में SAP के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशीलता का पता लगाने में विफल रहे हैं। . एक वैकल्पिक व्याख्या यह है कि आईजीजी कप्पा एक ऑटोइम्यून एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन के बजाय इन 2 प्रोटीनों के बीच सामान्य बातचीत के परिणामस्वरूप मौजूद है, क्योंकि आईजी कप्पा श्रृंखला सीरम एसएपी के सामान्य अंतःक्रिया का एक हिस्सा माना जाता है। इसलिए, हालांकि इस इकाई के ऊतक निदान के लिए उपयोगी, सीरम में एसएपी एंटीबॉडी के लिए परीक्षण इस समय एक गैर-निदान निदान के रूप में काम नहीं करता है, और इस बीमारी का अंतर्निहित चालक एक रहस्य बना हुआ है।

MGMID में नैदानिक ​​​​परिणाम अत्यंत परिवर्तनशील होते हैं, जिनमें स्वतःस्फूर्त छूट से लेकर प्रगति से लेकर अंतिम चरण तक शामिल हैंगुर्दाबीमारीप्रत्यारोपण में पुनरावृत्ति के साथ। पूर्वव्यापी विश्लेषण उपयोग किए गए उपचार और नैदानिक ​​​​परिणामों के बीच किसी भी संबंध को दिखाने में विफल रहा है। इस बीमारी में एसएपी की भागीदारी की खोज संभावित रूप से चिकित्सा के लिए निहितार्थ है। एसएपी को सीधे लक्षित करने वाले उपचारों ने अमाइलॉइडोसिस के उपचार में प्रारंभिक वादा दिखाया है। 17,18 इसके अतिरिक्त, मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणाम इंगित करते हैं कि पूरक कैस्केड को लक्षित करने वाली चिकित्सा ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के इस रूप के उपचार में उपयोगी हो सकती है, यह देखते हुए कि अधिकांश प्रोटीन जो बढ़े हुए थे MGMID में ग्लोमेरुली पूरक संबंधित हैं। इस बीमारी के साथ-साथ उपचारों के लिए गतिविधि के बायोमार्कर की पहचान करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है।

नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस पर एमजीएमआईडी बायोप्सी में प्रतिरक्षा जमा के मास्किंग का कारण एक रहस्य बना हुआ है। जमा में एसएपी की उपस्थिति एमजीएमआईडी के मामलों में इस घटना के लिए नए संभावित स्पष्टीकरण देती है। उदाहरण के लिए, SAP प्रोटीन की परस्पर क्रिया को Ca2þ-निर्भर, 6 के रूप में जाना जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए वृक्क बायोप्सी ऊतक के प्रसंस्करण में उपयोग किए जाने वाले कई परिवहन मीडिया और बफ़र्स Ca2þ से रहित हैं। Ca2þ की इन विट्रो अनुपस्थिति में प्रतिरक्षा जमा में व्यवधान हो सकता है ताकि वे जमे हुए ऊतक पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पता लगाने के लिए उपलब्ध न हों। हालांकि, ऊतक में प्रोटीन के बीच फॉर्मेलिन-प्रेरित सहसंयोजक रासायनिक बंधनों के परिणामस्वरूप, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतक में पता लगाने के लिए प्रतिरक्षा जटिल जमा उपलब्ध रहेगा।

हम यहां पहली बार एमजीएमआईडी के ग्लोमेरुलर निक्षेपों में एसएपी की अद्वितीय उपस्थिति का वर्णन कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, हम दिखाते हैं कि धुंधला हो जानागुर्दाबायोप्सीएसएपी के लिए नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा, बिना मास्किंग के, एमजीएमआईडी के समान क्लिनिकोपैथोलॉजिक विशेषताओं वाले मामलों की पहचान करता है। इन परिणामों को देखते हुए, हम मानते हैं कि एसएपी के लिए ग्लोमेरुलर जमा के भीतर सकारात्मक धुंधलापन ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के एक अद्वितीय रूप की पहचान करता है जो रोग के एक सामान्य पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र को साझा करता है। MGMID के हालिया विवरण तक, इन मामलों का निदान C3 ग्लोमेरुलोपैथी से लेकर संक्रमण से जुड़े ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस से लेकर एटिपिकल मेम्ब्रेनस ग्लोमेरुलोपैथी तक कई अलग-अलग श्रेणियों में किया गया था। नैदानिक ​​​​मानदंडों का तेजी से विकास और ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के इस रूप के बारे में हमारी समझ द्रव्यमान की शक्ति को उजागर करती है। प्रतिरक्षा-मध्यस्थ ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में पैथोफिजियोलॉजिकल अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए स्पेक्ट्रोमेट्री।

विधि

गुर्दे की बायोप्सी प्रसंस्करण तकनीक

मानक वृक्क बायोप्सी प्रसंस्करण तकनीकों का उपयोग किया गया था, जिसमें प्रकाश, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल थे। 19,20 सभी प्रकाश माइक्रोस्कोपी नमूनों को हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन, जोन्स मिथेनमाइन सिल्वर, मैसन ट्राइक्रोम और आवधिक एसिड-शिफ अभिकर्मक के साथ दाग दिया गया था। सभी प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस वर्गों को 4 मिमी में काट दिया गया था और आईजीजी, आईजीए, आईजीएम, सी 3, सी 1 क्यू, फाइब्रिनोजेन, और के- और एल-लाइट चेन (डको, कारपेंटेरिया, सीए) के लिए फ्लुफ्लोरेसिन-टैग किए गए पॉलीक्लोनल खरगोश विरोधी मानव एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया की गई थी। 1 घंटे के लिए, और धोया; जलीय बढ़ते मीडिया का उपयोग करके एक कवरस्लिप लागू किया गया था। IgG1, IgG2, IgG3, और IgG4 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO) के लिए फ्लुफ्लोरेसिन-टैग किए गए पॉलीक्लोनल माउस मानव-विरोधी एंटीबॉडी के लिए चुनिंदा मामलों को दाग दिया गया था। पैराफिन इम्यूनोफ्लोरेसेंस को पहले वर्णित के रूप में प्रोटीज पाचन के बाद किया गया था। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए कुल 9 एमजीएमआईडी बायोप्सी और अन्य प्रकार के झिल्लीदार ग्लोमेरुलोपैथी के साथ 8 तुलना नियंत्रण बायोप्सी का चयन किया गया था। अध्ययन प्रोटोकॉल समाधान संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी सिद्धांतों की घोषणा के अनुरूप था।

सिस्टांचे कैनटोनिफाइगुर्दा

लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली का मास स्पेक्ट्रोमेट्री

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक से गुर्दे की बायोप्सी ऊतक को लीका पीईटी-झिल्ली फ्रेम स्लाइड्स (लीका, वेट्ज़लर, जर्मनी) पर 1 0 मिमी की मोटाई में काटा गया था। इन स्लाइड्स को तब हेमटॉक्सिलिन से दाग दिया गया था। ग्लोमेरुली को लीका डीएम60{{20}}0बी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सूक्ष्म रूप से विभाजित किया गया था। माइक्रोडिसेक्टेड ग्लोमेरुली को 2 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट और 0.1 एम डाइथियोथेरिटोल में 1 घंटे के लिए 99 डिग्री पर लाइस किया गया था और फिल्टर-असिस्टेड सैंपल तैयारी (एफएएसपी) द्वारा संसाधित किया गया था। 21 स्पष्ट लाइसेट को विवाकॉन 500 सांद्रता (30 केडीए के एमडब्ल्यूसीओ; सार्टोरियस) पर स्थानांतरित किया गया था। , गोटिंगेन, जर्मनी)। सोडियम डोडेसिल सल्फेट को 0.1 एम ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमेथाइल) -एमिनोमेथेन / सीएल, पीएच 8.5 में 8 एम यूरिया के साथ बार-बार धोने से हटा दिया गया था; नमूनों को तब 0.05 M आयोडोएसेटामाइड के साथ क्षारित किया गया था। आयोडोएसेटामाइड को 8 एम यूरिया/0.1 एम ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमेथाइल) - एमिनोमेथेन/सीएल, पीएच 8.5 के साथ 3 वॉश द्वारा हटा दिया गया, इसके बाद 0.05 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट के साथ 3 वॉश किए गए। प्रोटीन को ट्रिप्सिन (अनुक्रमण ग्रेड, क्रोमेगा, मैडिसन, WI) के साथ 40: 1 w / w अनुपात में 37 डिग्री पर 16 घंटे के लिए पचाया गया। पेप्टाइड्स को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया और सी 18- स्टेज टिप्स (थर्मो साइंटिफिक, वॉलथम, एमए) पर उतारा गया।

डाइजेस्ट किए गए पेप्टाइड्स का विश्लेषण नैनोएलसी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा थर्मो ऑर्बिट्रैप फ्यूजन लुमोस मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो साइंटिफिक) का उपयोग करके किया गया था। पेप्टाइड्स को एक रिवर्स फेज़ ट्रैप कॉलम (इंटेग्रा-फ्रिट, न्यू ऑब्जेक्टिव, वोबर्न, एमए) पर लोड किया गया था जिसमें 2.5 मिमी वाटर्स एक्ससेलेक्ट (वाटर्स कॉर्प, मिलफोर्ड, एमए) चार्ज सतह हाइब्रिड राल 15 0 मिमी से जुड़ा हुआ था। X 0.075 मिमी विश्लेषणात्मक स्तंभ जिसमें ट्रैप में उपयोग किए गए समान रिवर्स चरण राल होता है। एक नैनोएक्विटी अल्ट्रापरफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (वाटर्स कॉर्प) का उपयोग तब 60-मिनट ग्रेडिएंट 98:2 से 60:40 बफर ए: बी अनुपात (बफर ए ¼ 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड) उत्पन्न करने के लिए किया गया था। , 0.5 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल; बफर बी 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड, 99.9 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल)।

पेप्टाइड्स को एक एकीकृत स्प्रे टिप (पिकोफ्रिट, न्यू ऑब्जेक्टिव) के साथ कॉलम से अलग किया गया था और इलेक्ट्रोस्प्रे (2. 0 केवी) द्वारा आयनित किया गया था, इसके बाद उच्च ऊर्जा टक्कर-प्रेरित पृथक्करण (एचसीडी) का उपयोग करके टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण किया गया था। पेप्टाइड अग्रदूतों का सर्वेक्षण स्कैन 240K रिज़ॉल्यूशन (400 मीटर/जेड पर) पर 5 × 10 आयन गिनती लक्ष्य के साथ किया गया था। अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1.6 Th पर चौगुनी, HCD विखंडन 30 की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा के साथ, और आयन ट्रैप में रैपिड स्कैन मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ अलगाव द्वारा किया गया था। प्राप्त अग्रानुक्रम द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा को सबसे हाल के यूनिप्रोट मानव डेटाबेस के खिलाफ खोजा गया था जिसमें स्विस प्रोट और TREMBLE दोनों प्रविष्टियों का उपयोग किया गया था

मैक्सक्वांट (मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ बायोकैमिस्ट्री, प्लेनेग, जर्मनी)। स्कैफोल्ड v4.6 (प्रोटिओम सॉफ्टवेयर, पोर्टलैंड, OR) का उपयोग करके डेटा का विज़ुअलाइज़ेशन किया गया था। पेप्टाइड-टू-स्पेक्ट्रम मैचों के लिए झूठी खोज दर 1 प्रतिशत निर्धारित की गई थी। MaxQuant से सामान्यीकृत iBAQ मान परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए गए थे। लोडिंग में अंतर को नियंत्रित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए iBAQ वितरण माध्य-समायोजित किया गया था। शून्य के बराबर iBAQ मान डेटा सेट से हटा दिए गए थे। सांख्यिकीय परिकल्पना परीक्षण के लिए, 2 समूहों के लिए सामान्यीकृत iBAQ मानों का उपयोग करके प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक 2-नमूना वेल्च का t-परीक्षण किया गया था। यदि केवल एक समूह में एक प्रोटीन का पता लगाया गया था, तो एक 1-नमूना वेल्च का टी-परीक्षण किया गया था, जिसमें सबसे छोटे से पहचाने गए iBAQ मान को शून्य परिकल्पना के रूप में उपयोग किया गया था।

एसएपी धुंधला

3 मिमी पर काटे गए फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों को चित्रित किया गया था, और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति 99 डिग्री पर की गई थी। वर्गों को खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-एसएपी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (1: 400; थर्मोफिशर, वॉलथम, एमए) के साथ प्रतिक्रिया दी गई थी, इसके बाद रोडामाइन लाल एक्स-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक था जो मानव के साथ न्यूनतम क्रॉस-रिएक्शन सुनिश्चित करने के लिए ठोस-चरण adsorbed था। आईजीजी (1:100; जैक्सन इम्यूनो रिसर्च लेबोरेटरीज, वेस्ट ग्रोव, पीए)। प्रत्येक मामले को सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ चलाया गया था। दाग का मूल्यांकन मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। यदि ग्लोमेरुली में सकारात्मक दानेदार केशिका लूप धुंधला था, और कोई केशिका लूप नहीं था, तो इसे सकारात्मक माना गया था।

ग्लोमेरुली में धुंधलापन। ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन में IgG और SAP के कोलोकलाइज़ेशन की जांच एक Zeiss LSM 880 कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (Zeiss माइक्रोस्कोपी, जेना, जर्मनी) का उपयोग करके कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। इस विश्लेषण के लिए, पॉलीक्लोनल (फ्लफ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-संयुग्मित) खरगोश विरोधी मानव आईजीजी (1:40; एगिलेंट, सांता क्लारा, सीए) को ऊपर वर्णित एसएपी के लिए धुंधला होने के बाद गर्मी से प्राप्त ऊतक के साथ प्रतिक्रिया दी गई थी। प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ कर एंटीबॉडी विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण किया गया। MGMID के चार मामलों का परीक्षण HP1BP3 (1:100; थर्मो फिशर, वॉलथम, एमए) की उपस्थिति के लिए इम्युनोपरोक्सीडेज धुंधला द्वारा किया गया था।

SAP के लिए सीरम एंटीबॉडी का परीक्षण

एसएपी प्रोटीन (आर एंड डी सिस्टम्स, मिनियापोलिस, एमएन; {0}}एसएबी-050) कार्बोनेट-बाइकार्बोनेट बफर (पीएच 9.6) में 3 एनजी / एमएल तक पतला था और एक {{ 6}}वेल इम्मुलॉन एच2 प्लेट (थर्मो साइंटिफिक) रात भर 4 डिग्री पर। 2 0 0 वाशिंग बफर (1 × फॉस्फेट-बफर खारा और 0.05 प्रतिशत ट्वीन) का उपयोग करके प्लेटों को x3 धोया गया और 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर (1 × फॉस्फेट-बफर खारा, 0.05 प्रतिशत) के साथ अवरुद्ध किया गया। ट्वीन, 1 प्रतिशत मछली जिलेटिन)। प्लेट्स को तब 200 मिलीलीटर वॉश बफर से × 3 धोया गया था। पतला सीरम के बीस माइक्रोलीटर (धोने के बफर में 1:100) प्रति कुएं में जोड़े गए और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। डिटेक्शन एंटीबॉडी, एंटी-ह्यूमन आईजीजी-एचआरपी (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च लैबोरेट्रीज; 309-035-003) के अलावा प्लेट्स × 7 को 200 मिली वॉश बफर से धोया गया। प्लेट्स × 7 को 200 मिली वॉश बफर से धोया गया। इसके बाद, 3,3', 5,5'-टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन पेरोक्सीडेज़ सब्सट्रेट, और पेरोक्सीडेज़ सब्सट्रेट सोल बी को 1:1 के अनुपात में मिलाया गया, और 100 मिलीलीटर को प्लेट में जोड़ा गया। 450 एनएम पर पढ़ने से पहले 20 मिनट के लिए बेंच पर छोड़े गए 2M H2SO4 के 100 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोक दिया गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि SAP प्रोटीन प्लेट से बंधा हुआ है, हमने खरगोश विरोधी SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA 1-28361) का उपयोग सीरियल कमजोर पड़ने के बाद खरगोश विरोधी IgG-HRP (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च लेबोरेटरीज) में किया। ; 111-035-144)। नियंत्रण ने एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने और अवशोषण के बीच एक अच्छा संबंध दिखाया, जिसका औसत आर-वर्ग मान 0.95 था।

सुधार के लिए Cistancheगुर्दासमारोह

खुलासा

सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया।

पूरक

सामग्री अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ)

चित्रा S1। वृक्क रोगों की एक किस्म से धुंधला ग्लोमेरुलर एसएपी की प्रतिनिधि छवियां।

चित्रा S2। एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख द्वारा एंटी-एसएपी सेरोएक्टिविटी अध्ययन।

तालिका S1। आईजीजी कप्पा जमा के साथ झिल्लीदार-जैसे ग्लोमेरुलोपैथी के मामलों से लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेड ग्लोमेरुली में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने गए सभी आईजी।

तालिका S2। सभी प्रोटीनों के नमूने द्वारा वर्णक्रमीय गणनाओं ने MGMID नमूनों में $1 log2 की बढ़ी हुई बहुतायत और एक P-मान # 0.1 दिखाया।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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