गोमिसिन एन मेलानोसाइट्स में PI3K/Akt और MAPK/ERK सिग्नलिंग पाथवे को विनियमित करके मेलानोजेनेसिस को रोकता है
Mar 17, 2022
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सार: गोमिसिन न, शिसांद्रा चिनेंसिस में पाए जाने वाले लिग्नन यौगिकों में से एक को विभिन्न अध्ययनों में एंटी-ऑक्सीडेटिव, एंटी-ट्यूमरजेनिक और एंटी-इंफ्लेमेटरी गतिविधियों के लिए दिखाया गया है। यहां हम पहली बार, स्तनधारी में गोमिसिन एन की एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभावकारिता की रिपोर्ट करते हैं। कोशिकाओं के साथ-साथ जेब्राफिश भ्रूणों में भी। गोमिसिन एन ने बिना कोशिकीय विषाक्तता के मेलेनिन की मात्रा को काफी कम कर दिया। हालांकि यह मशरूम की उत्प्रेरक गतिविधि को संशोधित करने में सक्षम नहीं थाटायरोसिनेसकृत्रिम परिवेशीय,गोमिसिन नमें कार्य करने वाले प्रमुख प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर देता हैमेलानोजेनेसिस. गोमिसिन एन डाउनरेग्युलेटेड मेलानोकोर्टिन 1 रिसेप्टर (MC1R), एडेनिल साइक्लेज 2, माइक्रोफथाल्मिया-एसोसिएटेड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF), टायरोसिनेस,टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन-1(TRP-1), और tyrosinase-संबंधित प्रोटीन-2 (TRP-2)। इसके अलावा, गोमिसिन एन-उपचारित मेलान-ए कोशिकाओं ने पी-एक्ट और पी-ईआरके स्तरों में वृद्धि का प्रदर्शन किया, जिसका अर्थ है कि पीआई3के/एक्ट और एमएपीके/ईआरके मार्गों की सक्रियता बाधित करने के लिए कार्य कर सकती है।मेलानोजेनेसिस. हमने यह भी पुष्टि की कि गोमिसिन ने MITF की अभिव्यक्ति को दबाकर मेलेनिन उत्पादन को कम किया,टायरोसिनेस, TRP-1, और TRP-2माउस और मानव कोशिकाओं के साथ-साथ zebrafish भ्रूण के विकास में। सामूहिक रूप से, हम यह निष्कर्ष निकालते हैं किगोमिसिन नसंभवतः PI3K/Akt और MAPK/ERK मार्गों को संशोधित करके, MITF और मेलेनोजेनिक एंजाइमों की अभिव्यक्ति को दबाकर मेलेनिन संश्लेषण को रोकता है।
कीवर्ड:शिसांद्रा चिनेंसिस;गोमिसिन न; लिग्नान;मेलानोजेनेसिस; त्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वाला
सिस्टैंच में त्वचा को गोरा करने का कार्य होता है
1 परिचय
मेलेनिन त्वचा, बाल, आंख, भीतरी कान, हड्डियों, हृदय और मस्तिष्क सहित अधिकांश जानवरों के अंगों में पाया जाने वाला एक वर्णक है [1,2]।मेलानोजेनेसिसएक जटिल प्रक्रिया है जिसमें कई सिग्नलिंग मार्ग शामिल होते हैं। मेलेनोकोर्टिन 1 रिसेप्टर (MC1R) में एक प्रमुख नियामक हैमेलानोजेनेसिस, मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (एमएसएच) और एड्रेनोकोर्टिकोट्रोपिक हार्मोन (एसीटीएच) [3] जैसे इसके लिगैंड्स के माध्यम से सिग्नलिंग। त्वचा मेलेनिन को एपिडर्मिस में मेलानोसाइट्स द्वारा जैवसंश्लेषित किया जाता है और फिर केराटिनोसाइट्स में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जहां वे सूर्य के प्रकाश से यूवी विकिरण को अवशोषित करके और प्रतिक्रियाशील मुक्त कणों [4,5] को नष्ट करके त्वचा की सुरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मेलेनिन संश्लेषण और त्वचा और बालों के रोम में स्थानांतरण इसके अग्रदूतों [6] की उपलब्धता से नियंत्रित होता है। L-tyrosine और L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), मेलेनोजेनिक एंजाइम के प्रमुख सबस्ट्रेट्स, मेलानोजेनेसिस [7] में हार्मोन जैसे नियामकों के रूप में भी कार्य करते हैं। दूसरी ओर, मेलेनिन के अतिउत्पादन के परिणामस्वरूप अवांछित त्वचा संबंधी चिंताएं होती हैं जैसे झाईयां और मेलास्मा [8,9]। मेलानोजेनेसिस कोशिकाओं के लोचदार गुणों को संशोधित करके सामान्य और घातक मेलानोसाइट्स के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है [10]। यद्यपि त्वचीय कोशिकाओं में व्यक्त सेरोटोनिन और मेलाटोनिन के लिए रिसेप्टर्स सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, अनियंत्रित हार्मोनल परिवर्तनों के माध्यम से मेलेनिन का अत्यधिक उत्पादन त्वचा में रोग संबंधी स्थितियों का कारण बन सकता है [11]।
इस प्रकार, आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए व्यापक प्रयास किए गए हैं जो मेलेनोजेनेसिस को हाइपरपिग्मेंटरी त्वचा विकारों के इलाज के लिए प्राथमिक कदम के रूप में नियंत्रित करते हैं। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार केत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालामेलेनिन संश्लेषण को बाधित करने वाले एजेंटों को पौधे और गैर-पौधे के अर्क से पहचाना गया है और व्यावसायिक रूप से कॉस्मीक्यूटिकल्स [12,13] में उपयोग किया जाता है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले वाइटनिंग एजेंटों में हाइड्रोक्विनोन, मेक्विनोल, अर्बुटिन, कोजिक एसिड, एस्कॉर्बिक एसिड और रेटिनोइक एसिड [12,14] शामिल हैं। हालांकि, मनुष्यों में हाइपरपिग्मेंटेशन के तीव्र या पुराने लक्षणों के उपचार में उनके उपयोग की विभिन्न सीमाएँ हैं। उदाहरण के लिए, हाइड्रोक्विनोन, हालांकि यह लंबे समय से 1960 के दशक से अपचयन के लिए उपयोग किया जाता रहा है, त्वचा में जलन और संपर्क जिल्द की सूजन का कारण बन सकता है [15,16]। यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और स्तनधारी कोशिकाओं में बहिर्जात ओक्रोनोसिस के विकास को बढ़ाकर डीएनए को नुकसान पहुंचाता है [17,18]। अन्य प्रसिद्धटायरोसिनेसकोजिक एसिड और एस्कॉर्बिक एसिड जैसे अवरोधकों में न केवल खराब त्वचा की पैठ, स्थिरता और सफेदी की प्रभावकारिता होती है, बल्कि लंबे समय तक उपयोग से साइटोटोक्सिसिटी, डर्मेटाइटिस और एरिथेमा भी हो सकता है [19,20]। इस संबंध में, मानव त्वचा के हाइपरपिग्मेंटेशन के उपचार के लिए सुरक्षित और अधिक प्रभावी वाइटनिंग एजेंट विकसित करने की आवश्यकता बढ़ रही है। पारंपरिक चिकित्सा में उपयोग की जाने वाली प्राकृतिक जड़ी-बूटियाँ उपन्यास विरंजन एजेंटों की पहचान करने के लिए वैकल्पिक स्रोत प्रदान कर सकती हैं जो प्रमुख चरणों को नियंत्रित करते हैंमेलानोजेनेसिसकम या बिना किसी दुष्प्रभाव के [21]।
शिसांद्रा चिनेंसिस, जिसे उत्तरी फाइन-फ्लेवर बेरी के रूप में भी जाना जाता है, स्वाभाविक रूप से उत्तरपूर्वी चीन, सुदूर-पूर्वी रूस, जापान और कोरिया [22] में पाया जाता है। यह पौधा लंबे समय से रतौंधी, त्वचा की जलन, सड़न रोकनेवाला सूजन और यकृत रोगों के उपचार के लिए पारंपरिक प्राच्य चिकित्सा [23,24] में उपयोग किया जाता रहा है। एस चिनेंसिस फलों का अर्क और इसके लिग्नन यौगिकों को murine सेल लाइनों में विभिन्न औषधीय प्रभाव रखने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, शिसांद्रा ए और सी में एंटी-ऑक्सीडेटिव प्रभाव होते हैं, जबकि शिसांद्रा बी में एंटी-फाइब्रोटिक, एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटी-ऑक्सीडेंट और एंटी-एपोप्टोटिक गतिविधियां होती हैं [25]। एक और लिग्नान यौगिकगोमिसिन न(चित्रा 1ए) को माइटोकॉन्ड्रिया से साइटोक्रोम सी की रिहाई को रोककर साइटोक्रोम सी की रिहाई को रोककर, कस्पासे 3 और PARP की दरार, और सीए 2 प्लस-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता H9c2 चूहे कार्डियोमायोसाइट्स [7,8] में दबाने के लिए सूचित किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि माउस मॉडल और मानव त्वचा सेल लाइनों का उपयोग करने वाले कई अध्ययनों ने त्वचा विकारों के इलाज के लिए एस चिनेंसिस की चिकित्सीय क्षमता का खुलासा किया है। ली एट अल। ने बताया कि एस चिनेंसिस फल के मेथनॉल अर्क ने टीएनएफ- और आईएफएन- जैसे प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के उत्पादन को कम करके संपर्क जिल्द की सूजन के लक्षणों को कम किया [8,24]। कांग एट अल। ने दिखाया कि शिसांद्रा फ्रुक्टस पानी के अर्क ने IκB सक्रियण को रोक दिया, जिससे मानव मस्तूल सेल लाइन HMC-1 [26] में TNF-, IL-6, और GM-CSF के उत्पादन को दबा दिया गया। इन निष्कर्षों ने हमें अभिधारणा करने के लिए प्रेरित किया। कि एस। चिनेंसिस लिग्नांस त्वचा कोशिका के कार्यों को अधिक व्यापक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। इस अध्ययन में, हमने की पुटेटिव भूमिकाओं की जांच करने की मांग कीगोमिसिन न, एस चिनेंसिस में प्रमुख लिग्नन यौगिकों में से एक, विनियमन मेंमेलानोजेनेसिस, इस प्रकार एकोसमीस्यूटिकल एजेंट के रूप में इसके संभावित उपयोग का मूल्यांकन करता है। यहां, हम रिपोर्ट करते हैं किगोमिसिन नमानव और माउस कोशिकाओं के साथ-साथ जेब्राफिश भ्रूणों में सेलुलर विषाक्तता के बिना मेलेनिन जैवसंश्लेषण को रोकता है।
2. परिणाम
2.1. मेलेनिन गठन और सेल व्यवहार्यता पर गोमिसिन एन के प्रभाव
गोमिसिन एन के प्रभावों को सत्यापित करने के लिएमेलानोजेनेसिस, हमने माउस मेलानोसाइट्स का इलाज विभिन्न सांद्रता के साथ कियागोमिसिन न72 घंटे के लिए, और फिर मेलेनिन सामग्री में परिवर्तन का आकलन किया। गोमिसिन एनट्रीटमेंट ने सामान्य मेलानोसाइट सेल लाइन मेलान-ए और बी16एफ10मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री को सेलुलर विषाक्तता (चित्रा 1बी, सी) के बिना खुराक पर निर्भर तरीके से कम कर दिया। हमने देखा कि Gomisin N ने B16F10 कोशिकाओं में -MSH- प्रेरित मेलेनिन उत्पादन को बाधित किया, जो कि PTU उपचार [27] (चित्र 1C) द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ तुलनीय था। मूल्यांकन करने के लिए कि क्या मेलेनिन की कमी परगोमिसिन नउपचार टायरोसिनेस की घटी हुई गतिविधि के कारण होता है, हमने सामान्य मानव एपिडर्मल मेलानोसाइट (एनएचईएम) कोशिकाओं में एल-डीओपीए धुंधला परख किया। जैसा कि चित्र 1ई में दिखाया गया है, गोमिसिन एन के साथ इलाज किए गए एनएचईएम कोशिकाओं ने अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में एल-डीओपीए के स्तर में कमी का प्रदर्शन किया। हालांकि, मेलेनिन उत्पादन पर गोमिसिन एन का निरोधात्मक प्रभाव मानव मेलेनोमा एमएनटी -1 कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) में महत्वपूर्ण नहीं था। .
2.2. टायरोसिनेस गतिविधि पर गोमिसिन एन के प्रभाव
जांच करने के लिए कि क्यागोमिसिन नरोकता हैटायरोसिनेसइन विट्रो में गतिविधि, हमने मशरूम टायरोसिनेस और बी 16 मेलेनोमा सेल लाइसेट्स का इस्तेमाल किया। कोजिक एसिड, एक प्रसिद्ध टायरोसिनेस अवरोधक, का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। जब मशरूम टायरोसिनेस के साथ इलाज किया जाता है, जबकि कोजिक एसिड ने एंजाइमैटिक गतिविधि को काफी कम कर दिया है, गोमिसिन एन ने एल-डोपा के डोपाक्रोम (चित्रा 2 ए) के रूपांतरण में कोई बदलाव नहीं किया है। हालांकि, जब बी 16 मेलेनोमा कोशिकाओं का इलाज किया जाता है, तो गोमिसिन एन में कमी आई है। मेंटायरोसिनेसएक खुराक पर निर्भर तरीके से सेल लाइसेट की गतिविधि (चित्रा 2बी)। इसके अलावा, जब -MSH inB16 कोशिकाओं के साथ सह-उपचार किया जाता है,गोमिसिन न-एमएसएच (चित्रा 3सी) द्वारा प्रेरित डोपाक्रोम गठन में वृद्धि को उलट दिया। विशेष रूप से, गोमिसिन एन सेलुलर को बाधित करने के लिए कोजिक एसिड की तुलना में अधिक प्रभावी प्रतीत होता हैटायरोसिनेस गतिविधि-MSH उद्दीपन पर B16 कोशिकाओं का। इन निष्कर्षों का अर्थ है कि माउस और मानव कोशिकाओं (चित्र 1) में देखे गए मेलेनिन उत्पादन पर गोमिसिन का निरोधात्मक प्रभाव टायरोसिनेस की उत्प्रेरक गतिविधि को सीधे बाधित करने के अपने कार्य के कारण नहीं है। हालांकि, यह अभी भी संभव है कि गोमिसिन टायरोसिनेस या अन्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है जो इसमें महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैंमेलानोजेनेसिस.
2.3. MC1R सिग्नलिंग पाथवे की निष्क्रियता पर गोमिसिन एन के प्रभाव
हमने मेलेनिन उत्पादन पर गोमिसिनएन के निरोधात्मक प्रभाव के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने की मांग की। हमने तर्क दिया किगोमिसिन नसिग्नलिंग प्रोटीन को विनियमित कर सकता है जिसमें शामिल हैंमेलानोजेनेसिसऔर इस तरह मेलेनिन संश्लेषण को रोकता है। मेलानोकोर्टिन 1 रिसेप्टर (MC1R) एमेलानोसाइटिक जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर है जो मेलेनिन संश्लेषण में एक प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है। इसके लिगैंड -एमएसएच या एड्रेनोकोर्टिकोट्रोपिक हार्मोन (एसीटीएच) द्वारा एमसी1आर के सक्रिय होने से एडेनिल साइक्लेज में वृद्धि होती है, जो बदले में इंट्रासेल्युलर सीएमपी स्तर [2,3] को बढ़ाता है। नतीजतन, MITF के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर को प्रोटीन किनसे-सी (PKA) / उत्तरदायी तत्व-बाइंडिंगप्रोटीन (CREB) मार्ग [2,28] के माध्यम से बढ़ाया जाता है। एमसी1आर सिग्नलिंग मार्ग पर गोमिसिन एन के नियामक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने गोमिसिन एन के साथ मेलान-ए कोशिकाओं का इलाज करने के बाद एमसी1आर और इसके डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग अणुओं के अभिव्यक्ति स्तरों की जांच की। हमने देखा कि गोमिसिन एन ने एमसी1आर और एडेनिल साइक्लेज 2 दोनों के प्रोटीन स्तर को काफी कम कर दिया है। एक खुराक पर निर्भर तरीके से (चित्रा 3ए-सी)। जैसा कि अपेक्षित था,गोमिसिन न-उपचारित कोशिकाओं ने MITF और इसके ज्ञात लक्ष्य tyrosinase, TRP-1, और TRP-2 (चित्र 3A, D–G) के प्रोटीन स्तर में कमी का भी प्रदर्शन किया। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि गोमिसिन एन MC1R सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से MITF को निष्क्रिय करके मेलेनिन-उत्पादक एंजाइमों को रोकता है।
2.4. मेलान-ए कोशिकाओं में एक्ट और ईआरके 1/2 के फास्फोराइलेशन पर गोमिसिन एन के प्रभाव
PI3K/Akt और MAPK/ERK पाथवे को ट्रांसक्रिप्शनल रूप से या पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से MITF [29,30] को विनियमित करके मेलानोजेनेसिस में शामिल होने के लिए जाना जाता है। यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या गोमिसिन इन सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करता है, हमने पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा एक्ट और ईआरके 1/2 की फॉस्फोराइलेशन स्थिति का आकलन किया। जैसा कि चित्र 3H-J में दिखाया गया है, उच्च खुराक उपचार (30 µM) ofगोमिसिन नAkt और ERK दोनों के फॉस्फोराइलेशन को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाया। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि गोमिसिन एन का निरोधात्मक प्रभावमेलानोजेनेसिसP13K/Akt और MAPK/ERK पाथवे से जुड़े होने की संभावना है।
2.5. जेब्राफिश भ्रूण में गोमिसिन एन इनहिबिटेड मेलानोजेनेसिस
हमने आगे यह जांचने का लक्ष्य रखा कि क्या गोमिसिन एन अवरोध करने में प्रभावी हैमेलानोजेनेसिसविवो में। अंत में, हमने 1, 10, 20, और 30 माइक्रोन की सांद्रता में 72 घंटे के लिए गोमिसिन एन के साथ जेब्राफिश भ्रूण का इलाज किया, और फिर मेलेनोजेनिक प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर को मापा। हमने देखा कि गोमिसिन एन उपचार ने जेब्राफिश भ्रूण के विकास में मेलेनिन के निर्माण को रोक दिया।गोमिसिन न-उपचारित भ्रूणों ने अनुपचारित नियंत्रण (चित्र 4) की तुलना में एकाग्रता-निर्भर तरीके से मेलेनिन सामग्री में कमी दिखाई। हमने यह भी पाया कि प्रोटीन का स्तरटायरोसिनेस, MITF, TRP-1, और TRP-2 को Gomisin N उपचार द्वारा घटाया गया (चित्र 5)। इन परिणामों से पता चलता है कि गोमिसिन एन प्रतिलेखन कारक MITF और उसके लक्ष्यों को विनियमित करके विवो में मेलानोजेनेसिस को रोकता हैटायरोसिनेस, टीआरपी-1,और टीआरपी-2।
2.6. गोमिसिन एन ने मानव एमएनटी में रैपामाइसिन-प्रेरित मेलानोजेनेसिस को उलट दिया-1
हालांकि गोमिसिन एन ने महत्वपूर्ण रूप से बाधित कियामेलानोजेनेसिसमेलान-ए और बी16 कोशिकाओं के साथ-साथ इंजेब्राफिश भ्रूणों में, हमने मानव एमएनटी -1 मेलेनोमा कोशिकाओं पर इसके प्रभाव का निरीक्षण नहीं किया। हमें उम्मीद थी कि गोमिसिन एन का प्रभाव एमएनटी -1 कोशिकाओं में उस स्थिति में पता लगाया जा सकता है जहां मेलानोजेनेसिस एक उपयुक्त उत्तेजना द्वारा नियंत्रित होता है। रैपामाइसिन को MITF, tyrosinase, TRP-1, और TRP-2 [31] के टायरोसिनेस गतिविधि और प्रोटीन स्तर को बढ़ाकर मेलेनोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, आंशिक रूप से ऑटोफैगी [32] की सक्रियता के माध्यम से। हमने के स्तरों की निगरानी कीटायरोसिनेस, MITF, TRP-1, और TRP-2 MNT-1 कोशिकाओं में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा, Gomisin N andrapamycin के साथ सह-उपचार के बाद। रैपामाइसिन उपचार ने MITF, TRP-1, और TRP-2 स्तरों को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित किया, लेकिन इसका कोई प्रभाव नहीं पड़ा।टायरोसिनेसस्तर (चित्र 6)। हालांकि, गोमिसिन एन उपचार ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से MITF, TRP-1, और TRP-2 पर रैपामाइसिन के प्रभावों को महत्वपूर्ण रूप से उलट दिया। का उल्टा प्रभावगोमिसिन नरैपामाइसिन के खिलाफ 10 माइक्रोन की तुलना में 20 और 30 माइक्रोन की एकाग्रता में अधिक आशाजनक था। इन परिणामों से पता चलता है कि गोमिसिन एन रोकता हैमेलानोजेनेसिसट्रांसक्रिप्शन कारक MITF और उसके लक्ष्य TRP-1 और TRP-2 को विनियमित करके मानव MNT-1 मेलेनोमा कोशिकाओं में।
3. चर्चा
मेलेनिन का मुख्य कार्य त्वचा की कोशिकाओं को यूवी विकिरण [33-35] से बचाना है। हाइपरपिग्मेंटेशन, त्वचा में मेलेनिन के अधिक उत्पादन का परिणाम, अवांछित कॉस्मेटिक चिंताओं का कारण बनता है और जिल्द की सूजन और त्वचा कैंसर से जुड़ा होता है। कई रिपोर्टों ने सुझाव दिया हैमेलानोजेनेसिसमेटास्टेटिक मेलेनोमा [36,37] के इलाज के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में। इस प्रकार, एंटी-मेलेनोजेनिक एजेंटों को विकसित करने की आवश्यकता बढ़ रही है जो सेल्युलरटॉक्सिसिटी [38] के बिना मेलेनोजेनेसिस को नियंत्रित करते हैं। त्वचा मेलेनोजेनेसिस में कई रास्ते शामिल हैं [39,40]। लिगैंड बाइंडिंग पर, MC1R एडेनिल साइक्लेज की गतिविधि को बढ़ाता है, जो बाद में सीएमपी [41,42] के इंट्रासेल्युलर स्तर को बढ़ाता है। पीकेए / सीआरईबी मार्ग के सीएमपी-निर्भर सक्रियण को व्यापक रूप से एमआईटीएफ के ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों को अपग्रेड करने के लिए सूचित किया गया है, जिससे मेलेनिन संश्लेषण [43] में वृद्धि हुई है। MITF तीन प्रमुख मेलेनोजेनिक एंजाइम टाइरोसिनेस, टीआरपी -1, और टीआरपी -2 कशेरुकी जंतुओं [3,21,44] के एक मास्टर नियामक के रूप में कार्य करता है। ये एंजाइम मेलानोसाइट्स के मेलानोसोमलमेम्ब्रेन में स्थित ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन होते हैं। टायरोसिनेस दर-सीमित कदम को नियंत्रित करता हैमेलानोजेनेसिसएल-टायरोसिनेस को एल-डोपा [23] में परिवर्तित करके। टीआरपी-1 और टीआरपी-2 भी मेलेनिन संश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, हालांकि उनके कार्यों को पूरी तरह से समझा नहीं गया है।
इस अध्ययन में, एस चिनेंसिस के एक लिग्नान यौगिक गोमिसिन एन ने बिना कोशिकीय विषाक्तता के अपक्षयी गतिविधि दिखाई। गोमिसिन एन ने सुसंस्कृत स्तनधारी सेल लाइनों के साथ-साथ ज़ेब्राफिश भ्रूण में मेलेनिन संश्लेषण को रोक दिया। मेलन-ए कोशिकाओं (चित्रा 1बी) में मेलेनिन उत्पादन को रोकने वाले सकारात्मक नियंत्रण पीटीयू की तुलना में गोमिसिन एन अधिक प्रभावी लग रहा था। गोमिसिन एन ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से मेलेनिन सामग्री को कम कर दिया। अनुपचारित नियंत्रण समूह की तुलना में, 10 µ मीटरगोमिसिन नसेलुलर विषाक्तता के बिना, मेलेनिन सामग्री को लगभग 40 प्रतिशत कम कर दिया। मेलान-ए कोशिकाओं में 100-μM पीटीयू के साथ 10-μM गोमिसिन एन की एंटी-मेलेनोजेनिक गतिविधि तुलनीय थी। इसी तरह, गोमिसिन -एमएसएच-सक्रिय बी16एफ10 कोशिकाओं में पीटीयू की तुलना में अधिक शक्तिशाली दिखाई दिया, जहां 5- और 10-μM गोमिसिन एन के प्रभाव 10- और {{12 के प्रभाव के साथ तुलनीय थे। }}μM PTU, क्रमशः (चित्र 1C)। Gomisin N के साथ उपचारित NHEM कोशिकाओं ने L-DOPA के कम स्तर का प्रदर्शन किया, जो बताता है कि GomisinN रोकता हैटायरोसिनेससंवर्धित कोशिकाओं में गतिविधि (चित्र 1ई)। इन निष्कर्षों ने हमें उस अंतर्निहित तंत्र की और जांच करने के लिए प्रेरित किया जिसके द्वारा गोमिसिन एन मेलानोजेनेसिस को रोकता है।
हमने जांच की कि क्यागोमिसिन नकी उत्प्रेरक गतिविधि को सीधे नियंत्रित करता हैटायरोसिनेसइन विट्रो में। कोजिक एसिड के विपरीत, गोमिसिन एन ने मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि (चित्रा 2 ए) पर निरोधात्मक प्रभाव नहीं दिखाया। हालांकि, बी16 मेलेनोमा सेल लाइसेट्स में सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि को गोमिसिन एन द्वारा -एमएसएच उपचार (चित्रा 2बी, सी) के साथ और बिना दोनों के द्वारा काफी डाउनग्रेड किया गया था। गोमिसिन एन ऑन-एमएसएच उत्तेजना की सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि का निषेध सकारात्मक नियंत्रण कोजिक एसिड (चित्रा 2सी) की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण पाया गया।
हमने माना है कि गोमिसिन एन का एंटी-मेलेनोजेनिक फ़ंक्शन टायरोसिनेस और टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन (टीआरपी) के ट्रांसक्रिप्शनल या पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन के माध्यम से हो सकता है। इसे मान्य करने के लिए, हमने एमसी1आर मार्ग में सिग्नलिंग अणुओं के अभिव्यक्ति स्तरों को मापा, जो इसके लिए एक प्रमुख निर्धारक है। मेलानोसाइट्स में मेलेनिन उत्पादन की मात्रा और गुणवत्ता। अपेक्षित रूप से, हमने देखा कि गोमिसिन एन ने मेलान-ए कोशिकाओं (चित्रा 3ए-सी) में एमसी1आर और एडेनिल साइक्लेज 2 के स्तर को कम कर दिया। आगे,गोमिसिन नटाइरोसिनेस, टीआरपी-1, और टीआरपी-2 (चित्रा 3ए,डी-जी) सहित एमआईटीएफ और इसके लक्षित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। इन परिणामों से पता चलता है कि गोमिसिन एन उपचार पर मेलेनिन सामग्री का कम स्तर MC1R मार्ग के निष्क्रिय होने के परिणामस्वरूप होता है।
दूसरी ओर, PI3K/Akt और MAPK/ERK मार्ग MITF को फॉस्फोराइलेट कर सकते हैं, और इस तरह इसकी गतिविधि को पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से संशोधित कर सकते हैं [45]। हालाँकि, PI3K/Akt और MAPK/ERK पथों के सक्रियण का समग्र प्रभावमेलानोजेनेसिसविवादास्पद है। दोनों PI3K/Akt और MAPK/ERK मार्ग संवैधानिक रूप से मानव मेलेनोमा में संचित उत्परिवर्तन [46] के कारण सक्रिय हैं। C2-मेल-एब कोशिकाओं में सेरामाइड-मध्यस्थता अपचयन p-Akt स्तरों में कमी के कारण होता है [47]। कई प्राकृतिक यौगिक हैं जो बी16 मेलेनोमा कोशिकाओं [28] में पी-ईआरके स्तरों को बढ़ाकर मेलानोजेनेसिस को सक्रिय करते हैं। इसके विपरीत, इस बात के भी प्रमाण हैं कि ऊंचा पी-ईआरके और पी-एक्ट स्तर मेलेनिन संश्लेषण को रोकता है [28,48]। मेलेनोजेनेसिस की जटिलता को आंशिक रूप से इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि फॉस्फोराइलेशन MITF की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बढ़ाता है, लेकिन साथ ही साथ MITF [26,49-51] के सर्वव्यापी-प्रोटीयोसोम-निर्भर गिरावट को प्रेरित करता है। हमारे डेटा से पता चला है कि पी-एक्ट और पी-ईआरके दोनों स्तरों को गोमिसिन एन-उपचारित मेलान-ए कोशिकाओं (चित्रा 3एच-जे) में अपग्रेड किया गया था। इसका तात्पर्य है कि PI3K/Akt और MAPK/ERKpathways मेलेनिन उत्पादन के निषेध में योगदान कर सकते हैं।
हमने विवो मॉडल में जेब्राफिश में गोमिसिन एन की मेलेनोजेनिक गतिविधि को और अधिक मान्य किया। गोमिसिन एन-उपचारित जेब्राफिश भ्रूण ने मेलेनिन रंजकता में उल्लेखनीय कमी दिखाई (चित्र 4)। इसके अलावा, गोमिसिन एन ने के स्तर को स्पष्ट रूप से कम कर दियाटायरोसिनेस, MITF, TRP-1, और TRP-2 जेब्राफिश भ्रूण विकसित करने में। ये निष्कर्ष सामूहिक रूप से सुझाव देते हैं किगोमिसिन नविवो में एमआईटीएफ और मेलेनोजेनिक एंजाइमों की अभिव्यक्ति को कम करके अपचयन को प्रेरित करता है। गोमिसिन एन की एंटी-मेलेनोजेनिक गतिविधि की पुष्टि मानव मेलेनोमा एमएनटी -1 कोशिकाओं में रैपामाइसिन द्वारा उत्तेजित की गई थी। हालांकि गोमिसिन एन के परिणामस्वरूप एमएनटी -1 कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) में मेलेनिन सामग्री में केवल छोटे परिवर्तन हुए, यह एमआईटीएफ, टीआरपी -1, और टीआरपी -2 के रैपामाइसिन-प्रेरित अपचयन को उलटने के लिए प्रभावी था। एक एकाग्रता-निर्भर तरीके (चित्रा 6ए, सी-ई)। एक साथ लिया, नियामक प्रभावगोमिसिन नMITF पर और मेलेनोजेनिक एंजाइम माउस और मानव कोशिकाओं के साथ-साथ जेब्राफिश भ्रूणों में प्रजनन योग्य रूप से पाए गए थे।
संक्षेप में, यह काम बताता है कि गोमिसिन एन में उपन्यास के रूप में उच्च क्षमता हो सकती हैत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाप्रतिनिधि। गोमिसिन एन रोकता प्रतीत होता हैमेलानोजेनेसिसकी उत्प्रेरक गतिविधि को सीधे संशोधित करने के बजाय, MC1R मार्ग के माध्यम से MITF की अभिव्यक्ति को दबाकरटायरोसिनेसऔर टीआरपी। हालांकि विस्तृत तंत्र को स्पष्ट किया जाना बाकी है, गोमिसिन एन-प्रेरित अपचयन के PI3K/Akt और MAPK/ERK पथ (चित्र 7) के सक्रियण से जुड़े होने की संभावना है।
4. सामग्री और तरीके
4.1. सामग्री
RPMI1640 को गिब्को-बीआरएल (गेथर्सबर्ग, एमडी, यूएसए) से खरीदा गया था। Dulbecco का संशोधित ईगल माध्यम (DMEM), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (PS) Hyclone (Carlsbad, CA, USA) से खरीदे गए थे। मेलानोसाइट विकास माध्यम प्रोमोसेल (हीडलबर्ग, जर्मनी) से खरीदा गया था। Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-एसीटेट (TPA), कोजिक एसिड, 1-फिनाइल-2-थियोरिया (PTU), मशरूम टायरोसिनेस, 3,{{ 9}}डायहाइड्रॉक्सी-एल-फेनिलएलनिन (एल-डीओपीए), -एमएसएच, डाइमिथाइल सल्फोऑक्साइड (डीएमएसओ), और पैराफॉर्मलडिहाइड को सिग्माकेमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था।गोमिसिन नयौगिक चुल यंग किम (हन्यांग विश्वविद्यालय, अंसन, कोरिया) द्वारा प्रदान किया गया था। रैपामाइसिन को सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था।
4.2. कोश पालन
माउस मेलेनोमा सेल लाइन B16F10 को कोरियाई सेल लाइन बैंक (सियोल, कोरिया) से प्रदान किया गया था। मरीन मेलानोसाइट मेलान-ए सेल [52] डॉ. ब्योंग गॉन ली (स्किनरिसर्च इंस्टीट्यूट, अमोरे पैसिफिक कंपनी, योंगिन) की ओर से एक उदार उपहार थे। -सी, कोरिया)। मानव एमएनटी -1 मेलेनोमा कोशिकाओं को आयोंग ली (डोंगगुक विश्वविद्यालय, गोयांग-सी, कोरिया में चिकित्सा का कोलाज) द्वारा उदारतापूर्वक प्रदान किया गया था। प्राथमिक सामान्य मानव एपिडर्मल मेलानोसाइट्स (NHEM) प्रोमोसेल (हीडलबर्ग, जर्मनी) से खरीदे गए थे। मेलान-ए कोशिकाओं को आरपीएमआई 1640 माध्यम (गिब्को, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) में विकसित किया गया था, जो 10 प्रतिशत एफबीएस, 1 प्रतिशत पीएस, और 200 एनएम टीपीए के पूरक थे। डीएमईएम 10 प्रतिशत एफबीएस और 1 प्रतिशत पीएस के साथ मेलन-ए कोशिकाओं और एनएचईएम कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था। 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।
4.3. मेलेनिन सामग्री का मापन
मेलान-ए कोशिकाओं को एक 24-वेल प्लेट (1 × 105सेल्स/वेल) में रखा गया था, जिसका इलाज किया गया थागोमिसिन न, और फिर 72 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। 72 घंटे के बाद, मेलेनिन सामग्री को पहले वर्णित [53] के रूप में मापा गया था। संक्षेप में, संस्कृति मीडिया को हटाने के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था। इसके बाद, मेलेनिन को भंग करने के लिए प्रत्येक कुएं में सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल (1 एमएल, 1 एन) मिलाया गया। एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषक 405 एनएम मापा गया था। इस परख को B16F10 कोशिकाओं (2 × 104 कोशिकाओं / कुएं) और MNT -1 कोशिकाओं के साथ एक ही विधि का पालन करते हुए दोहराया गया था।
4.4. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण
मेलान-ए कोशिकाओं को 100 मिमी व्यंजन (1 × 106 कोशिकाओं/डिश) में रखा गया था और 1, 5, या 10 माइक्रोन के साथ इलाज किया गया था।गोमिसिन न37 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए। कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और फिर एक खुरचनी का उपयोग करके काटा गया। अलग-अलग कोशिकाओं को पीबीएस के 1 मिलीलीटर में डाला गया और 5 मिनट के लिए 75 0 0 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। अपरसोल्यूशन को हटाने के बाद, सेल छर्रों को लसीका बफर (5 0 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8. 0, 0.1 प्रतिशत एसडीएस, 150 मिमी NaCl, 1 प्रतिशत एनपी -40 के साथ lysed किया गया था। 0.02 प्रतिशत सोडियम एजाइड, 0.5 प्रतिशत सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 100 माइक्रोग्राम/एमएल पीएमएसएफ, 1 ग्राम/एमएल एप्रोटीनिन) 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। कुल प्रोटीन 12, 000 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूज का उपयोग करके निकाला गया था। ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री को मापा गया था। प्रोटीन (30 माइक्रोग्राम) को 10 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) जेल का उपयोग करके अलग किया गया और एनिट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। ट्रिस-बफर सलाइनविथ ट्वीन -20 (टीबीएसटी) में 5 प्रतिशत स्किम दूध के साथ झिल्ली को 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था, और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी लक्ष्य-ट्यूबुलिन (सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। ), एमआईटीएफ (सेल सिग्नलिंग, डेनवर, एमए, यूएसए), टायरोसिनेस (सेल सिग्नलिंग), ईआरके (सेल सिग्नलिंग), फॉस्फो-ईआरके (सेल सिग्नलिंग), एकेटी (सेल सिग्नलिंग), फॉस्फो-एकेटी (सेल सिग्नलिंग), एमसी 1 आर ( सांता क्रूज़), एडेनिल साइक्लेज़ 2 (सांता क्रूज़), टीआरपी -1 (सांता क्रूज़), और टीआरपी -2 (सांता क्रूज़)। प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के बाद, झिल्ली को टीबीएसटी से तीन बार धोया गया और माध्यमिक के साथ ऊष्मायन किया गया। एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी बकरी आईजीजी-एचआरपी; माउस विरोधी खरगोश एचआरपी, सांता क्रूज़) 1 घंटे के लिए। झिल्ली को केमीडॉक एक्सआरएस प्लस इमेजिंग सिस्टम (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके उन्नत रसायनयुक्त अभिकर्मक के साथ इलाज किया गया था। इमेज मास्टरटीएम 2डी एलीट सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.1, जीई हेल्थकेयर, शिकागो, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके बैंड का डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया।
4.5. टायरोसिनेस गतिविधि परख
मशरूम पर गोमिसिन एन के निरोधात्मक प्रभाव का अनुमान लगाने के लिएटायरोसिनेसगतिविधि, tyrosinase 1, 5, या 10 µ एम . के साथ ऊष्मायन किया गया थागोमिसिन नया सकारात्मक नियंत्रण Kojic एसिड। प्रत्येक नमूना मेथनॉल भंग कर दिया गया था। L-DOPA (8.3 mM) और मशरूम tyrosinase (125 U) को 80 mM फॉस्फेटबफर (pH 6.8) में पतला किया गया था। प्रत्येक नमूने के 40 µ l और L-DOPA के 120 µ l को एक 96- वेल प्लेट में मिलाया गया, इसके बाद 40 µ l पतला मशरूम टायरोसिनेस मिला दिया गया। प्लेटों को तब 15 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था, और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 490 एनएम पर मापा गया था।
टायरोसिनेसB16 मेलेनोमा सेल लाइसेट्स में गतिविधि को -MSH उपचार के साथ या बिना मापा गया था, जैसा कि पहले ओगुची एट अल द्वारा वर्णित है। [54], मामूली संशोधनों के साथ। सेल लाइसेट को पश्चिमी धब्बा विश्लेषण भाग में ऊपर वर्णित अनुसार तैयार किया गया था। सतह पर तैरनेवाला में कुल प्रोटीन को ब्रैडफोर्ड परख द्वारा एक मानक [55] के रूप में बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग करके मापा गया था। प्रोटीन की एक समान मात्रा को पतला किया गया और टायरोसिनेस गतिविधि परख के लिए उपयोग किया गया।
टायरोसिनेस गतिविधि को रोकना
4.6. एनएचईएम कोशिकाओं में एल-डोपा धुंधला हो जाना
NHEM कोशिकाओं को एक {0}}अच्छी तरह से प्लेट में रखा गया था और 72 घंटे के लिए गोमिसिन एन के साथ ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं को 4 0 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ लगाया गया था, इसके बाद 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स के साथ उपचार किया गया था। {6}} 2 मिनट के लिए। एल-डोपा (0.1 प्रतिशत) प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया, इसके बाद 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। समाधान निकालने के बाद, कोशिकाओं को दो बार पीबीएस से धोया गया। माइक्रोस्कोप से तस्वीरें खींची गईं।
4.7. जेब्राफिश प्रयोग
Zebrafish भ्रूण Zebrafish संसाधन बैंक (डेगू, कोरिया) से प्राप्त किए गए थे। गोमिसिन एन के साथ 72 घंटे तक भ्रूण का इलाज किया गया। का चित्रण प्रभावगोमिसिन नजेब्राफिश भ्रूण पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत देखा गया। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, गोमिसिन एन-उपचारित भ्रूणों को लसीका बफर का उपयोग करके लाइस किया गया था, जिसमें से ऊपर बताए अनुसार कुल प्रोटीन तैयार किए गए थे।
5। निष्कर्ष
हमारा परिणाम इस दृष्टिकोण का समर्थन करता है कि गोमिसिन एन में एक कार्यात्मक भोजन के रूप में उपयोग करने की उच्च क्षमता है औरत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाप्रतिनिधि।गोमिसिन नएस चिनेंसिस में प्रमुख लिग्नन यौगिकों में से एक है। वास्तव में। चिनेंसिस एक हर्बल दवा है जिसका उपयोग कई मानव रोगों के इलाज के लिए किया जाता है। हालांकि, आगे त्वचा पर गोमिसिन एन की सुरक्षा को साबित करने के लिए महामारी विज्ञान के अध्ययन आवश्यक हैं। नतीजतन, विवो अध्ययन और नैदानिक परीक्षणों में गोमिसिन एन की प्रभावशीलता को और अधिक स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करने में सक्षम होंगे। निष्कर्ष में, यह अध्ययन बताता है किगोमिसिन नएक संभावित हाइपो-पिगमेंटरी एजेंट और प्राकृतिक हो सकता हैत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाकॉस्मेटिक उद्योग के लिए उम्मीदवार।
सिस्टैंच सफेदी में सुधार करता है
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