गॉसिपिट्रिन, एक प्राकृतिक रूप से पाया जाने वाला फ्लेवोनोइड, आयरन-प्रेरित न्यूरोनल और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति भाग 1 को क्षीण करता है

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सार:लोहे के होमोस्टैसिस का विघटन तंत्रिका कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के नुकसान का एक महत्वपूर्ण कारक है, जिससे न्यूरोडीजेनेरेशन होता है। यहां, हमने चूहे के दिमाग से पृथक माउस हिप्पोकैम्पस एचटी -22 कोशिकाओं और माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करके लोहे से प्रेरित न्यूरोनल सेल क्षति पर प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले फ्लेवोनोइड गॉसिपिट्रिन (गोस) की सुरक्षात्मक कार्रवाई का आकलन किया। Gos HT22 कोशिकाओं को 100 uM Fe()-सिट्रेट (EC50 8.6 uM) से हुई क्षति से बचाने में सक्षम था। यह सुरक्षा लोहे से प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित अपव्यय और एटीपी कमी दोनों की रोकथाम से जुड़ी थी। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में, गोस (50uM) ने लोहे से प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल सूजन, माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता की हानि और एटीपी की कमी के खिलाफ लगभग पूर्ण सुरक्षा प्राप्त की। Gos ने Fe (Ⅱ) -साइट्रेट-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरोक्सीडेशन को ICs0 मान 12.45 μM） के साथ रोका जो कि टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपरॉक्साइड-प्रेरित की तुलना में लगभग नौ गुना कम था।ऑक्सीकरण. इसके अलावा, फ्लेवोनोइड 15 और 1.5 मिमी 2-डीऑक्सीराइबोज दोनों के क्षरण को रोकने में प्रभावी था। इसने समय के साथ Fe (II) सांद्रता को भी कम किया, जबकि O2 खपत दर में वृद्धि की, और एस्कॉर्बेट द्वारा Fe (II) की कमी को कम किया। Gos-Fe (I) परिसरों का पता UV-VIS और IR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा लगाया गया, जिसमें स्पष्ट रूप से 2:1 का गोस-आयरन स्टोइकोमेट्री था। परिणाम बताते हैं कि गोस आम तौर पर एक शास्त्रीय एंटीऑक्सिडेंट के रूप में कार्य नहीं करता है, लेकिन यह सीधे लोहे को प्रभावित करता है, इसे फे (II) ऑक्सीकरण को उत्तेजित करने के बाद अपने फेरिक रूप में बनाए रखता है। इसलिए धातु आयन फेंटन-प्रकार की प्रतिक्रिया और लिपिड पेरोक्सीडेशन प्रसार चरण में भाग लेने में असमर्थ होंगे। इसलिए, लोहे से प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति से जुड़े न्यूरोनल रोगों के इलाज के लिए गोस का उपयोग किया जा सकता है।

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कीवर्ड: गपशप; लोहा; एचटी-22 सेल; माइटोकॉन्ड्रिया;न्यूरोडीजेनेरेशन; तंत्रिका संरक्षण

1 परिचय

आयरन कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं जैसे डीएनए संश्लेषण और बहाली, ऑक्सीजन परिवहन, सेलुलर श्वसन, ज़ेनोबायोटिक चयापचय और हार्मोन संश्लेषण [1] में एक आवश्यक सहकारक है। हालांकि, उच्च इंट्रासेल्युलर स्तरों पर, यह सेलुलर रेडॉक्स क्षमता [2,3] में संशोधन के साथ सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को बढ़ा सकता है। आयरन डाइहोमोस्टेसिस लगभग हर न्यूरोलॉजिकल स्थिति में देखा जाता है जैसे कि पार्किंसंस रोग (पीडी), अल्जाइमर रोग (एडी), हंटिंगटन रोग (एचडी), मल्टीपल स्केलेरोसिस, फ्राइड्रेइच की गतिभंग, मिर्गी, बेचैन पैर सिंड्रोम और स्ट्रोक [4,5]। विशेष रूप से, इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव में, जहां माइक्रोवैस्कुलचर का टूटना होता है और जारी रक्त तंत्रिका कोशिकाओं के रक्त-व्युत्पन्न लोहे के संपर्क का उत्पादन करता है, न्यूरोडीजेनेरेशन के मुख्य तंत्र लोहा- और हीम-प्रेरित आरओएस उत्पादन, सूजन और एक्साइटोटॉक्सिसिटी हैं। , 7]। मस्तिष्क रक्तस्राव के इन विट्रो और विवो प्रयोगात्मक मॉडल में फेरोटेपोसिस की उपस्थिति दिखाई गई है, जो विनियमित नेक्रोसिस का एक लोहे पर निर्भर रूप है [8]। इसके अलावा, बढ़ते सबूत बताते हैं कि तंत्रिका कोशिकाओं [9,10] में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के नुकसान में लोहे के होमियोस्टेसिस का विघटन आवश्यक है, जो बदले में, न्यूरोडीजेनेरेशन [11-14 को जन्म दे सकता है। हाल ही में लोहे के चयापचय की गड़बड़ी, और माइटोकॉन्ड्रियल हानि [15] के साथ पार्किंसंस रोग के प्रारंभिक शुरुआत के रूप के बीच एक संबंध बताया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल डिब्बों में लोहे और आरओएस दोनों की अपेक्षाकृत उच्च मात्रा का सह-अस्तित्व इस अंग को हाइड्रॉक्सिल रेडिकल-मध्यस्थता क्षति के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है। मस्तिष्क के लोहे के नियमन और लोहे की मध्यस्थता वाले माइटोकॉन्ड्रियल हानि को लक्षित करने वाले औषधीय एजेंट इसलिए न्यूरोडीजेनेरेशन के खिलाफ चिकित्सीय रूप से उपयोगी हो सकते हैं। विभिन्न प्रायोगिक मॉडलों [16-19] में न्यूरोप्रोटेक्टिव क्रियाओं को प्रदर्शित करने के लिए कई आयरन-चेलेटिंग एजेंट पाए गए हैं। दूसरी ओर, आयरन केलेशन और फ्री रेडिकल मैला ढोने की गतिविधियों [20,21] के संयोजन के आधार पर उनके एंटीऑक्सीडेंट कार्यों के कारण प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले पॉलीफेनोल्स की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता पर कई रिपोर्टें आई हैं। हमारे समूह ने देखा है कि कैटेकोल युक्त पॉलीफेनोल्स जैसे मैंगिफेरिन, गुट्टीफेरोन-ए, और रैपानोन इन विट्रो और विवो दोनों में लोहे के साथ बातचीत करते हैं, इस प्रकार आरओएस [22-28] को बढ़ावा देने में इसकी उत्प्रेरक भूमिका को रद्द कर देते हैं। हमने हाल ही में गॉसिपिट्रिन (गोस) के शक्तिशाली एंटीऑक्सिडेंट प्रभावों की भी सूचना दी है, जो एक प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले फ्लेवोनोइड (चित्र 1) है, जो एक न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंट [29] के रूप में इसके संभावित उपयोग को दर्शाता है। फिर भी, इन एंटीऑक्सीडेंट प्रभावों में शामिल तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी है। इलेक्ट्रॉन निरूपण, एक कैटेचोल की मात्रा, और तीन और सुगंधित हाइड्रॉक्सिल समूहों (उनमें से दो एक कार्बोनिल समूह से सटे हुए) के साथ एक प्लानर छह-सदस्यीय चक्रीय प्रणाली की उपस्थिति, दृढ़ता से सुझाव देती है कि यह अणु लोहे-चेलेटिंग एजेंट के रूप में कार्य कर सकता है। संरचनात्मक विशेषताएं हैं जो फ्लेवोनोइड्स 30 द्वारा लोहे के केलेशन का पक्ष लेती हैं]। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य HT की रक्षा करने के लिए Gos की क्षमता का मूल्यांकन करना है-22तंत्रिका कोशिकाएंऔर लोहे की मध्यस्थता से पृथक चूहे के मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रियाऑक्सिडेटिव क्षति. गोस-आयरन इंटरैक्शन की प्रकृति को आगे बढ़ाने के लिए सेल / माइटोकॉन्ड्रिया-मुक्त प्रणालियों में अन्य अध्ययन किए गए।

2. परिणाम

2.1. Gos ने HT को बचाया-22 Fe(I)-प्रेरित कोशिका मृत्यु से कोशिकाएं

Fe-II-100 μM） ने 24 घंटे के एक्सपोजर के बाद HT-22 सेल के अस्तित्व को घटाकर 17.4 प्रतिशत कर दिया, जैसा कि MTT परख द्वारा अनुमान लगाया गया था। गोस ने खुराक पर निर्भर तरीके से हिप्पोकैम्पस कोशिका मृत्यु को रोका। EC50 8.64 ± 1.58 μM (चित्र 2A, इनसेट) था। 100 μM गोस के साथ पूर्ण सेल सुरक्षा देखी गई, जो प्रसिद्ध हाइड्रोसॉल्युबल एंटीऑक्सिडेंट ट्रॉलॉक्स（500 uM） की तुलना में अधिक प्रभावी थी, जिसने कोशिका मृत्यु को 74 प्रतिशत तक रोका।

एचटी -22 2 घंटे के लिए लोहे के संपर्क में (कोशिका मृत्यु निष्पादन से पहले) ने माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के अपव्यय को प्रेरित किया, जैसा कि ऑर्गेनेल (चित्रा 2 बी) के भीतर रोडामाइन 123 की अवधारण और एटीपी कमी (चित्रा 2 सी) द्वारा अनुमानित है। ) यह माइटोकॉन्ड्रिया और सेल व्यवहार्यता पर विषाक्त लौह-मध्यस्थता प्रभावों के बीच एक संभावित संबंध का सुझाव देता है। गोस ने न्यूरॉन व्यवहार्यता के पैटर्न का अनुसरण करते हुए माइटोकॉन्ड्रिया के लोहे से प्रेरित खुराक पर निर्भर हानि को रोका, जिससे पता चला कि यह माइटोकॉन्ड्रियल सुरक्षा के माध्यम से लोहे से प्रेरित एचटी -22 कोशिका मृत्यु को रोक सकता है।

चित्रा 2. लोहे से प्रेरित न्यूरोनल सेल क्षति के खिलाफ गो सुरक्षा। एचटी पर गोस का प्रभाव -22 माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन उत्तरजीविता (ए), सेलुलर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (बी), और सेलुलर एटीपी स्तर（सी）। Gos（0-100 μM） या Trolox（500 μM） को 24 घंटे व्यवहार्यता） या 2h mitochondrial झिल्ली क्षमता और ATP स्तर） के लिए 100 μM FeCl2/ के साथ सह-ऊष्मायन किया गया था। 1 मिमी साइट्रेट। परख की स्थिति धारा 4 में वर्णित है। क्षतिग्रस्त नियंत्रण कोशिकाओं (गोस के बिना) में डीएमएसओ (0.001 प्रतिशत) प्लस आयरन-साइट्रेट मिश्रण होता है। परिणाम अप्रकाशित नियंत्रण (वाहन के रूप में DMSO0.001 प्रतिशत युक्त) के संबंध में कोशिका मृत्यु के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। मान तीन अलग-अलग प्रयोगों के माध्य ± एसडी हैं। विभिन्न प्रतीक p . पर सांख्यिकीय अंतर दर्शाते हैं<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

सिस्टैन्च इम्युनिटी में सुधार कर सकता है

2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitochondria from Iron-Induced Mitochondrial Lipoperoxidation Brain mitochondria incubated with Fe（）-citrate （50 μM） underwent a marked lipoperoxidation expressed by an increase in the formation of the thiobarbituric acid reactive substance(Figure 3A). Gos inhibited the iron-mediated mitochondrial lipid peroxidation in a concentration-dependent manner （IC50 value of 12.45±1.24 μM） （Figure 3A, inset）. The effects of Gos on tert-butyl hydroperoxide（300 μM）-induced mitochondrial lipid peroxidation（IC50 value>100 μM） से पता चलता है कि यह पेरोक्सिल प्रेरित लिपिड पेरोक्सीडेशन की तुलना में लोहे से प्रेरित लिपिड पेरोक्सीडेशन को रोकने में अधिक प्रभावी है, जो लोहे पर सीधे कार्य करने की क्षमता का सुझाव देता है (चित्र 3बी)।

चित्रा 3. गोस माइटोकॉन्ड्रिया में malondialdehyde गठन को रोकता है, जो 50 uM Fe () - साइट्रेट (A) या 300μM टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपरऑक्साइड (B) द्वारा प्रेरित होता है। रैटब्रेन माइटोकॉन्ड्रिया-1 मिलीग्राम/एमएल- को 125 एमएम सुक्रोज, 65 एमएम केसीएल, 10 एमएम एचईपीईएस बफर (पीएच 7.4), 2 एमएम सक्सेनेट, और 2.5 यूएम रोटेनोन युक्त प्रतिक्रिया माध्यम में इनक्यूबेट किया गया था, गोस के साथ या उसके बिना (1-50 यूएम)। प्रयोग 50μM Fe-II- या 300 μM टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपरॉक्साइड के अतिरिक्त द्वारा शुरू किए गए, बिना क्षतिग्रस्त नियंत्रण-ग्रे सलाखों को छोड़कर)। ऊष्मायन अवधि 28 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट थी। मान ± एसडी (एन =6) का मतलब है। विभिन्न प्रतीक p . पर सांख्यिकीय अंतर दर्शाते हैं<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3.Gos आयरन-मध्यस्थ माइटोकॉन्ड्रियल सूजन अपव्यय, और एटीपी कमी को रोकता है

चित्र 4ए से पता चलता है कि 50μM Fe（I）-साइट्रेट जटिल प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल सूजन, जैसा कि 54 0 एनएम (लाइन एफ बनाम लाइन ए) पर अवशोषण में कमी द्वारा व्यक्त किया गया है। यह एक सहज और पूर्ण Y विध्रुवण (चित्रा 4बी, लाइनफ बनाम लाइन ए), और एटीपी कमी (चित्रा 4सी, फे ()/साइट्रेट कॉलम) से जुड़ा था। गोस ने लोहे से प्रेरित सूजन प्रक्रिया और एवाई अपव्यय को एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से बाधित किया (चित्रा 4ए, बी लाइनें हो)। पैनल ए से अवशोषण मान (मतलब ± एसडी 7 मिनट पर) थे: 0.482 ± 0। 0 13 (लाइन ए), 0 .459 ± { {23}}.011 (लाइन बी),0.445± 0.007 (लाइन सी),0.435± 0.015( लाइन डी), 0.360 ± 0.011 (लाइन ई), और 0.338 ± 0.012 (लाइन एफ)। पैनल बी (मतलब ± एसडी 7 मिनट पर) से प्रतिदीप्ति मान 15.03 ± 1.71 (लाइन ए), 19.41 ± 2.07 (लाइन बी), 22.29 ± 2.58 (लाइन सी), 45.505 ± 4.47 (लाइन डी), 118.468 ± 5.76 थे। (लाइन ई), और 146.201 ± 5.83 (लाइन एफ)। लाइन एफ और अन्य लाइनों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर पी पर पाए गए थे।<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

चित्रा 4. (ए) माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण प्रेरण, (बी) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता 'एएच-लॉस, और सी' 50 माइक्रोन फे-II-साइट्रेट द्वारा प्रेरित एटीपी स्तरों की कमी। प्रतिदीप्ति जांच सफारी 5 uM） का उपयोग करके ए का अनुमान लगाया गया था। Gos 50,25, 10, और 1μM के निरोधात्मक प्रभाव क्रमशः लाइनों (बी), (सी), (डी), और (ई) में दिखाए जाते हैं। रेखाएं (ए) और (एफ) क्रमशः बिना क्षतिग्रस्त नियंत्रण (लोहे के बिना), और क्षतिग्रस्त नियंत्रण (गोस के बिना) का प्रतिनिधित्व करती हैं। रैट ब्रेन माइटोकॉन्ड्रिया (RBM-0.5 mg/mL), Fe-II） और 1 μM CCCP जोड़े गए जहां तीरों द्वारा संकेत दिया गया था। ग्राफ में विभिन्न प्रतीक（सी）सांख्यिकीय अंतर को इंगित करते हैं<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos Fe (II) -साइट्रेट ऑटॉक्सिडेशन और O, खपत को प्रेरित करता है

खुराक पर निर्भर तरीके से 2 मिमी साइट्रेट (माइटोकॉन्ड्रिया के बिना) युक्त प्रतिक्रिया माध्यम में Gos ने Fe () एकाग्रता (1- मिनट प्रीइंक्यूबेशन) को कम कर दिया (चित्र 5A, काले घेरे)। एक 5-मिनट प्रीइंक्यूबेशन अवधि (चित्रा 5ए, लाल बक्से) ने Fe (II) एकाग्रता को और भी कम कर दिया। Gos ने O2 खपत की दर में भी वृद्धि की, संभवतः Fe(ll) से Fe(ⅡII)(चित्र 5B,C) के ऑक्सीकरण के कारण। इन परिणामों से पता चलता है कि गोस साइट्रेट कॉम्प्लेक्स से Fe (II) को हटा सकता है और इसे फेरिक रूप में ऑक्सीकरण कर सकता है, जिसके लिए इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में O2 की आवश्यकता होती है। तदनुसार, गोस फेंटन-हैबर-वीस-प्रकार की प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक Fe (Il) को निष्क्रिय करके "OH रेडिकल्स के गठन में बाधा डाल सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के लिपिड पेरोक्सीडेशन को आरंभ कर सकता है।

चित्रा 5. (ए) गोस 1 मिमी साइट्रेट के साथ पूरक मानक माध्यम में चूहे के मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया की अनुपस्थिति में Fe (Ⅲl) ऑटॉक्सिडेशन को उत्तेजित करता है, और 5 मिमी 1, 10- फेनेंथ्रोलाइन। 1, 10- फेनेंथ्रोलाइन था Gos-Fe (II) ऊष्मायन अवधि के बाद 1 या 5 मिनट जोड़ा गया, और अवशोषण 510nm पर पढ़ा गया। मान तीन निर्धारण की औसत रहे हैं। * p . पर सांख्यिकीय अंतर<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos,="" （c）="" 30μm="" gos,="" （d）50="" μm="" gos,and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

यह लेख अणु 2021, 26, 3364 से निकाला गया है।